KR102313791B1 - 퇴행성 뇌질환의 진단을 위한 바이오 마커 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 퇴행성 뇌질환의 진단을 위한 바이오 마커 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 경도인지장애/치매 1기 환자, 및 치매 2기/치매 3기 환자의 혈청으로부터 메인 마커인 Aβ40(아밀로이드 베타 40), Tau(타우), NSE(neuron-specific enolase), 및 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)의 수준이 정상 대조군(Normal)에 비해 유의하게 높은 것을 측정하고, BDNF(뇌유래신경성장인자) 및 UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1)의 수준은 유의하게 낮은 것을 측정하였으며, AT180(Phospho-Tau) 및 HCY(Homocystein)의 수준은 유의하게 높은 것을 측정하고, Pin1(peptidyl-prolyl isomerase)의 수준 유의하게 낮은 것을 확인함으로써, 메인 마커 및 서브 마커를 유효성분으로 포함하는 조성물을 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커 조성물로 제공 한다.
Description
본 발명은 퇴행성 뇌질환의 진단을 위한 바이오 마커 조성물에 관한 것이다.
퇴행성 뇌질환은 나이가 들어감에 따라 발생하는 퇴행성 질환 중에서도 뇌에서 발생하는 질환을 뜻하며, 주요 증상과 침범되는 뇌 부위를 고려해 구분할 수 있는데, 대표적으로 알츠하이머병(alzheimer's disease), 전측두치매(frontotemporal dementia), 루이소체치매(lewy body dementia), 파킨슨병(parkinson's disease), 헌팅턴병(huntington's disease), 근위축성측색경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 등이 포함된다. 퇴행성 뇌질환은 노화에 따른 신경퇴화와 유전적·환경적 요인들로 인해 질환 별 특정 단백질이 응집되어 신경세포가 사멸해 야기되는 것으로 알려져 있으나, 아직까지 정확한 병적 기전이 밝혀지지 않아 이를 규명하기 위한 기초 연구가 활발히 진행되고 있다.
알츠하이머병은 기억력 감퇴로 서서히 발병하여 시공간능력 소실, 언어 장애, 실행능력 장애 등 점진적·광범위한 인지기능의 소실로 진행되어 독립적인 일상생활 수행이 불가능한 치매 증상을 나타낸다. 아직까지 병적 기전이 정확하게 규명되진 않았지만 노화, 유전적 위험인자, 환경인자 간의 상호작용에 기인하는 것으로 보고되고 있다.
보건복지부, 국민건강보험공단, 건강보험심사평가원, 사회보장정보원, 통계청 등 치매 유관기관이 분석한 결과에 의하면 2017년 말 치매 환자 수는 약 70만 명 이상으로 추정되며, 치매환자 1인당 연간 관리비용은 약 2,074만원, 국가 치매관리비용은 약 14조 6천억 원이다. 현재 치매의 예방, 진단, 관리는 임상적인 문진과 같은 설문 조사 또는 PET-CT와 같은 고가의 비용을 지불하는 검진이 이용되고 있으며, 발병한 후 진단, 관리하기 위해서 뇌척수액 등의 생체 시료를 요구하기 때문에 환자가 받는 고통이 관리비용의 부담에 가중되고 있다. 더군다나 고령화 사회에 따라 환자 수와 비용은 지속적으로 늘어날 전망이며, 이로 인해 추가로 손실되는 사회적 비용까지 감안하면 국가적으로도 큰 부담이다.
그런데 기존의 혈액을 이용한 치매 진단 기술은 학술적으로 혈청 또는 혈장 내에서 pg/㎖ 단위로 레이저 분석기를 이용하여 진행되어 왔으나, 혈액 성분을 이용하지 않고 있다. 기존 관련 진단 키트들은 다양하지 못한 치매 마커의 전위차를 이용하여 한정된 마커로 단순하고 민감도가 높지 않은 방법들을 사용하기 때문에 정확한 치매 진단 및 감별이 용이하지 않다. 따라서 개인의 건강 추구권 확보와 개인/국가적 관리 비용을 절감하기 위해서 치매를 조기에 예방, 발견하여 진행 정도를 관리할 수 있도록 혈액을 이용한 효과적인 치매 진단 키트의 필요성이 증대되고 있다.
