ES2227663T3

ES2227663T3 - Procedimiento para la determinacion de una sustancia de enlace al colageno.

Info

Publication number: ES2227663T3
Application number: ES97890118T
Authority: ES
Inventors: Jurgen Dr. Siekmann; Peter Dr. Turecek; Hans-Peter Prof. Schwarz; Johann Dr. Eibl; Bernhard Doz Fischer; Artur Dr. Mitterer; Friedrich Prof. Dorner
Original assignee: Baxter AG
Current assignee: Baxter AG
Priority date: 1996-07-04
Filing date: 1997-07-02
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2017-07-02
Also published as: EP0816852B1; DK0816852T3; DE59712002D1; EP0816852A1; ATE279731T1

Abstract

SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA ANALIZAR UNA SUSTANCIA LIGADORA DE COLAGENO, EN ESPECIAL LA ACTIVIDAD DE UNA PROTEINA DE ADHESION EN UN ENSAYO; DICHO PROCEDIMIENTO ESTA CARACTERIZADO PORQUE EL COLAGENO AVIDO SE FIJA COVALENTE A UNA FASE SOLIDA, LA SUSTANCIA LIGADORA DEL ENSAYO ES LIGADA AL COLAGENO, Y SE ANALIZA LA SUSTANCIA QUE LIGA EL COLAGENO LIGADO. TAMBIEN SE DESCRIBE UN CONJUGADO DE COLAGENO FORMADO DE UNA FASE SOLIDA Y EL COLAGENO AVIDO, LIGADO COVALENTE A ELLA. EL PROCEDIMIENTO ESTA ESPECIALMENTE INDICADO PARA EL ANALISIS DE LA ACTIVIDAD PRIMARIA HEMOSTATICA DEL VWF.

Description

Procedimiento para la determinación de una sustancia de enlace al colágeno.

La invención se refiere a un procedimiento para la determinación de una sustancia enlazante al colágeno, especialmente para la determinación de la actividad de proteínas de adhesión, así como a dispositivos para la realización de este procedimiento.

La coagulación sanguínea se inicia por una serie de reacciones sucesivas de diversas proteínas y enzimas. La falta o disfunción de uno de los factores de la coagulación sanguínea impide que se cierren las heridas, y a consecuencia de ello se producen hemorragias que pueden llegar a causar la muerte. Éste es el caso, por ejemplo, en la enfermedad de von Willebrand, que se caracteriza por la falta o trastorno del factor de adhesión FvW.

El factor von Willebrand es una proteína plasmática multimérica, que se compone de subunidades con pesos moleculares de 225.000 D. Dos subunidades forman un dímero, unido mediante enlaces sulfuro, con un peso molecular de 450.000 D. A partir de los dímeros FvW, y mediante un enlace covalente, se forman polímeros con pesos moleculares de 1 millón y mayores. En la coagulación sanguínea, el FvW cumple dos misiones esenciales: 1) El FvW enlaza el factor de coagulación VIII (FVIII), y 2) el FvW tiene propiedades de adhesión que intervienen en la agregación plaquetaria y su enlace al subendotelio de la pared vascular mediante el colágeno. Por lo general, se parte de que la funcionalidad del FvW depende esencialmente de su estructura multimérica y, por tanto, se supone que sólo los polímeros de FvW de alto peso molecular constituyen moléculas activas desde el punto de vista hemostático.

El factor von Willebrand (FvW) tiene especial importancia en la hemostasis fisiológica. Además de su función como proteína transportadora para el factor VIII, esta proteína plasmática es necesaria, sobre todo, para la adhesión de trombocitos al endotelio/subendotelio lesionado, así como para la agregación de los trombocitos en condiciones de estrés de cortes. En la primera fase de la hemostasis primaria, la adhesión, el FvW actúa como un enlace entre los receptores específicos de la superficie de los trombocitos, como el complejo gpIb-, gpIIb/IIIa, y los componentes del endotelio, por ejemplo el colágeno.

A continuación se produce una modificación en la forma de los trombocitos, en la secreción de las sustancias que contienen y, finalmente, se forman los agregados plaquetarios, mediando también el FvW.

Los distintos fenotipos de la enfermedad de von Willebrand (vWD - von Willebrand Disease) se caracterizan por la pérdida de los polímeros FvW de alto peso molecular, resultado evidente de las propiedades de adhesión reducidas del FvW, lo que provoca tendencia a la hemorragia y aumenta el tiempo de la misma. De acuerdo con el modelo de FvW, la enfermedad de von Willebrand se clasifica en 3 tipos principales y en varios subtipos. En la sangre de los pacientes de Tipo I se observa una reducción cuantitativa de todos los multímeros de FvW, junto con un contenido reducido en antígeno FvW (FvW:Ag) y una actividad reducida del cofactor ristocetina-FvW (FvW:RCo), mientras que el Tipo III se caracteriza por una ausencia total de FvW. El Tipo II se caracteriza por una anormalidad cualitativa y la ausencia de los multímeros de tamaño medio y grande, así como por una actividad muy reducida de FvW:RCo. Dado que los multímeros FvW de alto peso molecular tienen las propiedades de adhesión más pronunciadas, esta anormalidad cualitativa del FvW provoca también tendencias hemorrágicas y un aumento del tiempo que estas hemorragias duran.

Para el diagnóstico diferencial de la vWD se realizan una serie de análisis. Habitualmente la prueba de hemorragia cutánea y pruebas funcionales que analizan las propiedades de adhesión del FvW. En la caracterización de las propiedades de adhesión del FvW se suele analizar la agregación plaquetaria. Para ello, se mezcla FvW con plaquetas estabilizadas con formalina y el antibiótico no fisiológico ristocetina, y se mide la duración y la intensidad de la agregación plaquetaria. Sin embargo, este sistema de medición (agregación plaquetaria dependiente de ristocetina) no refleja la situación fisiológica ni la función del FvW.

El principio básico de esta determinación de la actividad del cofactor de ristocetina es inducir la aglutinación de trombocitos fijados o recién preparados en presencia de FvW mediante el antibiótico ristocetina (Weiss y col., J. Clin. Invest. 54 (1973), 2708-2716). En este caso, el aglutinamiento depende de la cantidad de FvW activo existente. Su concentración puede determinarse a partir de una curva de aglutinación registrada fotométricamente con ayuda de un agregómetro y comparándola con un estándar adecuado. Sin embargo, en esta prueba resulta problemática la posibilidad de que los valores RcoF varíen en función de la preparación de trombocitos. Además, esta prueba es relativamente poco sensible, ya que el límite de determinación para el FvW activo es de aproximadamente 1\mug/ml. Por otra parte, esta función del FvW referente a la agregación de trombocitos en presencia de ristocetina es un modelo no fisiológico, y posiblemente inadecuado, de la actividad hemostática primaria. Este modelo se utiliza únicamente para la determinación del FvW y no puede aplicarse a otras proteínas de adhesión.

El principio de medida de la aglutinación se utiliza también para la determinación de las interacciones antígeno/anticuerpo. Por ejemplo, es posible inmovilizar anticuerpos según la adsorción física (Crane, Clin. Chem. 27 (1981), 697-700) o también mediante la formación de un enlace covalente (US-PS 4 480 042; US-PS 4 210 723; Thakkar y col., Clin. Chem 37 (1991), 1248-1251) en micropartículas de resinas sintéticas inmovilizadas. El tamaño y las características ópticas de las partículas dependen entonces de la concentración del antígeno/anticuerpo respectivo, con lo que es posible determinar la concentración del antígeno o anticuerpo, por ejemplo con ayuda de un agregómetro, mediante nefelometría o turbidimetría.

Otro sistema para detectar las propiedades de adhesión del FvW consiste en la determinación del enlace de FvW a colágeno. El colágeno es una sustancia básica del tejido subendotelial. El colágeno Tipo III es el componente principal de la matriz extracelular de los vasos sanguíneos, a los que confiere una gran resistencia mecánica y al mismo tiempo elasticidad. En los vasos sanguíneos intactos, el colágeno está aislado de los componentes celulares y solubles de la sangre por una monocapa de células endoteliales que revisten el vaso sanguíneo en su interior. Si el vaso se lesiona, el endotelio se destruye localmente, con lo que el colágeno queda en contacto directo con la sangre. Al colágeno expuesto se enlaza la proteína plasmática FvW, que a su vez puede enlazarse mediante el receptor FvW (GP Ib/IX) y el receptor fibrinógeno activado (GPIIb/IIIa) de las plaquetas. De este modo se produce la adhesión mediada por FvW de las plaquetas al subendotelio que ha quedado al descubierto y, con ello, el primer cierre lábil de la herida. Los colágenos de Tipo I y Tipo VI, localizados principalmente en capas vasculares más profundas, también participan en el enlace del FvW al subendotelio. La determinación de un enlace FvW-colágeno corresponde a la función fisiológica del FvW.

Sobre el sitio de enlace exacto al colágeno del FvW existen aún ciertas dudas. Sin embargo, hay indicios de que los dominios A1 y A3 de FvW tienen sitios de enlace para el colágeno (Ruggeri y col. (1993), FASEB J. 7: 308-316). Cruz y col. ((1995), J. Biol. Chem. 270: 10822-10827) indican como sitios de enlace más probables la secuencia de aminoácidos entre Glu^{1018} y Arg^{1114} en el dominio A3. El enlace del FvW al receptor de FvW GP Ib de las plaquetas se realiza a su vez mediante sitios de enlace dentro del lazo Cys^{509}-Cys^{695} de FvW (Ruggeri y col. (1992), Thromb. Haemost. 67: 594-599).

En estudios comparativos se observó una gran coincidencia de los datos de enlace del colágeno con los resultados de la agregación plaquetaria dependiente de la ristocetina (Brown y col. (1986), Thromb. Res. 43: 303-311, Favaloro y col. (1994), Am. J. Hematol. 45: 205-211, Thomas y col. (1994), Hämostaseologie 14: 133-139) y se propuso sustituir la prueba de FvW:RCo por un ELISA-colágeno para la determinación de la actividad funcional del FvW in vitro. Debido a la gran afinidad de los multímeros FvW de alto peso molecular con el colágeno (Favaloro y col. (1995), Am. J. Clin. Pathol. 104: 264-271), esta prueba es particularmente adecuada para la diferenciación de los pacientes de vWD de Tipo II y de Tipo III y las personas sanas. Sin embargo, las ventajas esenciales de la prueba de enlace de colágeno en comparación con la prueba de enlace de ristocetina no consisten sólo en su mayor relevancia fisiológica, sino también en la menor cantidad de aparatos necesaria y la mayor facilidad y rapidez de ejecución. Además de la aplicación de la prueba de enlace de colágeno en la clasificación de la enfermedad de von Willebrand, se propuso utilizar también dicha prueba para la monitorización de pacientes con vWD durante y después del tratamiento con desmopresina, para asegurar la calidad del FvW en preparados de factor de coagulación VIII, así como para la observación de pacientes con otras afecciones, como por ejemplo leucemia linfoblástica aguda, síndrome hemolítico-urémico (síndrome de Moschkowitz) o púrpura trombótica autoinmune (Favaloro y col. (1994), Am. J. Hematol. 45: 205-211, Brown y col. (1986), Thromb. Res. 43: 303-311, Thomas y col. (1994), Hämostaseologie 14: 133-139) o emplear la prueba de enlace de colágeno para la determinación y clasificación de los autoanticuerpos específicos para el colágeno en la artritis reumatoide y en el lupus eritematoso sistémico.

Para la determinación del enlace FW-colágeno se han propuesto hasta la fecha sistemas en los que se fijaba colágeno por adición mediante interacciones hidrófobas no específicas en superficies sintéticas, por ejemplo placas microtituladas. En virtud de su función como proteína fibrilar, el colágeno no es soluble en condiciones fisiológicas. En estado puro sólo puede disolverse mediante sales o ácidos fuertes. Especialmente en el rango de pH neutro y básico, el colágeno disuelto se vuelve de nuevo insoluble y precipita de la solución. Si se utilizan superficies sintéticas para la inmovilización de proteínas, por ejemplo placas microtituladas, hay que generar condiciones tampón entre neutras y básicas para enlazar las proteínas a dichas superficies mediante enlaces no específicos. Debido a la insolubilidad del colágeno, especialmente en condiciones básicas, este método no es eficaz para enlazar el colágeno a superficies sintéticas. Para, a pesar de todo, enlazar el colágeno a superficies sintéticas mediante un mecanismo no específico, hasta la fecha era necesario emplear concentraciones muy altas de colágeno con el fin de lograr al menos unos pocos enlaces con la superficie sintética.

