TW574503B - A method of in vitro determining the degree of aggregation of the betaA4 peptide - Google Patents

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Description

574503 A7 B7 五、發明説明（1 ) 1 .發明的領域 本發明關於ys A 4胜肽聚合度的測量方法。最特別的 是，利用一適宜的結合試劑與蛋白質反應。然後測量反應 後未反應的結合試劑量。 2.先前技藝的討論 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 我們已知，在阿茲海默症（Alzheimer，s Disease) 病人的腦部含有貝他澱粉樣前驅蛋白質小片段（即澱粉樣 貝他胜肽或ySA4胜肽）的聚集或塊團。此含4 2個胺基 酸的A 4胜肽的胜肽序列是天冬胺酸-丙胺酸一穀胺酸 -苯丙胺酸-精胺酸-組織胺酸-天冬胺酸-絲胺酸一甘 胺酸-酪胺酸-榖胺酸-纈胺酸-組織胺酸-組織胺酸一 榖胺酸-賴胺酸-亮胺酸-纈胺酸-苯丙胺酸-苯丙胺酸 -丙胺酸-穀胺酸-天冬胺酸-纈胺酸-甘胺酸-絲胺酸 -天冬醯胺-賴胺酸-甘胺酸-丙胺酸-異亮胺酸-異亮 胺酸-甘胺酸-亮胺酸-甲硫胺酸-纈胺酸-甘胺酸-甘 胺酸-纈胺酸-纈胺酸-異亮胺酸-丙胺酸（ DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA)。 一般討論ys A 4胜肽和阿茲海默症之關連係參考 Dennis J. Seiko, Scientific American· November 1991, 68-78和 Joseph T. Jar rett e t a 1., Cell, Vo 1. 73, 1 055- 1 058 ( 1 993 )。 一種具潛力以抵抗阿茲海默症進展的治療方法是利用 含有活性組成物的藥物治療病人，其中該活性組成物可阻 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'/297公釐）-4- 574503 A7 ___B7_ 五、發明説明（2 ) 止y3 A 4胜肽的聚集或結塊。因此必需有一篩選確認該活 性組成物或有效的化學化合物的方法。 有許多已知測量蛋白質的方法。其中之一方法是使用 Bradford染料’或是所謂的 Coomassie Brilliant Blue G250。關於此方法請參考J. James Sedmak etal., Analytical Biochemistry. 7flT 544-552 ( 1 9 77 )，其主要 描述蛋白質的測量，而非聚集或自由態的A 4胜肽。 我們必需有一可區分聚集態和自由或非聚集態的点A 4胜肽的測量方法，然後藉此方法我們可觀察各種化合物 對於）5八4聚集態的影響爲何。在？^十^、？^彳^^ 2, 404-4 1 0 ( 1 9 93 ) H· LeVine 曾應用硫黃素 T(Thioflavin )測量聚集的澱粉樣蛋白質。 圖片的簡述 圖1係顯示隨著時間進行yS A 4胜肽的非集合度變化 〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖2係顯示A 4胜肽的非集合度與其吸光度之對應 本發明的概要 本發明係關於yS A 4胜肽聚集態的測量方法，最特別 的是本方法利用只可與非聚集態的yS A 4胜肽相結合的適 宜結合試劑與蛋白質反應，然後測量含有蛋白質的結合試 劑量。 本紙張尺度適用中國國家標準（〇奶）八4規格（210'/297公釐）-5- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 574503 A7 ___B7__ 五、發明説明（3 ) 詳細描述 在阿茲海默症病人的腦部發現有3 9 - 4 2個胺基酸 的澱粉樣蛋白（或稱爲ySA4胜肽）聚集或結塊。而此聚 集或結塊的蛋白，被認爲是造成阿茲海默症病人正常腦細 胞損壞的原因。一旦此殺手性結塊或聚集蛋白形成，其是 幾乎無法回復成正常狀態。因此，治療阿茲海默症病人的 一種具潛力的方法係投予該病人一種可防止θ A 4胜肽結 塊或聚集的化合物或藥物。 研究已發現，利用篩選方法，我們可確認某些化合物 是否具有抑制體外yg A 4胜肽聚集的效果，然後以做爲治 療阿茲海默症之用。 因此必需選擇一適宜的結合試劑。此結合試劑可選擇 性和非聚集的澱粉樣蛋白胜肽（即/3A4 )或聚集的澱粉 樣蛋白胜肽反應，但不與篩選的化合物反應；然後已與胜 肽反應的結合試劑具有測量特徵，如在特別波長有吸光值 。一些適當的結合試劑包括Bradford染料，或Coomassie Brilliant Blue G250，剛果紅（Congo Red)和硫黃素 T 。而特別適合的是Bradford染料0 Bradford染料是 Coomassie Brilliant Blue G250。關於 Bradford 染料或 Coomassie Blue 染料請參考 M. Bradford, Ana 1. B i ochem .,7 2, 248 (1976); A. H. Re i sner et a 1. , Ana 1. B i ochem· 64，509 (1975 ); S. Fazukes de St. Groth，
