JP2013527757A - アルツハイマー型認知症の治療剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、アルツハイマー型認知症の治療剤に関する。本発明によると、Aβオリゴマーに結合することによりアルツハイマー型認知症の治癒または緩和をもたらす、SEQ ID NO:1に記載のペプチドが提供される。本発明のさらなる形態では、SEQ ID NO:1を含有するものの、前置された、ペプチドの分泌を可能にする配列断片も有するペプチドが提供される。遺伝子治療を目的に、対応する、特に配列3〜6に記載のDNA配列およびベクターが提供される。
Description
本発明は、アルツハイマー型認知症の治療剤に関する。
アルツハイマー型認知症(AD)は、認知症の最も頻繁な形態であって、今日では、世界中で推定2400万人の認知症患者の人々の60%超に該当するものである。ADの病理学的な主な特徴は、Aβペプチドからなる老人斑またはアミロイド斑の形成、およびTauタンパク質からなる神経原線維沈着の形成である。Aβペプチドは、少なくとも2種の異なるプロテアーゼの活性により、前駆体タンパク質である「アミロイド前駆体タンパク質」(APP)から生成する。この前駆体タンパク質は、ニューロンの細胞壁中に局在する。APPのタンパク質分解に際し、および後からの修飾により、長さおよび種類の異なるAβ断片が生成する。90年代にはアミロイド・カスケード仮説が立てられ、Aβの斑状の沈着が症候の引き金であると仮定された。自由に拡散できるAβオリゴマーは、斑に沈着したAβ原線維よりも有毒である。最近の研究によると、班は、シナプスおよびニューロンの破壊と共局在するオリゴマーAβのストックとして見なすことが可能である。
凝集するニューロン内Aβ(Aβi)は、早期AD病因の重要因子と見なされる。大部分がAβ1−42からなるAβiが、分泌されなかったAβであるか、または再内在化されたAβであるかは、まだ最終的には解明することができていない。しかしながら、2番目の可能性への示唆が蓄積しつつある。
これまでは、ADの症状のみが治療可能である。病理過程を阻止するか、または後退させることができる承認医薬品は知られていない。ADの治療を目的に研究される大抵の物質は、細胞外Aβに焦点を合わせたものであるが、その際、可溶性のAβオリゴマーを対象にはしていない。しかしながら、ほかでもなく可溶性のAβオリゴマーを対象にすることが、病理過程を早期段階に阻止できるためには望まれる。
欧州特許第1379546号B1(特許文献1)には、様々な、D型エナンチオマーのペプチドが、β−アミロイドペプチドに結合するため、アルツハイマー型認知症の治療に適しているかもしれないと記載されている。特に、この明細書に開示された、請求項3の対案e)に記載の、D3ペプチドとも呼ばれるペプチドは、Aβ凝集を調節する。D3ペプチドは、可溶性Aβオリゴマーと相互作用する。表面プラズモン共鳴による研究は、D3が好ましくは可溶性Aβオリゴマーに結合することを示唆する。APPトランスジェニックマウスモデルでは、D3は脳内の老人斑の数および関連した炎症プロセスを軽減する。
これまでは、アルツハイマー型認知症の緩和療法しか存在しない。非常に様々な治療可能性が、全力を挙げて研究されているにもかかわらず、これまでアルツハイマー型認知症の原因を治療することはできていない。その際、例えば、Aβに結合することで(さらなる)凝集を不可能にさせる物質によってAβ凝集を阻止することが頻繁に焦点にある。
i)有毒な可溶性Aβオリゴマーをin vivoで軽減し、そしてii)ニューロンの外部のみならず内部でも有効な物質が必要とされる。
したがって、アルツハイマー型認知症の、より優れた治療上の処置を可能にする薬剤を提供することが本発明の課題である。
意外なことに、この課題は、本発明により、請求項1〜15に記載の薬剤を提供することによって解決される。さらに、請求項16に記載のアルツハイマー型認知症治療方法が提供される。
以下に、配列表に列挙される配列を定義する。
SEQ ID NO:1:本発明によりAβオリゴマーに結合するL3ペプチド。
SEQ ID NO:2:SEQ ID NO:1を含むが、付加的に細胞膜を通る分泌を引き起こす配列断片も含む、模範的に挙げられた本発明によるペプチド。
SEQ ID NO:3:ペプチドNo.1をコードするDNA配列。
SEQ ID NO:4:ペプチドNo.2をコードするDNA配列。
SEQ ID NO:5:SEQ ID NO:3を含有し、蛍光を発する構造単位をコードするベクターをコードする配列。
