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Die vorliegende Erfindung betrifft einen Testkit und ein Verfahren zur Bestimmung der on Willebrand Faktor-spaltenden Protease sowie die Anwendung des Verfahrens zur Differential agnostik der thrombotisch thrombozytopenischen Purpura (TTP) und des hämolytisch-uramiscien Syndroms (HUS) Mangel an von Willebrand Faktor-spaltender Protease wurde bei Patienten mit TTP festgestellt, während Patienten mit hämolytisch-urämischem Syndrom (HUS) eine normale Aktivität der on Willebrand Faktor-spaltenden Protease aufwiesen. Abgesehen von den bisher bereits beschn be- nen verschiedenen aufwendigen Verfahren (Blood 1996 ; 87 : 4223) ist zur Zeit kein Bestimmu gs- verfahren der Aktivität der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease verfügbar.
Ein einfac es Bestimmungsverfahren würde die Unterscheidung zwischen TTP und HUS erleichtern und so ein besseres Monitoring der Therapie von Patienten mit TTP erlauben.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass ein Testkit, bestehend aus einer von 1Iebrand Faktor-Standardpräparation, die frei von von Willebrand Faktor-spaltender Aktivität ist, als Substrat für die von Willebrand Faktor-spaltende Aktivität in einer Probe oder im Patientenpla ma und einem System zur quantitativen Bestimmung der Bindung von von Willebrand Faktor an 01lagen die Analytik der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease und die Differentialdiagnostik zwischen Patienten mit thrombotisch thrombozytopenischer Purpura und Patienten mit häm ly- tisch-urämischem Syndrom erstmals auf einfache Weise ermöglicht.
Die von Willebrand Fa or- Standardpräparation kann dabei sowohl spezifisch hinsichtlich von Willebrand Faktor-spalte der Protease inaktiviert sein, es kann dabei aber ebenso eine generell Protease-inaktivierte von 1Iebrand Faktor-Standardpräparation verwendet werden.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Testkits erfolgt die q an- t ! tative Bestimmung der Collagen-Bindungsaktivität an immobilisiertem aviden Collagen, weiches vorzugsweise an eine Mikrotiterplatte gebunden vorliegt.
Günstig ist dabei, wenn das immobilisierte Collagen kovalent gebunden ist.
Weiters ist dabei vorteilhaft, wenn das avide Collagen ein enzymatisch abgebautes, löslic es, humanes Collagen ist.
Vorzugsweise ist die von Willebrand Faktor-Standardpräparation ein humanes Referenz ? as- ma, bel welchem die von Willebrand Faktor-spaltende Proteaseaktivität inaktiviert ist.
Gemäss noch einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die von Willebrand Fa or- Standardpräparation ein rekombinanter von Willebrand Faktor ist.
Günstig ist auch, wenn die von Willebrand Faktor-Standardpräparation ein von Willebrand aktor-Dimer ist.
Weiters betrifft die vorliegende Erfindung auch noch ein Verfahren zum Nachweis eines e or- benen oder kongenitalen Mangels der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease, wobei eine on Willebrand Faktor-Standardpräparation, die frei von von Willebrand Faktor-spaltender Aktivitat ist, als Substrat mit der von Willebrand Faktor-spaltenden Aktivität des Patientenplasmas oder Ver ün- nungen desselben in Kontakt gebracht wird und nach Inkubation die quantitative Detektion es residualen von Willebrand Faktors durch seine Bindungseigenschaften an Collagen erfolgt.
Die beiliegenden Abbildungen zeigen das erfindungsgemässe Testprinzip und die Anwend ng zur Diagnostik von Patientenplasmen. Die Übereinstimmung der komplizierten SDS-Agarose elelektrophoretischen Qualifizierung mit anschliessendem Immunblotting mit der quantitativen Me hode des erfindungsgemassen Collagen-Bmdungstests (CBA) ist ebenfalls in den beiliegenden A bildungen dargestellt.
Erfindungsgemäss wurden Verdünnungen von Patlenten- und Normalplasmen mit Barium ktiviert und mit unverdünntem vWF-Substrat versetzt. Als Substrat wurde ein Protease-inaktivie'tes Plasma benutzt. Nach zwei Stunden Verdauung in Anwesenheit von Urea wurde die Reaktion gestoppt und das Inkubationsgemisch auf eine ELISA-Platte gegeben, die zuvor mit Collagen beschichtet worden war. Die langen vWF-Multimere binden sehr stark an das Collagen, die klei en Moleküle kaum oder gar nicht. Der Überstand wird sodann verworfen und die vWF-Moleküle, die an das Collagen gebunden wurden, können mittels allgemein bekannter Verfahren des Standes der Technik detektiert werden, z. B. mit Hilfe Peroxidase-markierter Antikörper angefärbt werden Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die beiliegenden Abbildungen n her erläutert.
Es zeigen
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Fig. 1 das Pnnzip des erfindungsgemässen Kollagen-Bindungstests,
Fig. 2 die Wirkung der Protease mit vWF-spaltender Aktivität,
Fig. 3 die Wirkung der Protease mit vWF-spaltender Aktivität auf die vWF-Untereinheit,
Fig. 4 die Testkalibrierung,
Fig. 5 die Bestimmung der vWF-spaltenden Protease in Patienten mit thrombotisch thrombo- zytopenischer Purpura,
Fig. 6 die Bestimmung der vWF-spaltenden Protease in einem Patienten mit thrombotisch thrombozytopenischer Purpura während der therapeutischen Behandlung, und
Fig. 7 die quantitative Bestimmung der vWF-spaltenden Protease in gereinigten Plasmafrak- tionen.
