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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Adhäsionsproteinen sowie Vorrichtungen zur Durchführung dieses Verfahrens.
Dem von Willebrand-Faktor (vWF) kommt eine besondere Bedeutung in der physiologischen Hämostase zu. Neben seiner Funktion als Carrier-Protein für Faktor VIII ist dieses Plasmaprotein vor allem für die Adhäsion von Thrombozyten an das geschädigte Endothel/Subendothel sowie für die Aggregation der Thrombozyten unter Scherstressbedingungen notwendig. Im ersten Schritt der primären Hämostase, der Adhäsion, fungiert der vWF als ein Bindeglied zwischen spezifischen Rezeptoren der Thrombozytenoberfläche, wie gplb-, gpllblllla-Komplex, und Komponenten des Endothel, beispielsweise Collagen.
In der Folge kommt es zu einer Formveränderung der Thrombozyten, der Sekretion von Inhaltsstoffen sowie schliesslich zur Bildung von Thrombozyten-Aggregaten, die auch durch vWF mediiert wird.
Die funktionelle Aktivität des vWF lässt sich Im wesentlichen mit Hilfe zweier verschiedener Testprinzipien ermitteln : der Bestimmung der Ristocetin-Cofaktor-Aktivität (RCoF) sowie der Collagen-Bindungs- Aktivität. Für die Routinebestimmung der vWF-Aktivität wird gegenwärtig der RCoF-Bestimmung die grösste Bedeutung zugemessen.
Grundprinzip der Bestimmung der Ristocetin-Cofaktor-Aktivität ist die Induzlerung der Agglutination von fixierten oder frisch präparierten gewaschenen Thrombozyten in Gegenwart von vWF durch das Antibiotikum Ristocetin (Weiss et al., J. Clin. Invest. 54 (1973), 2708-2716). Die Agglutination ist dabei von der Menge des vorhandenen aktiven vWF abhängig. Dessen Konzentration lässt sich aus einer photometrisch aufgenommenen Agglutinationskurve mit Hilfe eines Aggregometers im Vergleich zu einem geeigneten Standard bestimmen. Problematisch Ist jedoch bel diesem Test, dass die RCoF-Werte je nach ThrombozytenPräparation variieren können.
Ausserdem Ist dieser Test relativ unempfindlich, die Nachweisgrenze für den aktiven vWF liegt bei ungefähr 1 ng/ml. Darüberhinaus ist diese Funktion des vWF zur Aggregation von Thrombozyten in Gegenwart von Ristocetin eine unphysiologische und möglicherweise ein ungeeignete Modell der pnmären hämostatischen Aktivität. Dieses Modell wird lediglich zur Bestimmung des vWF herangezogen und ist auf weitere Adhäsionsproteine nicht übertragbar.
Das Prinzip der Agglutinometrie wird auch zur Bestimmung von Antigen/Antikörper-Wechseiwirkungen verwendet. So lassen sich Antikörper aufgrund physikalischer Adsorption (Crane, Clin. Chem. 27 (1981), 697-700) oder auch durch Bildung einer kovalenten Bindung (US-PS 4 480 042 ; US-PS 4 210 723 ; Thakkar et al., Clin. Chem. 37 (1991), 1248-1251) an Mikropartikel aus Kunstharzen Immobilisieren. Die Grösse und die optischen Eigenschaften der Teilchen sind dann abhängig von der Konzentration des betreffenden Antigens/Antikörpers, wodurch die Bestimmung der Konzentration des Antigens bzw. Antikörpers, beispielsweise mit Hilfe eines Aggregometers, nephelometrisch oder turbidimetrisch möglich ist.
Neben der RCoF-Bestimmung des vWF kommt einem anderen Modell eines Testsystems eine zunehmende diagnostische Bedeutung zu. Grundprinzip ist hierbei die Wechselwirkung des von WillebrandFaktors mit Collagen, einem funktionellen Protein der primären Haemostase. Die in den letzten Jahren entwickelten Collagen-Bindungs-Assays (CBA) erlauben eine Quantifizierung des von Willebrand-Faktors mit ähnlichen Ergebnissen wie bei der Bestimmung der Ristocettn-Cofaktor-Aktivität (Brown et al., Thromb. Res.
43 (1986), 303-311). Darüberhinaus bietet ein CBA die Möglichkeit, bei Patienten mit von WillebrandJürgens-Syndrom zwischen den Typen I und 11 zu differenzieren (Favaloro et al., Blood Coagulation and Fibnnolysis 2 (1991), 285-291). Ähnlich wie bei allgemein üblichen ELISA-Techniken lassen sich Mikrotiterplatten aufgrund physikalischer Adsorption mit Collagen beschichten. Danach erfolgt die Bindung des vWF aus einer Probe an das Collagen sowie die Detektion mit einem anti-vWF-Antikörper. Die bekannten vWFCBA-Systeme sind schlecht reproduzierbar und zeigen oft starke Schwankungen bei der Korrelation gegenüber den RCoF- oder den immunologischen vWF-Antigen-Bestimmungen.