Brown y col. (1986, Thromb. Res. 43: 303-311) incubaron 3,3 \mug de colágeno/cavidad de placa microtitulada (=33 mg/ml) durante una noche, procurando que el colágeno no se precipitase durante la dilución. Para reducir la duración del enlace de colágeno a superficies sintéticas, Bockenstedt y col. (1986, J. Clin. Invest. 78: 551-556) emplearon 187 \mug de colágeno/cavidad de placa microtitulada (1,87 mg/ml, disueltos en ácido acético 0,05 M) y un tiempo de incubación de 1,5 horas para la obtención de una superficie de colágeno sintética. En estas condiciones se enlazaron un máximo de 10 \mug de colágeno/cavidad de placa microtitulada, es decir 1/18 de la cantidad empleada. La capacidad de enlace era, en este caso, de 7,5 ng de FvW/\mug de colágeno. Favaloro y col. (1991, Blood Coagul. Fibrinol. 2: 285-291) utilizaron un colágeno HORM especial y una solución de glucosa isotónica con un pH de 2,8 como solución de enlace y un tiempo de incubación de, como mínimo, 48 horas, con el fin de lograr un enlace de 10 \mug de colágeno/cavidad de placa microtitulada (=50 \mug/ml, en una solución de glucosa isotónica con un pH de 2,8) a la superficie. Van Genderen y col. (1994, Blood 84: 3378-3384) utilizaron 20 \mug de colágeno/cavidad de placa microtitulada (=200 \mug/ml, disueltos en 20 mmol de ácido acético), con un tiempo de contacto de más de 12 horas, para la obtención de una superficie de colágeno sintética. Niesvizky y col. utilizó 5 \mug de colágeno/cavidad de placa microtitulada (=50 \mug/ml, disueltos en ácido acético), y tiempos de enlace de más de 12 horas (1994, J. Lab. Clin. Med., 123: 137-142).

Los procedimientos mencionados para la inmovilización pasiva de colágeno requerían altas concentraciones de colágeno y/o un largo tiempo de contacto para obtener superficies de colágeno sintéticas. La duración del tiempo de incubación del colágeno con la superficie sintética permite suponer además que una gran parte del colágeno precipita demasiado pronto de la solución de incubación y por ello no está disponible para el enlace a la superficie.

Thomas y col. (1994, Hämostaseologie 14: 133-139) describen un ELISA de actividad de enlace de colágeno (CBA) del FvW que resulta adecuado y puede estandarizarse para su manejo en las tareas rutinarias de laboratorio, y en el que pueden utilizarse las mismas diluciones de muestras, el mismo tampón y los mismos instrumentos que en un ELISA para FvW:Ag. Demostraron que los datos obtenidos con ELISA FvW:CBA presentaban una buena coincidencia con los valores FvW:RCo. Sin embargo, las placas revestidas mediante interacción no específica con 3 \mug de colágeno/cavidad de placa microtitulada podían almacenarse a 4ºC sólo durante 48 horas.

Favarolo y col. (Blood Coagulation and Fibrinolysis 2 (1991), 285-291) fueron capaces de, con un sistema CBA, diferenciar entre los Tipos I y II en pacientes con la enfermedad de von Willebrand.

Para determinar la actividad colagenasa, Wilkinson y col. (1990, Anal. Biochem. 185: 294-296) describieron un procedimiento alternativo para el acoplamiento del colágeno a placas microtituladas. El colágeno se sometió a una biotinilación con éster biotina-N-hidroxisuccinimida en la parte proteínica y se inmovilizó en placas microtituladas modificadas con avidina mediante un enlace de alta afinidad. Este procedimiento permitió reducir el tiempo de revestimiento a 1 hora a temperatura ambiente, con una concentración de 5 \mug de colágeno biotinilado/cavidad de placa microtitulada (50 \mug/ml). La superficie de colágeno así obtenida se incubó con colagenasa y, mediante los fragmentos de colágeno biotinilado liberados, se determinó la actividad de la misma. La biotinilación produce un enlace con los aminoácidos primarios del colágeno, con lo que tal modificación de una molécula posiblemente cause perjuicio a sus propiedades de enlace y a su afinidad con respecto a proteínas de enlace de colágeno funcionales. Por lo tanto, no puede saberse de antemano si un colágeno modificado en su parte proteínica aún estará en situación de enlazarse a una proteína de adhesión.

El documento EP 0 713 707 describe una matriz de colágeno-polímero en la que el colágeno se enlaza de forma covalente con grupos amino primarios, en particular restos de lisina, en la parte proteínica a un polímero sintético activado. Los grupos amino primarios del colágeno no enlazados al polímero se usaron para acoplar un agente biológicamente activo. La matriz de colágeno-polímero se utiliza para la producción de implantes en medicina.

Siekmann y col. (1995, Thromb. Haemost. 73: 1160) describieron varias variantes de un ELISA de enlace FvW-colágeno y comprobaron que, dependiendo del tipo de acoplamiento del colágeno a la matriz (enlace no específico o enlace mediante anticuerpos de colágeno policlonales), el límite de detección se hallaba entre 15 y 50 ng de FvW/ml de solución inicial. La variante del enlace del colágeno mediante anticuerpos policlonales a la matriz requería una menor concentración de colágeno y proporcionaba mayor sensibilidad que una inmovilización pasiva.

Santoro y col. (1977, J. Clin. Invest. 60: 1054-1060) caracterizaron colágeno oxidado con periodato y demostraron que la parte glucídica del colágeno no es necesaria para la agregación plaquetaria.

Shadle y col. (1982, J. Cell Biology 95: 361-365) acoplaron colágeno de forma covalente a portadores plásticos y modificaron los oligosacáridos del colágeno para estudiar la influencia de la parte glucídica del colágeno en la adhesión plaquetaria.

Uno de los problemas de utilizar un sistema de prueba de enlace de colágeno para determinar la afinidad de una proteína de adhesión con el colágeno es la preparación de una superficie revestida uniformemente con colágeno. Otro de los problemas de utilizar portadores de colágeno revestidos mediante los métodos usuales es su poca estabilidad de almacenamiento, dado que, incluso en el rango de pH ácido, el colágeno precipita después de algún tiempo y se vuelve a separar del portador o incluso forma agregados. Esto perjudica en gran medida a la sensibilidad y reproducibilidad del sistema de prueba. Por lo tanto, para obtener resultados suficientemente buenos en una prueba de CBA, hasta la fecha los portadores revestidos se preparaban poco antes de su uso y se utilizaban inmediatamente después. Por consiguiente, los portadores revestidos descritos en el estado actual de la técnica presentan limitaciones a la hora de emplearse en trabajos rutinarios o incluso en la producción comercial de sistemas de prueba para la determinación de la CBA de una proteína (plasmática) de enlace de colágeno.

Los sistemas CBA del FvW ya conocidos resultan además difíciles de reproducir y, con frecuencia, presentan fuertes fluctuaciones de correlación con las determinaciones de antígeno FvW inmunológico o RcoF. Antes de realizar un CBA era necesario revestir también de nuevo la placa microtitulada con colágeno, con el fin de que hubiera disponible suficiente sustrato de enlace en su forma nativa. Este procedimiento requiere mucha destreza y no resulta adecuado para análisis rutinarios, sobre todo para el control de preparados de FvW.

La presente invención tiene por objeto desarrollar procedimientos de determinación cuantitativa perfeccionados para la actividad de un factor von Willebrand y/u otras sustancias de enlace de colágeno, especialmente proteínas de adhesión, que permitan determinar las proteínas con facilidad y precisión. El nuevo procedimiento de determinación ha de ser especialmente adecuado para el control de calidad de preparados de FvW altamente concentrados.

Otro objeto de la invención consiste en poner a disposición una superficie de colágeno estable que no presente las desventajas arriba descritas, que sea fácil de producir y fácil de estandarizar. Otro objeto de la invención es un procedimiento perfeccionado para la determinación cuantitativa de sustancias de enlace de colágeno, especialmente de proteínas con propiedades de adhesión, así como para la determinación de la capacidad de enlace de colágeno de estas sustancias.

Según la invención, estos objetivos se logran mediante un procedimiento para la determinación de una sustancia de enlace de colágeno, especialmente para la determinación de la actividad de proteínas de adhesión, en una muestra, procedimiento caracterizado porque el colágeno se fija de forma covalente a una fase sólida mediante una modificación en su parte glucídica, la sustancia de enlace de colágeno de la muestra se enlaza al colágeno y se determina la sustancia de enlace de colágeno enlazada.

El colágeno ávido, o sea el colágeno que presenta como mínimo una modificación en su parte glucídica, tiene una capacidad de enlace extraordinariamente alta para la adhesión de sustancias de enlace de colágeno, especialmente de proteínas, está caracterizado por un sinnúmero de sitios de enlace accesibles para la sustancia que se ha de determinar. De la avidez o función de enlace del colágeno son responsables sobre todo los sitios de enlace que hacen posible la adhesión rápida del sustrato de enlace con la suficiente fuerza de adhesión. Los criterios a tener en cuenta para seleccionar un colágeno adecuado son numerosos. Por una parte puede tomarse como material de partida uno del que ya se sepa que posee las capacidades de enlace adecuadas y que se somete, en caso dado, a un proceso para lograr un aumento de la estabilidad. Sin embargo, dicho proceso también puede realizarse con el fin de lograr un incremento o la homogeneidad de la superficie del colágeno inmovilizado, lo cual es una condición previa para la escala reproducible de la adsorción de un ligando.

La avidez de un colágeno se determina preferentemente en estado ya inmovilizado, o sea enlazado a un portador, con una preparación estándar utilizada habitualmente para el calibrado de sistemas ELISA análogos. La determinación de la avidez se realiza convenientemente en las mismas condiciones que en la determinación de la sustancia de enlace de colágeno.

A diferencia de los CBA del estado actual de la técnica, en los que es usual el "revestimiento" de una fase sólida con colágeno, el sistema de prueba según la invención permite por vez primera la puesta a disposición de un procedimiento o producto reproducible, que presenta estabilidad de almacenamiento y, con ello, puede emplearse tanto comercialmente como en análisis rutinarios.

No era previsible que un colágeno fijado químicamente pudiese emplearse como receptor para una sustancia de enlace de colágeno, especialmente para una proteína de adhesión. Para evitar la modificación o desnaturalización irreversible del colágeno, lo que tenía como consecuencia una actividad y avidez muy reducidas, en los CBA del estado actual de la técnica se procuraba no perjudicar a sus características nativas y a su estructura y realizar un revestimiento respetuoso, basado únicamente en interacciones no covalentes.

Las soluciones de colágeno utilizadas por Brown y col. y Favaloro y col. para los CBA presentaban concentraciones sumamente altas (33 ó 50 ó 100 \mug/ml). En ensayos en serie se había comprobado que la concentración mínima necesaria para la preparación del producto de colágeno inmovilizado era de 50 \mug/ml. Esta gran cantidad de colágeno era necesaria sobre todo para enlazar al FvW una cantidad suficiente para la detección, ya que el colágeno utilizado no había sido seleccionado en función de su avidez.

Este colágeno conserva la afinidad con respecto a la sustancia de enlace de colágeno incluso después de su procesamiento y desintegración mediante un tratamiento mecánico o proteolítico, afinidad que puede aumentarse aún más mediante dicho tratamiento.