본 발명은 퇴행성 뇌질환의 진단을 위한 바이오 마커 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 경도인지장애/치매 1기 환자, 및 치매 2기/치매 3기 환자의 혈청으로부터 메인 마커인 Aβ40(아밀로이드 베타 40), Aβ42(아밀로이드 베타 42), Tau(타우), NSE(neuron-specific enolase), 및 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)의 수준이 정상 대조군(Normal)에 비해 유의하게 높은 것을 측정하고, BDNF(뇌유래신경성장인자) 및 UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1)의 수준은 유의하게 낮은 것을 측정하였으며, 서브 마커인 CRMP2(collapsing response mediator protein-2), CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels), AT180 및 HCY(Homocystein)의 수준은 유의하게 높은 것을 측정하고, Pin1(peptidyl-prolyl isomerase)의 수준 유의하게 낮은 것을 확인함으로써, 메인 마커 및 서브 마커를 유효성분으로 포함하는 조성물을 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커 조성물로 제공하는 것이다.
본 발명은 Aβ40(아밀로이드 베타 40), Aβ42(아밀로이드 베타 42), BDNF(뇌유래신경성장인자), GFAP(Glial fibrillary acidic protein), NSE(neuron-specific enolase), Tau(타우) 및 UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 메인 마커; 및 CRMP2(collapsing response mediator protein-2), CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels), Pin1(peptidyl-prolyl isomerase), AT180(Phospho-Tau) 및 HCY(Homocystein)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 서브 마커;를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Aβ40(아밀로이드 베타 40), Aβ42(아밀로이드 베타 42), BDNF(뇌유래신경성장인자), GFAP(Glial fibrillary acidic protein), NSE(neuron-specific enolase), Tau(타우) 및 UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 메인 마커의 수준을 측정하는 제제; 및 CRMP2(collapsing response mediator protein-2), CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels), Pin1(peptidyl-prolyl isomerase), AT180(Phospho-Tau) 및 HCY(Homocystein)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 서브 마커의 수준을 측정하는 제제;를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 대상체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Aβ40(아밀로이드 베타 40), Aβ42(아밀로이드 베타 42), BDNF(뇌유래신경성장인자), GFAP(Glial fibrillary acidic protein), NSE(neuron-specific enolase), Tau(타우) 및 UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 메인 마커 수준을 측정하는 단계; 상기 메인 마커의 수준이 정상 대조군과 비교하는 단계; 상기 생물학적 시료로부터 CRMP2(collapsing response mediator protein-2), CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels), Pin1(peptidyl-prolyl isomerase), AT180(Phospho-Tau) 및 HCY(Homocystein)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 서브 마커의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 서브 마커의 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 경도인지장애/치매 1기 환자, 및 치매 2기/치매 3기 환자의 혈청으로부터 메인 마커인 Aβ40(아밀로이드 베타 40), Tau(타우), NSE(neuron-specific enolase), 및 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)의 수준이 정상 대조군(Normal)에 비해 유의하게 높은 것을 측정하고, BDNF(뇌유래신경성장인자) 및 UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1)의 수준은 유의하게 낮은 것을 측정하였으며, CRMP2(collapsing response mediator protein-2), CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels), AT180(Phospho-Tau) 및 HCY(Homocystein)의 수준은 유의하게 높고, Pin1(peptidyl-prolyl isomerase)의 수준 유의하게 낮은 것을 확인함으로써, 메인 마커 및 서브 마커를 유효성분으로 포함하는 조성물을 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커 조성물로 제공할 수 있다.
도 1은 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 메인 마커 또는 서브 마커의 수준을 측정하는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 Aβ40(아밀로이드 베타 40)를 평가한 결과이다.
도 3은 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 Aβ42(아밀로이드 베타 42)를 평가한 결과이다.
도 4는 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 BDNF(뇌유래신경성장인자)를 평가한 결과이다.
도 5는 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)를 평가한 결과이다.
도 6은 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 NSE(neuron-specific enolase)를 평가한 결과이다.
도 7은 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 Tau(타우)를 평가한 결과이다.
도 8은 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1)를 평가한 결과이다.