Vor der Durchführung eines CBA musste auch die Mikrotiterplatte frisch mit Collagen beschichtet werden, um ausreichend Bindungssubstrat in seiner nativen Form zur Verfügung zu stellen. Diese Vorgangsweise erfordert viel Geschick und ist für Routineuntersuchungen, vor allem für die Kontrolle von vWF-Präparaten ungeeignet.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabenstellung zugrunde, verbesserte quantitative Bestimmungsverfahren für die Aktivität eines von Willebrand-Faktors und/oder von weiteren Adhäsionsproteinen zu entwickeln, welche ein einfaches aber exaktes Bestimmen der Proteine ermöglichen. Das neue Bestimmungsverfahren soll insbesondere zur Kontrolle der Qualität von hochkonzentrierten vWF-Präparaten geeignet sein.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Adhäsionsproteinen in einer Probe, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass avides Collagen an eine feste Phase kovalent fixiert, das Adhäsionsprotein aus der Probe an das Collagen gebunden wird und das gebundene Adhäsionsprotein bestimmt wird.
Avides Collagen, also Collagen, das eine ausserordentlich hohe Bindungskapazität zur Adhäsion von Proteinen besitzt, ist gekennzeichnet durch eine Vielzahl von zugänglichen Bindungsstellen für das zu
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bestimmende Adhäsionsprotein. Dabei sind vor allem die Bindungsstellen für die Avidität bzw. Bindungsfunktion des Collagens verantwortlich, die die rasche Adhäsion des Bindungssubstrates ermöglichen mit einer ausreichenden Adhäsionskraft. Die Kriterien zur Auswahl eines geeigneten Collagens sind vielfältig.
Einerseits kann von einem Material ausgegangen werden, welches bekanntermassen die geeigneten Bindungsfähigkeiten besitzt und gegebenenfalls zur Erhöhung der Stabilität prozessiert wird. Die Prozessierung kann aber auch mit dem Ziel der Vergrösserung bzw. Homogenität der Oberfläche des immobilisierten Collagens erfolgen, was Voraussetzung für das reproduzierbare Ausmass der Adsorption eines Bindungspartners ist.
Die Avidität eines Collagens wird bevorzugterweise im bereits immobilisierten Zustand, also gebunden an einem Träger, bestimmt mit einer Standardpräparation, welche üblicherweise für die Kalibrierung von entsprechenden ELISA-Systemen verwendet wird. Die Bestimmung der Avidität wird dabei zweckmässigerweise unter gleichen Bedingungen durchgeführt, wie bei der Bestimmung des Adhäsionsproteins.
Im Gegensatz zu den CBA des Standes der Technik, bei denen das "Coating" einer festen Phase mit Collagen üblich ist, ist. es erstmals durch das erfindungsgemässe Testsystem möglich, ein reproduzierbares, lagerstabiles und damit kommerziell einsetzbares Verfahren bzw. Mittel zur Verfügung zu stellen, welches auch für Routineuntersuchungen einsetzbar ist.
Es war nicht vorauszusehen, dass ein Collagen in chemisch fixierter Form noch als Rezeptor für ein Adhäsionsprotein eingesetzt werden kann. Um nämlich die irreversible Änderung bzw. Denaturierung des Collagens zu vermeiden, was eine stark reduzierte Aktivität und Avidität zur Folge hätte, wurde bei den CBA des Standes der Technik darauf geachtet, die Nativität und Struktur des Collagens nicht zu beeinträchtigen und in schonender Weise eine Beschichtung vorzunehmen, die allein auf nicht-kovalente Wechselwirkungen beruht.
Die von Brown et al. und Favaloro et al. für die CBA verwendeten Collagen lösungen waren äusserst hochkonzentriert (33 bzw. 50 oder 100 ug/ml). Reihenversuche hatten gezeigt, dass eine Mindestkonzentration von 50/. Lg/ml zur Vorbereitung des Collagenimmobilisates erforderlich ist. Diese grossen Mengen an Collagen waren vor allem deshalb notwendig, um eine zur Detektion ausreichende Menge an vWF zu binden, da das verwendete Collagen an sich nicht hinsichtlich dessen Avidität ausgewählt wurde.
Dieses Collagen behält auch nach dessen Prozessierung und Desintegration durch mechanische oder proteolytische Behandlung die Affinität zum Adhäsionsprotein, welche Affinität durch diese Behandlung noch zusätzlich gesteigert werden kann.
Ein besonders bevorzugtes Adhäsionsprotein, welches mit dem erfindungsgemässen Verfahren bestimmt werden kann. ist vWF oder eine vWF-Fraktion, insbesondere hochmolekularer vWF, wobei vorzugsweise dessen primäre hämostatische Aktivität ermittelt wird. Andere Beispiele für Adhäsionsproteine umfassen Proteine, welche in vivo mit Collagen wechselwirken, oder therapeutische Proteine mit einer
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Fibrinogen, Antikörper, oder deren Analoge bzw. Derivate. Prinzipiell können aber sämtliche Proteine oder Substanzen mit einer Affinität zu Collagen mit dem erfindungsgemässen Verfahren quantitativ bestimmt werden. Die Bestimmung ist nicht nur eine quantitative oder semiquantitative sondern auch eine qualitative. da die spezifische Bindungsaktivität als ein Parameter zur Charakterisierung des Adhäsionsproteins herangezogen wird.