Según la invención, se entiende como colágeno ávido el colágeno que presenta como mínimo una modificación en su parte glucídica con la que se realiza el enlace covalente a la fase sólida. El colágeno modificado puede estar enlazado de forma covalente a la fase sólida bien directamente o bien mediante un espaciador o bien mediante un elemento de unión. El colágeno puede estar enlazado a la fase sólida, por ejemplo, mediante coenzimas, anticuerpos u otros ligandos químicos que formen enlace covalente con la fase sólida. Según la invención, se entiende también como enlace covalente un enlace "quasi-covalente", como el que se forma por ejemplo con los grupos NH_{2} secundarios de una placa "Covalink™" (con espaciador para placas de poliestireno).

Una proteína de adhesión especialmente preferente, que puede determinarse con el procedimiento según la invención, es el FvW o una fracción del mismo, especialmente FvW de alto peso molecular, determinándose preferentemente su actividad hemostática primaria (por ejemplo en un sistema dinámico). Entre otros ejemplos de proteínas de adhesión se incluyen proteínas que interactúan in vivo con el colágeno, o proteínas terapéuticas que presentan afinidad con el colágeno, como por ejemplo fibronectina, proteínas receptoras de plaquetas, multímeros, vitronectina, fibrinógeno, anticuerpos, o sus análogos o derivados. Sin embargo, el procedimiento según la invención permite en principio también la determinación cuantitativa de todas las proteínas o sustancias que presenten una afinidad con el colágeno. La determinación no es sólo cuantitativa o semicuantitativa, sino también cualitativa, ya que se utiliza la actividad de enlace específica como parámetro para la caracterización de la proteína de adhesión.

Con el procedimiento según la invención también puede determinarse un derivado del FvW.

Como colágeno ávido se emplea preferentemente un colágeno nativo o un derivado del colágeno, que presente una capacidad de enlace de, como mínimo, una unidad RcoF de FvW/mg, preferentemente más de 10 unidades RcoF/mg, y de forma especialmente preferente más de 100 unidades RcoF/mg.

Según la invención, preferentemente también se fija de forma covalente a una fase sólida un colágeno nativo o un derivado del colágeno con una capacidad de enlace de, como mínimo, 13 \mug de antígeno FvW/mg, preferentemente más de 130 \mug/mg, y especialmente más de 1.300 \mug/mg.

Para ello, cada técnico en la materia puede elegir las condiciones de tal modo que sea posible un enlace de la sustancia al colágeno. Entre los parámetros que influyen en la reacción de enlace se incluyen la temperatura, el tipo de tampón, el pH y el tiempo de incubación. Estos parámetros para la realización del procedimiento según la invención pueden ser averiguados y aplicados por todo técnico en la materia sin dificultad alguna. La incubación se realiza preferentemente a una temperatura entre 15ºC y 37ºC, pero especialmente a temperatura ambiente. La elección del sistema tampón a utilizar para la realización del procedimiento no queda limitada con ello, y puede utilizarse un tampón con un valor pH o una fuerza iónica cualquiera. Esto resulta particularmente ventajoso en el caso de que, en una prueba paralela, se determine por ejemplo el contenido en antígeno de la proteína y se desee emplear el mismo tampón en ambos sistemas.

Entre los derivados del colágeno utilizados según la invención se incluyen fragmentos, proteínas o polipéptidos químicamente modificados y estructuralmente transformados derivados de colágeno y que contengan sitios de enlace para las proteínas de adhesión, por ejemplo un minicolágeno (Analytical Biochemistry 231, 57-64 (1995)). El colágeno ávido a emplear según la invención se selecciona preferentemente entre los colágenos de bajo peso molecular, entre los colágenos sometidos a un proceso proteolítico, desintegrados y homogeneizados. El colágeno de origen humano, preferentemente de Tipo III (especialmente de placenta humana), constituye un colágeno muy especialmente preferente. Sin embargo, los colágenos de Tipo I, por ejemplo de vaca, caballo o cerdo, también son adecuados para su utilización en el sistema de prueba según la invención.

Según una forma de realización especial, la determinación de la sustancia de enlace de colágeno se realiza mediante una reacción de detección específica, preferentemente mediante un inmunoanálisis. En éste, el enlace específico entre la sustancia de enlace de colágeno y el colágeno se determina incubando la sustancia enlazada al colágeno con un anticuerpo dirigido específicamente contra la sustancia. Para ello pueden emplearse anticuerpos especialmente marcados, prefiriéndose en particular los anticuerpos monoclonales.

El complejo colágeno, sustancia de enlace de colágeno y anticuerpo puede determinarse caracterizando el anticuerpo enlazado, para lo que pueden utilizarse los métodos generales y habituales del estado actual de la técnica, como enzimoinmunoanálisis, cromoinmunoanálisis, luminoinmunoanálisis, fluoroinmunoanálisis o radioinmunoanálisis. Para ello se determina la reacción de enlace, así como la eficacia del enlace, mediante la técnica respectiva y se determina la cantidad de proteína enlazada/sustancia enlazada por la intensidad de la coloración, la emisión radioactiva, etc. Este procedimiento permite determinar con medios sencillos la funcionalidad y concentración de una sustancia afín al colágeno en un material biológico o en una muestra.

La determinación de la sustancia de enlace de colágeno enlazada, especialmente del FvW enlazado, puede realizarse de muchas maneras: por ejemplo mediante reacción antígeno-anticuerpo utilizando un anticuerpo marcado, midiendo la variación de la densidad óptica, mediante agregometría o aplicando un método de haz luminoso, especialmente mediante amplificación de luz, con la que es posible determinar el radio hidrodinámico de complejos de FvW/partículas de colágeno, estableciéndose una correlación directa entre la cantidad de FvW enlazado y el tamaño de los complejos determinado. Sin embargo, para determinar la sustancia enlazada pueden utilizarse también procedimientos específicos para la sustancia de enlace de colágeno respectiva, por ejemplo en el caso del FvW u otras proteínas de enlace de plaquetas, mediante el enlace de plaquetas o sus equivalentes.

Con el FvW, por ejemplo, puede inducirse una aglutinación de microportadores revestidos de colágeno, por ejemplo partículas de látex-colágeno, según un principio activo. La aglutinación de las partículas depende en este caso de la cantidad de FvW. Al igual que en la aglutinación de trombocitos por FvW inducida con ristocetina, también aquí puede elaborarse una curva de agregación con ayuda de un agregómetro, a partir de la cual es posible calcular la concentración de FvW en base al enlace de colágeno.

Según un aspecto particular de la presente invención, el procedimiento según la invención se emplea para determinar la funcionalidad y concentración de proteínas de enlace de colágeno, especialmente de proteínas con propiedades o actividades de adhesión. Una de las proteínas preferidas es el FvW, un derivado del mismo, que puede ser un fragmento del FvW completo, pero que aún tenga las regiones de enlace de colágeno específicas del FvW, una fracción de FvW o FvW de alto peso molecular. Además, el procedimiento según la invención puede emplearse para la determinación de fibronectina o derivados de la misma. No obstante, el procedimiento según la invención permite determinar cualquier otra proteína, o fragmento o derivado de la misma, que presente afinidad con el colágeno. Entre éstas se incluyen, entre otros, anticuerpos o fragmentos de los mismos, proteínas receptoras, laminina, fibrinógeno o
trombospondina.

Las fuentes de las que procede la muestra con el material biológico que se ha de analizar pueden ser diversas. El material biológico puede ser de origen natural o haberse obtenido mediante técnicas de ingeniería genética. Entre los materiales biológicos de origen natural se incluyen según la invención, por ejemplo, sangre, plasma, fracciones plasmáticas; mientras que entre los materiales obtenidos mediante técnicas de ingeniería genética se incluyen excedentes de cultivos celulares o cultivos celulares recombinantes.

El procedimiento según la invención es especialmente adecuado para la realización de pruebas rutinarias en la determinación de la funcionalidad de proteínas afines al colágeno, especialmente de proteínas de adhesión activas, desde un punto de vista hemostático, y su cuantificación o comprobación de su funcionalidad. Una aplicación puede ser la determinación del FvW en el diagnóstico de la vWD y la diferenciación y clasificación del tipo de FvW, ya que la sensibilidad del procedimiento según la invención permite determinar incluso pequeñas divergencias de la CBA del FvW con respecto al estado normal. Dado que se ha mejorado la capacidad de enlace del colágeno en el FvW, con respecto a los análisis de CBA de acoplamiento pasivo usuales, es posible representar con mayor precisión el contenido de FvW en el plasma. La prueba puede utilizarse para todos los procedimientos conocidos hasta la fecha en los que se determine la CBA del FvW, como por ejemplo para la monitorización de pacientes con vWD durante y después del tratamiento con preparados de factor VIII, FvW, complejo factor VIII/FvW o desmopresina, para asegurar la calidad de preparados de factor de coagulación, especialmente de preparados de complejo factor VIII o preparados de FvW, obtenidos del plasma o bien mediante técnicas de ingeniería genética. El sistema de prueba también es adecuado para la selección rutinaria de clones que expresen proteínas de adhesión de colágeno en biotecnología, ya que de este modo es posible seleccionar eficazmente clones recombinantes que expresen grandes cantidades de la proteína.

Los sistemas de prueba conocidos hasta la fecha con colágeno acoplado de forma pasiva tenían sólo una capacidad limitada para enlazar proteínas de enlace de colágeno, y ya con pequeñas cantidades de, por ejemplo, FvW se llegaba a una saturación del colágeno inmovilizado. Esto hacía que no fuera posible realizar una diferenciación sensible entre clones recombinantes que expresaban distintas cantidades de proteína. Sólo con la puesta a disposición de la prueba según la invención, que presenta una mayor sensibilidad con respecto a las proteínas de enlace de colágeno, ha sido posible diferenciar fácilmente clones recombinantes que expresan una proteína de enlace de colágeno con distinta intensidad.

Otra aplicación del procedimiento según la invención se halla, en particular, en la cuantificación de proteínas de enlace de colágeno en la fabricación comercial de productos sanguíneos a partir de plasma, ya que la pureza de tales productos ha de estar garantizada dentro de los márgenes que aseguran su calidad. Gracias a la mayor sensibilidad y especificidad de la prueba según la invención, es posible determinar en un producto sanguíneo depurado incluso cantidades mínimas de, por ejemplo, fibronectina, FvW u otra proteína de enlace de colágeno. El límite de sensibilidad para la determinación de una proteína de enlace de colágeno en una muestra, especialmente de FvW, es preferentemente de 5 ng, de forma especialmente preferente de 1 ng y de forma muy especialmente preferente de 0,5 ng. La capacidad de enlace es preferentemente de, como mínimo, 100 ng de FvW/\mug de colágeno, especialmente de 300 ng/\mug de colágeno.

El procedimiento según la invención puede estandarizarse también más fácilmente que en el caso de la determinación del cofactor ristocetina, ya que no es necesario utilizar trombocitos cuya procedencia podría influir en el resultado. Constituye también un sistema de prueba más apropiado fisiológicamente y ofrece además una sensibilidad mucho mayor que los sistemas de prueba usuales. Los límites de detección habituales en el estado actual de la técnica para la CBA se superan con creces, como ya se ha mencionado. El límite de detección que puede alcanzarse es inferior a 30 ng/ml de muestra, preferentemente inferior a 20 ng/ml y con la máxima preferencia inferior a 10 ng/ml. Además se simulan las condiciones de hemostasis fisiológica: la adhesión de los trombocitos al colágeno del endotelio/subendotelio, así como su agregación, están mediadas por la actividad del FvW fisiológico.

El principio de la interacción del FvW con colágenos fijados a superficies artificiales puede extenderse también a ensayos de enlace de colágeno usuales para la detección de otras proteínas de adhesión. Se ha comprobado sorprendentemente que los sistemas según la invención, en los que existe un enlace covalente entre la placa microtitulada y el colágeno, permiten una elevada reproducibilidad de los resultados de medida.

En otra forma de realización se enlaza colágeno, en la forma arriba descrita, a una placa microtitulada de poliestireno o a una partícula portadora. Una vez inmovilizado, el colágeno se digiere parcialmente con una enzima proteolítica (por ejemplo pepsina y/u otras proteasas con un pH óptimo de actividad en el rango ácido), de modo que sólo queden enlazadas al portador aquellas estructuras de colágeno que correspondan a la parte soluble del colágeno ávido. De este modo se modifica la estructura espacial del colágeno en tal medida que se exponen epítopos de enlace para la proteína de adhesión que han de cuantificarse posteriormente en la superficie del portador.