도 9는 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 CRMP2(collapsing response mediator protein-2)를 평가한 결과이다.
도 10은 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels)를 평가한 결과이다.
도 11은 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 Pin1(peptidyl-prolyl isomerase)를 평가한 결과이다.
도 12는 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 AT180(Phospho-Tau)를 평가한 결과이다.
도 13은 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 HCY(Homocystein)를 평가한 결과이다.
도 2는 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 Aβ40(아밀로이드 베타 40)를 평가한 결과이다.
도 3은 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 Aβ42(아밀로이드 베타 42)를 평가한 결과이다.
도 4는 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 BDNF(뇌유래신경성장인자)를 평가한 결과이다.
도 5는 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)를 평가한 결과이다.
도 6은 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 NSE(neuron-specific enolase)를 평가한 결과이다.
도 7은 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 Tau(타우)를 평가한 결과이다.
도 8은 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1)를 평가한 결과이다.
도 9는 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 CRMP2(collapsing response mediator protein-2)를 평가한 결과이다.
도 10은 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels)를 평가한 결과이다.
도 11은 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 Pin1(peptidyl-prolyl isomerase)를 평가한 결과이다.
도 12는 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 AT180(Phospho-Tau)를 평가한 결과이다.
도 13은 퇴행성 뇌질환의 진단하기 위한 바이오 마커인 HCY(Homocystein)를 평가한 결과이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 Aβ40(아밀로이드 베타 40), Aβ42(아밀로이드 베타 42), BDNF(뇌유래신경성장인자), GFAP(Glial fibrillary acidic protein), NSE(neuron-specific enolase), Tau(타우) 및 UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 메인 마커; 및 CRMP2(collapsing response mediator protein-2), CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels), Pin1(peptidyl-prolyl isomerase), AT180(Phospho-Tau) 및 HCY(Homocystein)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 서브 마커;를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 진단용 조성물을 제공한다.
상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병(Alzheimer’s disease), 전측두치매(Frontotemporal dementia), 파킨슨병(Parkinson’s disease), 근위축성측색경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 진행성핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 피질기저핵변성(Corticobasal degeneration), 피크병(Pick's disease), 경도인지장애(MCI) 및 치매로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명은 Aβ40(아밀로이드 베타 40), Aβ42(아밀로이드 베타 42), BDNF(뇌유래신경성장인자), GFAP(Glial fibrillary acidic protein), NSE(neuron-specific enolase), Tau(타우) 및 UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 메인 마커의 수준을 측정하는 제제; 및 CRMP2(collapsing response mediator protein-2), CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels), Pin1(peptidyl-prolyl isomerase), AT180(Phospho-Tau) 및 HCY(Homocystein)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 서브 마커의 수준을 측정하는 제제;를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 진단용 키트를 제공한다.
상기 메인 마커의 수준을 측정하는 제제는 메인 마커에 특이적으로 결합하는 항체이고, 상기 서브 마커의 수준을 측정하는 제제는 서브 마커에 특이적으로 결합하는 항체이다. 상기 항체는 상업적으로 구입 가능하다.
상기 키트는 혈장 내에 존재하는 메인 마커 및 서브 마커의 수준을 0.3 pg/ml 내지 50 ng/ml 농도 범위로 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 대상체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Aβ40(아밀로이드 베타 40), Aβ42(아밀로이드 베타 42), BDNF(뇌유래신경성장인자), GFAP(Glial fibrillary acidic protein), NSE(neuron-specific enolase), Tau(타우) 및 UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 메인 마커 수준을 측정하는 단계; 상기 메인 마커의 수준이 정상 대조군과 비교하는 단계; 상기 생물학적 시료로부터 CRMP2(collapsing response mediator protein-2), CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels), Pin1(peptidyl-prolyl isomerase), AT180(Phospho-Tau) 및 HCY(Homocystein)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 서브 마커의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 서브 마커의 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 메인 마커 수준을 측정하는 단계는, 생물학적 시료에 Aβ40(아밀로이드 베타 40), Aβ42(아밀로이드 베타 42), BDNF(뇌유래신경성장인자), GFAP(Glial fibrillary acidic protein), NSE(neuron-specific enolase), Tau(타우) 또는 UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1)에 특이적으로 결합하는 1차 항체를 처리하는 단계; 상기 1차 항체에 특이적으로 결합하고 불변 부위에 비오틴이 결합된 형태인 2차 항체를 처리하는 단계; 및 상기 비오틴에 특이적으로 결합하고, HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 형태인 아비딘을 처리하는 단계를 포함한다.