SEQ ID NO:6:SEQ ID NO:4を含有し、蛍光を発する構造単位をコードするベクターをコードする配列。
SEQ ID NO:1:本発明によりAβオリゴマーに結合するL3ペプチド。
SEQ ID NO:2:SEQ ID NO:1を含むが、付加的に細胞膜を通る分泌を引き起こす配列断片も含む、模範的に挙げられた本発明によるペプチド。
SEQ ID NO:3:ペプチドNo.1をコードするDNA配列。
SEQ ID NO:4:ペプチドNo.2をコードするDNA配列。
SEQ ID NO:5:SEQ ID NO:3を含有し、蛍光を発する構造単位をコードするベクターをコードする配列。
SEQ ID NO:6:SEQ ID NO:4を含有し、蛍光を発する構造単位をコードするベクターをコードする配列。
本発明によるペプチドは、好ましくは、L型エナンチオマーである。このペプチドをコードするDNA配列およびベクターも同様に、好ましくはL型エナンチオマーをコードする。本発明によると、SEQ ID NO:1に記載のペプチドは、Aβペプチド、特にAβオリゴマーに結合する。したがって、このペプチドは、アルツハイマー型認知症を治療するための医薬品である。したがって、アルツハイマー型認知症を治療するための医薬品は、SEQ ID NO:1に記載のペプチド、またはSEQ ID NO:1に記載のペプチドを含有する成分からなり得る。SEQ ID NO:1に記載のペプチドは、ペプチドD3よりも優れたAβペプチド結合特性を有する。SEQ ID NO:1に記載のペプチドは、アルツハイマー型認知症を治療するための細胞内および細胞外での適用を可能にする。
SEQ ID NO:1に記載のペプチドは、例えば、メリフィールド合成、および配列1をコードするDNAの発現によって、合成的に製造することができる。
SEQ ID NO:1に記載のペプチドは、さらに、アルツハイマー型認知症を治療するための医薬品の製造に使用することができる。
SEQ ID NO:1に記載のペプチドは、細胞内でも細胞外でもAβオリゴマーに結合する。その結果、アルツハイマー型認知症を、細胞内での作用によっても細胞外での作用によっても治療することができる。
本発明の一発展形態では、SEQ ID NO:1に記載の配列断片であるが、そのペプチドが分泌性である、つまり細胞膜を通過して出ることができるという機能をコードする配列断片も含む配列断片を含有するタンパク質が提供される。このタンパク質は、細胞から輸送され得る。SEQ ID NO:1に記載のペプチドは、ペプチドD3よりも優れたAβ結合特性を有する。SEQ ID NO:1に記載のペプチドは、アルツハイマー型認知症の細胞内および細胞外治療を可能にする。
分泌を引き起こす配列断片は、当業者には公知である。模範的に、分泌性ペプチドとして、前記の特性を有する、SEQ ID NO:2に記載のペプチドを挙げることができる。好ましくは、分泌を引き起こす、ヒト由来であるかヒト配列と同一である配列断片が使用される。このことは、人間を治療する際に、分泌断片に対する望ましくない免疫応答が阻止され得るかまたは抑制され得るという利点をもたらす。SEQ ID NO:1に記載の配列断片を含有する分泌性ペプチドは、細胞膜を通って出ることが可能であるため細胞膜の向こう側に存在する標的場所も有するということをもたらす。
分泌性ペプチドも同様に、メリフィールド合成によって、または対応するDNAの発現によって製造可能である。これらの分泌性ペプチドは、医薬品である。さらに、これらのペプチドは、アルツハイマー型認知症を治療するための医薬品の製造に使用することができる。分泌性ペプチドは、細胞内または細胞外で使用することができる。
SEQ ID NO:1およびNo.2に記載の本発明によるペプチド、ならびに配列1に記載の配列部分を含有するさらなる分泌性ペプチドは、モノマー性、オリゴマー性、さらには原線維性または斑状のAβペプチドにも結合する。本発明によるペプチドは、可溶性オリゴマーAβペプチドに特に良好に結合する。特に多大な効果は、構造長Aβ1−42のAβペプチドにおいて認められた。
本発明のさらなる有利な一形態では、SEQ ID NO:1に記載のペプチドをコードするDNAが提供される。
このDNAは細胞内で発現可能であるため、アルツハイマー型認知症の治療に適した、SEQ ID NO:1に記載のペプチドが生成する。したがってこのDNAは、遺伝子治療に適している。配列1に記載のペプチドをコードするDNAは、特にアルツハイマー型認知症を治療するために使用可能な医薬品である。このDNAは、さらに、アルツハイマー型認知症を治療するための医薬品の製造に使用することができる。