La ventaja de este método consiste en que el colágeno se enlaza a la matriz portadora con su estructura nativa y no es necesaria una desnaturalización previa, por ejemplo con enzimas proteolíticas. De este modo es posible cuantificar aquellas moléculas que se enlacen a colágeno nativo pero no puedan interactuar con el colágeno desnaturalizado.

En otra forma de realización se enlaza de forma covalente colágeno nativo en una suspensión a una matriz portadora activada. La proteína excedente, que tras este proceso se halla enlazada por adsorción a la matriz, se elimina mediante tratamiento con un reactivo caotrópico o desnaturalizante (por ejemplo urea, clorhidrato de guanidinio, tiocianato, detergentes, etc.), mediante lavado de las partículas revestidas de colágeno o de las cavidades de una placa microtitulada. También aquí se tiene la ventaja de que el colágeno se fija con una estructura que ha de ser lo más similar posible al estado nativo.

Para fijar covalentemente el colágeno ávido a las superficies adecuadas se dispone de numerosos métodos, de modo similar a lo que ocurre en el caso de acoplamiento covalente de anticuerpos a partículas de látex. Así, por ejemplo, la fijación puede realizarse mediante acoplamiento directo de la función amino primaria de los colágenos a partículas activadas con epoxi. Otra posibilidad de inmovilización consiste en el acoplamiento carbodiimida a partículas o superficies que lleven un grupo amino primario o un grupo carboxilo libre. El acoplamiento carbodiimida puede realizarse a valores pH de entre 4 y 5, un rango en el que los colágenos presentan una solubilidad particularmente alta. También es imaginable la utilización del reactivo SPDP heterobifuncional (Pharmacia, Uppsala, Suecia), así como en general el acoplamiento del colágeno mediante moléculas espaciadoras.

También es posible revestir muy fácilmente con colágeno placas de poliestireno activadas con anhídrido de ácido maleico, a un pH neutro y a temperatura ambiente, con lo que se forma un enlace amida. Placas de este tipo pueden obtenerse, por ejemplo, con el nombre Reacti-Bind™ (Pierce). Como ya se ha mencionado, para el revestimiento se utiliza preferentemente colágeno Tipo III de origen humano, especialmente de placenta humana, habiéndose comprobado que es suficiente una concentración de no más de 2 \mug/ml. En una forma de realización preferente del ensayo según la invención, este tipo de colágeno se emplea también en forma de material digerido con pepsina. Las placas así revestidas pueden liofilizarse con gran facilidad a partir de la solución acuosa, después de lo cual es posible almacenar las placas a 4ºC, bajo exclusión de oxígeno y humedad, durante varios meses. Las placas microtituladas así preparadas son muy adecuadas para realizar un ensayo rápido de enlace de colágeno con fines de diagnóstico. El límite de determinación para el FvW es aquí del orden de 10 a 20 ng/ml.

Según otro aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado de colágeno, compuesto de una fase sólida y su colágeno enlazado de forma covalente, que presenta como mínimo una modificación en su parte glucídica, mediante la cual se realiza una inmovilización estable en un portador, sin que se vea perjudicada en lo esencial la capacidad de enlace del colágeno con respecto a una proteína de enlace de colágeno.

Sorprendentemente se descubrió que es posible modificar el colágeno químicamente y fijar el colágeno modificado mediante un enlace covalente a un portador, sin influir en la afinidad entre una proteína de enlace de colágeno y el colágeno, introduciendo una modificación en su parte glucídica. En el conjugado de colágeno según la invención, la capacidad de enlace y las propiedades de enlace del colágeno con respecto a una proteína afín al mismo permanecen inalteradas especialmente porque, según la presente invención, la modificación del colágeno se realiza en la parte glucídica de la molécula, con lo que no se causa perjuicio a los posibles sitios de enlace para proteínas de adhesión que se hallen en la parte proteínica de la molécula por una interacción entre portadores de colágeno con un enlace directo de la parte proteínica al portador. En los conjugados de colágeno enlazados de forma covalente descritos hasta el estado actual de la técnica, el enlace se realizaba con residuos aminoácido del colágeno, como por ejemplo en el caso de Wilkinson y col. (1990, Anal. Biochem. 185: 294-296) o en el documento EP 0 713 707. En éstos no podía excluirse que una parte de las regiones del colágeno necesarias para la afinidad con respecto a proteínas se bloqueasen o que los sitios de enlace se enmascarasen por una variación de la conformación debida al acoplamiento a un portador, con lo que se reduce la capacidad de enlace del colágeno a la proteína de adhesión. El conjugado de colágeno según la invención comprende colágeno ávido y preferentemente, como mínimo, una modificación en su parte glucídica.

La modificación puede introducirse en colágeno nativo no modificado mediante todos los procedimientos químicos habituales, especialmente mediante oxidación, sulfatación, acilación, esterificación, etc. Son preferentes aquellas modificaciones que introducen, como mínimo, un grupo reactivo en la parte glucídica del colágeno, y especialmente aquellas que se producen por oxidación, preferentemente de los restos de azúcar de los oligosacáridos, como galactosa y glucosa. Así, mediante la reacción o modificación química se produce un colágeno activado, capaz de reaccionar con otro ligando y entrar en una combinación química, por ejemplo en un enlace covalente.

Se comprobó que la configuración específica de los grupos reactivos en la parte azúcar de la molécula de colágeno también permite una inmovilización covalente en un portador, sin perjuicio de la afinidad del colágeno con respecto a las proteínas con propiedades adhesivas de enlace de colágeno. Los grupos reactivos del colágeno que pueden formar enlaces covalentes pueden obtenerse, por ejemplo, mediante oxidantes, como por ejemplo sales periodato de restos de azúcares como galactosa o glucosa, para su oxidación en la parte glucídica del colágeno con el fin de formar restos de aldehído y la formación de un enlace covalente entre estos grupos aldehído y otros grupos químicamente reactivos. Esto permite enlazar colágeno modificado químicamente a un portador de forma estable y covalente. Por lo tanto, en el conjugado de colágeno según la invención, el colágeno presenta preferentemente como modificación un grupo reactivo, especialmente un grupo aldehído, dentro de la parte glucídica del colágeno. Preferentemente, el colágeno según la presente invención está enlazado de forma covalente al portador mediante, como mínimo, un grupo reactivo.

Para la preparación del conjugado según la invención pueden emplearse como fase sólida todos los portadores poliméricos insolubles que puedan formar un enlace covalente con los grupos reactivos del colágeno modificado o sean aptos para el enlace covalente después de una adecuada activación. Como materiales portadores entran en consideración polímeros orgánicos, como poliamidas y polímeros vinílicos (poliacrilo, poliestireno y alcoholes polivinílicos y sus derivados), además de polímeros naturales, como celulosa, dextranos, agarosa, quitina y poliaminoácidos, y polímeros inorgánicos, como gel de sílice, vidrio e hidróxidos metálicos. Estos materiales portadores pueden utilizarse en forma de membranas, tiras o placas, como por ejemplo placas microtituladas, o para implantes, formas prefabricadas para articulaciones o uniones articulares artificiales o como revestimientos de heridas.

En una forma de realización especial, el colágeno se fija de modo covalente a un portador en forma de una placa microtitulada.

Según un aspecto preferente de la invención, la fase sólida del conjugado de colágeno según la invención presenta, como mínimo, un grupo reactivo que pueda formar un enlace covalente con, como mínimo, un grupo reactivo de colágeno modificado. La fijación covalente del colágeno modificado se realiza aquí directamente mediante un enlace de los grupos reactivos.

Según la presente invención, los grupos funcionales reactivos del portador son aquellos grupos funcionales que están químicamente activados y que pueden reaccionar con, como mínimo, un grupo reactivo del colágeno modificado. "Funcional activado" significa en este contexto un derivado químico de uno o varios grupos químicos del portador que, mediante reacciones químicas, son capaces de formar un enlace con grupos reactivos del colágeno modificado. Los grupos funcionales reactivos del portador pueden ser, por ejemplo, grupos aldehído, grupos anhídrido, grupos hidracida o grupos succinimida, que puedan formar un enlace covalente con grupos reactivos del colágeno modificado, como por ejemplo grupos aldehído. Mediante la utilización de portadores activados se garantiza también que el acoplamiento covalente del colágeno modificado proporcione una superficie sintética revestida del modo más uniforme posible. Además, mediante el enlace de dos grupos reactivos puede lograrse, en caso dado, una mayor rapidez de preparación del conjugado y su mayor estabilidad.

Según una forma de realización especial de la presente invención, el conjugado de colágeno según la invención se compone de un colágeno modificado, que como grupo reactivo presenta preferentemente un grupo aldehído, y un portador, que como grupo reactivo presenta preferentemente un grupo hidracida.

El colágeno modificado se enlaza de forma covalente al portador, preferentemente en solución o en suspensión. Mediante el enlace covalente estable del colágeno modificado al portador puede eliminarse fácilmente el colágeno no enlazado y en exceso, por ejemplo mediante una etapa de lavado especial.

Según otro aspecto de la presente invención, la fase sólida también puede estar unida al colágeno modificado mediante un elemento de unión o espaciador. Para ello, el colágeno puede estar acoplado a un antígeno, a una coenzima o a un anticuerpo enlazado de forma covalente a la fase sólida. Si el elemento de unión es un antígeno o un anticuerpo, puede emplearse cualquier antígeno para el cual pueda obtenerse un anticuerpo específico, o cualquier anticuerpo que reaccione con un antígeno determinado. Para la preparación del conjugado de colágeno según la invención, el antígeno o el anticuerpo se enlaza al colágeno de tal modo que la reacción química y el enlace entre el colágeno modificado y el portador no causen la pérdida de las propiedades de enlace del antígeno con respecto al anticuerpo específico y la capacidad de enlace del colágeno con respecto a una proteína de adhesión no se vea perjudicada en esencia. Según la presente invención, el conjugado colágeno-antígeno o el conjugado colágeno-anticuerpo puede enlazarse a continuación a una matriz sólida por medio de una interacción antígeno-anticuerpo. Para ello se acopla a una matriz sólida, preferentemente una matriz polimérica sintética, un anticuerpo que reaccione específicamente contra el antígeno determinado, o bien un antígeno contra el cual se disponga de un anticuerpo, y el conjugado colágeno-antígeno se inmoviliza en la matriz polimérica sólida mediante el anticuerpo enlazado a la matriz, o bien el conjugado colágeno-anticuerpo se inmoviliza en la matriz polimérica sólida con el antígeno enlazado a la matriz.

Según una forma de realización especial de la presente invención, el enlace del colágeno modificado en el conjugado de colágeno se realiza en una coenzima. Esta coenzima es, en particular, una coenzima que puede formar un enlace muy estable con un compuesto químico determinado, con una constante de disociación de como mínimo K=10^{-13} M, preferentemente de como mínimo K=10^{-15} M. Esta propiedad de la coenzima en particular se aprovecha para inmovilizar el compuesto químico de forma estable en una matriz sólida y realizando, con el compuesto químico enlazado a la matriz, una inmovilización estable del conjugado de colágeno según la invención. Según una forma de realización especial de la presente invención, la coenzima del conjugado de colágeno es biotina y el compuesto químico, que forma un enlace estable con la biotina, es avidina o estreptavidina.

De este modo, la matriz sólida a la que está acoplada preferentemente la avidina o la estreptavidina se asocia al conjugado de colágeno según la invención mediante el compuesto químico que actúa de espaciador. La matriz sólida puede ser una matriz polimérica sintética o natural. La matriz polimérica puede estar compuesta por cualquier material portador ya conocido, según lo arriba explicado.

