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Die Erfindung betrifft Mittel zur Behandlung der Alzheimerschen Demenz.
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Die Alzheimersche Demenz (AD) ist die häufigste Demenzform und betrifft heute mehr als 60% der geschätzten 24 Millionen demenzkranken Menschen weltweit. Pathologisches Hauptmerkmal der AD ist die Bildung von senilen oder amyloiden Plaques, bestehend aus dem Aβ-Peptid, und neurofibrillären Ablagerungen aus dem Tau-Protein. Das Aβ-Peptid entsteht durch die Aktivitäten mindestens zweier verschiedener Proteasen aus einem Vorläuferprotein, dem „Amyloid Precursor Protein” (APP). Dieses ist in der Zellwand von Neuronen lokalisiert. Bei dem proteolytischen Abbau von APP und durch nachträgliche Modifikation entstehen Aβ-Fragmente unterschiedlicher Länge und Art. Die Amyloid-Kaskadenhypothese wurde in den 90 er Jahren aufgestellt und postuliert, dass die Ablagerung von Aβ in Form von Plaques Auslöser der Krankheitssymptome ist. Frei diffundierbare Aβ-Oligomere sind toxischer als die in den Plaques abgelagerten Aβ-Fibrillen. Neuen Arbeiten zufolge können die Plaques als Reservoir für oligomeres Aβ angesehen werden, welches mit der Zerstörung von Synapsen und Neuronen kolokalisiert.
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Aggregierendes, intraneuronales Aβ (Aβi) gilt als signifikanter Faktor der frühen AD Pathogenese. Ob Aβi, welches zum Großteil aus Aβ1–42 besteht, nicht sekretiertes Aβ oder reinternalisiertes Aβ ist, konnte noch nicht abschließend geklärt werden. Es häufen sich jedoch die Hinweise für die zweite Möglichkeit.
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Bisher können nur die Symptome der AD behandelt werden. Es sind keine zugelassenen Medikamente bekannt, die die Krankheitprozesse aufhalten oder rückgängig machen können. Die meisten der Substanzen, die für die Therapie der AD erforscht werden, fokussieren auf extrazelluläres Aβ, dabei aber nicht gezielt auf lösliche Aβ-Oligomere. Um den Krankeitsprozess in frühen Stadien aufhalten zu können, wäre aber genau das wünschenswert.
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Im
Europäischen Patent 1379 546 B1 wird beschrieben, dass verschiedene D-enantiomere Peptide an das β-Amyloid-Peptid binden und daher möglicherweise geeignet sind, die Alzheimersche Demenz zu therapieren. Insbesondere das in der Schrift offenbarte Peptid nach Anspruch 3 Alternative e), auch als D3 Peptid bezeichnet, moduliert die Aβ-Aggregation. Das D3 Peptid interagiert mit löslichen Aβ-Oligomeren. Surface-Plasmonen-Resonanz Studien weisen darauf hin, dass D3 bevorzugt lösliche Aβ-Oligomere bindet. Im transgenen APP Mausmodell reduziert D3 die Zahl der senilen Plaques im Gehirn und die assoziierten entzündlichen Prozesse.
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Bisher gibt es nur palliative Therapien der Alzheimerschen Demenz. Die Ursachen können bisher nicht behandelt werden, obgleich mit Hochdruck an unterschiedlichsten Therapiemöglichkeiten geforscht wird. Häufig steht hierbei die Verhinderung der Aβ-Aggregation im Fokus, z. B. durch Substanzen, die an Aβ binden und so eine (weitere) Aggregation unmöglich machen.
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Es werden Substanzen benötigt, die i) toxische, lösliche Aβ-Oligomere in vivo reduzieren und ii) die nicht nur außerhalb, sondern auch innerhalb von Neuronen wirksam sind.
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Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, Mittel zu Verfügung zu stellen, die eine bessere therapeutische Behandlung der Alzheimerschen Demenz ermöglichen.
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Überraschenderweise wird die Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass Mittel nach den Ansprüchen 1 bis 15 zur Verfügung gestellt werden. Weiterhin wird ein Verfahren zur Therapie der Alzheimerschen Demenz nach Anspruch 16 zur Verfügung gestellt.
