JP6619394B2 - 血液、血液生産物及び器官を処置する方法 - Google Patents

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Description

本発明は、アルツハイマー病及び他のアミロイドベースの疾患の伝染を予防するための血液、血液生成物及び器官を処置する方法（ｅｘ ｖｉｖｏ）に関する。
今後数十年での人口統計的増大に基づき、高齢による疾病を被る人の数は多くなるであろう。ここでは、特にいわゆるアルツハイマー病（ＡＤ、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓｃｈｅ Ｄｅｍｅｎｚ、ラテン名＝Ｍｏｒｂｕｓ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）と称することにする。
アルツハイマー病の特徴は、アミロイドβ−ペプチド（Ａβ−ペプチド、Ａβ又はＡβ−ペプチド）の細胞外沈殿物である。プラークの形のこれらのＡβ−ペプチドの沈殿物は、通常は、死後ＡＤ−患者の脳内に確認される。従って、種々の形のＡβ−ペプチド、例えば、フィブリルのようなものは、疾患の発生と進行の原因になっている。更に、数年来、遊離した小さな拡散性Ａβ−オリゴマーは、ＡＤの発症と進行の主な原因になっているとみなされる。
Ａβ−オリゴマーの構成成分としてのＡβ−モノマーは、人体で持続的に生じ、かつ自体は毒性ではないと推定されている。Ａβ−モノマーは、その濃度により無作為に結合することができる。この濃度は、体内でのその形成速度と分解速度に応じる。年齢が上がるにつれて体内でのＡβ−モノマーの濃度の増大が生じるので、Ａβ−オリゴマーへのモノマーの自発的な結合が常に起こり得る。このように生じるＡβ−オリゴマーは、プリオンと同様に増大し、かつ最後にはアルツハイマー病を生じる。
ＡＤの予防と治療又は治癒の重要な違いは、初めのＡβ−オリゴマーの形成を阻止することにより、すでに予防を達成できるということにある。このために、Ａβ−オリゴマーに関して僅かに親和性かつ選択的である幾つかの、僅かなＡβ−リガンドで十分である。
多くのモノマーからのＡβ−オリゴマーの形成は、高い系統の反応であり、従ってＡβ−モノマー濃度の高い能力に依存する。従って、活性なＡβ−モノマー濃度の僅かな低減が、初めのＡβ−オリゴマーの形成の阻止につながる。このメカニズムに従来の予防は基づいている。
しかし、ＡＤの治療の場合には、完全に異なる状況から出発する。ここには、プリオンに似たオリゴマーの増大により生じるＡβ−オリゴマー又は事実上既に大きなポリマー又はフィブリルも存在する。しかし、これはより低い系統の反応であり、かつＡβ−モノマーの濃度に殆ど依存しない。
これまでにアルツハイマー病（ＡＤ）の因果的な治療に認可された医薬品は存在していない。通常は、死後ＡＤ−患者の脳内でプラークの形でいわゆるβ−アミロイド−ペプチド（Ａβ又はＡベータ）の沈殿物が確認される。従って、既に種々の形のＡβ−オリゴマー、例えば、フィブリルは、ＡＤの発生と進行の原因になっている。更に、数年来、遊離した小さな拡散性Ａβ−オリゴマーは、ＡＤの発症と進行の主な原因になっているとみなされている。Ａβ−モノマーは、人体で持続的に生じ、かつ自体は毒性ではないと推定されている。Ａβモノマーがその濃度に依存して無作為に結合するのかどうか及びそれにより年齢が増すにつれてますます自発的に結合してＡβ−オリゴマーになるのかどうかが考察されている。一旦生じたＡβ−オリゴマーは、プリオンに似たメカニズムにより増大することができ、かつ最後には疾患につながる。プリオン病のようにＡＤが原則的にヒトからヒトに伝染し得るのかどうかが数年来論議されてきた。類似したことは、全てのアミロイド関連疾患（例えば、パーキンソン）にも当てはまる。特に輸血、血液生成物の投薬及び臓器移植による可能性のある伝染は、適切な試験及び予防法なしに受容者の健康の大きな危険性につながる。これに関連して、非科学的文献には、トランスジェニックマウスの全血液を病気のマウスのものと交換した後に、このマウスにＡＤの早期疾患が報告されている。
これらの考察に基づき、（予防薬又は予防的）処置により、血液、血液生成物及び器官から伝染性微粒子を遊離するか又はこれらを不活化する可能性が生じる。この場合に、毒性Ａβ−オリゴマーを完全に除去するか又は撲滅する、すなわち解毒し、ひいてはそれらのプリオンに似た増大を阻止する目的がある。
従来技術から、生物毒性物質、生物粒子、分子及び病理学的タンパク質沈殿物を除去する種々の方法が公知である。数分間目的を定めて血液を毒物から精製するためにナノマグネットを使用する研究がある。同様に、リポタンパク質（ＤＡＬＩ）ＬＤＬ−コレステロールを血液から直接に吸収することで除去することが記載されている。抗体又はペプチドの固定化は、ＤＥ６００２６９８３Ｔ２又はＵＳ５９６８８２０に記載されている。
更にＤＥ１０２００９０３７０１５Ａ１からは、生物毒性物質を体液から除去する装置と方法が公知である。液体からの細胞、生物粒子又は分子の単離は、ＤＥ１０２００５０６３１７５Ａ１に記載されている。更にＤＥ１０２００５０３１４２９Ａ１からは病理学的タンパク質沈殿物を選択的に決定する方法が公知である。最後に、ＤＥ１０２００５００９９０９Ａ１には、ミスフォールディングタンパク質と関連した疾患を処置する化合物が記載されている。
従来技術から公知の物質は、Ａβ−モノマー及び／又はオリゴマーの濃度を種々の方法で減少させる。従って、例えば動物実験で予防に使用されたγ−セクレターゼ−モジュレーターが公知である。
ＷＯ０２／０８１５０５とＤＥ１０１１７２８１Ａ１からは、Ａβ−ペプチドに結合するＤ−アミノ酸の種々の配列が公知である。ＷＯ０２／０８１５０５のＤ−アミノ酸から成るこれらの配列は、４μＭの解離定数ＫD−値でアミロイド−β−ペプチドに結合する。
ＷＯ２０１１／１４７７９７からは、Ａβ−オリゴマー化を阻止するアミノピラゾールとペプチドから成るハイブリッド化合物が公知である。
しかし、血液、血液生成物及び／又は器官を精製するこれらの化合物の使用は開示されていない。
動物実験でプラスの結果を示した多くの物質では、ヒトにおける臨床実験でのこの作用は証明できなかった。臨床実験では、フェーズＩＩとＩＩＩは明らかにＡＤと診断されたヒトでのみ処置できた。ここでは、多量のＡβ−オリゴマーを阻止するため及び／又は疾病の経過における影響を獲得するために、もはやＡβ−モノマー濃度を僅かに減少させるだけではむしろ十分ではなかった。
これまでに、アルツハイマー病は、症状が既に認知されたヒトでの試験により主に神経−心理試験により診断されている。しかし、Ａβ−オリゴマー及び時間的に更にそれに続くフィブリル及びプラークは、症状が生じる前に患者の脳内で２０年間まで遡って生じていて、かつ既に不可逆的な障害を引き起こし得たことが公知である。しかし、これまでにＡＤが該症状の発病前に診断された可能性はない。
本発明の課題は、処置によって血液、血液生成物及び／又は器官から、毒性及び／又は伝染性粒子を除去する、又は前記粒子を不活性にすることである。血液、血液生成物又は器官中に存在するＡβ−オリゴマーを完全に除去するか又は危険の無い形に変換することが目的である。
従って、本発明の対象は、血液、血液生成物及び／又は器官を処置する方法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ）であり、該方法は血液、血液生成物及び／又は器官が、人体又は動物の体から取り出され、かつアミロイド−β−オリゴマーが除去及び／又は解毒されることを特徴とする。
処置される血液は、血液バンクから由来する及び／又は処置後に血液バンクで貯蔵することができる。