Según un aspecto especial de la invención, el conjugado colágeno-biotina se inmoviliza en una matriz sólida en forma de una placa microtitulada, a la que está enlazada la avidina o la estreptavidina mediante un enlace biotina-(estrept)-avidina. Este tipo de conjugado de colágeno según la invención es preferente porque la preparación de las matrices poliméricas con (estrept)-avidina acoplada a las mismas corresponde al estado general actual de la técnica y es fácil de realizar. El empleo de un conjugado colágeno-biotina según la presente invención permite disponer también de una matriz revestida uniformemente con colágeno por medio del enlace con el complejo biotina-estreptavidina.

Se ha comprobado sorprendentemente que, mediante el conjugado de colágeno según la invención, especialmente mediante el acoplamiento químico de colágeno modificado en su parte azúcar a una fase sólida, en particular a una superficie sintética, tanto el tiempo de contacto como las cantidades de colágeno necesarias para preparar un conjugado de colágeno estable según la invención son considerablemente menores. Se descubrió, por ejemplo, que 1 \mug del colágeno según la invención y un tiempo de incubación de 1 hora son suficientes para enlazar químicamente el colágeno a un portador, como por ejemplo a una superficie sintética. La considerable reducción del tiempo de contacto lograda mediante el acoplamiento químico del colágeno a la superficie sintética hace que no se produzcan pérdidas por precipitación de colágeno "activo" y, con ello, que las cantidades de colágeno suficientes para formar una superficie de colágeno sintética estable sean considerablemente menores. Por consiguiente, para revestir el portador pueden emplearse concentraciones de colágeno inferiores a 3 \mug/ml, preferentemente inferiores a 2 \mug/ml. El revestimiento se realiza durante un mínimo de 10 minutos y hasta 24 horas, pero es preferible un tiempo de revestimiento de entre 30 y 60 minutos. La temperatura para ello puede seleccionarse entre 20ºC y 37ºC.

Se ha descubierto que en el conjugado de colágeno según la invención no se produce agregación alguna de colágeno y que, incluso después del enlace covalente del colágeno a un portador sólido, durante un tiempo prolongado no se produce ninguna agregación del colágeno inmovilizado. Esto permite preparar un conjugado de colágeno estable, enlazado si es el caso a una matriz polimérica sólida, conservando los sitios de enlace funcionales para proteínas de adhesión. Esto constituye una ventaja, especialmente si los conjugados de colágeno según la invención han de almacenarse durante un espacio de tiempo prolongado antes de su utilización. El almacenamiento puede realizarse a 4ºC en solución, pero preferentemente en forma liofilizada, durante varios meses o años.

La estabilidad del conjugado de colágeno según la invención garantiza que, en caso de utilizarse el mismo en distintos momentos tras su preparación, se obtengan datos de medición reproducibles o bien puedan compararse éstos directamente entre sí. Una comparación de datos, por ejemplo en la determinación de FvW:CBA, resultaba difícil hasta la fecha sobre todo porque la inmovilización pasiva no proporcionaba superficies de colágeno revestidas uniformemente, y la diferente distribución del colágeno acoplado a la superficie de la matriz sólo permitía sacar conclusiones limitadas con respecto a otros datos de medición o con respecto a muestras de comparación o controles. Gracias al acoplamiento covalente del colágeno al portador no pueden producirse pérdidas de colágeno, incluso con una manipulación posterior de la superficie de colágeno sintética, como por ejemplo el lavado de la superficie con soluciones o tampones, a diferencia de la fijación de colágeno pasiva y no específica. En la utilización de las soluciones y tampones empleados se dispone también de una mayor flexibilidad, ya que no hay que temer, como en el caso del acoplamiento pasivo del colágeno a una superficie, que la variación del pH del tampón cause una agregación del colágeno o una precipitación del mismo, lo que influiría de un modo muy negativo en los resultados medidos o en otros procedimientos para los que se emplea el colágeno según la invención. El acoplamiento covalente del colágeno permite además elegir entre condiciones neutras y ácidas durante el acoplamiento del colágeno, con lo que se aumenta la solubilidad del mismo. La mayor solubilidad del colágeno influye a su vez positivamente en la cantidad de colágeno que se ha de emplear para la preparación de portadores revestidos con colágeno. El conjugado de colágeno según la invención es especialmente adecuado para la realización de pruebas de diagnóstico. En éstas se han revelado como ventajas del conjugado especialmente la fácil estandarización y reproducibilidad de los resultados de medida, lo que hace posible una comparación de resultados.

El conjugado de colágeno según la invención también puede emplearse para la producción de implantes revestidos de colágeno, articulaciones artificiales o uniones articulares o revestimientos de heridas, por ejemplo en forma de vellón de colágeno, donde resulta ventajoso que estos revestimientos sean estables y uniformes sobre la superficie. Se prefieren especialmente los conjugados de colágeno que presentan, como mínimo, una modificación en su parte glucídica, a través de la cual se realiza un enlace estable a la fase sólida, sin influir en la capacidad de enlace de una sustancia de enlace de colágeno. De este modo es posible enlazar al conjugado de colágeno agentes adicionales que favorezcan la curación de las heridas o la compatibilidad del órgano artificial, por ejemplo fibrinógeno o fibronectina, o bien, utilizando el conjugado de colágeno según la invención, mejorar y/o acelerar el proceso de curación gracias a la conservación de la capacidad de enlace del conjugado de colágeno con las sustancias de enlace de colágeno presentes de forma natural en el proceso de curación de las heridas. Naturalmente, también es posible emplear polímeros inorgánicos como materiales portadores para la preparación del conjugado de colágeno según la invención. Tales conjugados de colágeno pueden utilizarse, por ejemplo, como portadores de afinidad para purificar y obtener sustancias de enlace de colágeno o para la extracción de tales sustancias de una solución. En este proceso, las sustancias de enlace de colágeno se enlazan de forma selectiva al portador de afinidad, mientras que las demás sustancias permanecen en solución; en caso dado la sustancia de enlace de colágeno se desorbe a continuación de nuevo del portador. Las condiciones para la realización de este procedimiento corresponden a los conocimientos técnicos generales y pueden realizarse similarmente a como se describe, por ejemplo, en Crouch y col. (1987, Biochem. Biophys. Acta 924: 81-86).

El colágeno del conjugado de colágeno según la invención puede obtenerse de colágeno presente en la naturaleza o de colágeno obtenido por métodos biotecnológicos o químicos, pudiendo el colágeno ser de Tipo I, Tipo III, Tipo IV, Tipo V, Tipo VI, Tipo VII o Tipo VIII o sus derivados. El colágeno puede ser de origen humano, bovino, porcino o equino, pero se prefiere el colágeno humano, especialmente de Tipo III. Sin embargo, para la preparación del conjugado pueden emplearse todos los derivados de colágeno, siempre que aún presenten los sitios de enlace específicos para proteínas de enlace de colágeno.

El conjugado de colágeno según la presente invención se distingue en particular porque el colágeno enlazado de forma covalente a un portador en el conjugado no presenta alteración alguna de sus propiedades de enlace ni de su capacidad de enlace con respecto a proteínas afines al colágeno, especialmente a proteínas con propiedades hemostáticas o con actividad hemostática. Esto es importante sobre todo porque, utilizado en una prueba de diagnóstico, el conjugado de colágeno presentaría una especificidad reducida si se hubieran visto perjudicados sus sitios de enlace con proteínas. Sin embargo, se descubrió sorprendentemente que en el conjugado de colágeno según la invención la capacidad de enlace del colágeno a una proteína afín, especialmente del colágeno modificado, no se ve perjudicada, sino que, por el contrario, la capacidad de enlace del colágeno enlazado de forma covalente en el conjugado con respecto a una proteína de adhesión con el colágeno se mejorado y aumenta considerablemente con relación al colágeno que está enlazado por adsorción a un portador mediante inmovilización pasiva. Esto fue sorprendente porque no era de esperar que el colágeno modificado, por ejemplo en su parte azúcar, pudiera enlazar una sustancia afín igual que el colágeno no modificado y porque, además, una inmovilización covalente según la invención del colágeno en un portador no influye negativamente en la capacidad de enlace del colágeno. En el marco de la presente invención se comprobó además que, gracias a la mejor y más eficaz cuota de acoplamiento a un portador del colágeno enlazado, es posible disponer de una superficie de colágeno sintética que requiere menos colágeno por superficie de portador de colágeno producida y presenta una mayor capacidad de enlace.

Uno de los objetivos fundamentales en la realización de análisis de sustancias y caracterizaciones funcionales consiste en disponer de alta sensibilidad para la detección de trazas de proteína en mezclas de sustancias. El conjugado de colágeno de la presente invención en particular es capaz de detectar cantidades mínimas de, por ejemplo, FvW en mezclas. Esto corresponde a una dilución superior a 1:2.000 del plasma humano. Por lo tanto, en el conjugado de colágeno según la invención el límite de sensibilidad para la determinación de una proteína de enlace de colágeno en una muestra, en particular de FvW, es preferentemente de 2 ng, de forma especialmente preferente de 1 ng y de forma muy especialmente preferente de 0,5 ng de FvW.

El conjugado de colágeno modificado según la invención en particular puede obtenerse sometiendo colágeno no modificado a una reacción química, con lo que se modifica químicamente. La reacción química es, preferentemente, una reacción de oxidación en la que se modifican químicamente sobre todo las moléculas de la parte glucídica del colágeno. Preferentemente se oxidan los restos azúcar presentes en la parte glucosídica de la molécula de colágeno, con lo que al menos se forma un grupo reactivo. Los restos azúcar son, principalmente, galactosa o glucosa, en los que el proceso de oxidación forma grupos aldehído reactivos. Como mínimo uno de los grupos reactivos del colágeno modificado es capaz de formar un enlace covalente con un grupo reactivo de un portador, con lo que se obtiene un conjugado de colágeno. Dado el caso, el conjugado de colágeno puede estar asociado a una matriz sólida, siempre que el portador del conjugado de colágeno no constituya de por sí una matriz polimérica sólida.

Según otro aspecto, la presente invención se refiere también a un dispositivo para la realización del procedimiento de determinación según la invención, que comprende un conjugado de colágeno según la invención. Este conjugado de colágeno puede ofrecerse separado de un recipiente adecuado para la toma de la muestra, o bien constituir en si mismo una parte del recipiente o estar configurado como recipiente.

El dispositivo según la invención comprende preferentemente también el recipiente para muestras; es decir, por ejemplo, una placa microtitulada, cubetas, cámaras de perfusión, tubos capilares, cuyos huecos o superficies contengan el colágeno ávido fijado de forma covalente.

Sin embargo, la fase sólida, incluyendo el colágeno ávido inmovilizado, puede estar configurada también como cuerpo para su introducción en un recipiente para muestras, por ejemplo como un peine que se ajuste a una placa de microtitulación o como perlas o granulado. Como cuerpos son adecuados por ejemplo las micropartículas, preferentemente de poliestireno, látex, liposomas o cuerpos lipídicos, polímeros sintéticos, polímeros orgánicos como proteínas desnaturalizadas de fibrina o colágeno, a los cuales está fijado el colágeno ávido de forma covalente. Estas micropartículas pueden estar preferentemente marcadas, por ejemplo con un colorante, con un marcador de fluorescencia, o utilizando propiedades magnéticas, aplicándose la marca a las partículas bien directamente o a través de un mediador.

El colágeno inmovilizado puede emplearse para el enlace del FvW en un sistema de análisis estático, pero también en uno dinámico. El enlace del factor von Willebrand a superficies en condiciones de flujo también depende de las fuerzas de cizallamiento presentes y de la composición de las soluciones en las que se produce esta adhesión. De esta forma, se emplean modelos en los que se bombean suspensiones de plaquetas o sangre a través de tubos capilares o cámaras, en las que se ofrecen a las soluciones perfundidas superficies que están dotadas de propiedades de enlace especiales para proteínas de los productos perfundidos.

En el estado actual de la técnica hasta la fecha en tales cámaras de perfusión se utilizaban superficies revestidas físicamente con colágeno, y a continuación se perfundían estás con sangre completa, con lo que la adhesión resultante de los trombocitos a la capa de colágeno era mediada por el factor von Willebrand contenido en la sangre completa. Las células enlazadas pueden hacerse visibles después de la fijación mediante técnicas de tinción convencionales y valorarse bajo el microscopio cualitativa y cuantitativamente mediante microdensitometría. Para ello se dispone también de métodos de análisis de imagen por medio de sistemas de vídeo (Sakariassen y col., Meth. Enzymol. 169, 37-104, 1989). Estos métodos pueden mejorarse mediante el procedimiento según la invención ya que el colágeno se halla enlazado de forma covalente en la cámara o a los tubos capilares.