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Im Folgenden werden die im Sequenzprotokoll gelisteten Sequenzen definiert.
Sequenz Nr. 1: L3 Peptid, welches erfindungsgemäß an Aβ-Oligomere anbindet.
Sequenz Nr. 2: Beispielhaft aufgeführtes erfindungsgemäßes Peptid, welche die Sequenz Nr. 1 umfasst, jedoch zusätzlich einen Sequenzabschnitt umfasst, der bewirkt, dass eine Sekretion durch eine Zellmembran stattfindet.
Sequenz Nr. 3: DNA-Sequenz, die für das Peptid Nr. 1 kodiert.
Sequenz Nr. 4: DNA-Sequenz, die für das Peptid Nr. 2 kodiert.
Sequenz Nr. 5: Sequenz, die für einen Vektor kodiert, der die Sequenz Nr. 3 enthält und für eine Struktureinheit kodiert, die fluoresziert.
Sequenz Nr. 6: Sequenz, die für einen Vektor kodiert, der die Sequenz Nr. 4 enthält und für eine Struktureinheit kodiert, die fluoresziert.
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Die erfindungsgemäßen Peptide sind bevorzugt L-Enantiomere. Die für sie kodierenden DNA-Sequenzen und Vektoren kodieren vorzugsweise ebenfalls für L-Enantiomere. Erfindungsgemäß bindet das Peptid nach Sequenz Nr. 1 an das Aβ-Peptid, insbesondere an Aβ-Oligomere an. Es ist daher ein Arzneimittel zur Behandlung der Alzheimerschen Demenz. Das Arzneimittel zur Behandlung der Alzheimerschen Demenz kann daher aus dem Peptid nach Sequenz Nr. 1 oder einem Stoff bestehen, der das Peptid nach Sequenz Nr. 1 enthält. Das Peptid nach Sequenz Nr. 1 hat bessere Bindeeigenschaften an das Aβ-Peptid als das Peptid D3. Es ermöglicht eine intra- und extrazelluläre Anwendung zur Behandlung der Alzheimerschen Demenz.
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Das Peptid nach Sequenz Nr. 1 kann synthetisch hergestellt werden, beispielsweise durch eine Merryfield-Synthese, und Expression einer für Sequenz 1 kodierende DNA.
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Das Peptid nach Sequenz Nr. 1 kann weiterhin für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Alzheimerschen Demenz verwendet werden.
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Das Peptid nach Sequenz Nr. 1 bindet sowohl intrazellulär, als auch extrazellulär an Aβ-Oligomere an. Damit kann die Alzheimersche Demenz sowohl durch intrazelluläre als auch durch extrazelluläre Wirkung behandelt werden.
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In einer Weiterbildung der Erfindung wird ein Protein zur Verfügung gestellt, welches einen Sequenzabschnitt nach Sequenz Nr. 1 enthält, der jedoch einen Sequenzabschnitt umfasst, der für die Funktion kodiert, dass das Peptid sekretionsfähig ist, also durch eine Zellmembran hindurch treten kann. Diese Proteine können aus der Zelle exportiert werden. Das Peptid nach Sequenz Nr. 1 hat bessere Bindeeigenschaften an Aβ als das Peptid D3. Es ermöglicht eine intra- und extrazelluläre Behandlung der Alzheimerschen Demenz.
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Die eine Sekretion bewirkenden Sequenzabschnitte sind dem Fachmann bekannt. Beispielhaft kann für ein sekretionsfähiges Peptid ein Peptid nach Sequenz Nr. 2 angegeben werden, das die genannten Eigenschaften hat. Vorzugsweise wird ein die Sekretion bewirkender Sequenzabschnitt verwendet, der humanen Ursprungs ist oder der mit einer humanen Sequenz identisch ist. Dies hat den Vorteil, dass bei der Behandlung des Menschen eine unerwünschte Immunantwort gegen den Sekretionsabschnitt verhindert oder unterdrückt werden kann.