更に、本発明による方法は、健康な人間で予防的に使用できる。この場合、ＡＤの症状を有さない健康なヒトの血液から、人体又は動物体の治療的処置の方法の工程に関わらず、存在する場合にはアミロイド−β−オリゴマーが除去される。
例えば、血液にビーズを添加し、これがＡβ−オリゴマーに結合するか又は保持することによりＡβ−オリゴマーを除去できる。血液プローブを処置するために、Ａβオリゴマーに結合する物質を磁気ビーズに結合させることができる。ビーズの１例は、ダイナル（Ｄｙｎａｌ）社のダイナルビーズである。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(R)Ｍ−２８０ストレプトアビジン（Ｄｙｎａｌ Ａ．Ｓ．，Ｏｓｌｏ）は、ビオチンと高い親和性（ＫD＝１０-15）で結合する精製ストレプトアビジンと共役結合する超磁気マイクロ粒子である。続いて、これらのビーズはこれに結合したＡβ−オリゴマーを例えば、アフィニティークロマトグラフィー、濾過、サイズ除外沈殿又は遠心分離により再び除去できる。
本発明の１変法では、血液及び／又は血液プローブを表面上に誘導することにより、Ａβ−オリゴマーが結合するか又は保持されてＡβ−オリゴマーを除去できる。本発明によれば、担体上でＡβ−オリゴマーに結合するもしくは解毒される（いわゆる捕捉分子）が設置され、これにより液体プローブが誘導される。１変法では、捕捉分子にはナノ磁石を用いて固定化が可能である。同様に、透析系において捕捉分子の設置が可能である。もう１つの変法では、捕捉分子は生物適合性材料から成っていてもよい。担体は、膜、フィルター、フィルタースポンジ、ビーズ、スティック、ロープ、柱状物及び中空繊維であり得る。
もう１つの変法では、捕捉分子を器官を介して、及び／又は器官を通して誘導する（ｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏ）ことにより、関連する器官から、Ａβ−オリゴマーを除去できる。
本発明のもう１つの変法では、Ａβ−オリゴマーを無毒性型、非アミロイド形成型、非感染型に変換する物質の添加によりＡβ−オリゴマーを不活性化できる。
Ａβ−オリゴマー不活性化物質又はＡβ−オリゴマー結合物質として、全てのＡβ−オリゴマー変性リガンド、例えば、Ａβ−抗体又はＡβ−結合ペプチドを使用できる。使用すべき物質は、Ａβ−オリゴマーに対してできるだけ高い親和性を有するべきである。相応する解離定数は、μＭの範囲、有利にはｎＭの範囲、特にｐＭの範囲内、又はより小さな範囲内であるのがよい。治療的処置の目的分子はＡβ−オリゴマーであり、ひいては当然ながら多価の標的であるので、本発明の１変法では、処置に使用すべき物質は既に効率的なＡβ−オリゴマー結合単位の複数のコピーから製造できる。損害を与える影響（例えば、立体干渉による）が不在の場合には、少なくともｘの解離定数（ＫD）でＡβ−オリゴマーに結合するＡβ−オリゴマー結合単位のｎ量体、ｘｎの見かけ上のＫを達成できる。これを達成するために存在する種々の可能性は次のものである：Ａβ−オリゴマー結合単位（モノマー単位）は、共有結合又は非共有結合（例えば、ビオチン基又はストレプトアビジンテトラマー）により互いに結合できる。本発明の１変法では、任意の多くのコピーをビーズの表面上で固定化することができる。
本発明の意味で、Ａβ−オリゴマーという用語は、Ａβ−凝集体とＡβオリゴマーの両方、また遊離する小さな拡散性Ａβ−オリゴマーも意味する。本発明の意味で、オリゴマーとは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のモノマー又はその数倍から形成されるポリマーである。
本方法は、有利には人体又は動物の体の外側において実施される。このために使用される用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏである。
１実施態様では、ポリマーはペプチドである。これは有利には実質的にＤ−アミノ酸から成る。
本発明の意味で、“実質的にＤ−アミノ酸から成る”という用語は、使用すべきモノマーが、少なくとも６０％、有利には７５％、８０％、特に有利には８５％、９０％、９５％、特に９６％、９７％、９８％、９９％、１００％がＤ−アミノ酸から構成されていることを意味する。
本発明の１変法では、Ａβ−モノマー及び／又はＡβ−オリゴマー及び／又はＡβ−ペプチドのフィブリルに、最大で５００μＭ、有利には２５０、１００、５０μＭ、特に有利には２５、１０、６μＭ、とりわけ４μＭの解離定数（ＫD−値）で結合するモノマーが使用される。
ポリマーは、上記モノマーの２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上を含有する。
もう１つの実施態様では、モノマーは次のもの：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９ならびにそれらの相同体から成る群から選択される。
もう１つの変法では、ポリマーはアミロイドβ−ペプチドの多量体化ドメインに結合する。
“多量体化ドメイン”という用語は、アミロイドβ−ペプチドの相互作用と互いに関わるアミロイドβペプチドのドメインとして定義づけられる。１変法では、アミロイドβ−ペプチドの１０〜４２個のアミノ酸はこの機能を満たす。
もう１つの変法では、モノマーは、所定の配列から３個までのアミノ酸が異なる配列を有する。更に上記配列を含有する配列もモノマーとして使用される。
もう１つの変法では、モノマーは上記配列の断片を有するか、又は上記配列に相同の配列を有する。
本発明の意味では、“相同配列”又は“相同性”とは、１つのアミノ酸配列が、モノマーの上記アミノ酸配列のうち１つと少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の同一性を有することを意味する。“同一性”という用語の代わりに、本記載では、“相同”又は“相同体”も同じ意味で使用される。２個の核酸配列又はポリペプチド配列の間の同一性は、Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９（１９８１））のアルゴリズムに基づくプログラムＢＥＳＴＦＩＴを用いる比較により、アミノ酸に関して以下のパラメーター：ギャップクリエーションペナルティー：８及びギャップ伸長ペナルティー：２；及び核酸に関して以下のパラメーター：ギャップクリエーションペナルティー：５０及びギャップ伸長ペナルティー：３の調整下に算定した。
２個の核酸配列又はポリペプチド配列の間の同一性は、それぞれ全体の配列長さにわたる核酸配列／ポリペプチド配列の同一性により定義付けるのが有利であり、これは例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３）のアルゴリズムに基づくプログラムＧＡＰを用いる比較により、アミノ酸に関して以下のパラメーター：キャップクリエーションペナルティー：８及びギャップ伸長ペナルティー：２；及び核酸に関して以下のパラメーター：ギャップクリエーションペナルティー：５０及びギャップ伸長ペナルティー：３の調整下に算定した。本発明の意味で、２個のアミノ酸配列が同じアミノ酸配列を有する場合には、これらは同一である。
１つの変法で相同体とは、上記モノマーの相応するｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ配列を意味すると解釈される。“ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ配列”という用語は、本発明によればエナンチオマー型のアミノ酸から組成されるアミノ酸配列を指し（ｉｎｖｅｒｓ：α−炭素原子のキラリティーが逆になっている）及びその際に更に配列順序は元のアミノ酸配列とは逆になっている（ｒｅｔｒｏ＝逆方向）。