상기 서브 마커 수준을 측정하는 단계는, 생물학적 시료에 CRMP2(collapsing response mediator protein-2), CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels), Pin1(peptidyl-prolyl isomerase), AT180(Phospho-Tau) 및 HCY(Homocystein)에 특이적으로 결합하는 1차 항체를 처리하는 단계; 상기 1차 항체에 특이적으로 결합하고 불변 부위에 비오틴이 결합된 형태인 2차 항체를 처리하는 단계; 및 상기 비오틴에 특이적으로 결합하고, HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 형태인 아비딘을 처리하는 단계를 포함한다.
상기 정보 제공 방법은 상기 Aβ40(아밀로이드 베타 40), Tau(타우), NSE(neuron-specific enolase), 및 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)의 수준이 정상 대조군보다 높고, Aβ42(아밀로이드 베타 42), BDNF(뇌유래신경성장인자) 및 UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1)의 수준이 정상 대조군 보다 낮으면, 대상체가 퇴행성 뇌질환으로 진단하거나 진단될 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 정보 제공 방법은 CRMP2(collapsing response mediator protein-2), CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels), AT180(Phospho-Tau) 및 HCY(Homocystein)의 수준이 높고, Pin1(peptidyl-prolyl isomerase)의 수준이 정상보다 낮으면, 대상체가 퇴행성 뇌질환으로 진단하거나 진단될 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예>
본 발명에 따라 퇴행성 뇌질환의 진단용 메인 마커 및 서브 마커 수준을 측정하기 위하여 본 발명자들이 개발한 간접 면역 정량 ELISA(Indirect Immunometric ELISA)를 이용하였다.
메인 마커 또는 서브 마커의 수준을 측정하기 위해 Aβ40(아밀로이드 베타 40), Aβ42(아밀로이드 베타 42), BDNF(뇌유래신경성장인자), GFAP(Glial fibrillary acidic protein), NSE(neuron-specific enolase), Tau(타우), UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1), CRMP2(collapsing response mediator protein-2), CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels), Pin1(peptidyl-prolyl isomerase), AT180(Phospho-Tau) 또는 HCY(Homocystein)에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하였다. 항체는 비오틴이 결합된 항체를 사용하였다.
각 바이오 마커의 수주을 측정하기 위해 사용된 항체 및 실험 방법은 상업적으로 판매되는 키트를 참고하였다. 구체적으로 Aβ40(아밀로이드 베타 40)는 Human Amyloid beta 40 ELISA Kit(Invitrogen)를 사용하고, Aβ42(아밀로이드 베타 42)는 Human Amyloid beta 42 ELISA Kit, Ultrasensitive(Invitrogen)를 사용하고, BDNF(뇌유래신경성장인자)는 Human Brain-derived neurotrophic factor ELISA Kit(abcam)를 사용하고, GFAP(Glial fibrillary acidic protein)는 Human Glial fibrillary acidic protein DuoSet ELISA(R&D Systems)를 사용하고, NSE(neuron-specific enolase)는 Human Neuron-specific Enolase ELISA Kit(abcam)를 사용하고, Tau(타우)는 Human Tau ELISA Kit(abcam)를 사용하고, UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1)는 Human Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 DuoSet ELISA(R&D Systems)를 사용하고, CRMP2(collapsing response mediator protein-2)는 Human DPYSL2 / CRMP2 ELISA Kit(LSBio)를 사용하고, CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels)는 Human Voltage dependent N-type calcium channels subunit Alpha 1B ELISA kit(Mybiosource)를 사용하고, Pin1(peptidyl-prolyl isomerase)는 Human peptidylprolyl cis/trans isomerase NIMA-interacting1 ELISA Kit(Cusabio)를 사용하고, AT180(Phospho-Tau)는 Human Phosphorylated tau 231 ELISA Kit(Mybiosource)를 사용하고, HCY(Homocystein)는 Human Homocysteine ELISA Kit(Mybiosource)를 사용하였다. 실시예에 사용된 재료는 하기 표 1과 같다.