De este modo se logra en primer lugar una homogeneidad máxima de la capa de colágeno inmovilizada, y en segundo lugar se impide que el colágeno enlazado sea desorbido por la superficie en el transcurso de la perfusión de los tubos capilares o las cámaras.

Según una forma de realización preferente del dispositivo según la invención, éste se presenta en una forma estable al almacenamiento, preferentemente en forma liofilizada.

La presente invención se refiere también a un kit para la realización del procedimiento según la invención, que contiene

a): un dispositivo según la invención con una fase sólida, a la que está fijado el colágeno ávido, y

b): un componente que presenta una actividad estandarizada de la sustancia de enlace de colágeno, preferentemente del FvW.

Como estándar preferido para el calibrado del sistema de prueba se emplea un plasma de referencia o un FvW altamente puro, especialmente FvWr, o una fracción de FvW con una actividad definida.

El dispositivo y el componente del kit según la invención se proporcionan preferentemente en una forma estable al almacenamiento, especialmente en forma liofilizada.

El kit según la invención puede contener además medios para la determinación de la sustancia de enlace de colágeno enlazada, en particular del FvW. Entre los ejemplos de tales medios se incluyen preparados de anticuerpos marcados, especialmente anticuerpos monoclonales contra la sustancia de enlace de colágeno, en particular contra una proteína de adhesión, recipientes separados para acoger soluciones de detección y reactivos.

Por lo tanto, el kit de prueba según la invención puede incluir, como mínimo, una sustancia o reactivo para realizar una reacción de detección específica, especialmente para la detección de la sustancia enlazada al colágeno. Como sustancias o reactivos preferentes para la reacción de detección se utilizan sobre todo anticuerpos marcados, dirigidos contra la proteína afín al colágeno, y en particular contra proteínas de adhesión enlazadas al colágeno, prefiriéndose especialmente los anticuerpos monoclonales.

Mediante el enlace del FvW por una parte al colágeno de la pared vascular y por otra parte a receptores de las plaquetas se produce el efecto de hemostasia del FvW. Los enlaces del FvW al receptor FvW GP Ib de las plaquetas se realiza en sitios de enlace dentro del lazo Cys 509-Cys 695 del FvW. Sorprendentemente, los presentes estudios han demostrado que tras el enlace del FvW al conjugado de colágeno, el FvW enlazado puede determinarse cualitativa y cuantitativamente mediante un anticuerpo monoclonal que se enlace de forma selectiva al sitio de enlace del receptor funcional dentro del lazo Cys 509-Cys 695. Esto ha permitido desarrollar por vez primera un sistema de prueba que englobe las dos propiedades funcionalmente necesarias del FvW: el enlace al colágeno y la funcionalidad del sitio de enlace de receptor GP Ib.

Por lo tanto, el kit de prueba contiene de forma especialmente preferente un anticuerpo monoclonal contra FvW, con preferencia un anticuerpo monoclonal que se enlace al epítopo funcionalmente activo del FvW para el enlace de plaquetas (Goddall y col. (1985), Brit. J. Haemotol. 59: 565-577), y FvW con una actividad determinada como estándar. Mediante la combinación del enlace del FvW a una superficie de colágeno, por una parte, y el enlace del anticuerpo monoclonal al epítopo del FvW responsable del enlace FvW-plaquetas, por otra parte, se logra una simulación única de la funcionalidad in vivo del FvW, la formación de puentes colágeno-epitelio y plaquetas, y con ello por vez primera un nuevo sistema de diagnóstico que tiene en cuenta in vitro la funcionalidad total del FvW en relación a la hemostasis primaria.

La detección se realiza preferentemente tras una reacción con un sustrato marcado, pudiendo emplearse como marcadores fluorógenos, cromógenos, sustancias radioactivas, luminógenos, etc.

Por último, la presente invención se refiere también a un procedimiento para la fabricación de un dispositivo según la invención, que comprende la preparación de una solución de un colágeno que presente como mínimo una modificación en su parte glucídica, la fijación química del colágeno mediante la modificación en su parte glucídica a un portador sólido, especialmente sin una reticulación esencial del colágeno, y en caso dado la liofilización. El procedimiento puede realizarse con concentraciones muy bajas del colágeno ávido, preferentemente con menos de 20 \mug de colágeno ávido por ml de solución de partida, especialmente menos de 10 \mug/ml.

Hay que destacar que el procedimiento según la invención es adecuado tanto para la determinación cuantitativa o semicuantitativa como para la determinación cualitativa de factor von Willebrand plasmático o recombinante. Como muestra puede analizarse plasma o bien una fracción plasmática. No obstante, una de las ventajas esenciales consiste en la posibilidad de ensayar preparados de FvW fisiológicos altamente concentrados y altamente activos. Por consiguiente, también es objeto de la presente invención un procedimiento para la determinación de la actividad fisiológica del FvW en una muestra, procedimiento caracterizado porque se pone en contacto la muestra con un conjugado de colágeno según la invención y se determina la cantidad de FvW enlazada.

De este modo ha sido posible comprobar sorprendentemente actividades específicas de como mínimo 40 U/mg, preferentemente más de 50 U/mg, hasta la actividad específica teórica.

El procedimiento de determinación según la invención implica habitualmente la incubación del colágeno inmovilizado con una muestra, para lo cual se emplean diferentes diluciones de la muestra y, en caso dado, un calibrador. La incubación se realiza preferentemente a una temperatura entre 18 y 37ºC, preferentemente a temperatura ambiente, durante un espacio de tiempo de entre 10 minutos y 3 horas, preferentemente entre 30 minutos y 1 hora. A continuación se separa el resto de la muestra, en caso dado se lava el portador sólido, y se pone en contacto con un reactivo para inducir una reacción de detección o se determina la proteína de adhesión enlazada con métodos de detección directos. Comparando con un preparado estándar se determina la concentración de la proteína de adhesión en la muestra.

Por último, la presente invención se refiere también a la utilización del procedimiento según la invención para la determinación de la funcionalidad, especialmente de la capacidad de enlace, de una sustancia de enlace de colágeno, pues el procedimiento según la invención no es sólo adecuado para la cuantificación de muestras, sino también, gracias a su especificidad, por ejemplo para la medición de capacidades de enlace, y especialmente la excelente capacidad de estandarización del procedimiento según la invención ofrece importantes ventajas frente a los procedimientos usuales.

La invención se explica más detalladamente en los ejemplos siguientes y las figuras de los dibujos, a los/las cuales no ha de limitarse.

Figuras

Figuras 1 y 2: pruebas de enlace de colágeno utilizando placas microtituladas a las que se ha fijado de forma covalente colágeno humano de Tipo III;

Figura 3: significado de la prueba de enlace de colágeno en lo que se refiere a las variaciones estructurales del FvW;

Figura 4: enlace de FvW a un conjugado de colágeno modificado enlazado de forma covalente;

Figura 5: enlace de FvW a un conjugado de colágeno-biotina;

Figura 6: comparación entre el enlace de FvW a conjugado de colágeno modificado (- - -) y a un colágeno no modificado (.......);

Figura 7: enlace de fibronectina a un conjugado de colágeno modificado enlazado de forma covalente;

Figura 8: enlace de FvW a un conjugado de colágeno modificado y detección mediante anticuerpos monoclonales con especificidad para el epítopo de FvW funcionalmente activo;

Figura 9: estructura multimérica de LMW-FvW (traza b), MMW-FvW (traza c) y HMW-FvW (traza d) tras un análisis mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%;

Figura 10: estructura multimérica del FvW de plasma citratado de pacientes con vWD, representando: traza a = muestra #01; traza b = muestra #02; traza c = muestra #03; traza d = muestra #04; traza e = muestra #05; traza f = muestra #06; traza g = muestra #07; traza h = muestra #08; traza i = muestra #09; traza j = muestra #10; traza k = muestra #11; traza l = muestra #12; traza m = muestra #13; traza n = plasma normal;

y

Figura 11: estructura multimérica de FvW antes y después del tratamiento con DDAVP, representando: traza a = plasma normal, traza b = muestra #14; traza c = muestra #14 1 h. tras la dosis de DDAVP; traza d = muestra #15; traza e = muestra #15 1 h. tras la dosis de DDAVP; traza f = muestra #16; traza g = muestra #16 1 h. tras la dosis de DDAVP; traza h = muestra #17; traza i = muestra #17 1 h. tras la dosis de DDAVP.

Ejemplos Ejemplo 1

A una placa microtitulada de poliestireno (96 pocillos, Pierce Reactibind™/anhídrido de ácido maleico activado) se le añaden, en cada pocillo, 100 \mul de una suspensión de colágeno Tipo III digerido con pepsina (Southern Biotechnology) procedente de placenta humana, a una concentración de 2 \mug/ml, y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente, y a continuación durante 30 minutos con 150 \mul de tampón de bloqueo (Pierce Superblock™). A continuación se aplican, en cada caso, 100 \mul de distintas diluciones de la muestra que contiene el factor von Willebrand (25-250 ng de FvW/ml). Después se incuba con 100 \mul de una solución de un anticuerpo anti-FvW conjugado con peroxidasa (Dakopatts P226, dilución 1:1.000). Seguidamente se añaden 100 \mul de sustrato (Single Component TMB Peroxidase EIA Substrate, Bio-Rad) y la reacción de tinción se interrumpe después de 1 minuto mediante dilución 1+1 con H_{2}SO_{4} 0,18 M. Luego se mide la extinción a 450 nm con ELISA-Reader (lector ELISA) y se determina la concentración de la muestra frente a una serie de diluciones de un estándar. Después de cada paso de incubación se lava siempre 3 veces con 150 \mul de tampón (tampón correspondiente, en cada caso, a la etapa siguiente).

Sistema tampón utilizado

Tampón 1: (para el revestimiento de colágeno y la dilución de anticuerpos): fosfato sódico 8 mM, NaCl 135 mM, KCl 2,6 mM, pH 7,3

Tampón 2: (para la dilución de muestras): corresponde a tampón 1 + 0,05% de Tween 20 y 1% de albúmina de suero bovino, pH 7,3

Los resultados se desprenden de la Figura 1. En la prueba se emplean, en cada caso, distintas diluciones de FvW y, como ya se ha mencionado, las absorciones se determinan mediante ELISA-Reader. La figura muestra las absorciones medidas en función de la cantidad de FvW empleada en la prueba en el ejemplo de un plasma de referencia. A partir de una curva como ésta, que puede servir como estándar, y una serie de diluciones de la muestra puede determinarse la actividad de enlace de colágeno de la muestra (Parallel Line Assay). El rango de trabajo óptimo para esta variante se halla en una concentración de FvW de entre 50 y 250 ng/ml, con un límite de determinación de 20 ng/ml.

Ejemplo 2

Se biotinila un anticuerpo policlonal contra el factor von Willebrand humano (Dakopatts A 082) con ayuda de un kit (Amersham RPN 28). Siguiendo las instrucciones, el anticuerpo se diluye con tampón borato 0,05 M, pH 8,6, hasta una concentración de 1 mg/ml. A 2 ml de esta solución se añaden 80 \mul de reactivo de biotinilación y se incuba durante una hora a temperatura ambiente, agitando ligeramente. A continuación se filtra esta mezcla sobre gel mediante Sephadex G-25, utilizando tampón PBS, pH 7,5, que contiene un 0,1% de albúmina de suero bovino. Las fracciones que contienen el anticuerpo biotinilado (volumen de exclusión/medición de la extinción a 280 nm), se reúnen y almacenan tras adición de un 0,2% de azida sódica a una temperatura de 4ºC.