ポリマーは、同一のモノマーから構成されるか、又は種々のモノマーを含有している。
代替方法では、ポリマーは、上記モノマーの２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の任意の組合せから各々構成される。
１実施態様では、ポリマーは、２個のＤ３−モノマーから成るダイマー（配列番号１３）である。
もう１つの実施態様では、ポリマーは、２個のＲＤ２−モノマーから成るダイマー（ＲＤ２−ＲＤ２：ｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒ（配列番号：７６）である。
ダイマーは、例えば化学合成又はペプチド合成により製造できる。
本発明の１実施態様では、モノマーは共有結合により互いに結合する。もう１つの実施態様では、モノマーは非共有結合により互いに結合する。
本発明の意味でのモノマー単位の共有結合又は結合は、ペプチドが頭−頭、尾−尾又は頭−頭で、それらの間にリンカー又はリンカー基を使用せずに互いに線状に結合する場合には存在する。
本発明の意味で、非共有結合は、モノマーがビオチン及びストレプトアビジン、特にストレプトアビジンテトラマーを介して互いに結合する場合には存在する。
モノマー単位が、それぞれリンカー無しに又はリンカー基を用いて頭−頭、尾−尾又は頭−尾で互いに線状に結合することにより共有結合を達成できる。
代替方法では、プラットフォーム分子上に木材のような骨格（デンドリマー）で結合することもでき、又はこれらの任意選択の組合せも可能である。この場合に、非同一のモノマー単位を組合せることができる。
ポリマーは、アミロイド−β−オリゴマーが、最大で１ｍＭ、有利には８００、６００、４００、２００、１００、１０μＭ、特に有利には１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０ｎＭ、特に有利には１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０ｐＭ、最も有利には最大で２０ｐＭの解離定数で結合することに特徴付けられる。
ポリマーは医薬品で使用するために適切である。
１実施態様では、これはアルツハイマー病の治療に使用できるポリマーである。もう１つの実施態様では、これはパーキンソン、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、スクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）又は糖尿病の治療に使用できるポリマーである。
自体がＡβ−オリゴマーに結合したモノマーから構成されたポリマーは、モノマーと比べてＡβ−オリゴマーに対するその選択性と親和性に関して著しい相乗効果を示す。言い換えると：本発明によるポリマーは、モノマーに対して勝っている。本発明の意味での相乗効果とは、Ａβ−オリゴマーに関してより高い選択性と親和性を示す効果であり、特にモノマー単体として又はその付加においてＡβ−オリゴマーへの結合に関するＫD値の効果である。
リンカーとは、共有結合によりモノマーに結合した１個又は複数の分子を意味すると解釈され、その際、このリンカーは互いに共有結合により結合していてもよい。
本発明のもう１つの代替方法では、リンカーによって、モノマーにより予め与えられたポリマーの特性、すなわち、Ａβ−オリゴマーの結合は変化しない。
もう１つの代替方法では、リンカーはモノマーにより予め与えられたポリマーの特性の変化に作用する。このような実施態様では、本発明によるポリマーの選択性及び／又は親和性は、Ａβ−オリゴマーに関して強くなる及び／又は解離定数が下がる。もう１つの実施態様では、リンカーは、これが特定の大きさのＡβ−オリゴマーだけに選択的に結合し、本発明によるポリマーの立体作用を変化させるように選択されるか又は構成できる。
本発明によるポリマーの立体作用のこのような変化は、本発明による分枝ポリマーの構成によって、特殊な構造のデンドリマーによって、もしくはモノマー及びプラットフォーム分子によるポリマーの相応する構造によって又はこれらの任意選択の組合せによっても達成できる。
本発明の更なる対象は、アルツハイマー病を決定するための組成物ならびにそれらの使用であり、その際、Ｄ−ペプチドは
ａ）アミロイドβペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分断片のｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ配列を含有し、かつ完全にＤ−アミノ酸から成る及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量体化ドメインに結合する及び／又は
ｃ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９の配列を含有するか又は有し、及び完全にＤ−アミノ酸から成る及び／又は
ｄ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９の配列を有するＤ−ペプチドを含有するか又は有し、その際、Ｄ−ペプチドは部分的にＬ−アミノ酸を含有する及び／又は
ｅ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９に相同な配列を含有するか又は有する。
“Ｄ−ペプチド”は、１変法ではアミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド部分断片に対するｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ配列から成り、かつ完全にＤ−アミノ酸から成る。
“部分断片”は、アミロイドβ−ペプチドのアミノ酸配列に相同な３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個又はそれ以上のアミノ酸から成る。
もう１つの変法では、Ｄ−ペプチドはアミロイドβ−ペプチドの多量体化ドメインに結合する。もう１つの変法では、Ｄ−ペプチドは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９の配列を有し、及び完全にＤ−アミノ酸から成る。もう１つの変法では、Ｄ−ペプチドは上記の配列のうち１つを有し、かつ部分的にＬ−アミノ酸を含有する。もう１つの変法では、Ｄ−ペプチドは上記配列に相同な配列を有する。“Ｄ−ペプチド”とは、Ｄ−型のアミノ酸から構成されるペプチドであると解釈される。
本発明のもう１つの変法では、Ｄ−ペプチドは部分的にＬ−アミノ酸も有する。“部分的”なＬ−アミノ酸とは、Ｄ−アミノ酸から成るＤ−ペプチドのアミノ酸配列に相同である１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のアミノ酸が、それぞれＬ−型の同じアミノ酸に置換されていることを意味する。
“Ｄ−ペプチド”とは、１変法では、アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分断片に対するｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ配列から成り、かつ完全にＤ−アミノ酸から成る。
“部分断片”は、アミロイドβ−ペプチドのアミノ酸配列に相同な３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個又はそれ以上のアミノ酸から成る。