| Reagents | Quantity |
| Assay plate (12x 8 coated microwells) | 1(96 wells) |
| Standard (Freeze dried) | 2 |
| Biotin-antibody (100 x concentrate) | 1 x 120 μl |
| HRP-avidin (100 x concentrate) | 1 x 120 μl |
| Biotin-antibody Diluent | 1 x 15 ml |
| HRP-avidin Diluent | 1 x 15 ml |
| Sample Diluent | 1 x 50 ml |
| Wash Buffer (25 x concentrate) | 1 x 20 ml |
| TMB Substrate | 1 x 10 ml |
| Stop Solution | 1 x 10 ml |
| Adhesive Strip (For 96 wells) | 4 |
| Instruction manual | 1 |
상기 Biotin-antibody는 비오틴이 결합된 항체로 바이오 마커에 특이적으로 결합한다. 상기 항체는 Biotin-antibody Diluent 용액으로 100 배 희석하여 사용하였다. 상기 HRP-avidin은 항체에 결합된 Biotin에 결합하는 아비딘 물질로 양 고추 냉이 과산화 효소 (HRP)가 결합된 형태이며, HRP-avidin Diluent 용액으로 100 배 희석하여 사용하였다. TMB Substrate는 TMB Substrate Set [BioLegend, 421101]를 사용하였으며, Stop Solution은 1 M sulfuric acid (H2SO4) [PFP, 8J250]을 사용하였다. Wash Buffer는 (25 x) 20ml를 탈 이온수 나 증류수에 희석하여 500ml를 준비하였다. 각 메인 마커 및 서브 마커의 Standard는 스톡 솔루션을 준비하고, 1/2 희석하여 0 pg/ml 내지 50 ng/ml 농도의 Standard 샘플을 준비하였다. 10 X Anti-Rabbit IgG HRP를 HRP Diluent를 사용하여, 1 X Anti-Rabbit IgG HRP를 사용하였다.
메인 마커 또는 서브 마커의 수준을 측정하기 위해 분석 대상이 되는 샘플을 준비하였다. 샘플은 수집일로부터 5일이 이내에 2-8℃ 조건에서 보관된 것으로 준비하였다. 혈청 혈청 분리기 튜브 (SST)를 사용하여 준비된 샘플을 2 시간 동안 응고시킨 후, 1000 X g에서 15 분 동안 원심 분리하였다. 혈장 EDTA 또는 헤파린을 항응고제로 사용하여 혈장을 수집하였다. 수집 후 30 분 이내에 2-8℃에서 1000 X g 조건으로 15 분 동안 원심 분리하였다. 세포 배양물의 경우 1000 xg, 2-8℃에서 15 분 동안 원심 분리하여 미립자를 제거하여 사용하였다. 조직 균질물의 경우 100mg 조직을 1X PBS로 헹구고 1ml의 1X PBS에서 균질화하고, 두 번의 동결-해동 사이클을 수행한 후, 5000 x g, 2-8℃에서 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하고 사용하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 각 혈청 샘플 또는 Standard 샘플을 100μl씩 웰에 추가하고 접착 스트립으로 웰을 덮고, 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 각 웰에 100μl의 Biotin- Antibody (1x)를 추가하고, 새 접착 스트립으로 교체하고 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. Wash Buffer를 200μl로 각 웰을 3번 세척하였다. HRP-avidin (1x) 100μl를 추가하고 새 접착 스트립으로 교체하고 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. Wash Buffer를 200μl로 각 웰을 3번 세척하였다. 90μl의 TMB Substrate을 각 웰에 추가하고, 37℃에서 암조건으로 15분 내지 30분 동안 배양하였다. 50μl의 Stop Solution을 추가하여 반응을 정지하였다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 450nm의 흡광도를 측정하였다.