Bevorzugterweise wird als avides Collagen ein natives Collagen oder Collagenderivat eingesetzt, welches eine Bindungskapazität von mindestens einer RCoF-Einheit vWF/mg, vorzugsweise mehr als 10 RCoF-Einheiten/mg, am meisten bevorzugt mehr als 100 RCoF-Einheiten/mg, aufweist.
Erfindungsgemäss wird auch bevorzugterweise ein natives Collagen oder Collagenderivat mit einer Bindungskapazität von mindestens 13 ug vWF-Antigen/mg, vorzugsweise mehr als 130 u. g/mg, und insbesondere mehr als 1300 ug/mg, an eine feste Phase kovalent fixiert. Zu den erfindungsgemäss verwendeten Collagenderivaten zählen Fragmente, chemisch modifizierte, strukturell veränderte Proteine bzw. Polypeptide, die von Collagen abgeleitet sind und Bindungsstellen für die Adhäsionsproteine enthalten, beispielsweise ein Minicollagen (Analytical Biochemistry 231, 57-64 (1995). Das avide Collagen, welches erfindungsgemäss eingesetzt wird, ist vorzugsweise aus niedermolekularem Collagen, aus proteolytisch prozesslertem, desintegriertem und homogenisiertem Collagen ausgewählt.
Collagen humanen Ursprungs, vorzugsweise vom Typ 111 (insbesondere aus humaner Placenta), stellt dabei ein ganz besonders bevorzugtes Collagen dar. Jedoch sind auch Collagen vom Typ I, beispielsweise aus Rindern, Pferden oder Schweinen, zur Verwendung im erfindungsgemässen Testsystem geeignet.
Die Bestimmung des gebundenen Adhäsionsproteins, insbesondere des gebundenen vWF, kann auf vielfältige Weise realisiert werden : beispielsweise durch eine Antigen-Antikörperreaktion unter Verwendung eines markierten Antikörpers, durch die Messung der Änderung der optischen Dichte, durch Aggregometrie oder durch Anwendung einer Lichtstrahimethode, insbesondere durch dynamische Lichtstreuung, mit
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welcher der hydrodynamische Radius von vWF/Collagenpartikel-Komplexen bestimmt werden kann, wobei die Menge an gebundenem vWF dabei direkt mit der ermittelten Grösse der Komplexe korreliert. Daneben können aber auch für das jeweilige Adhäsionsprotein spezifische Verfahren zur Bestimmung des gebundenen Adhäsionsproteins herangezogen werden, z. B.
Im Falle von vWF oder anderen Blutplättchen-bindenden Proteinen, durch die Bindung von Blutplättchen oder deren Äquivalenten.
Beispielsweise kann mit vWF eine Agglutination von Collagenbeschichteten Microcarnern, beispielsweise Latex-Collagen-Partikeln, nach einem aktiven Prinzip induziert werden. Die Agglutination der Partikel Ist dabei von der Menge des vWF abhängig. Analog zur Ristocetin-induzierten Agglutination von Thrombozyten durch vWF kann auch hier mit Hilfe eines Aggregometers eine Aggregationskurve erstellt werden, aus der sich die vWF-Konzentration auf Basis der Collagen-Bindung berechnen lässt.
Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich im Vergleich zur Bestimmung des Ristocetin-Cofaktors einfacher standardisieren, da keine Thrombozyten verwendet werden müssen, deren Herkunft das Ergebnis beeinflussen kann. Es stellt auch ein physiologischeres Testsystem dar und bietet weiters eine gegenüber den herkömmlichen Testsystemen stark erhöhte Empfindlichkeit. Die im Stand der Technik üblichen Detektionsgrenzen für CBA werden weit unterboten. So kann eine Detektionsgrenze von unterhalb 30 ng/ml Probe, bevorzugterweise weniger als 20 ng/ml, am meisten bevorzugt weniger als 10 ng/ml, erreicht werden.
Darüberhinaus werden die Verhältnisse bei der physiologischen Hämostase simuliert : Die Adhäsion der Thrombozyten an das Collagen des Endothels/Subendothels sowie deren Aggregation wird von der physiologischen vWF-Aktivität vermittelt.
Das Prinzip der Wechselwirkung des vWF mit an künstlichen Oberflächen fixierten Collagenen lässt sich auch auf herkömmliche Collagen-Bindungs-Assays zur Detektion anderer Adhäsionsproteine ausdehnen. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass die erfindungsgemässen Systeme, bei denen eine kovalente Bindung zwischen Mikrotiter-Platte und Collagen geknüpft ist, eine erhöhte Reproduzierbarkeit der Messergebnisse erlauben.
In einer weiteren Ausführungsform wird Collagen in der oben dargestellten Weise kovalent an eine Mikrotiterplatte aus Polystyrol oder ein Trägerpartikel gebunden. Nach erfolgter Immobilisierung wird das Collagen mittels eines proteolytischen Enzyms (z. B. Pepsin und/oder anderer Proteasen mit einem pHOptimum im sauren Bereich) partiell verdaut, so dass nur jene Strukturen des Collagen am Träger gebunden bleiben, die dem löslichen Anteil des aviden Collagens entsprechen. Dadurch wird die Raumstruktur des Collagen insoweit geändert, dass Bindungsepitope für die später zu quantifizierenden Adhäsionsproteine an der Oberfläche des Trägers exponiert werden.
Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass Collagen in seiner nativen Struktur an die Trägermatrix gebunden wird und eine vorhergehende Denaturierung, z. B. durch ein proteolytisches Enzym, nicht erforderlich ist. Damit können jene Moleküle, die an natives Collagen binden, nicht aber mit denaturiertem Collagen in Wechselwirkung treten können, quantifiziert werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird natives Collagen in einer Suspension an eine aktivierte Trägermatrix kovalent gebunden. Überschüssiges Protein, welches nach dieser Prozedur an der Matrix adsorptiv gebunden vorliegt, wird durch Behandlung mit einem chaotropen oder denaturierenden Reagens (z. B. Harnstoff, Guanidinium-Hydrochlorid, Thiocyanate, Detergentien etc. ) durch Waschen der mit Collagen
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Collagen in einer Struktur fixiert wird, die dem nativen Zustand möglichst ähnlich sein soll.
Für die kovalente Fixierung der aviden Collagen an geeignete Oberflächen steht ähnlich wie bel der kovalenten Kupplung von Antikörpern an Latex-Partikel eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung. So kann beispielsweise eine Fixierung durch direkte Kupplung der pnmären Aminofunktion der Collagene an epoxyaktivierte Partikel erfolgen. Eine weitere Möglichkeit der Immobilisierung besteht in der CarbodiimidKupplung an Partikel oder Oberflächen, die eine freie Carboxylgruppe oder primäre Aminogruppe tragen.
Die Carbodiimid-Kupplung kann bei pH-Werten von 4 bis 5 durchgeführt werden, ein Bereich, bei denen Collagene eine besonders hohe Löslichkeit aufweisen. Denkbar ist auch die Verwendung des heterobifunktionellen SPDP-Reagens (Pharmacia, Uppsala, Schweden) sowie allgemein die Kupplung des Collagens über Spacer-Moleküle.
Weiters lassen sich Maleinsäure-Anhydrid aktivierte Polystyrol-Platten bei neutralem pH-Wert sehr leicht bel Raumtemperatur mit Collagen unter Ausbildung einer Amidbindung beschichten. Zur Beschichtung wird wie erwähnt vorzugsweise Typ-III-Collagen humanen Ursprungs, insbesondere aus menschlicher Plazenta, verwendet, wobei sich eine Konzentration von nicht mehr als 2 u-g/ml als ausreichend erwiesen hat. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Assays wird dieser Collagen-Typ auch als pepsinverdautes Material eingesetzt. Die so beschichteten Platten lassen sich aus wässriger Lösung heraus sehr leicht gefriertrocknen, wonach eine Lagerung der Platten bei 4. C unter Sauerstoff- und Feuchtigkeitsabschluss über mehrere Monate möglich ist.
Auf diese Weise hergestellte Mikrotiterplatten
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eignen sich sehr gut für eine schnelle Durchführung eines Collagen-Bindungs-Assays für diagnostische Zwecke. Die Nachweisgrenze für vWF liegt dabei in der Grössenordnung um 10 bis 20 ng/ml.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemässen Bestimmungsverfahrens, welche eine feste Phase, an der avides Collagen kovalent fixiert ist, umfasst. Diese feste Phase kann einerseits separat von einem Behälter, der zur Aufnahme der Probe geeignet ist, angeboten werden oder selbst als ein Tell des Behälters bzw. als Behälter ausgebildet sein.
Vorzugsweise umfasst die erfindungsgemässe Vorrichtung auch den Proben-Behälter, also z. B. als Mikrotiterplatte, Küvetten, Perfusionskammern, Kapillaren, deren Ausnehmungen bzw. Oberflächen das kovalent fixierte avide Collagen enthalten.
Die feste Phase umfassend das immobilisierte avide Collagen kann aber auch als Körper zur Einführung in einen Proben-Behälter ausgebildet sein, etwa als Kamm passend zu einer Mikrotiterplatte oder als Kügelchen bzw. Granulat. Geeignete Körper sind beispielsweise Mikropartikel, vorzugsweise aus Polystyrol,
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von Fibnn oder Collagen, an welchen das avide Collagen kovalent fixiert ist. Diese Mikropartikel können vorzugsweise markiert sein, beispielsweise durch einen Farbstoff, Fluoreszenzmarker oder durch magnetische Eigenschaften, wobei die Markierung direkt am Partikel angebracht ist oder über einen Vermittler.
Das immobilisierte Collagen kann zur Bindung des vWF im statischen, aber auch in einem dynamischen Analysensystem eingesetzt werden. Die Bindung des von Willebrand-Faktors an Oberflächen unter Flussbedingungen ist auch von den dabei auftretenden Scherkräften und von der Zusammensetzung der Lösungen, in welchen diese Adhäsion auftritt, abhängig. Entsprechend werden Modelle eingesetzt, bei welchen Suspensionen von Blutplättchen oder Blut durch Kapillaren oder Kammern gepumpt werden, in welchen den perfundierten Lösungen Oberflächen angeboten werden, die mit speziellen Bindungseigenschaften für Proteine aus den Perfusaten ausgestattet sind.