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Die sekretionsfähigen Peptide, enthaltend einen Sequenzabschnitt nach Sequenz Nr. 1, bewirken, dass sie durch Zellmembranen treten können und dadurch auch einen Wirkort aufweisen, der sich jenseits der Zellmembran befindet.
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Die sekretionsfähigen Peptide sind ebenfalls durch eine Merryfieldsynthese oder durch Expression der entsprechenden DNA herstellbar. Diese sekretionsfähigen Peptide sind Arzneimittel. Weiterhin können sie zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Alzheimerschen Demenz verwendet werden. Die sekretionsfähigen Peptide können intrazellulär oder extrazellulär eingesetzt werden.
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Die erfindungsgemäßen Peptide nach den Sequenzen Nr. 1 und Nr. 2 sowie weitere sekretionsfähige Peptide, die Sequenzanteile nach Sequenz 1 enthalten, binden an das monomere, oligomere aber auch das fibrilläre oder plaqueartige Aβ-Peptid. Besonders gut binden die erfindungsgemäßen Peptide an lösliche, oligomere Aβ-Peptide. Eine besonders große Wirkung wurde bei Aβ-Peptiden der Strukturlänge Aβ1–42 beobachtet.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird eine DNA zur Verfügung gestellt, welche für ein Peptid nach Sequenz Nr. 1 kodiert.
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Die DNA kann intrazellulär exprimiert werden, so dass ein Peptid nach Sequenz Nr. 1 entsteht, das zur Behandlung der Alzheimerschen Demenz geeignet ist. Diese DNA ist daher für die Gentherapie geeignet. Die für ein Peptid nach Sequenz 1 kodierende DNA ist ein Arzneimittel, das insbesondere zur Behandlung der Alzheimerschen Demenz eingesetzt werden kann. Sie kann weiterhin zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Alzheimerschen Demenz verwendet werden.
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Beispielhaft wird eine DNA nach Sequenz Nr. 3 zur Verfügung gestellt.
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In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform wird eine DNA zur Verfügung gestellt, welche für ein Peptid kodiert, das Sequenz Nr. 1 enthält, die einen Sequenzabschnitt umfasst, der funktionell für eine Sekretionsfähigkeit des Peptids kodiert. Auch diese DNA kann intrazellulär exprimiert werden, so dass ein Peptid nach Sequenz Nr. 2 entsteht, welches sekretionsfähig ist und einen Abschnitt nach Sequenz Nr. 1 enthält, das zur Behandlung der Alzheimerschen Demenz geeignet ist. Diese DNA ist daher für die Gentherapie geeignet. Vorzugsweise kodiert der für die Sekretion verantwortliche Abschnitt der DNA für eine humane Sekretionssequenz. Die für ein solches Peptid kodierende DNA ist ein Arzneimittel, das insbesondere zur Behandlung der Alzheimerschen Demenz eingesetzt werden kann. Sie kann weiterhin zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Alzheimerschen Demenz verwendet werden.
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Beispielhaft wird eine DNA gemäß Sequenz Nr. 4 bereitgestellt.
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In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung werden Vektoren zu Verfügung gestellt, welche einen DNA-Abschnitt enthalten, der für ein Protein nach Sequenz Nr. 1 kodiert. Die Vektoren können auch einen DNA-Abschnitt, kodierend für ein Protein nach Sequenz Nr. 1 enthalten, die eine DNA-Sequenz umfasst, die funktionell eine Sekretion des exprimierten DNA Abschnitts bzw. Proteins bewirkt. Mit den Vektoren können Peptide nach Sequenz Nr. 1 sowie sekretionsfähige Derivate davon, wie Peptide nach Sequenz Nr. 2, intrazellulär exprimiert werden. Die Vektoren können Abschnitte enthalten, die funktionell für fluoreszierende Strukturanteile kodieren. Beispielhaft können Vektoren nach den Sequenzen 5 oder 6 bereitgestellt werden.