무색 또는 하늘색에서 파란색 그라데이션으로 변경되는 흡광도 값을 기준으로 메인 마커 또는 서브 마커의 수준을 계산하였다. Standard 샘플의 결과값을 통해 "Curve Expert"로 표준 곡선을 작성하고, 4 개 매개 변수 로지스틱 (4 PL) 곡선 맞춤을 생성할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 데이터를 줄여 표준 곡선을 제작하였다. y 축의 농도에 대해 x 축에서 그래프의 점을 통해 최적의 곡선을 측정하였다.
<시험예>
본 발명에 따른 퇴행성 뇌질환을 진단하기 위한 메인 마커 및 서브 마커를 확인하기 위해, 정상 지원자, 경도인지장애 환자, 1기 치매 환자, 2기 치매 환자 및 3기 치매 환자로부터 혈액 샘플을 제공받고, 각 혈청에 존재하는 메인 마커 및 서브 마커의 수준을 측정하였다. 2020년 8월 5일부터 2020년 10월 31일까지 강원도 춘천새윤요양병원에서 모집된 지원자의 샘플을 사용하고, 정보 제공의 서면 동의하였다.
정상 지원자 10명으로부터 받은 샘플을 정상 대조군(Normal)으로 분류하고, 경도인지장애 환자 및 1기 치매 환자 23명으로부터 받은 샘플을 제1실험군(경도인지장애/치매 1기)으로 분류하고, 2기 치매 환자 및 3기 치매 환자 22명으로부터 받은 샘플을 제2실험군(치매 2기/치매 3기)으로 분류하였다. 상기 실시예의 방법을 이용하여 각 분류된 대조군 및 실험군들의 혈액 샘플로부터 Aβ40(아밀로이드 베타 40), Aβ42(아밀로이드 베타 42), BDNF(뇌유래신경성장인자), GFAP(Glial fibrillary acidic protein), NSE(neuron-specific enolase), Tau(타우), UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1), CRMP2(collapsing response mediator protein-2), CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels), Pin1(peptidyl-prolyl isomerase), AT180(Phospho-Tau) 또는 HCY(Homocystein)의 수준을 측정하였다.
상기 도 2 내지 도 13에 나타난 바와 같이, 메인 마커인 Aβ40(아밀로이드 베타 40), Tau(타우), NSE(neuron-specific enolase), 및 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)의 수준이 정상 대조군(Normal)에 비해 제1실험군(경도인지장애/치매 1기) 및 제2실험군(치매 2기/치매 3기)에서 유의하게 높은 것으로 나타났다. 메인 마커인 Aβ42(아밀로이드 베타 42), BDNF(뇌유래신경성장인자) 및 UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1)의 수준은 정상 대조군(Normal)에 비해 제1실험군(경도인지장애/치매 1기) 및 제2실험군(치매 2기/치매 3기)에서 유의하게 낮게 나타났다.
또한, 서브 마커인 CRMP2(collapsing response mediator protein-2), CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels)의 수준은 정상 대조군(Normal)에 비해 제1실험군(경도인지장애/치매 1기)에서 유의하게 높으나, 제2실험군(치매 2기/치매 3기)에서 유의하게 낮은 것으로 나타났다. 서브 마커인 AT180(Phospho-Tau) 및 HCY(Homocystein)의 수준은 정상 대조군(Normal)에 비해 제1실험군(경도인지장애/치매 1기) 및 제2실험군(치매 2기/치매 3기)에서 유의하게 높은 것으로 나타났다. 서브 마커인 Pin1(peptidyl-prolyl isomerase)의 수준은 정상 대조군(Normal)에 비해 제1실험군(경도인지장애/치매 1기) 및 제2실험군(치매 2기/치매 3기)에서 유의하게 낮게 나타났다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
Claims (15)
- Aβ42(아밀로이드 베타 42), CRMP2(collapsing response mediator protein-2), 및 CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels)를 유효성분으로 포함하는 정상인과 경도인지장애 및 치매 1기(경도/치매1기)를 구분하는 진단용 마커 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 포스포-타우(Phospho-Tau), UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1), Pin1(peptidyl-prolyl isomerase), 및 HCY(Homocystein)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 정상인과 경도인지장애 및 치매 1기(경도/치매1기)를 구분하는 진단용 마커 조성물.