Im Stand der Technik wurden bisher in solchen Perfusionskammern physikalisch mit Collagen beschichtete Oberflächen verwendet und diese anschliessend mit Vollblut perfundiert, wobei die dann resultierenrende Adhäsion von Thrombozyten an die Collagenschicht durch den von Willebrand-Faktor, der im Vollblut auch enthalten ist, mediiert wird. Die gebundenen Zellen können dann durch konventionelle Färbetechniken nach Fixierung sichtbar gemacht und unter dem Mikroskop qualitativ und auch quantitativ über Mikrodensitometrie beurteilt. Dazu stehen auch Methoden der Bildanalyse über Videosysteme zur Verfügung (Sakariassen et al., Meth. Enzymol. 169, 37-104, 1989). Diese Methoden lassen sich durch das erfindungsgemässe Verfahren insoweit verbessern, als das Collagen in der Kammer bzw. an der Kapillare kovalent gebunden vorliegt.
Damit wird erstens eine maximale Homogenität der immobilisierten Collagenschicht erreicht und zweitens verhindert, dass das gebundene Gollagen im Zuge der Perfusion der Kapillaren oder Kammern von der Oberfläche desorbiert.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung liegt diese In lagerstabiler Form vor, vorzugsweise in gefriergetrockneter Form.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Set zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens, welches a) eine erfindungsgemässe Vomchtung mit einer festen Phase, an die das avide Collagen fixiert ist, und b) eine Komponente enthaltend eine standardisierte Aktivität des Adhäsionsproteins, vorzugsweise des vWF, enthält.
Als bevorzugter Standard zur Kalibrierung des Testsystems wird ein Referenzplasma oder ein hochgereiniger vWF, insbesondere rvWF, oder eine Fraktion des vWF eingesetzt mit definierter Aktivität.
Die Vorrichtung und die Komponente des erfindungsgemässen Sets werden vorzugsweise in lagerstabiler Form zur Verfügung gestellt, insbesondere in gefriergetrockneter bzw. Iyophilisierter Form.
Weiters kann das erfindungsgemässe Set auch Mittel zur Bestimmung des gebundenen Adhäsionsproteins, insbesondere des vWF, enthalten. Beispiele für solche Mittel umfassen markierte Antikörperpräpara- tionen, insbesondere monoklonale Antikörper gegen das Adhäsionsprotein, separate Behälter zur Aufnahme von Detektionslösungen und Reagenzien.
Die Detektion erfolgt vorzugsweise nach Reaktion mit einem markierten Substrat, wobei als Marker Fluorogene, Chromogene, radioaktive Substanzen, Luminogene, etc. eingesetzt werden können.
Schliesslich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemä- ssen Vorrichtung, weiche das Bereitstellen einer Lösung eines aviden Collagens, das chemische Fixieren des Collagens an den festen Träger, insbesondere ohne wesentliche Vernetzung des Collagens, und gegebenenfalls das Gefnertrocknen umfasst. Dabei kann das Verfahren mit sehr niedrigen Konzentrationen
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des aviden Collagens durchgeführt werden, vorzugsweise mit weniger als 20 ug avidem Collagen pro mi Ausgangslösung, insbesondere mit weniger als 10 ug/ml.
Es ist zu betonen, dass das erfindungsgemässe Verfahren gleichermassen zur quantitativen, semiquantita- teven oder qualitativen Bestimmung von plasmatischem bzw. rekombinantem von Willebrand Faktor geeignet ist. So kann als Probe entweder Plasma oder eine Plasmafraktion untersucht werden. Ein wesentlicher Vorteil besteht jedoch durch die Möglichkeit der Testung von hochkonzentrierten, hochaktiven physiologischen vWF-Präparationen.
So konnten überraschenderweise spezifische Aktivitäten von mindestens 40 E/mg. bevorzugterweise mehr als 50 E/mg, bis zur theoretischen spezifischen Aktivität getestet werden.
Das erfindungsgemässe Bestimmungsverfahren beinhaltet üblicherweise eine Inkubation des Collagenimmobilistes mit einer Probe, wobei unterschiedliche Verdünnungen der Probe und gegebenenfalls ein Kalibrator eingesetzt werden. Die Inkubation wird vorzugsweise bei 18 bis 37*C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, für einen Zeitraum von 10 min bis 3 h, vorzugsweise 30 min bis 1 h, vorgenommen. Anschliessend wird die restliche Probe abgetrennt, gegebenenfalls der feste Träger gewaschen und mit einem Reagens in Kontakt gebracht zur Induktion einer Detektionsreaktion bzw. mit direkten Detektionsmethoden das gebundene Adhäsionsprotein bestimmt. Durch einen Vergleich mit einer Standardpräparation wird die Konzentration des Adhäsionsproteins in der Probe ermittelt.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen und den Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, näher erläutert.