e t a 1 .，Biochim. Biophvs. Acta. 71 37 7(1963)和 J. J 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）- 6 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 574503 A7 B7 五、發明説明（4 ) .Sedmack et a 1. , Ana 1. Bo i chem. 79, 5 44 (1977)。 目前市面上已有商品做爲標準試劑（如Bio-Rad Life Science Group, Hercules, California生產的 Protein Assay Dye Reagent Concentrate)。此染料只與非聚集 態的A 4反應，並不會和任何聚集態的澱粉樣蛋白胜肽 反應。 如 Marion M. Bradford於 Analytical Biochemistry. 72, 248-2 54 ( 1 9 76 )所述，Bradford染料的組成係 0· 01% (w/v) Coomassie Brilliant Blue G-250 ，1· 7%(w/v)乙醇和8. 5%(w/v)磷酸。 購自Bio-Rad，編號5 0 0 — 0 0 0 6，商品名爲Protein Assay Dye Reagent Concentrate係 Bradford染料的修飾 品，其組成如下：0· 04%(w/v)Coomassie Brilliant Blue G-250 溶於 2 5% 甲醇，5 0%磷酸和 2 5%水。經過修飾的組成配方具有較佳安定性，較長保 存期，並且由於減少磷酸含量因此有較低生物危險性，但 並不因此影響其蛋白質結合特性。目前有二種不同的套組 ，分別是以牛伽侷球蛋白（bovine gamma globulin)爲 標準的套組I(編號500—0001)和牛血清白蛋白 (borine serum albumin)爲標準的套組 Π (編號 5 0 0 — 0 0 0 2 )。 在實際應用時，必需製備已知濃度非聚集型式的澱粉 樣胜肽（即A 4胜肽）。利用一般胜肽合成儀（如： Millipore Model 9050 peptide synthesizer)可獲得非 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 7 _ ---------I-r----1T------Φ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 574503 A7 __—_B7_ 五、發明説明（5 ) 聚集態的ySA4澱粉樣蛋白胜肽。例如將i 0mg的胜肽 在20 — 2 5 °C下溶於適當的有機溶劑（如二甲基亞硕（ DMSO)或乙睛），而得到高濃度溶液如： 2 5 0 0 /zM。將此高濃度瑢液以磷酸鹽緩衝食鹽水（ pH7_ 4)做十倍稀釋，而得到控制溶液（如 250//M)。首先取16//$的控制溶液加入 1 4 4 // P的磷酸鹽緩衝溶液，並與2 5 // j?的適當結合 試劑（如Brad ford染料）反應，其中該結合試劑和非聚集 態澱粉樣蛋白質反應而形成第一濃度或蛋白質結合結合試 劑含量。爲了使結合試劑只選擇性地與非聚集態蛋白質結 合’因此反應條件必需配合所使用的結合試劑和所要測量 的其結合特性。如使用Bradford染料做爲結合試劑時，其 反應條件爲：於2 0 - 2 5 °C的中性或微鹼性環境下（ ρΗ7· 0—7· 4)反應5—15分鐘。 我們必需注意的是，當我們要測量第一濃度或蛋白質 結合結合試劑含量時，必需考慮反應的結合試劑所具有的 特性，以使用適當的偵測方法，如Bradford染料在波長 5 9 5 nm之吸收值爲〇 _ 7，然後可得到第一個數值 X 1 〇 選取分裝的控制溶液進行第二個實驗。因爲ΘΑ 4隨 著時間延長而發生聚集，因此將控制溶液於適當溫度（約 3 7 °C )下反應適合的時間（如2 4 - 7 2小時），使其 形成聚集物，然後加入結合試劑與非聚集態澱粉樣蛋白反 應而產生第二濃度或結合蛋白質含量或反應的結合試劑含 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(210X297公釐）- 8 - ' ----------裝一T (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 着 574503 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（6 ) 量。澱粉樣蛋白聚集的濃度或含量並不會與結合試劑，因 此並不被偵測或測量。而且可測得有蛋白質結合的結合試 劑含量，如利用在適當波長具有的吸光值，如Bradford染 料於5 9 5 nm有吸光值，藉此可得到第二數值χ2。其 代表已與非聚集態的θ A 4反應的結合試劑含量。 當聚集現象發生時，蛋白質結合或反應的結合試劑濃 度是與已發生的聚集度成反比。因此，第二數值χ2小於 Xi，顯示有某種程度的Α 4胜肽發生聚集現象。 爲了對候選的阿茲海默氏化合物進行品質篩選，必需 拿取分裝的控制溶液進行第三個實驗。