もう１つの変法では、本発明によるＤ−ペプチドは、アミロイドβ−ペプチドの多量体化ドメインに結合する。もう１つの変法では、Ｄ−ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９の上記配列を有し、かつ完全にＤ−アミノ酸からなる。
本発明のもう１つの実施態様では、ペプチドは配列モチーフＤＢ４：ＲＰＲＴＲＬＲＴＨＱＮＲ（配列番号１）又はその活性断片を含む。
本発明のもう１つの実施態様では、ペプチドは配列モチーフＳＨＹＲＨＩＳＰ（配列番号３）又はその活性断片を含む。
本発明のもう１つの実施態様では、ペプチドは配列モチーフＧｌＳＷＱＱＳＨＨＬＶＡ（配列番号４）又はその活性断片を含む。
本発明のもう１つの実施態様では、ペプチドは配列モチーフＰＲＴＲＬＨＴＨ（配列番号５）又はその活性断片を含む。
もう１つの変法では、ペプチドはＤ−アミノ酸配列：
ａ）ＱＳＨＹＲＨＩＳＰＡＱＶ（配列番号６）；ｂ）ＱＳＨＹＲＨＩＳＰＤＱＶ（配列番号７）；ｃ）ＱＳＨＹＲＨＩＳＰＡＲ（配列番号８）；ｄ）ＫＳＨＹＲＨＩＳＰＡＫＶ（配列番号９）；ｅ）ＲＰＲＴＲＬＨＴＨＲＮＲ（配列番号１０）；ｉ）ＲＰＲＴＲＬＨＴＨＲＴＥ（配列番号１１）；及びｇ）ＫＰＲＴＲＬＨＴＨＲＮＲ（配列番号１２）；有利には、更に配列ａ）〜ｇ）のうち３個までのアミノ酸が異なる配列；ならびに配列ａ）〜ｇ）と配列ａ）〜ｇ）のうち３個までのアミノ酸が異なる配列を含んでいる配列を有するペプチドから成る群から選択される。
もう１つの変法では、ペプチドはＤ−アミノ酸配列：
Ｄ３Ｄ３：ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒ（配列番号１３）、ａＤ３ｎｗｎＤ３：ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒｎｗｎｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒ（配列番号１４）、二重−Ｄ３−遊離Ｎ末端：（ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒ）2−ＰＥＧ３（配列番号１５）、二重−Ｄ３−遊離Ｃ末端：ＰＥＧ５−（ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒ）2（配列番号１６）、又は二重−Ｄ３−遊離Ｎ末端：（ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒ）2−（配列番号６３）、二重−Ｄ３−遊離Ｃ末端：（ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒ）2（配列番号６４）、ＤＢ３：ｒｐｉｔｒｌｒｔｈｑｎｒ（配列番号６５）、ＲＤ２：ｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒ（配列番号６６）、ＲＤ１：ｐｎｈｈｒｒｒｒｒｒｔｌ（配列番号６７）、ＲＤ３：ｒｒｐｔｌｒｈｔｈｎｒｒ（配列番号６８）、Ｄ３−デルタ−ｈｔｈ：ｒｐｒｔｒｌｒｎｒ（配列番号６９）、ＮＴ−Ｄ３：ｒｐｒｔｒｌ（配列番号７０）、ＤＢ１：ｒｐｉｔｒｌｈｔｎｒｎｒ（配列番号７１）、ＤＢ２：ｒｐｉｔｔｌｑｔｈｑｎｒ（配列番号７２）、ＤＢ５：ｒｐｉｔｒｌｑｔｈｅｑｒ（配列番号７４）、Ｄ３−デルタ−ｈｔｈＤ３−デルタ−ｈｔｈ：ｒｐｒｔｒｌｒｎｒｒｐｒｔｒｌｒｎｒ（配列番号７５）、ＲＤ２−ＲＤ２：ｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒ（配列番号７６）、ＤＯ３：ｓｇｗｈｙｎｗｑｙｗｗｋ（配列番号７７）、ｒｐｒｔｒｓｇｗｈｙｎｗｑｙｗｗｋｒｎｒ（配列番号７８）及びｐｔｌｓｇｗｈｙｎｗｑｙｗｗｋｒｒｒｒｒ（配列番号７９）を有するペプチドから成る群から選択される。
上記配列から３個までのアミノ酸が異なる更なる配列が有利である；ならびに上記配列の個々のもの又は任意の組合せを含む配列も有利である。
もう１つの変法では、Ｄ−ペプチドは、上記配列の断片を有するか、又は上記配列に対する相同配列を有する。
本発明によれば、個体固有のタンパク質の病原性凝集体又はオリゴマーを定量化するための標準の定義付けられた均一かつ安定な調製物は、特に血液、血液生成物及び／又は器官の処置に使用可能である。ここで使用可能であるのは、タンパク質凝集疾患又はアミロイド変性又はタンパク質ミスフォールディング疾病に特徴付けられるオリゴマー又は病原性凝集体の定量化のための標準である。この場合に、ポリマーはポリペプチド配列から構成され、これはその配列に関して、個体固有のタンパク質との相応する部分領域中と同一であるか、又はタンパク質凝集疾患又はアミロイド変性又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴とする固体特有のタンパク質との相応する部分領域上に少なくとも５０％の相同性を有し、その際、ポリマーは凝集しない。
本発明の意味での標準とは、特徴及び／又は量の比較と決定に使用され、全ての有効かつ認容される確証された基準サイズであり、特に個体固有のタンパク質からの病原性凝集体の大きさと量の決定に使用される。本発明の意味での標準は、容器及び／又は測定のキャリブレーションに使用できる。
本発明の意味で、“タンパク質凝集疾患”という用語に、アミロイド変性及びタンパク質ミスフォールディング疾患を包含することもできる。このような疾患及びそれに関連する個体固有のタンパク質の例は次の通りである：ＡＤのＡβ−タンパク質及びタウ−タンパク質、パーキンソンのα−シンクレイン、糖尿病のアミリン又はプリオン病のプリオンタンパク質、例えば、ヒトクロイツフェルトヤコブ病（ＣＤＪ）、ヒツジ病スクレイピー及びウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）。
個体固有のタンパク質の“相応する部分領域”という用語は、本発明による定義によれば本発明による標準が構成されるモノマーのペプチド配列と同一であるか又は所定のパーセント数だけ相同なペプチド配列を有するものであると解釈される。
本発明による標準にとって重要なことは、標準が凝集しないこと、有利にはモノマー配列の使用により凝集しないことである。それというのも、個体固有のタンパク質の“相応する部分領域”は、凝集の原因ではなく、又は凝集の原因となる基を遮断することにより凝集しないからである。
本発明の意味での凝集体は、
− 複数の有利には互いに非共有結合により結合した同じ構成成分から成る粒子及び／又は
− 非共有結合により結合した複数のモノマー
である。
本発明の１実施態様では、標準は正確に定義付けられた数のエピトープを有し、これは相応するプローブの結合用に共有結合により（直接的に又はアミノ酸、スペーサー及び／又は官能基を介して）互いに結合する。本発明の意味でのプローブは、次のもの：抗体、ナノ体及びアフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）から成る群から選択される。
エピトープの数は、その配列に関して、それぞれ個体固有のタンパク質の部分領域と同一であるポリペプチド配列を使用することにより決定され、これはエピトープを形成するか、又はこの部分領域と少なくとも５０％の相同性を有し、かつその際にエピトープの生物活性を有する。
本発明のもう１つの実施態様では、エピトープとは、部分領域Ａβ１〜１１、Ａβ−３〜１１又はｐｙｒｏＧｌｕＡβ３〜１１から選択されるＡβ−ペプチドのエピトープ、例えば、ヒトＮ−末端エピトープ（以下の配列を有する：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥ（１〜１１）（配列番号：１７））である。