In dem erfindungsgemässen Test (Fig. 1) wird die unterschiedliche Affinität der verschiedenen langen vWF-Multimere ausgenützt. Die langen Multimere haben eine sehr hohe Affinität zu Collagen, während die kleinen Moleküle keine oder nur geringe Affinität aufweisen.
Der vWF besteht aus verschiedenen langen Multimeren derselben Untereinheit. Die Unterenheiten sind jeweils an den Carboy- un an den Aminotermini durch Disulfidbrücken miteinander verbunden (Fig. 2). Jede Untereinheit kann bei Tyrosin842-Methionin843 durch die vWF-Protease gespalten werden (Fig. 3).
Unter diesen Bedingungen wurde mit verschiedenen Normalplasmaverdünnungen eine Eichkurve erstellt (Fig. 4). Auf der Y-Achse ist die Extinktion bei 492 nm aufgetragen, auf der X-Achse die Normalplasmaverdünnungen. Es wird angenommen, dass eine Verdünnung von Normalplasma von 1/20 einer Aktivität von 100% entspricht. Je mehr vWF-spaltende Protease im Gemisch vorhanden ist, desto stärker wird der vWF verdaut, desto weniger kann er an Collagen binden und um so kleiner wird die Extinktion.
In Fig. 5 sind die Untersuchungen an zwei Familien dargestellt, deren Mitglieder an hereditärer TTP leiden. Oben ist die Immunblotting-Methode, unten die Werte, die mit dem erfindungsgemÅa- ssen Collagen-Bindungsassay (CBA) erhalten wurden, dargestellt. Ganz links ist der Propositus, der homozygot defizient an vWF-spaltender Protease ist. Als nächster kommt der Bruder, ebenfalls homozygot defizient, die Schwester normal, beide Eltern obligatorisch heterozygot. Dort, wo man in der Immunblotting-Methode einen stark verdauten vWF sieht, erhielt man auch im erfindungsgemä- ssen CBA einen Wert um 100%, dort wo das Substrat nicht verdaut wurde, konnte auch im erfindungsgemässen CBA keine Aktivität festgestellt werden. Rechts sind Mitglieder derselben Familie, die alle homozygot defizient sind.
Ausserdem wurden auch Plasmen eines Patienten mit hereditärer TTP während der Therapie mit FFP untersucht (Fig. 6). Oben ist wiederum die Immunblotting-Methode, unten sind die Werte, die mit dem erfindungsgemässen CBA erhalten wurden, zu sehen. Ganz links ist eine Plasmaprobe aufgeführt, die vor der Therapie entnommen wurde. Die weiteren Proben sind nach einem ersten und einem zweiten Plasmaaustausch entnommen worden. Sowohl bei der Immunblotting-Methode als auch bel dem erfindungsgemässen Collagen-Bindungsassay kann eine Zunahme der Aktivität nach dem ersten Austausch, ein weiterer Anstieg nach der zweiten und danach eine Abnahme der Aktivität beobachtet werden.
Aus diesen Ergebnissen kann gefolgert werden, dass es möglich ist, mit Hilfe des erfindungsgemässen Collagen-Bindungsassays die Aktivität der vWF-spaltenden Protease auf einfache und schnelle Weise zu messen. Dadurch sollte die Diagnose und das Therapiemonitoring von Patienten mit TTP erleichtert werden.
Der Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens Ist die Möglichkeit zur quantitativen Auswertung und die einfachere und vor allem kürzere Durchführbarkeit, die in der Akutdiagnostik der lebensbedrohlichen Krankheitsbilder von entscheidender Bedeutung ist. Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemässen Tests verwendet zur quantitativen Bestimmung des Proteasesubstrates von von Willebrand Faktor den Collagen-Bindungsassay gemäss AT 403 853.
Eine weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung besteht in der quantitativen Bestimmung der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease bei der Reinigung und Charakterisierung als therapeutische Plasmafraktion oder zur Qualitätskontrolle von therapeutisch eingesetzten Voliplasmen.
Dies wird durch das nachfolgende Beispiel (siehe Fig. 7) näher erläutert :
Die von Willebrand Faktor-spaltende Protease (Multimerase) wurde gemäss AT 404 359 teilweise gereinigt. Zur weiteren chromatographischen Reinigung wurde die Multimerasepräparation
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auf eine Säule, gefüllt mit Fractogel TSK AF-Orange (Merck), aufgetragen und mit einem Pu fer- gradienten von pH 5, 5-pH 8, 5 in einem Trispuffer (10 mM Tris, 10 mM Na3. Citrat, 150 mM N CI) eluiert. In den Fraktionen wurde die UV-Absorption bei 280 nm (Gesamtprotein) und die Colla enBindungsaktivität eines von Willebrand Faktor-Standards nach erfindungsgemässer Inkubation mit den Fraktionen gemessen.
Der Kehrwert der Collagen-Bindungsaktivität wurde in das Elution ia- gramm eingetragen und zeigt, dass neben einem Teil der Proteaseaktivität, die sich im Säulendurchlauf (Fraktion 10-20) befindet, der Grossteil der Aktivität zwischen Fraktion 33 und 38 eil lert werden konnte
EMI3.1
PATENTANSPRÜCHE : 1.
Testkit zur Analytik der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease und zur Differentialdiagnostik zwischen Patienten mit thrombotisch thrombozytopenischer Purpura und atienten mit hämotytsch-urämischem Syndrom, bestehend aus einer von Willebrand Fa tor- Standardpräparation, die frei von von Willebrand Faktor-spaltender Aktivität ist, als Substrat für die von Willebrand Faktor-spaltende Aktivität in einer Probe oder im Patienenplasma und einem System zur quantitativen Bestimmung der Bindung von von Willebrand Faktor an Collagen.