Die Fig. 1 und 2 verdeutlichen das Prinzip eines Collagen-Bindungs-Tests unter Verwendung von Mikrotiterplatten, an denen menschliches Typ-III-Collagen kovalent fixiert ist. wobei Fig. 1 der Durchführung eines Collagen-Bindungs-Tests gemäss Beispiel 1 unter Verwendung eines mit Meerrettich-Peroxidase konjugierten, polyklonalen Antikörpers zur Detektion des gebundenen vWF entspricht. Fig. 2 beschreibt eine bevorzugtere Variante unter Benutzung eines biotmylierten, polyklonalen Antikörpers (Beispiel 3). In den Test werden jeweils verschiedene Verdünnungen des vWF eingesetzt und die Absorptionen mittels eines ELISA-Readers bestimmt. Beide Figuren zeigen die gemessenen Absorptionen als Funktion der im Test eingesetzten vWF-Menge am Beispiel eines Referenzplasmas.
Aus einer solchen Kurve, die als Standard dienen kann, und einer Verdünnungsreihe der Probe lässt sich die Collagen-Bindungs-Aktivität der Probe bestimmen (Parallel Line Assay). Der optimale Arbeitsbereich für Variante 1 liegt bei einer Konzentration des vWF Im Bereich von 50 bis 250 ng/mi bel einer Nachweisgrenze von 20 ng/ml. Für die empfindlichere Variante 2 liegt das Optimum zwischen 20 und 200 ng/ml bei einer Nachweisgrenze von 5 ng/ml.
Fig. 3 zeigt die Bedeutung des Collagen-Bindungs-Tests im Hinblick auf strukturelle Änderungen des vWF im Vergleich zur Bestimmung des Ristocetin-Cofaktors (Beispiel 13) am Beispiel der Kinetik einer Plasmin-Verdauung von rekombinantem vWF (Beispiel 11). Als Vergleich ist in dieser Grafik der prozentuale Abbau der Multimere (Beispiel 12) eingesetzt. Die Fig. sowie die Daten der Tabelle verdeutlichen, dass zwar die Collagen-Bindungs-Aktivität als auch der Ristocetin-Cofaktor mit steigendem Abbau der Multimeren abnimmt, die Bestimmung der Collagen-Bindungsaktivät aber ein Testsystem darstellt, das sich von der Ristocetin-Cofaktor-Aktivität deutlich unterscheidet.
Beispiele Beispiel 1 :
Zu einer Mikrotiterplatte aus Polystyrol (96 weit, Pierce Reactibind/Matemsäureanhydrid aktiviert) werden pro Napf 100 ul Suspension von pepsinverdautem Typ lU-Collagen (Southern Biotechnology) aus humaner Plazenta bei einer Konzentration von 2 ug/mt gegeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. anschliessend für 30 min mit jeweils 150 III Blockpuffer (Pierce SuperBlock). Dann werden jeweils 100 ul verschiedener Verdünnungen der von Willebrand-Faktor enthaltenden Probe aufgetragen (25-250 ng vWF/ml). Danach wird mit 100 jj. 1 einer Lösung eines Peroxidase-konjugierten anti-vWF-Antikörpers Inku-
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stimmt.
Nach jedem lnkubationsschritt wird jeweils mit 3mal 150 Ill-Puffer (Puffer entsprechend der jeweils nächsten Stufe) gewaschen.
Verwendetes Puffersystem :
Puffer 1 (für die Collagenbeschichtung und Antikörperverdünnung) :
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8 mM Natriumphosphat, 135 mM Na1, 2, 6 mM KCI, pH 7, 3
Puffer 2 (für Probenverdünnung) : entspricht Puffer 1 + 0, 05 % Tween 20 und 1 % Rinderserum-Albumin, pH 7, 3
Die Ergebnisse sind der Fig. 1 zu entnehmen.
Beispiel 2 :
Ein polyklonaler Antikörper gegen humanen von Willebrand-Faktor (Dakopatts A 082) wird mit Hilfe eines Kits (Amersham RPN 28) blotmyliert. Entsprechend der Vorschrift wird der Antikörper mit 0, 05 M Boratpuffer, pH 8, 6 auf eine Konzentration von 1 mg/mi verdünnt. Zu 2 ml dieser Lösung werden 80 u. 1 Biotinylierungsreagens gegeben und über eine Stunde bel Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Diese Mischung wird anschliessend über Sephadex G-25 unter Verwendung von PBS-Puffer, pH 7, 5, enthaltend 0, 1 % Rinderserum-Albumin, gelfiltriert.
Die Fraktionen, die den biotmylierten Antikörper enthalten (AusschlussvQlumen/Messung der Extinktion bei 280 nm), werden gesammelt und unter Zusatz von 0, 2 % Natriumazid bel einer Temperatur von 40 C gelagert.
Beispiel 3 :
Analog zu Beispiel 1 wird ein vWF-Collagen-ELISA unter Verwendung eines biotinylierten Antikörpers (hergestellt gemäss Beispiel 2) durchgeführt. Auf eine nach Beispiel 1 präparierte Mikrotiterplatte mit immobilisiertem Collagen Typ 111 werden, wie In diesem Beispiel beschrieben, verschiedene Verdünnungen der von Willebrand-Faktor enthaltenden Probe (10 - 200 ng vWF/ml) aufgetragen. Anschliessend wird mit
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bei Raumtemperatur inkubiert, danach über 1 h mit jeweils 100 ul eines Strepavidin-Peroxidase Konjugates (Amersham RPN 1231) in einer Verdünnung von 1 : 1000 (Puffer 1 mit 0, 1 % Tween 20). Die Substratzugabe und die weiteren Schritte erfolgen wie unter Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt.