本発明による標準分子は、先に定義したポリペプチド−配列から成るポリマーである。本発明の意味でのオリゴマーとは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のモノマー（モノマーとは、上記のポリペプチド配列であると解釈される）から形成されるか、又はその数倍、有利には２〜１６、４〜１６、８〜１６個、特に有利には８又は１６個、又はその数倍から成るポリマーである。
本発明のもう１つの代替方法では、標準は水溶性である。
本発明のもう１つの代替方法では、標準は同じポリペプチド配列から構成される。
本発明のもう１つの代替方法では、標準は種々のポリペプチド配列から構成される。
本発明のもう１つの代替方法では、上記に定義したようなポリペプチド配列は線状の形態で繋ぎ合わされる。
本発明のもう１つの代替方法では、上記に定義したようなポリペプチド配列は、分枝状の本発明によるオリゴマーに繋ぎ合わされる。
本発明のもう１つの代替方法では、上記に定義したようなポリペプチド配列は、架橋した、本発明によるオリゴマーに繋ぎ合わされる。
分枝又は架橋した本発明によるオリゴマーは、個々の構成成分の結合により、リジンにより又はクリック−ケミストリーにより製造できる。
もう１つの代替方法では、本発明は部分領域Ａβ１〜１１、Ａβ３〜１１又はｐｙｒｏＧｌｕＡβ３〜１１から選択されるＡβ−ペプチドのアミノ末端部分のコピー、例えば、ヒトＮ−末端エピトープ（以下の配列を有する：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥ（１〜１１）（配列番号：１７））のコピーを含有するか、又は構成される標準分子に関する。
官能基によるエピトープの効力増強は、個々の構成成分の合成前又は後に実施できる。本発明による標準に特徴的であるのは、ポリペプチド配列の共有結合である。
本発明により使用されるべきポリペプチド配列は、Ａβ−全長−ペプチドの配列と同一であってもよいか、又はＡβ−全長−ペプチドの配列と５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の相同性を示す。
二者択一的に、本発明による標準分子の構成に、Ａβ−全長−ペプチドの部分領域と同一であるか、又はＡβ−全長−ペプチドの部分領域と５０、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の相同性を示すペプチド配列も使用される。
本発明により使用される配列にとって重要であるのは、その特性が凝集しない（又は条件によってのみ制御されて凝集する）及び／又はそのエピトープとしての活性である。
本発明のもう１つの実施態様では、標準はデンドリマーとして構成される。本発明によるデンドリマーは、上記の本発明により使用すべきポリペプチド配列から構成され、かつ中心の骨格分子を含有していてもよい。
本発明によるデンドリマーは、１変法ではＡβ−ペプチドの部分領域と同一であるか、又は相応する部分領域に少なくとも５０％の相同性を示す１つの配列を有するポリペプチド配列を含有する。
本発明によれば、少なくとも５０％の相同性という用語は、５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％から成る群から選択されるより高い相同性を意味すると解釈される。
個体固有のタンパク質からの病原性凝集体又はオリゴマーよりも有利には水溶液中でより高い溶解度を有する標準は、本発明の実施態様ではポリペプチド配列から形成され、これはＡβ−ペプチドのＮ−末端領域と同一であるか、又はそれに少なくとも５０％の相同性を有する。本発明によれば、Ａβ−ポリペプチドのＮ−末端領域とは、アミノ酸配列Ａβ１〜８、Ａβ１〜１１、Ａβ１〜１６、Ａβ３〜１１又はｐｙｒｏＧｌｕＡβ３〜１１を意味すると解釈される。
本発明により使用可能な標準分子は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の種々のプローブにエピトープを含有できる。
種々のプローブに特徴的なエピトープは、本発明による標準では、Ａβ−ペプチドの種々の領域と同一であるか、又はそれに少なくとも５０％の相同性を有するが、相応するエピトープの活性を有するポリペプチド配列を使用することにより組み込むことができる。
１実施態様では、このためにＡβ−ポリペプチドのＮ−末端領域と同一であるか、又は５０％の相同性を有するポリペプチド配列ならびにＡβ−ポリペプチドのＣ−末端と同一であるか、又は５０％の相同性を有するポリペプチド配列が使用される。
本発明の１実施態様では、標準分子はいわゆるスペーサーを含有する。
スペーサーとは、共有結合により標準分子中に組み込まれ、かつ特定の物理及び／又は化学的特性を有し、これにより標準分子の特性が変化する分子を意味すると解釈される。本発明による標準の１実施態様では、親水性又は疎水性、有利には親水性スペーサーが使用される。親水性スペーサーは、ポリエチレングリコール、糖、グリセリン、ポリ−Ｌ−リジン又はβ−アラニンから形成される分子の群から選択される。
本発明により使用可能な標準は、本発明の１つの代替方法では（更なる）官能基を含有する。
官能基とは、標準分子に共有結合により結合した分子であると解釈される。１変法では、官能基はビオチン基を含有する。これにより、ストレプトアビジンに強い共有結合が可能になる。このようにビオチン基を含有する標準分子は、ストレプトアビジン基を含有する分子に結合できる。本発明により使用可能な標準分子がビオチン及び／又はストレプトアビジン基を含有する場合には、より大きな標準を組み立てることができるか、又は場合によりより多くの種々の標準分子を骨格に結合できる。
本発明のもう１つの実施態様では、標準分子は、分光光度計により測定するための染料及び／又は芳香族アミノ酸を含有する。芳香族アミノ酸は、例えば、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンであるか又はこれらの群から選択される。トリプトファンの組み込みにより、溶液中での標準の濃度の分光光度計による測定が可能になる。
本発明の更なる対象は、その配列に関して個体固有のタンパク質との相応する部分領域中と同一であるか、又は個体固有のタンパク質との相応する部分領域上に少なくとも５０％の相同性を有するポリペプチド含有デンドリマーの使用であり、これはタンパク質凝集疾患に特徴付けられる。
デンドリマーは、標準の上記のそれぞれの特徴又はその任意の組合せを含有できる。
本発明のもう１つの代替方法では、プローブの共有結合のために正確に定義付けられた数のエピトープを含有するデンドリマーは、Ａβ−ペプチドのエピトープを含有するデンドリマーである。
アミロイド−β−オリゴマーについて血液、血液生成物及び／又は器官を試験するために標準を使用でき、タンパク質凝集疾患又はアミロイド変性又はタンパク質ミスフォールディング疾患に特徴付けられる個体固有のタンパク質からの病原性凝集体又はオリゴマーの定量化には、その配列に関して、個体固有のタンパク質との相応する部分領域中と同一であるか又はタンパク質凝集疾患又はアミロイド変性又はタンパク質ミスフォールディング疾患に特徴付けられる個体固有のタンパク質との相応する部分領域上に少なくとも５０％の相同性を有するポリペプチド配列からポリマーが構成され、その際、ポリマーは凝集しないことに特徴付けられる。
標準はプローブを結合するために、共有結合で互いに結合した正確に定義付けられた数のエピトープを有することができる。
標準は、Ａβ−ペプチドのエピトープ及び／又は本発明による配列を含有できる。
アミロイド−β−オリゴマーにおいて血液、血液生成物及び／又は器官を試験するために、以下の方法もＡβ−凝集体の選択的定量化に使用できる：