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Die erfindungsgemäßen Vektoren können ausgehend von käuflichen Vektoren mit den dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt werden. Sie sind Arzneimittel insbesondere zur Behandlung der Alzheimerschen Demenz und können zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Alzheimerschen Demenz verwendet werden. Besonders geeignet sind virale Vektoren, da sie für die Gentherapie am Menschen aber auch anderen Lebewesen, wie Tieren, besonders gut eingesetzt werden können.
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Für eine Gentherapie können die für ein Peptid nach Sequenz Nr. 1 kodierenden Desoxyribonukleinsäuren, die für ein Peptid nach Sequenz Nr. 1 kodierenden Desoxyribonukleinsäuren, die einen Sequenzabschnitt für die Sektretionsfähigkeit, beispielsweise für ein Peptid nach Sequenz Nr. 2, umfassen sowie die Vektoren, die die entsprechenden Nukleinsäuren umfassen, eingesetzt werden. Beispielhaft können eine DNA und ein Vektor nach den Sequenzen 3 bis 6 eingesetzt werden. Diese werden in den Körper eingeführt.
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Beispiel:
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L3 wird in Zellen des zentralen Nervensystems beispielsweise in Neuronen oder in Zellen exprimiert und anschließend sekretiert und führt somit gezielt zu einer Reduktion der besonders toxischen Aβ-Oligomere. Dies kann mithilfe spezieller, viraler Vektoren bewerkstelligt werden. Es wurden Versuche in Zellkultur durchgeführt. Dabei erfolgte die Expression von L3 sowohl intra- als auch extrazellulär.
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Experimentelle Ergebnisse:
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In den Figuren sind experimentelle Ergebnisse dargestellt.
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Es zeigt:
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1: Vergleich der Bindepräferenzen von L3 und D3 für Aβ-Oligomere
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2: Vergleichsergebnisse der Dichtegradientenzentrifugation von Aβ-42 ohne Peptid, mit L3 und mit D3
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3: Vergleich des hydrodynamischen Radius von Aβ1–42 Partikeln mit und ohne L3 zu verschiedenen Zeitpunkten
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4: Thioflavin-T-Test und Trübungstest zur Analyse des Aggregationsverhaltens
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5: ThT-Fluoreszenzintensität
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1 zeigt den Vergleich der Bindepräferenzen von L3 und D3 für Aβ1–42-Oligomere. L3 ist in Figurenabschnitt A und D3 ist in Figurenabschnitt B dargestellt. L3 zeigt eine stärkere Bindung als D3. Aβ1–42 Monomere (gestrichelte Linen), Oligomere (durchgezogene Linen) und Fibrillen (gepunktete Linien) wurden auf einem CM5-Biosensorchip immobilisiert. Mittels Surface-Plasmonen-Resonanz wurden Interaktionsanalysen durchgeführt. RU: Resonanzeinheiten (Resonance Units). Es wurden jeweils 25 μl Peptidlösung (100 μg/ml) injiziert. Beide Peptide zeigen die deutlichste Bindung an Aβ1–42-Oligomere, L3 zeigt generell eine höhere maximale Resonanz als D3. Die Gleichen Ergebnisse sind auch für Aβ1–40-Oligomere zu erhalten.
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2 zeigt Vergleichsergebnisse der Dichtegradientenzentrifugation von Aβ1–42 ohne Peptid, mit L3 und mit D3. L3 fällt Aβ-Oligomere aus komplexen Mischungen verschiedener Aβ-Formen. Die Größenverteilungen von Aβ in Lösung und Aβ-Peptid-Mischungen wurden durch Sedimentationsanalyse auf einem Iodixanol-Gradienten (5–50%) untersucht. Die Mischungen enthielten 125 μM Aβ und jeweils 125 mM Peptid. Nach der Zentrifugation wurden 14 Fraktionen von je 140 μl durch sequenzielles Pipettieren von der Oberfläche gewonnen und mittels denaturierender Polyacrylamidgelelektrophorese SDS-PAGE und anschließender Silberfärbung analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Peptide den Gehalt an Aβ-Oligomeren signifikant reduzieren, L3 zu dem untersuchten Zeitpunkt in einem höheren Maße als D3. Es entstehen große Aggregate, die in weiteren folgenden Versuchen als amorph, nicht fibrillär und nicht amyloidogen beschrieben werden.