Ejemplo 3

Análogamente al ejemplo 1, se realiza un ELISA de FvW:colágeno utilizando un anticuerpo biotinilado (obtenido según el Ejemplo 2). En una placa microtitulada preparada según el Ejemplo 1 con colágeno inmovilizado de Tipo III se aplican, según se explica en dicho ejemplo, distintas diluciones de la muestra que contiene el factor von Willebrand (10-200 ng de FvW/ml). A continuación se incuba, en cada caso, con 100 \mul de una dilución (1:500 en tampón 1) de un anticuerpo biotinilado según el Ejemplo 2 durante 1 h a temperatura ambiente y después durante 1 hora, en cada caso con 100 \mul de un conjugado estreptavidina-peroxidasa (Amersham RPN 1231) a una dilución 1:1.000 (tampón 1 con un 0,1% de Tween 20). La adición de sustrato y los pasos ulteriores se realizan según se explica en el Ejemplo 1. Los resultados de esta variante preferente se muestran en la Figura 2.

Para esta variante, el valor óptimo está entre 20 y 200 \mug/ml, con un límite de determinación de 5 \mug/ml.

Ejemplo 4

Análogamente al Ejemplo 1 se fija de forma covalente colágeno de Tipo III procedente de placenta humana a una placa microtitulada mediante incubación de 100 \mul de suspensión de colágeno durante un tiempo de incubación de 3 horas y se realizan pruebas de enlace de colágeno según los Ejemplos 1 y 3.

Ejemplo 5

Como se explica en los Ejemplos 1 y 4, se fija de forma covalente colágeno de Tipo III procedente de placenta humana a placas microtituladas. Como tampón de revestimiento se utiliza el tampón 1, añadiendo un 0,3% de albúmina de suero bovino. Tras el revestimiento, y en cada caso, se realiza una prueba de enlace de colágeno como se explica en los Ejemplos 1 y 3.

Ejemplo 6

Se realiza una prueba de enlace de colágeno como se explica en los Ejemplos 1 y 3. El bloqueo de la placa microtitulada se realiza mediante incubación durante 1 hora con 150 \mul de tampón fosfato, pH 7,2 (fosfato 0,1 M, NaCl 0,15 M), añadiendo un 3% de albúmina de suero bovino.

Ejemplo 7

Después de revestir con colágeno unas placas microtituladas según los Ejemplos 1, 4 y 5, y tras la etapa de bloqueo, se lava 5 veces con 150 \mul de ácido acético 0,1 M. Tras añadir otros 150 \mul de ácido acético 0,1 M por pocillo, las placas se congelan a -80ºC y se liofilizan.

Ejemplo 8

Después de revestir con colágeno unas placas microtituladas según los Ejemplos 1, 4 y 5, y tras la etapa de bloqueo, se lava 5 veces con 150 \mul de H_{2}O. Tras añadir otros 150 \mul de H_{2}O por pocillo, las placas se congelan a -80ºC y se liofilizan.

Ejemplo 9

Con ayuda de unas placas microtituladas preparadas según los Ejemplos 7 y 8 se realiza un ensayo de enlace de colágeno. El primer paso del ensayo consiste en la incubación con la muestra que contiene el factor von Willebrand según lo explicado en los Ejemplos 1 y 3. Todos los demás pasos se realizan también según lo explicado en dichos ejemplos.

Ejemplo 10

Para la determinación de la actividad de enlace de colágeno de un FvW recombinante se prediluye una solución hasta una unidad de RcoF/ml. De esta solución, así como de un plasma de referencia (firma Immuno, Viena) que sirve como estándar, se prepara una dilución 1:50 en el tampón 2 (véase el Ejemplo 1), y de ésta otras 6 diluciones en incrementos de 1:1,5 respectivamente. Estas diluciones se emplean para la variante de prueba descrita en el Ejemplo 3. Las absorciones obtenidas con ayuda de ELISA-Reader se valoran de forma semilogarítmica (sistema de coordenadas: absorción lineal / dilución logarítmica). A partir de la serie de diluciones del plasma de referencia (= 100% FvW:CB) se elabora una curva de referencia. En esta curva de referencia pueden leerse los valores para las diluciones de las muestras correspondientes. Para calcular la actividad de enlace de colágeno (unidad: FvW:CB) de la muestra, se multiplican los valores por las diluciones de las muestras correspondientes y se calcula la media (Parallel Line
Assay).

Ejemplo 11

A 8,1 ml de una solución de FvW recombinante (3 unid. FvW:RcoF/ml) en tampón citrato fisiológico, pH 7,0, se añaden 0,9 ml de una solución de plasmina humana (firma Chromogenix) a una concentración de 30 U/ml (concentración final 3 U/ml) y se incuban a 37ºC. En los momentos 0, 1, 3, 6 y 21 horas se toman muestras y se interrumpe la reacción mediante adición de 0,15 ml de una solución PPACK 10 mM (D-Phe-Pro-Arg-clorometilcetona-diclorhidrato/firma Calbiochem) a 1,35 ml de muestra. A continuación, se analiza el factor von Willebrand de estas muestras en lo que se refiere a su estructura multimérica, la actividad del cofactor ristocetina y el enlace de colágeno. Los resultados se muestran en la Tabla 1 (véase también la Figura 3).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Ejemplo 12

La estructura multimérica del factor von Willebrand en la digestión enzimática con plasmina se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa SDS, en un gel de agarosa al 2%, según el método descrito en Ruggeri y col., Blood 57: 1140-1143. Aquí, los multímeros de factor von Willebrand se hacen visibles mediante tinción inmunoenzimática según Aihara y col., Thromb. Haemostas. 55: 263-267, 1986. Como anticuerpo primario se utiliza un antisuero de anti-factor von Willebrand de conejo (Dakopatts, Glostrup, Dinamarca) a una dilución 1:5.000. Como anticuerpo secundario se utiliza un anticuerpo anti-conejo-IgG H + L de cabra conjugado con fosfatasa alcalina y purificado por afinidad (Axell, Accurate Chemical and Scientific Corp., NY) a una dilución 1:1.000. La tinción de las bandas proteínicas se realiza mediante un sistema de sustrato cloruro nitroazul de tetrazolio-cloroindolilfosfato de bromo. A continuación se escanean las bandas coloreadas con un densitómetro, Scanner Sharp JX325, y se cuantifican las bandas multiméricas que corresponden al pentámero del dímero primario con el software ImageMaster™ (Pharmacia). La disminución de las bandas con el tiempo se determina en relación al momento 0 (= 100%).

Ejemplo 13

La determinación del cofactor ristocetina se realiza con ayuda de un método turbidimétrico, utilizando un agregómetro de 4 canales (firma Chronolog) con un sistema de registro conectado al mismo. Para realizar la determinación se prepara, a partir de un plasma de referencia (calibrado para la actividad del cofactor ristocetina frente al estándar WHO) y de las muestras que contienen el FvW, una serie de diluciones con tampón citrato fisiológico, pH 7,35 (adicionando un 5% de albúmina humana). A continuación se incuban en la cubeta del agregómetro 400 \mul de trombocitos fijados con formaldehído (250.000/\mul) con 50 \mul de muestra durante 3 minutos a 37ºC y bajo agitación constante (900 rpm). Con la adición de 50 \mul de una solución de sulfato de ristocetina (Apothekernes Laboratorium A.S.) en H_{2}O (concentración 10 mg/ml) se inicia la reacción de aglutinación, que se detecta mediante fotometría y se registra. Se mide la velocidad máxima de reacción en el punto de mayor pendiente de la curva. A partir de la serie de diluciones del plasma de referencia puede elaborarse una curva estándar, en la que pueden leerse las actividades de cofactor ristocetina (unidad: FvW:RcoF/ml) de las muestras. Los resultados se desprenden de la Figura 3. Esta figura muestra el significado de la prueba de enlace de colágeno en lo referente a las variaciones estructurales del FvW en comparación con la determinación del cofactor ristocetina (Ejemplo 13) ilustrando la cinética de una digestión con plasmina del FvW recombinante (Ejemplo 11). Como comparación, en este gráfico se ha empleado la degradación de los multímeros en porcentaje (Ejemplo 12). La figura, así como los datos de la tabla, muestran que, aunque la actividad de enlace de colágeno y el cofactor ristocetina descienden con el aumento de la degradación de los multímeros, la determinación de la actividad de enlace de colágeno constituye un sistema de prueba que se diferencia claramente de la actividad del cofactor ristocetina.

Ejemplo 14

Para la utilización en una cámara de flujo, se inmoviliza colágeno de Tipo I en el cubreobjetos que presenta la superficie de enlace específica de la forma siguiente:

El cubreobjetos se trata durante 1 hora con HNO_{3} al 3% a 90ºC, a continuación se lava con agua hasta que ya no pueda detectarse ácido alguno en la solución de lavado. Seguidamente, el vidrio se guarda como mínimo durante 36 horas en agua destilada. Al cubreobjetos se adiciona entonces una solución acuosa al 10% de 3-aminopropiltrietoxisilano y el pH de la solución se ajusta a 3,5 con HCl 6 M. A continuación se calienta durante 2 horas hasta 75ºC, se saca el cubreobjetos del baño, se elimina el exceso de reactivo mediante lavado intenso con agua y se seca durante 15 horas a 115ºC. Con el tratamiento con aminosilano se introducen covalentemente grupos amino primarios en la superficie del vidrio, que en el paso siguiente continúan siendo derivados con dialdehído glutárico. Mediante tratamiento con una solución acuosa de dialdehído glutárico al 10% durante 4 horas a 22ºC se forman bases de Schiff con los grupos amino primarios. El dialdehído glutárico en exceso se elimina con un lavado con agua helada. Como resultado de este proceso aparecen grupos aldehído activos en la superficie, a los que el colágeno puede ahora enlazarse de forma covalente. Para ello se prepara una solución de 1 mg/ml de colágeno Tipo I de tendón de caballo (Kollagenreagens Horm, Nycomed Arzneimittel, Munich) en tampón acetato 0,1 M, pH 4,0. El cubreobjetos así tratado se incuba ahora durante 15 horas a 22ºC en esta solución. A continuación se elimina la proteína en exceso mediante tratamiento con tampón acetato. El cubreobjetos así pretratado se emplea ahora como superficie en una cámara de flujo, fabricada de acuerdo con una publicación de Sakariassen y col. (J. Lab. Clin. Med. 102, 522-535, (1983)).

Ejemplo 15

Con el sistema de cámara de flujo obtenido según el Ejemplo 13 se realiza un experimento de perfusión. Como producto de perfusión se utiliza sangre completa citratada (Sakariassen y col., Meth. Enzymol. 169, 37-70, (1989)). La subsiguiente perfusión, así como la valoración de los datos, se realiza según Boomgaard y col. (Vox Sang. 66, 18-24, (1994)). El producto de perfusión se bombea a través de la cámara a una velocidad de 95 ml/min y una temperatura de 37ºC durante un tiempo de 5 minutos. Después se saca de la cámara el cubreobjetos revestido de colágeno, se fijan las células adheridas con un 0,5% de aldehído glutárico y se tiñen con una solución May-Grünwald-Giemsa (Merck, Darmstadt). La evaluación de la densidad porcentual de ocupación de los trombocitos en la superficie del cubreobjetos se realiza mediante microscopía óptica de 1.000 aumentos, utilizando un sistema de análisis de imagen.

Ejemplo 16 Disolución de colágeno

Se disolvió en ácido acético 500 mM, a 4ºC, colágeno humano de Tipo III hasta 5 mg/ml y a continuación se diluyó con agua hasta 1 mg/ml. El colágeno disuelto se almacenó a -20ºC.

Ejemplo 17 Modificación química del colágeno

Para la modificación química se diluyó el colágeno (Ejemplo 16) en un tampón de acetato sódico 10 mM, pH 4, hasta 10 \mug/ml. Se añadieron 32 mg de NaIO_{4} a 10 ml de la solución y durante ½ hora a temperatura ambiente se llevó a cabo la modificación, en la cual se produce una modificación química y se forman grupos aldehído reactivos en la molécula de colágeno.