模範的に、SEQ ID NO:3に記載のDNAを提供する。
さらに好ましい一実施形態では、機能的にそのペプチドの分泌性をコードする配列断片を含む、SEQ ID NO:1を含有するペプチドをコードするDNAが提供される。このDNAもまた細胞内で発現可能であるため、SEQ ID NO:2に記載のペプチドが生成し、このペプチドは、分泌性である上にSEQ ID NO:1に記載の断片を含有しており、アルツハイマー型認知症の治療に適している。したがって、このDNAは、遺伝子治療に適している。好ましくは、DNAのうちの分泌を担う断片は、ヒト分泌配列をコードする。そのようなペプチドをコードするDNAは、特にアルツハイマー型認知症の治療に使用することが可能な医薬品である。さらに、このDNAは、アルツハイマー型認知症を治療するための医薬品の製造に使用することができる。
模範的に、SEQ ID NO:4に記載のDNAを提供する。
本発明のさらなる一形態では、SEQ ID NO:1に記載のタンパク質をコードするDNA断片を含有するベクターが提供される。これらのベクターは、SEQ ID NO:1に記載のタンパク質をコードしつつ、発現されたDNA断片ないしタンパク質の分泌を機能的に引き起こすDNA配列を含むDNA断片も含有することができる。これらのベクターを用いて、SEQ ID NO:1に記載のペプチド、ならびにSEQ ID NO:2に記載のペプチドのような、それらの分泌性誘導体を細胞内で発現することができる。これらのベクターは、機能的に蛍光を発する構造部分をコードする断片を含有してもよい。模範的に、配列5または6に記載のベクターを提供することができる。
本発明によるベクターは、当業者には公知の方法により、市販ベクターから製造することができる。これらのベクターは、特にアルツハイマー型認知症を治療するための医薬品であって、アルツハイマー型認知症を治療するための医薬品の製造に使用可能である。特に適しているのはウイルスベクターであるが、それというのも、ウイルスベクターは、ヒトにおける遺伝子治療に、さらには動物のような別の生物の遺伝子治療にも特に良好に使用することができるからである。
遺伝子治療には、SEQ ID NO:1に記載のペプチドをコードするデオキシリボ核酸、分泌性をもたらす配列断片、例えばSEQ ID NO:2に記載のペプチド用の配列断片を含む、SEQ ID NO:1に記載のペプチドをコードするデオキシリボ核酸、ならびに対応する核酸を含むベクターを使用することができる。模範的に、配列3〜6に記載のDNAおよびベクターを使用することができる。これらを体内に導入する。
L3が中枢神経系の細胞内、例えばニューロン内または細胞内で発現され、続いて分泌されることによって、特に有毒なAβオリゴマーの軽減を特異的にもたらす。このことは、特殊なウイルスベクターを利用して遂行することができる。細胞培養での実験を実施した。その際、L3が、細胞内でも細胞外でも発現された。
実験結果:
図において実験結果を示す。
図において実験結果を示す。
図1は、Aβ1−42オリゴマーに対するL3およびD3の結合優先性の比較を示す。L3は、図1Aに示され、D3は図1Bに示されている。L3は、D3よりも強い結合を示す。Aβ1−42モノマー(破線)、オリゴマー(実線)および原線維(点線)をCM5バイオセンサーチップ上に固定化した。表面プラズモン共鳴を用いて相互作用分析を行った。RU:レゾナンスユニット(Resonance Units)。それぞれの場合に、ペプチド溶液(100μg/ml)25μlを注入した。両ペプチドともAβ1−42オリゴマーに対して最もはっきりとした結合を示し、L3は、一般的にD3よりも高い最大共鳴を示す。同じ結果が、Aβ1−40オリゴマーに関しても得られる。
図2は、ペプチドを添加しない、L3を添加、およびD3を添加した場合のAβ1−42の密度勾配遠心分離の比較結果を示す。L3は、様々なAβ型の複合的な混合物からなるAβオリゴマーを沈殿させる。溶液およびAβ−ペプチド混合物中でのAβのサイズ分布を、イオジキサノール勾配(5〜50%)上での沈降分析により検査した。混合物は、125μMのAβおよびそれぞれ125mMのペプチドを含有した。遠心分離後にそれぞれ140μlの14フラクションを連続的なピペット操作により表面から得、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS−PAGEおよびそれに続く銀染色を利用して分析した。この結果は、ペプチドがAβオリゴマーの含有量を著しく低下させ、検査時点においてL3はD3よりも高い程度で低下させることを示す。大きな凝集が生成し、この凝集は、さらなる以下の実験では非晶質、非原線維性、非アミロイド形成性として記載される。