方法は、基質上でのＡβ−捕捉分子の固定化、基質上への試験すべきプローブの塗布、検出に特徴付けられたプローブを付加し、Ａβ−凝集体への特異的結合により、これがマークされ、かつマークされた凝集体を検出することを含む。
Ａβ−凝集体を選択的に定量化及び／又は特徴付けるこの方法は、以下の工程：
ａ）基質上に試験すべきプロープを塗布する、
ｂ）検出のために特徴付けられたプローブを付加し、Ａβ−凝集体への特異的結合によりこれがマークされ、かつ
ｃ）マークされた凝集体を検出する
を含み、その際、工程ｂ）は工程ａ）の前に実施できる。
病個体固有のタンパク質からの原性凝集体又はオリゴマーの正確かつ定量的な測定を可能にする標準も提供される。標準は、内部又は外部標準として使用可能である。
更に、正確に定義づけられた均一かつ安定な標準の調製は、個体固有のタンパク質からの病原性凝集体又はオリゴマーの定量化のために使用できる。
タンパク質凝集疾患又はアミロイド変性又はタンパク質ミスフォールディング疾患に特徴付けられるオリゴマー又は病原性凝集体を定量化するための標準は、その配列に関して、個体固有のタンパク質との相応する部分領域中で同一であるか、又は個体固有のタンパク質との相応する部分領域上に少なくとも５０％の相同性を有するポリペプチド配列からポリマーが構成され、その際、ポリマーは凝集しないことに特徴付けられる。
標準は、これがプローブの結合のために互いに共有結合により結合した正確に定義付けられた数のエピトープを有することに特徴付けられる。
更に標準は、Ａβ−ペプチドのエピトープ及び／又は本発明による配列を含有することに特徴付けられてもよい。
本発明によれば、標準は捕捉分子として使用される。１つの代替方法では、血液、血液生成物及び／又は器官中のアミロイド−β−オリゴマーを除去及び／又は解毒するために標準は使用される。
もう１つの他の実施態様では、本発明は本発明による標準及び／又は配列を含むキットに関する。本発明のキットの化合物及び／又は成分を容器中で場合によりバッファー及び／又は溶液と一緒に／中にパッケージングすることができる。二者択一的に、幾つかの成分を同じ容器中にパッケージングできる。これに加えて、又はその代わりに固体担体、例えばガラス板、チップ又はナイロン膜に又はマイクロタイタープレートのウェルに１つ又は複数の成分が吸収される。
更に、キットは任意の実施態様用にキットを使用するための指示書を含有できる。
本発明の対象は、記載された方法によりＡβ−凝集体を選択的に定量化するためのキットである。このようなキットは、以下の１つ又は複数の成分を含有できる：
−疎水性材料で被覆されたガラスから成る基質
−標準
−捕捉分子
−プローブ
−捕捉分子を有する基質
−溶液
−バッファー。
本発明のキットの化合物及び／又は成分を容器中で場合によりバッファー及び／又は溶液と一緒に／中にパッケージングできる。二者択一的に、幾つかの成分を同じ容器中にパッケージングできる。これに加えて、又はその代わりに、１つ又は複数の成分は、固体担体、例えば、ガラス板、チップ又はナイロン膜に、又はマイクロタイタープレートのウェルに吸収できる。更に、キットは任意の実施態様用にキットを使用するための指示書を含有できる。
キットのもう１つの変法では、基質上に上記捕捉分子を固定させる。更に、キットは溶液及び／又はバッファーを含有できる。デキストラン表面及び／又はその上に固定された捕捉分子を保護するために、これを溶液又はバッファーで上塗りすることができる。
キットは、タンパク質凝集疾患のある個体固有のタンパク質からの病原性凝集体又はオリゴマーを定量化するために、少なくとも１つの標準又は少なくとも１つのデンドリマーを含有できる。
本発明によりアミロイド−β−オリゴマーを除去及び／又は解毒するために、血液、血液生成物及び／又は器官を処置（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）する方法で使用可能であるポリマー、Ｄ−ペプチド、抗体及び／又は化合物は以下に示されている。
Figure 0006619394
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本発明によりアミロイド−β−オリゴマーを除去及び／又は解毒するために、血液、血液生成物及び／又は器官を処置する方法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で使用可能である抗体は、以下に定義されている：
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分断片のｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ配列に結合する及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量体化ドメインに結合する及びまたアミロイドβ−ペプチドにも結合する及び／又は
ｃ）次の群：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９の配列又はそれらの相同配列；から選択される上記の本発明による配列のうち１つに結合する抗体。
本発明によりアミロイド−β−オリゴマーを除去及び／又は解毒するために、血液、血液生成物及び／又は器官を処置する方法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で使用可能であるハイブリッド化合物は、以下に定義付けられる：
式Ａ−Ｂのハイブリッド化合物（ここで、Ａはアミノピラゾール又はその誘導体であり、及びＢはペプチドである）及びＡとＢは、直接的に又はリンカーにより共有結合により互いに結合する。
ＢがＤ−ペプチドであることに特徴付けられるハイブリッド化合物は、Ｄ−ペプチドが本発明による上記配列から選択されることに特徴付けられる。
式Ａ−Ｂのハイブリッド化合物は、Ａが次のものから成る化合物の群：３−アミノピラゾール−５−カルボン酸、複素環式ＣＨ−基が−ＣＲ−又は−Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓ−に置換されているそれらの誘導体、３−アミノピラゾール−５−カルボン酸−ダイマーならびに−トリマー又は−テトラマーから選択され、
Ｂが、次のもの：Ｄ３−ペプチド、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９から成る化合物の群から選択され、
リンカーが、次のもの：リンカー無し、ＧＡＢＡ、ＴＥＧ、ＴＥＧ−ダイマー、ＰＥＧ、α−アミノ酸、α−アミノ−オメガ−カルボン酸から成る化合物の群から選択されることに特徴付けられる。
本発明による方法により、病原性粒子、アミロイド−βオリゴマーが除去及び／又は解毒される、すなわち、害にならない形に変換されるか又は分解される。従って、病原性（アミロイド形成性）粒子の滞留及び増大による更なる感染が回避される。この場合に、本発明により使用すべき化合物により引き起こされる相乗効果が生じる。従って、特にアミロイド−β−ペプチド（−オリゴマー）からの共凝集体及び本発明により使用すべき化合物は、無害な形として、Ａβ−凝集体の更なる形成又は新規形成を後から阻止又は減少させる。
本発明による方法は、従来技術から公知の方法よりも信頼ができる。それというのも、病原性、毒性及び／又は感染性粒子の完全に徹底的な除去を行わなくても良いからである。無害な形への変換により解毒が行われ、むしろより遅い感染、すなわち、Ａβ−凝集体の形成を阻止又は減少させることができる。