將反應物置於含有 候選化合物的適當反應狀況下，如3 7°C反應4 8小時， 然後加入適當結合試劑，如Bradford染料，再利用一般的 分光光度計測量反應後混合物的吸光值，而可得到結合的 結合試劑吸光值。假如候選化合物並無抗聚集的效果，那 麼X 3的數值將幾乎與第二數值X 2相同。假如X3數值比 X 2增加3 0 — 4 0 %，則該候選化合物即被認爲可抑制 澱粉樣胜肽的聚集。 在進行以上篩選試驗時，澱粉樣蛋白胜肽的濃度爲選 擇的結合試劑的1 5 0 0 - 1 8 0 0倍（澱粉樣蛋白/結 合試劑）。澱粉樣蛋白胜肽濃度爲候選化合物的4-40 倍（候選化合物/澱粉樣蛋白胜肽）。 聚集度的定量可依照下列方法。首先將相同分量的控 制溶液進行不同時間的反應。當時間增加，聚集度也隨之 增加。然後在每一反應時間後加入結合試劑（如 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐）-9 - ---------裝--Γ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 574503 A7 —___B7 五、發明説明（7 )
Bradford染料），並測定（如對於Bradford染料而言係測 量在595nm的吸光值）。然後可決定出每一反應時間 ，聚集的澱粉樣蛋白濃度或百分比對非聚集的澱粉樣蛋白 圖形。結合試劑測量非聚集（或聚集的）蛋白。聚集的冷 一澱粉樣蛋白含量的計算係其從新鮮蛋白減去無聚集的蛋 白數值（X 1 )並以百分比法表示。我們可得到聚集的胜 肽百分比對於各種反應時間（如24，48，72，96 小時，顯示於圖1 )的一直線反比圖。重覆此程序，除了 在每一反應時間後將結合試劑加至反應物內，然後測量反 應後混合後的X值。然後可建立聚集或非聚集現象（X值 表不）之間與吸光值（如·· Bradford染料於5 9 5 nm波 長的吸光值，顯示於圖1 )的關連性。然後可得到X值對 非聚集現象的標準反比圖，如圖1所示。 對於一特殊候選化合物的X值，我們可與對照組相比 ，而定量其抑制聚集作用的程度，如圖2所示。 實施例1 將/5 —澱粉樣蛋白（即iSA4)胜肽溶於1 〇 〇%二 甲基亞硕（DMS0)使其濃度爲(或 2500//M)。然後以PH7. 4的磷酸鹽緩衝食鹽水 (PBS)稀釋該蛋白溶液成lmg/m$ (或 2 5 0从M )的庫存液。取Corning 96孔盤，每一孔內加 入1 6 # 5的蛋白質溶液，然後加入三種不同濃度（ 250#M，500#M和ImM)的試驗化合物，並以 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐）- 10 - " ----------裝IT (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 574503 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（8 ) PBS調整每一孔內的總體積爲160/ζί (使蛋白質的 最終濃度爲2 5 //Μ)。而未處理對照組則僅含yS -澱粉 樣胜肽，而不添加化合物，並使其總體積爲160//又。 將實驗盤以石臘封住並於3 7 °C反應4 8小時。 反應時間到時，將實驗盤取出並在每一孔內加入2 5 从芡的Bio-Rad蛋白試驗染料試劑（Brad ford染料）。此 時也建立一標準曲線以估計新鮮（即未聚集的）胜肽的吸 光值。利用吸量器混合染料並以2 5 0 0 r pm快速旋轉 實驗盤以去除氣泡。 染料加入後的1 5分鐘，利用Dynatech MR50 00 plate reader觀察每一孔反應物於5 9 5 nm波長的吸光 值。我們評估未處理聚集的胜肽組和已處理聚集的胜肽組 之差異發現：當加入含8個胺基酸的胜肽A4 1 9 2 0 t 化合物〔其胺基酸序列爲縠胺酸一賴胺酸-亮胺酸一纈胺 酸一蘇胺酸一蘇胺酸—丙胺酸—穀胺酸（QKLVTTAE)〕時 ，可降低Θ -澱粉樣蛋白的聚集百分率。當加入 250//M，5 0 0//M 和 ImM (或 1000//M)的 A41920t時，其降低率分別爲48.1%， 52. 44% 和 32. 26%。 實施例2
重複實施例1的程序，除了在9 6孔內加入1 6 //芡 lmg/mj? i8 —澱粉樣蛋白庫存液並加上1 〇μ又 3 0%的過氧化氫溶液，然後加入1 34 // j?的P BS 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐）- 11 - ----------裝IT- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 574503 A7 B7 五、發明説明（9 ) 至每一孔內使總體積爲1 6 0 。將實驗盤封口並於 3 7 °C反應4 8小時。 反應時間結束時，將實驗盤取出並加入2 5 /z j?的 Bio-Rad蛋白試驗染料試劑（Bradford染料）。再次利用 標準曲線以評估新鮮（即未聚集的）胜肽的吸光值。以吸 量器混合染料並利用2 5 0 0 r pm快速旋轉實驗盤以去 除氣泡。 加入染料1 5分鐘後，利用Dynatech MR5000 plate reader觀察實驗盤內反應物於5 9 5 nm波長的吸光值。 蛋白質聚集的評估係去除背景值，然後考慮新鮮和過氧化 氫處理的点一澱粉樣蛋白吸光值的差異。此差異的表示法 爲過氧化氫處理過胜肽除以新鮮或未聚集胜肽再乘以百分 之百。經過48小時之後，聚集度爲97. 7%。 實施例3