Beispiel 4 :
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Tests werden gemäss den Beispielen 1 und 3 durchgeführt.
Beispiel 5 :
Wie in den Beispielen 1 und 4 beschrieben, wird Typ III-Collagen aus humaner Plazenta an Mikrotiterplatten kovalent fixiert. Als Beschichtungspuffer dient Puffer 1 unter Zusatz von 0, 3% Rinderserum-Albumln. Nach der Beschichtung wird jeweils ein Collagen-Bindungstest wie unter den Beispielen 1 und 3 beschrieben durchgeführt.
Beispiel 6 :
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erfolgtPhosphat, 0, 15 M NaCI) unter Zusatz von 3% Rinderserum-Albumin.
Beispiel 7 :
Nach der Beschichtung von Mikrotiterplatten gemäss den Beispielen 1,4 und 5 mit Collagen wird nach
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0, 1Beispiel 9 :
Mit Hilfe gemäss den Beispielen 7 und 8 präparierten Mikrotiterplatten wird ein Collagen-Bindungsassay durchgeführt. Der erste Schritt des Testes besteht In der Inkubation mit der von Willebrand-Faktor enthaltenden Probe wie unter den Beispielen 1 und 3 beschneben. Alle weiteren Schritte werden ebenfalls wie unter diesen Beispielen beschrieben durchgeführt.
Beispiel 10 :
Zur Bestimmung der Collagen-Bindungsaktivität eines rekombinanten vWF wird eine Lösung auf eine Einheit RCoF/ml vorverdünnt. Von dieser Lösung sowie von einem Referenzplasma (Fa. Immuno, Wien), das als Standard dient, wird eine 1 : 50 Verdünnung in Puffer 2 (siehe Beispiel 1) hergestellt sowie davon jeweils weitere 6 Verdünnungen In 1 : 1, 5 Schritten. Diese Verdünnungen werden für die in Beispiel 3 beschriebene Testvariante eingesetzt. Die mit Hilfe eines ELISA-Readers ermittelten Absorptionen werden halblogarithmisch ausgewertet (Koordinatensystem : Absorption linear/Verdünnung logarithmisch). Aus der Verdünnungsreihe des Referenzplasmas (= 100 % vWF : CB) wird eine Bezugskurve erstellt.
Aus dieser Bezugskurve lassen sich die Werte für die entsprechenden Probenverdünnungen ablesen. Zur Berechnung der Collagen-Bindungs-Aktivität (Einheit : vWF : CB) der Probe werden die Werte mit den entsprechenden Probenverdünnungen multipliziert und gemittelt (Parallel Line Assay).
Beispiel 11 :
Zu 8, 1 ml einer Lösung von rekombinanten vWF (3 E vWF : RCoF/ml) in physiologischem Citrat-Puffer, pH 7, 0, werden 0, 9 ml einer Lösung von humanem Plasmin (Fa. Chromogenix) mit einer Konzentration von 30 E/ml (Endkonzentration 3 E/ml) zugegeben und bei 37. C inkubiert. Zu den Zeiten 0, 1, 3,6 und 21 Stunden werden Proben gezogen und die Reaktion durch Zugabe von 0, 15 ml einer 10 mM PPACK-Lösung (D-Phe-Pro-Arg-chloromethylketon-dihydrochlond/Fa. Calbiochem) zu 1, 35 ml Probe abgebrochen. Anschlie- ssend wird der von Willebrand-Faktor in diesen Proben in Hinblick auf die Multimerenstruktur, der RistocetinCofaktor-Aktivität und der Collagen-Bindung analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angeführt (siehe auch Fig. 3).
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Tabelle 1 :
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<tb>
<tb> Rekombinanter <SEP> vWF
<tb> Verdauung <SEP> mit <SEP> Plasmin
<tb> Ze <SEP> ! <SEP> t <SEP> Mu) <SEP> t <SEP> ! <SEP> merenabbau <SEP> (%)"vWF <SEP> : <SEP> RCoF/m <SEP> !'"RCoF <SEP> (%) <SEP> vWF <SEP> : <SEP> CB/mF <SEP> Cott.-Bmd. <SEP> (%) <SEP>
<tb> Oh <SEP> 100 <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> 100 <SEP> 3, <SEP> 6 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> h <SEP> 87, <SEP> 2 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 56 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 42
<tb> 3h <SEP> 56, <SEP> 4 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 37 <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP> 21
<tb> 6h <SEP> 36, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 22 <SEP> 0, <SEP> 47 <SEP> 13
<tb> 21 <SEP> h <SEP> 14, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 11 <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Beispiel 12 :
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wird57 : 1140-1143, analysiert.