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3 zeigt die Ergebnisse von Experimenten zum Vergleich des hydrodynamischen Radius von Aβ1–42 Partikeln mit und ohne L3 zu verschiedenen Zeitpunkten. Die dynamische Lichtstreuung dient zur Bestimmung des hydrodynamischen Radius von Partikeln, die sich in Lösung oder Suspension befinden. Eine 5 μM Probe von Aβ1–42 oligomeren Partikeln wurde zum einen durch Zugabe einer 50 μM L3-Probe, zum anderen mit Puffer (50 mM NaPhosphat, 100 mM NaCl, pH 7,4) verdünnt. Der hydrodynamische Radius der Aβ1–42 Partikel mit und ohne L3 wurde in einem DynaPro-light scattering System vermessen, unmittelbar nach Ansetzen der Probe und nach 20 min. Es wurde ein 655,6 nm Laser (13 mW – 58% Laserstärke) verwendet. Die Erfassungszeit betrug 2 Sekunden, die Messtemperatur 25°C. Für die Berechnung des hydrodynamischen Radius wurden sphärisch sedimentierte Partikel angenommen. L3 fördert die schnelle Bildung großer Aβ-Aggregate.
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4 zeigt Ergebnisse zu einem Thioflavin-T-Test und einem Trübungstest zur Analyse des Aggregationsverhaltens von Aβ in Anwesenheit von L3. Beide Tests wurden aus gemeinsamen Stocklösungen von 25 μM Aβ (helle Balken) und 25 μM Aβ mit 1 mM L3 (dunkle Balken) angesetzt. Im ThT-Test wurden 5 μl der Lösungen mit 200 μl ThT-Lösung (5 μM ThT; 50 mM Glycerin pH 8,5) versetzt und bei λex 440 nm und λem = 490 nm im Fluoreszenzspektrometer vermessen. ThT ist ein Farbstoff, der bei Bindung an reguläre Fibrillen eine höhere Fluoreszenz besitzt und somit als Maß für die Fibrillierung dient. Im Trübungstest wurde die Trübung der Lösung als Maß für die Aggregation als Absorption bei 355 nm im UV/VIS-Spektrometer vermessen. L3 fördert die schnelle Entstehung großer Aβ-Aggregate, die keine fibrilläre Struktur aufweisen und somit im Thioflavin-T(ThT)-Test negativ sind.
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5 zeigt Ergebnisse zu den amyloidogenen Eigenschaften von Aβ-L3-Aggregaten, gemessen mittels ThT-Fluoreszenzintensität. Amyloidogene Aggregationskeime sind Partikel, die als „Keimzellen” fungieren und so den Aggregationsprozeß beschleunigen. Für die Aggregation von Aβ ist bekannt, dass bereits bestehende Aβ-Oligomere/Keime den Aggregationsprozess von Monomeren deutlich beschleunigen. Für den Versuch wurden Keime hergestellt, die aus Aβ bestanden (Dreiecke) und solche, die aus Aβ und L3 bestanden (Quadrate). Nach der Inkubation von Aβ und Aβ-L3-Mischungen für 5 Tage wurden die Keime abzentrifugiert und gewaschen. Die Keime (20% v/v) wurden im ThT-Test zu frisch präpariertem Aβ gegeben. Als Kontrolle wurde Aβ ohne Keime vermessen (Rauten). Gezeigt wird die ThT-Fluoreszenz im Verlauf der Zeit. Die Keime, die L3 enthalten, führen nicht zu einer Beschleunigung der Aggregation im Vergleich zu Aβ-Lösungen ohne Keime. Dies ist ein Indiz dafür, dass Aβ-D3-Aggregate keine amyloiden Strukturen mehr haben. Aggregationskeime, die aus Aβ und L3 bestehen, beschleunigen im Gegensatz zu Aβ-Aggregationskeimen den Aβ-Aggregationsprozess nicht.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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