除了以葡萄糖胺聚糖，戊聚糖多硫酸鹽取代過氧化氫 之外，重覆實施例2的程序。實驗結果發現：〇. 5//M 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，5#Μ和50//M的聚集度增加百分率分別爲40. 8 % ^ 5 7. 1% 和 62. 9%〇 實施例4 除了以1— (5 / —氧基己基）一 3 —甲基一7 —丙 基一 2，6 -（1Η，3Η) -嘌呤二酮〔即丙烯基非林 (propentofylline)〕取代 A4192 0 t 之外，重覆 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇χ297公釐）- 12 - 574503 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（1()) 實施例1的程序。結果發現：當500#M和lmM(或 1 0 0 0 /zM)濃度時，降低聚集度的百分率分別爲 29· 68% 和 37. 4%。 序列列表 (1)一般資料： (i )申請者： (A )公司名稱：Hoechst Marion Roussel, Inc· (B )街名：2110E· Galbraith Rd., Ρ·0· BOX 1 5 6 30 0 (C )城市：辛辛那提 (D)州：俄亥俄 (E )國家：美國 (F) 郵遞區號：45215-6300 (G) 電話：513 — 948 — 7369 (Η )傳真：5 1 3 — 9 4 8 - 7 9 6 1 (I )電傳·· 2 1 4 3 2 0 (i i )發明名稱：/SA4肽集合度之測量方法 (i i i )序列號碼：1 (iv)電腦可讀型式： (A )媒體種類：Floppy disk (B )電腦：I Β Μ Ρ C相容
(C)執行系統：PC-DOS/MS—DOS (D )軟體：Patenlhn Release #1.0，Version 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐）_ — 裝 j- 訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 574503 A7 B7 五、發明説明（11 ) #1.30 (EPO) (vi)先前申請案資料： (A) 申請案編號：US08/515，606 (B) 申請曰期：1995年8月16曰 (2 ) S E Q ID ΝΟ:1 的資料： (i )序列特徵= (A)長度：42個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (C )股： (D )拓樸學：直線 (ii)分子種類：蛋白質 (xi)序列敘述：SEQ ID Ν Ο ： 1
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala 35 40 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐）-14 - ---------裝--；-----訂----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims (1)

  1. 574503
    A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 附件义： 松於|5g修正 補充 第85 1 09828號專利申請案 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 中文申請專利範圍無劃線替換本 民國92年8月15日修正 種體外測量^ A 4胜肽聚合度的方法，其係包 含： (a )使作爲結合試劑之 c ο 〇 m a s s i e B r i 1 1 i a n t b 1 u e G- 250染料與/3 A 4胜肽於2 0至2 5 t：的中性或微鹼性環 境下反應5至1 5分鐘，形成具有蛋白質結合的結合試劑 和不含蛋白質的結合試劑；並且 (b )測量該具有蛋白質結合的結合試劑含量。 ’ 2 · —種測量化合物是否具抑制々A 4胜肽聚集的方 法，其係包含： (a )將含自由態冷A 4胜肽的樣本與作爲結合試劑 之 Coomassie Bi. illiant blue G-250 染料於 2 0 至 2 5°C 的中性或微鹼性環境下反應5至1 5分鐘，以形成蛋白質 結合的結合試劑，進而形成蛋白質結合的結合試劑樣本； 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (:b )測量該蛋白質結合的結合試劑樣本以得到第一 參考値，其對應於存在的蛋白質結合的結合試劑含量； (c )將該蛋白質結合的結合試劑樣本與一經選擇的 候選化合物反應一適宜時間，以形成一試驗樣本；. (d )測量該試驗樣本以得到第二參考値，藉此以決 定第一和第二參考値之間的差異程度。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）
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