インヒビター物質の添加無しに生じる予備形成されたＡβ−凝集体の不在（実線）及び存在でのＴｈＴ蛍光の時間経過を示す図である。 試験開始前にインヒビター物質Ｄ３の添加下に生じる予備形成されたＡβ−凝集体の不在（実線）及び存在でのＴｈＴ蛍光の時間経過を示す図である。 試験開始前にインヒビター物質ＤＢ１の添加下に生じる予備形成されたＡβ−凝集体の不在（実線）及び存在でのＴｈＴ蛍光の時間経過を示す図である。 試験開始前にインヒビター物質ＤＢ２の添加下に生じる予備形成されたＡβ−凝集体の不在（実線）及び存在でのＴｈＴ蛍光の時間経過を示す図である。 試験開始前にインヒビター物質ＤＢ３の添加下に生じる予備形成されたＡβ−凝集体の不在（実線）及び存在でのＴｈＴ蛍光の時間経過を示す図である。 試験開始前にインヒビター物質ＤＢ４の添加下に生じる予備形成されたＡβ−凝集体の不在（実線）及び存在でのＴｈＴ蛍光の時間経過を示す図である。 試験開始前にインヒビター物質ＤＢ５の添加下に生じる予備形成されたＡβ−凝集体の不在（実線）及び存在でのＴｈＴ蛍光の時間経過を示す図である。
実施例：
１．ＴｈＴ−シーディングアッセイ：基礎
アミロイド形成性ペプチドは、アミロイド繊維を形成する能力がある。これは確かな見込みで自発的に行うことができる。アミロイド“シード”が何も存在しないの場合には、初めのアミロイドフィブリルが形成されるまで若干の時間持続でき、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）の蛍光を用いたそれらの形成と増大を定量的に追跡できる。ＴｈＴは、Ａβフィブリルと一緒に取り入れられ、かつフィブリル染料−複合体は、高い蛍光（λem：４５０ｎｍ、λex：４９０ｎｍ）を示した。ＴｈＴシグナルが増大し始めるまでの時間は、“ｌａｇフェーズ”と称される。アミロイド“シード”（また“ｓｅｅｄｓ”とも称する）を凝集沈殿物に添加する場合には、“ｌａｇフェーズ”が回避されるか、又は著しく短くなる。公知の１例は、モノマーリコンビナントプリオンタンパク質の溶液へのプリオン−含有の脳材料の添加であり、それに基づいて著しく短くなった“ｌａｇ ｐｈａｓｅ”でＴｈＴ−陽性フィブリルが形成される。もう１つの例は、凝集していないＡβ−ペプチド（Ａβ）の溶液への少量のＡβ−アミロイド−フィブリルの添加から成る。この場合にも、ＴｈＴ−陽性Ａβ−フィブリルを形成するための“ｌａｇ ｐｈａｓｅ”は著しく短くなる。これにより、この試験（“ＴｈＴ−シーディングアッセイと称する”）は、任意の物質又は物質混合物をシード能力のあるアミロイドのその含有量に関して試験できるようになる。凝集沈殿物に添加される物質混合物が“シード能力のある”アミロイドを含有する場合には、これは“ｌａｇ ｐｈａｓｅ”の不足又は短縮に効果を生じる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのこの特性は、しばしばプリオンに似た感染力と類似しているか、又はｉｎ ｖｉｖｏでの伝染をもたらす。
第一のコントロール試験では、予備形成されたＡβ−凝集体が、凝集シードとして新たに解けたＡβの凝集の“ｌａｇ ｐｈａｓｅ”を事実上短くするのかどうかが試験された。このために、予備形成されたＡβ−凝集体の不在又は存在での新たに解けたＡβのＴｈＴ蛍光が追跡される。引き続き、Ａβ−凝集体が形成され、これはＡβ（１〜４２）と、アミロイドフィブリルの形成を妨げるべき阻害物質（この例では、それぞれＤ−ペプチドＤ３、ＤＢ１、ＤＢ２、ＤＢ３、ＤＢ４、ＤＢ５のうち１つ）から成る混合物から形成されたものである。このように形成されたＡβ−インヒビター共凝集体をアミロイドＡβ−凝集体と全く同様にＴｈＴ−シーディングアッセイに加え、この共凝集体の残ったアミロイドポテンシャルを測定した。
２．ＴｈＴ−シーディングアッセイ：実験の詳細
Ａβ−ペプチド（１〜４２）２０μＭをインヒビター物質（２０μＭ）と一緒に１０ｍＭ ＮａＰｉ（ｐＨ７．４）中、３７℃で７日間予備インキュベートした。引き続き、プローブを遠心分離（２０分、１６１００×ｇ）し、凝集体ペレットを３回洗浄し、及び１０ｍＭ ＮａＰｉ（ｐＨ７．４）中で再懸濁した。同様に、インヒビター無しのＡβ−フィブリルを陽性コントロールとして製造した。事実上のＴｈＴ−シーディングアッセイの直前に、新たなＡβ（１０ｍＭ ＮａＰｉ（ｐＨ７．４）中２０μＭ）を、インヒビター物質の存在又は不在で生じた再懸濁した凝集シードと混合し（８０：２０体積部）、かつ１０μＭ ＴｈＴをこれに加えた。凝集シード無しのバッファー溶液と混合（８０：２０体積部）しておき、かつ１０μＭ ＴｈＴを含有した新たなＡβ−溶液を参照物として使用した。それぞれの反応溶液５０μｌを黒い３８４−ウェル−マイクロタイタープレートのウェルにピペッティングした。ＴｈＴ蛍光は、全て３０分間ずつ２０時間にわたり４４０ｎｍの励起波長及び４９０ｎｍの発光波長で測定した。評価のために、蛍光強度は２０％の引き算により添加した凝集シードを修正し、及び平均値を計算した。８回測定を実施した。
３．実施：
図１は、インヒビター物質の添加無しに生じる予備形成されたＡβ−凝集体の不在（実線）及び存在でのＴｈＴ蛍光の時間経過を示している。この凝集体は、新たなＡβの凝集を著しく促進したことが明らかであり（約４時間のΔｔ）、すなわち、明白なシーディング効果を示している。
図２は、試験開始前にインヒビター物質Ｄ３の添加下に生じる予備形成されたＡβ−凝集体の不在（実線）及び存在でのＴｈＴ蛍光の時間経過を示している。この凝集体は、新たなＡβの凝集を促進できなかったことが明らかである。すなわち、明白なシーディング効果は何も示されていない。
図３は、試験開始前にインヒビター物質ＤＢ１の添加下に生じる予備形成されたＡβ−凝集体の不在（実線）及び存在でのＴｈＴ蛍光の時間経過を示している。この凝集体は、新たなＡβの凝集を促進できなかったことが明らかである。すなわち、明白なシーディング効果は何も示されていない。
図４は、試験開始前にインヒビター物質ＤＢ２の添加下に生じる予備形成されたＡβ−凝集体の不在（実線）及び存在でのＴｈＴ蛍光の時間経過を示している。この凝集体は、新たなＡβの凝集を促進できなかったことが明らかである。すなわち、明白なシーディング効果は何も示されていない。
図５は、試験開始前にインヒビター物質ＤＢ３の添加下に生じる予備形成されたＡβ−凝集体の不在（実線）及び存在でのＴｈＴ蛍光の時間経過を示している。この凝集体は、新たなＡβの凝集を促進できなかったことが明らかである。すなわち、明白なシーディング効果は何も示されていない。
図６は、試験開始前にインヒビター物質ＤＢ４の添加下に生じる予備形成されたＡβ−凝集体の不在（実線）及び存在でのＴｈＴ蛍光の時間経過を示している。この凝集体は、新たなＡβの凝集を促進できなかったことが明らかである。すなわち、明白なシーディング効果は何も示されていない。むしろＤＢ４−Ａβ−凝集体はＴｈＴ−陽性Ａβ−凝集体の形成をより遅いフェーズで減少したように見える。
図７は、試験開始前にインヒビター物質ＤＢ５の添加下に生じる予備形成されたＡβ−凝集体の不在（実線）及び存在でのＴｈＴ蛍光の時間経過を示している。この凝集体は、新たなＡβの凝集を促進できなかったことが明らかである。すなわち、明白なシーディング効果は何も示されていない。
４．結果のまとめ：
Ａβ凝集体と一緒に形成された試験した全てのＤ−ペプチドは、新たに溶解したＡβの凝集の“ｌａｇ ｐｈａｓｅ”を短くできなかった。すなわち、これら共凝集体は、アミロイド形成性ではない。

Claims (13)

  1. ヒト又は動物の体から取り出された血液、血液生成物及び／又は器官と接触させることで、前記血液、血液生成物及び／又は器官からアミロイド−β−オリゴマーを除去及び／又は解毒するための医薬製剤を製造するための方法において、
    以下ａ）−ｅ）の群；