- Aβ40(아밀로이드 베타 40), 포스포-타우(Phospho-Tau), 및 CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels)를 유효성분으로 포함하는 정상인과 치매 2기 및 치매 3기(치매2기/치매3기)를 구분하는 진단용 마커 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 조성물은 GFAP(Glial fibrillary acidic protein), NSE(neuron-specific enolase), Tau(타우), UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1), Pin1(peptidyl-prolyl isomerase), 및 HCY(Homocystein)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 정상인과 치매 2기 및 치매 3기(치매2기/치매3기)를 구분하는 진단용 마커 조성물.
- Aβ40(아밀로이드 베타 40), GFAP(Glial fibrillary acidic protein), CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels) 및 CRMP2(collapsing response mediator protein-2)를 유효성분으로 포함하는 경도인지장애 및 치매 1기(경도/치매1기)와 치매 2기 및 치매 3기(치매2기/치매3기)를 구분하는 진단용 마커 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 조성물은 포스포-타우(Phospho-Tau), BDNF(뇌유래신경성장인자), 또는 Tau(타우)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 경도인지장애 및 치매 1기(경도/치매1기)와 치매 2기 및 치매 3기(치매2기/치매3기)를 구분하는 진단용 마커 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 마커 조성물의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 정상인과 경도인지장애 및 치매 1기(경도/치매1기)를 구분하는 진단용 키트.
- 제7항에 있어서, 상기 마커 조성물의 수준을 측정하는 제제는 각각의 마커에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 정상인과 경도인지장애 및 치매 1기(경도/치매1기)를 구분하는 진단용 키트.
- 제7항에 있어서, 키트는 혈장 내에 존재하는 마커의 수준을 0.3 pg/ml 내지 50 ng/ml 농도 범위로 측정하는 것을 특징으로 하는 정상인과 경도인지장애 및 치매 1기(경도/치매1기)를 구분하는 진단용 키트.
- 제3항 또는 제4항의 마커 조성물의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 정상인과 치매 2기 및 치매 3기(치매2기/치매3기)를 구분하는 진단용 키트.
- 제5항 또는 제6항의 마커 조성물의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 경도인지장애 및 치매 1기(경도/치매1기)와 치매 2기 및 치매 3기(치매2기/치매3기)를 구분하는 진단용 키트.
- 대상체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Aβ42(아밀로이드 베타 42), CRMP2(collapsing response mediator protein-2), 및 CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels)로 이루어진 마커들의 수준을 측정하는 단계;
상기 생물학적 시료로부터 포스포-타우(Phospho-Tau), UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1), Pin1(peptidyl-prolyl isomerase), 및 HCY(Homocystein)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 마커의 수준을 측정하는 단계; 및
상기 마커들의 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 정상인과 경도인지장애 및 치매 1기(경도/치매1기)를 구분하기 위한 정보 제공 방법. - 제12항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 조직, 소변, 타액 및 뇌척수액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 정상인과 경도인지장애 및 치매 1기(경도/치매1기)를 구분하기 위한 정보 제공 방법.
- 대상체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Aβ40(아밀로이드 베타 40), 포스포-타우(Phospho-Tau), 및 CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels)로 이루어진 마커들의 수준을 측정하는 단계;
상기 생물학적 시료로부터 GFAP(Glial fibrillary acidic protein), NSE(neuron-specific enolase), Tau(타우), UCH-L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1), Pin1(peptidyl-prolyl isomerase), 및 HCY(Homocystein)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 마커의 수준을 측정하는 단계; 및
상기 마커들의 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 정상인과 치매 2기 및 치매 3기(치매2기/치매3기)를 구분하기 위한 정보 제공 방법. - 대상체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Aβ40(아밀로이드 베타 40), GFAP(Glial fibrillary acidic protein), CaV2.2(N-type voltage-gated calcium channels) 및 CRMP2(collapsing response mediator protein-2)로 이루어진 마커들의 수준을 측정하는 단계;
상기 생물학적 시료로부터 포스포-타우(Phospho-Tau), BDNF(뇌유래신경성장인자), 또는 Tau(타우) 마커의 수준을 측정하는 단계; 및
상기 마커들의 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 경도인지장애 및 치매 1기(경도/치매1기)와 치매 2기 및 치매 3기(치매2기/치매3기)를 구분하기 위한 정보 제공 방법.
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