図3は、L3を添加、および添加しなかった場合の、異なる時点でのAβ1−42粒子の流体力学的半径を比較する実験の結果を示す。動的光散乱が、溶液または懸濁液中に存在する粒子の流体力学的半径の特定に利用される。5μMのAβ1−42オリゴマー粒子サンプルを、一方では50μMのL3サンプルの添加により、および他方では緩衝液(50mMリン酸ナトリウム、100mM NaCl、pH7.4)により希釈した。L3を添加、および添加しなかった場合のAβ1−42粒子の流体力学的半径を、サンプル混合直後および20分後にDynaPro−光散乱システムで測定した。655.6nmレーザ(13mW−58%レーザ強度)を使用した。取得時間は2秒、測定温度は25℃であった。流体力学的半径の算出には、球状に沈降する粒子を想定した。L3は、大きなAβ凝集体の迅速な形成を促進する。
図4は、L3の存在下でのAβの凝集挙動を分析することを目的としたチオフラビンT試験および濁度試験の結果を示す。両試験とも、共通のストック溶液、25μMのAβ(白塗棒グラフ)および1mMのL3を含む25μMのAβ(黒塗棒グラフ)から混合した。ThT試験では、溶液5μlをThT溶液(5μMのThT;50mMグリセリンpH8.5)200μlと混合し、蛍光分光光度計によりλex440nmおよびλem=490nmにおいて測定した。ThTは、通常の原線維に結合することでより高い蛍光を有する色素であるため、線維化の尺度として利用される。濁度試験では、溶液の濁度を凝集の尺度として、UV/VIS分光光度計での355nmにおける吸光として測定した。L3は、原線維性構造を有さない大きなAβ凝集体の早急な生成を促進するため、チオフラビンT(ThT)試験では陰性である。
図5は、ThT蛍光強度を利用して測定した、Aβ−L3凝集体のアミロイド形成特性に関する結果を示す。アミロイド形成凝集核は、「核細胞」として機能することで凝集プロセスを促進する粒子である。Aβの凝集に関しては、既存のAβオリゴマー/核が、モノマーの凝集プロセスを明らかに促進することが公知である。この実験のために、Aβからなる核(三角形)、およびAβとL3からなるような核(正方形)を製造した。AβおよびAβ−L3混合物を5日間インキュベーションした後、核を遠心分離して洗浄した。ThT試験では、新鮮に調製したAβに核(20%v/v)を加えた。コントロールとして、核を加えていないAβを測定した(菱形)。ThT蛍光を時間経過で示す。L3を含有する核は、核を含まないAβ溶液と比べて、凝集の促進をもたらさない。このことは、Aβ−D3凝集体がもはやアミロイド構造を有さないということの証拠である。AβとL3からなる凝集核は、Aβ凝集核とは異なり、Aβ凝集プロセスを促進しない。
Claims (16)
- SEQ ID NO:1を特徴とするタンパク質。
- タンパク質であって、SEQ ID NO:1に記載の配列断片を含むこと、および前記タンパク質の分泌性をもたらす配列断片を含むことを特徴とするタンパク質。
- SEQ ID NO:2を特徴とする、請求項2に記載のタンパク質。
- SEQ ID NO:1に記載のタンパク質をコードするデオキシリボ核酸。
- SEQ ID NO:3による、請求項4に記載のデオキシリボ核酸。
- 請求項3に記載のペプチドをコードするデオキシリボ核酸。
- SEQ ID NO:4による、請求項6に記載のデオキシリボ核酸。
- SEQ ID NO:3に記載の配列断片を含有するベクター。
- SEQ ID NO:5を特徴とする、請求項8に記載のベクター。
- SEQ ID NO:4に記載の配列断片を含有するベクター。
- SEQ ID NO:6を特徴とする、請求項10に記載のベクター。
- SEQ ID NO:1に記載のタンパク質を含有するかまたは前記タンパク質からなることを特徴とする医薬品。
- 配列1ならびに機能的に分泌性をもたらす配列断片を含有するかまたはそれらからなるタンパク質であることを特徴とする医薬品。
- 請求項4〜7のいずれか一つに記載のデオキシリボ核酸を含むかまたは前記デオキシリボ核酸からなることを特徴とする医薬品。
- 請求項8〜11のいずれか一つに記載のベクターを含むかまたは前記ベクターからなることを特徴とする医薬品。
- 請求項1〜15のいずれか一つに記載の少なくとも一つの薬剤を体内に導入することを特徴とする、アルツハイマー型認知症の治療方法。
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