    ａ）ｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒ（ＲＤ２；配列番号６６）又はその相同体、ここで相同体は、前記配列番号６６により表されたペプチドと同等のアミロイド−β−オリゴマーに対する結合活性を有し、かつ、前記配列番号６６の配列と少なくとも８３％の配列同一性を有する；
    ｂ）ｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒ（ＲＤ２−ＲＤ２；配列番号７６）又はその相同体、ここで相同体は、前記配列番号７６により表されたペプチドと同等のアミロイド−β−オリゴマーに対する結合活性を有し、かつ、前記配列番号７６の配列と少なくとも８３％の配列同一性を有する；
    ｃ）前記ａ）および／またはｂ）のポリペプチド配列から成るポリマーである、標準分子；
    ｄ）前記ａ）の少なくとも１個のモノマーを含有するダイマー、ポリマー及び／又はマルチマー；
    ｅ）前記ａ）の少なくとも１個のモノマーと、以下ｉ）−ｉｉｉ）の群から選択される１個のモノマーを含有するダイマー、ポリマー及び／又はマルチマー；
    から選択された１つ又は複数の化合物を、アミロイド−β−オリゴマーに対して高い親和性を有する物質として選択する工程を含み、
    ここで、ｉ）−ｉｉｉ）の群は以下のとおりである；
    ｉ）式Ａ−Ｂのハイブリッド化合物、ここでＡはアミノピラゾールであり、Ｂは次の群：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、及び配列番号７９から選択されるペプチドであり、かつＡとＢは、直接に又はリンカーにより互いに共有結合により結合している；
    ｉｉ）ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒ（Ｄ３Ｄ３：配列番号１３）、ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒｎｗｎｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒ（Ｄ３ｎｗｎＤ３：配列番号１４）、（ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒ）2−ＰＥＧ３（二重−Ｄ３−遊離Ｎ末端：配列番号１５）、ＰＥＧ５−（ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒ）2（二重−Ｄ３−遊離Ｃ末端、配列番号１６）、二重−Ｄ３−遊離Ｎ末端：（ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒ）2−（配列番号６３）、二重−Ｄ３−遊離Ｃ末端：（ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒ）2（配列番号６４）、ＤＢ３：ｒｐｉｔｒｌｒｔｈｑｎｒ（配列番号６５）、ＲＤ２：ｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒ（配列番号６６）、ＲＤ１：ｐｎｈｈｒｒｒｒｒｒｔｌ（配列番号６７）、ＲＤ３：ｒｒｐｔｌｒｈｔｈｎｒｒ（配列番号６８）、Ｄ３−デルタ−ｈｔｈ：ｒｐｒｔｒｌｒｎｒ（配列番号６９）、ＮＴ−Ｄ３：ｒｐｒｔｒｌ（配列番号７０）、ＤＢ１：ｒｐｉｔｒｌｈｔｎｒｎｒ（配列番号７１）、ＤＢ２：ｒｐｉｔｔｌｑｔｈｑｎｒ（配列番号７２）、ＤＢ５：ｒｐｉｔｒｌｑｔｈｅｑｒ（配列番号７４）、Ｄ３−デルタ−ｈｔｈＤ３−デルタ−ｈｔｈ：ｒｐｒｔｒｌｒｎｒｒｐｒｔｒｌｒｎｒ（配列番号７５）、ＲＤ２−ＲＤ２：ｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒ（配列番号７６）、
    ＤＯ３：ｓｇｗｈｙｎｗｑｙｗｗｋ（配列番号７７）、ｒｐｒｔｒｓｇｗｈｙｎｗｑｙｗｗｋｒｎｒ（配列番号７８）及びｐｔｌｓｇｗｈｙｎｗｑｙｗｗｋｒｒｒｒｒ（配列番号７９）、およびこれらの相同体、ここで相同体は、前記配列番号により表されたペプチドと同等のアミロイド−β−オリゴマーに対する結合活性を有し、かつ、前記配列の一つと少なくとも８３％の配列同一性を有するものである；
    ｉｉｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号７３およびこれらの相同体；ここで相同体は、前記配列番号により表されたペプチドと同等のアミロイド−β−オリゴマーに対する結合活性を有し、かつ、前記配列の一つと少なくとも８３％の配列同一性を有するものである；前記方法。
  2. 前記１つ又は複数の化合物を、捕捉分子として担体上に設置する工程を含み、ここで、前記担体を介して血液、血液生成物及び／又は器官を含有する試料が誘導される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記捕捉分子をビーズ上に固定する工程を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記捕捉分子をナノ磁石上に固定する工程を含む、請求項２に記載の方法。
  5. 前記捕捉分子を透析系に設置する工程を含む、請求項２に記載の方法。
  6. 前記捕捉分子用の担体は、生物相溶性材料から成る、請求項２に記載の方法。
  7. 前記捕捉分子用の担体は、膜、フィルター、フィルタースポンジ、ビーズ、スティック、ロープ、柱状物、中空繊維の１つ又は複数から選択される、請求項２に記載の方法。
  8. 前記医薬製剤が、Ａβ−凝集体を選択的に定量化するため、かつ／又は血液、血液生成物及び／又は器官を処置する（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ための以下の１つ又は複数の成分：
    ・疎水性材料で被覆されたガラスから成る基質
    ・標準
    ・捕捉分子
    ・プローブ
    ・捕捉分子を有する基質
    ・１つ又は複数の溶液
    ・バッファー
    を更に有する、請求項１に記載の方法。
  9. 前記医薬製剤が、血液、血液生成物及び／又は器官からアミロイド−β−オリゴマーを除去するための医薬製剤である、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記医薬製剤が、血液、血液生成物及び／又は器官中に存在するＡβ−オリゴマーを解毒するための医薬製剤である、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記１つ又は複数の化合物が、式Ａ−Ｂの１つまたはそれ以上のハイブリッド化合物をさらに含み、ここでＡはアミノピラゾールであり、かつ、Ｂは次の群：配列番号１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５及び配列番号７６から選択されるペプチドであり、かつＡとＢは、直接に又はリンカーにより互いに共有結合により結合している、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記１つ又は複数の化合物が更に、１つ又は複数のリンカーを含む、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記１つ又は複数の化合物が更に、１つまたはそれ以上の他のアミノ酸、スペーサーおよび／または官能基を含有する、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法。
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