Dabei werden die von Willebrand-Faktor-Multimere durch eine Immunenzymati- sche Färbung nach Alhara et al., Thromb. Haemostas. 55 : 263-267, 1986, sichtbar gemacht. Als primärer Antikörper wird ein Kaninchen-anti-von Willebrand-Faktor-Antiserum (Dakopatts, Glostrup, Denmark) in einer Verdünnung von 1 : 5000 verwendet. Als sekundärer Antikörper dient ein alkalische Phosphatase-konjugler-
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Banden mit einem Densitometer, Scanner Sharp JX325, gescannt, und die Mu) t) merenbande, weiche dem Pentamer des primären Dimers entspricht, mittels der ImageMaster Software (Pharmacia) quantifiziert.
Die Abnahme der Bande über die Zeit wird in Relation zum Zeitpunkt 0 (= 100 %) bestimmt.
Beispiel 13 :
Die Bestimmung des Ristocetin-Cofaktors erfolgt mit Hilfe einer turbidometrischen Methode unter Verwendung eines 4-Kanal-Aggregometers (Fa. Chronolog) mit angeschlossenem Schreiber. Zur Durchführung der Bestimmung wird von einem Referenzplasma (kalibriert auf Ristocetin-Cofaktor-Aktivität gegenüber dem WHO-Standard) sowie von den vWF enthaltenden Proben durch Verdünnung mit physiologischem Citratpuffer, pH 7, 35 (Zusatz von 5 % Humanalbumin) eine Verdünnungsreihe hergestellt. Dann werden in
EMI9.2
1 formaldehydfixiertemaximale Reaktionsgeschwindigkeit an der steilsten Stelle der Kurve. Aus der Verdünnungsreihe des Referenzplasmas lässt sich eine Standardkurve erstellen, an der die Ristocetin-Cofaktor-Aktivitäten (Einheit : vWF : RCoF/ml) der Proben abgelesen werden können.
Die Ergebnisse sind in Fig. 3 eingetragen.
Beispiel 14 :
Für die Verwendung in einer Flusskammer wird an das die spezifische Bindungsoberfläche darbietende Deckglas Collagen vom Typ I mit folgender Methode Immobilisiert : Das Deckglas wird 1 h in 3 % iger HNOa bei 90 0 C behandelt, anschliessend mit Wasser solange gewaschen, bis in der Waschlösung keine Säure mehr nachweisbar ist. Anschliessend wird das Glas mindestens 36 h in destilliertem Wasser gelagert. Das Deckglas wird dann mit einer 10 %igen wässrigen Lösung von 3- Aminopropyltriethoxysilan versetzt und der pH-Wert der Lösung mit 6 M HCI auf 3, 5 eingestellt.
Nun wird für 2 h auf 750 C erhitzt, das Deckglas wird aus dem Bad entfernt, mit Wasser vom überschüssigen Reagens durch intensives Waschen befreit und 15 h bei 1150 C getrocknet. Durch die Behandlung mit dem Aminosilan werden primäre Aminogruppen an der Glasoberfläche kovalent eingeführt, welche im nächsten Schritt mit Glutardialdehyd weiter derivatisiert werden. Durch Behandlung mit einer 10 % ig wässrigen Glutardialdehyd-Lösung für 4 h bei 220 C werden mit den primären Aminogruppen Schiff'sche Basen gebildet. Das überschüssige Glutardialdehyd wird durch Waschen mit Eiswasser entfernt. Als Resultat dieser Vorgangsweise liegen aktive Aldehydgruppen an der Oberfläche vor, an welche nun Collagen kovalent gebunden werden kann.
Dazu wird eine Lösung von 1 mg/mi Collagen, Typ I, aus der Pferdesehne (Kollagenreagens Horm, Nycomed Arzneimittel, München) in 0, 1 M Acetatpuffer, pH 4, 0, hergestellt. Das derivatisierte Deckglas wird nun 15 h bei 220 C in dieser Lösung inkubiert. Anschliessend wird das überschüssige Protein durch Behandeln mit Acetatpuffer entfernt. Das so vorbehandelte Deckglas wird nun als Oberfläche in eine Flusskammer eingesetzt, die entsprechend einer Publikation von Sakanassen et al.
(J. Lab. Clin. Med. 102, 522-535, (1983)) hergestellt wurde.
Beispiel 15 :
Mit einem nach Beispiel 13 hergestellten Flusskammer-System wird ein Perfusionsexperiment durchgeführt. Als Perfusat dient dazu ein Citrat-Vollblut (Sakariassen et al., Meth. Enzymol. 169,37-70, (1989)). Die nachfolgende Perfusion sowie die Auswertung der Daten erfolgt gemäss Boomgaard et al. (Vox Sang. 66, 18-24, (1994)). Das Perfusat wird bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 95 mi/min und einer Temperatur von 370 C über einen Zeitraum von 5 min durch die Kammer gepumpt. Danach wird das mit Collagen beschichtete Deckglas der Kammer entnommen, die adhärierten Zeiten mit 0, 5 % Glutaraldehyd fixiert und mit May-Grünwald-Giemsa-Lösung (Merck, Darmstadt) gefärbt.
Die Evaluierung der prozentualen Belegungsdichte der Thrombozyten an der Deckglasoberfläche erfolgt lichtmikroskopisch bei 1000facher Ver-
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grösserung unter Verwendung eines Bildanalysesystems.