Ejemplo 18 Acoplamiento químico del colágeno modificado

Para la obtención de un colágeno enlazado de forma covalente a una superficie sintética se puso en contacto colágeno modificado con una superficie de hidrazida. Para ello se enlazó de forma covalente colágeno según el Ejemplo 17 en placas microtituladas con superficie de hidrazida (firma Costar). En cada pocillo de la placa microtitulada se aplicaron 100 \mul de la solución con colágeno modificado y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después se realizaron 3 lavados con tampón Tris/HCl 10 mM, pH 7,2, que contenía NaCl 150 mM y un 0,05% de Tween 20. A continuación se desactivó la placa microtitulada mediante adición de un tampón Tris/HCl 50 mM, pH 8,2, que contenía un 1% de albúmina bovina. Finalmente se eliminó la solución de desactivación.

Ejemplo 19 Biotinilación del colágeno

Para la obtención de colágeno biotinilado se mezcló 1 ml de una solución de colágeno (1 mg/ml en ácido acético 100 mM) con 1 ml de NaIO_{4} (20 mM en tampón acetato sódico 100 mM, pH 5,5) y se incubó durante ½ hora. Después se añadieron 3 \mul de glicerina y se separó el exceso de glicerina y de NaIO_{4} mediante filtración sobre gel. A continuación se añadió biotina-LC-hidrazida hasta una concentración final 5 mM y se incubó durante 2 horas. El exceso de biotina se eliminó mediante diálisis. Mediante oxidación de los oligosacáridos del colágeno se formaron grupos aldehído reactivos, que reaccionan con grupos amino reactivos, como los grupos hidrazida, y se enlazan a éstos de forma covalente, con lo que se forma un complejo estable de biotina y colágeno.

Ejemplo 20 Acoplamiento biotina-colágeno en placas microtituladas

Para la obtención de una superficie de colágeno sintética se puso en contacto el sistema biotina-colágeno enlazado de forma covalente con una superficie que contenía estreptavidina, para que el complejo biotina-colágeno se fijase, por adición, a la superficie sintética mediante el enlace altamente afín entre la biotina y la estreptavidina. Para ello se enlazó biotina-colágeno según el Ejemplo 19 en placas microtituladas con superficie de estreptavidina. En cada pocillo de la placa se aplicaron 100 \mul de biotina-colágeno (10 \mug/ml en tampón Tris/HCl 10 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 150 mM y un 0,05% de Tween 20), que se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se realizaron 3 lavados con tampón Tris/HCl 10 mM, pH 7,2, que contenía NaCl 150 mM, un 0,1% de BSA y un 0,05% de Tween 20. A continuación se desactivó la placa microtitulada mediante adición de un tampón Tris/HCl 50 mM, pH 8,2, que contenía un 1% de albúmina bovina. Finalmente se eliminó la solución de desactivación.

Ejemplo 21 Enlace del FvW a un conjugado de colágeno y detección del FvW enlazado

Se diluyó plasma citratado humano de modo que resultasen concentraciones de FvW de entre 330 ng/ml y 5 ng/ml. Como tampón de dilución se utilizó Tris/HCl 10 mM, pH 7,2, que contenía NaCl 150 mM, un 0,05% de Tween 20 y un 1% de albúmina bovina. Se cargaron en cada caso 100 \mul de las diluciones en cada pocillo de la placa microtitulada con colágeno modificado acoplado (según el Ejemplo 18 o el Ejemplo 19) y se incubaron durante 1 hora. A continuación se lavaron las placas 3 veces con tampón Tris/HCl 10 mM, pH 7,2, que contenía NaCl 150 mM y un 0,05% de Tween 20. Para la detección del FvW enlazado al colágeno se diluyó a 1:1.000 un suero anti-FvW de cabra policlonal conjugado con peroxidasa (Dako) y se dispusieron 100 \mul en cada pocillo. Tras 1 hora de incubación, la placa microtitulada se lavó 3 veces con tampón Tris/HCl 10 mM, pH 7,2, que contenía NaCl 150 mM y un 0,05% de Tween 20. A continuación se inició la reacción colorimétrica mediante adición de una solución de sustrato peroxidasa, reacción que a los 5 minutos se interrumpió adicionando 100 \mul de H_{2}SO_{4} 1 M. Después se determinó la extinción de la solución de tinción mediante fotometría a una longitud de onda de 450 nm y se relacionó con la concentración de FvW administrada (Figura 4 y Figura 5). Pudo demostrarse que la superficie de colágeno según la invención enlaza el FvW en una forma que depende de la concentración.

Ejemplo 22 Comparación de la capacidad de enlace del conjugado de colágeno modificado enlazado de forma covalente y el colágeno no modificado inmovilizado de forma pasiva

Siguiendo el Ejemplo 18 se enlazó covalentemente colágeno modificado químicamente a placas microtituladas con superficie de hidrazida (firma Costar). En cada uno de los pocillos de las placas se introdujeron 100 \mul de la solución con colágeno modificado y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después se realizaron 3 lavados con tampón Tris/HCl 10 mM, pH 7,2, que contenía NaCl 150 mM y un 0,05% de Tween 20. A continuación se desactivó la placa microtitulada adicionando de tampón Tris/HCl 50 mM, pH 8,2, que contenía un 1% de albúmina bovina. Entonces se eliminó la solución de desactivación. De igual modo, las placas microtituladas se trataron con colágeno no modificado inmovilizado de forma pasiva, según el procedimiento descrito por Brown y col. (1986, Throm. Res. 43: 303-311). A continuación se realizó para ambas variantes el enlace de FvW y la detección del FvW según el Ejemplo 21. El resultado se muestra en la Figura 6. Puede verse que, mediante la modificación química específica del colágeno y el subsiguiente acoplamiento covalente, se logra un enlace FvW-colágeno considerablemente más sensible que con colágeno no modificado enlazado de forma pasiva a la superficie sintética. Llama especialmente la atención que en el caso del colágeno no modificado se produzca una saturación de la capacidad de enlace del FvW a una concentración de éste considerablemente menor que en el caso del conjugado de colágeno según la invención.

Ejemplo 23 Caracterización del FvW con distintos grados de multimerización mediante conjugado de colágeno covalente y correlación entre la multimerización de FvW y el enlace de colágeno

De acuerdo con la solicitud de patente alemana DE 44 35 392 se obtuvieron, a partir de plasma humano citratado, fracciones de FvW con distintos grados de multimerización (FvW de bajo peso molecular (LMW-vWF), FvW de peso molecular medio (MMW-vWF) y FvW de alto peso molecular (HMW-vWF)). La Figura 8 muestra la multimerización de LMW-vWF, MMW-vWF y HMW-vWF. Las fracciones de FvW se analizaron de acuerdo con el Ejemplo 21 en lo que se refiere al enlace de colágeno. Como referencia se utilizó el enlace de colágeno del FvW de plasma humano, siendo la concentración del antígeno FvW (vWF:Ag) en el plasma humano de 10 \mug/ml y definiéndose la actividad de enlace de colágeno (CBA) del FvW en el plasma humano en 1 ml como 1 CBA, de lo que resulta un enlace de colágeno específico de 100 CBA por 1 mg de FvW:Ag. Al mismo tiempo se determinó la funcionalidad de los preparados de FvW con relación a la actividad del cofactor ristocetina (Rist:CoF), así como el contenido en antígeno de FvW (FvW:Ag). Los resultados se resumen en la Tabla 2. Puede verse que un aumento de la actividad de enlace de colágeno (CBA/FvW:Ag) coincide con un aumento del grado de multimerización. Al mismo tiempo, existía una coincidencia entre CBA y Rist:CoF.

TABLA 2 Caracterización del enlace de colágeno del FvW en función del grado de multimerización

2

Ejemplo 24 Enlace de fibronectina al conjugado de colágeno modificado enlazado de forma covalente y detección de la fibronectina enlazada

Se diluyó plasma humano citratado de modo que resultasen concentraciones de fibronectina de entre 150 ng/ml y 2,34 ng/ml. Como tampón de dilución se utilizó Tris/HCl 10 mM, pH 7,2, que contenía NaCl 150 mM, un 0,05% de Tween 20 y un 1% de albúmina bovina. Se cargaron 100 \mul de las diluciones en cada pocillo de la placa microtitulada con colágeno modificado enlazado (Ejemplo 18) y se incubaron durante 1 hora. A continuación se lavaron las placas 3 veces con un tampón Tris/HCl 10 mM, pH 7,2, que contenía NaCl 150 mM y un 0,05% de Tween 20. Para la detección del FvW enlazado al colágeno se diluyó a 1:1.000 un suero anti-fibronectina policlonal de cabra conjugado con peroxidasa (Dako) y se añadieron 100 \mul a cada pocillo. Tras 1 hora de incubación, la placa microtitulada se lavó 3 veces con tampón Tris/HCl 10 mM, pH 7,2, que contenía NaCl 150 mM y un 0,05% de Tween 20. A continuación se inició la reacción colorimétrica mediante adición de una solución de sustrato de peroxidasa, reacción que a los 5 minutos se interrumpió por adición de 100 \mul de H_{2}SO_{4} 1 M. Después se determinó la extinción de la solución de tinción mediante fotometría a una longitud de onda de 450 nm y se relacionó con la concentración de FvW administrada (Figura 7). Se demuestra que el colágeno modificado y enlazado de forma covalente enlaza la proteína plasmática fibronectina en una forma que depende de la concentración.

Ejemplo 25 Enlace del FvW a un conjugado de colágeno modificado y detección de la actividad FvW mediante un anticuerpo monoclonal específico

Se diluyó plasma humano citratado de modo que resultasen concentraciones de FvW de entre 330 ng/ml y 5 ng/ml. Como tampón de dilución se utilizó Tris/HCl 10 mM, pH 7,2, que contenía NaCl 150 mM, un 0,05% de Tween 20 y un 1% de albúmina bovina. Se cargaron 100 \mul de las diluciones en cada pocillo de cada placa microtitulada con colágeno modificado enlazado (Ejemplo 18) y se incubaron durante 1 hora. A continuación se lavaron las placas 3 veces con tampón Tris/HCl 10 mM, pH 7,2, que contenía NaCl 150 mM y un 0,05% de Tween 20. Para la detección del FvW enlazado al colágeno se utilizó un anticuerpo monoclonal (mAK), que se enlaza de forma selectiva sólo al epítopo funcionalmente activo del FvW para el enlace de plaquetas (Goodall, A.H. y col., Brit. J. Haematol (1985), 59, 565-577). Tras 1 hora de incubación, las placas se lavaron 3 veces con tampón Tris/HCl 10 mM, pH 7,2, que contenía NaCl 150 mM y un 0,05% de Tween 20. Para la detección del mAK enlazado al FvW se diluyó a 1:1.000 un suero policlonal de cabra conjugado con peroxidasa contra inmunoglobulina de ratón (Bio-Rad) y se añadieron 100 \mul en cada pocillo. Tras 1 hora de incubación, la placa se lavó 3 veces con tampón Tris/HCl 10 mM, pH 7,2, que contenía NaCl 150 mM y un 0,05% de Tween 20. A continuación se inició la reacción colorimétrica mediante adición de una solución de sustrato de peroxidasa, reacción que a los 5 minutos se interrumpió por la adición de 100 \mul de H_{2}SO_{4} 1 M. Después se determinó la extinción de la solución de tinción mediante fotometría a una longitud de onda de 450 nm y se relacionó con la concentración de FvW administrada (Figura 8). El mAK utilizado tiene una capacidad de enlace tal que el mAK sólo se enlaza al epítopo funcionalmente activo, responsable del enlace de plaquetas, del FvW. Mediante la combinación del enlace del FvW a una superficie de colágeno por una parte y el enlace del mAK al epítopo responsable del enlace FvW-plaquetas del FvW por otra, se simula de un modo único la funcionalidad in vivo del FvW, la formación de puentes colágeno-epitelio y plaquetas, y con ello se presenta por vez primera un nuevo sistema de diagnóstico que tiene en cuenta in vitro la funcionalidad total del FvW con relación a la hemostasis primaria.

Ejemplo 26 Estructura de un ELISA de enlace FvW-colágeno (prueba in vitro enzimoinmunológica para la determinación cuantitativa del enlace FvW-colágeno) Principio de la prueba

"Sandwich-Assay": En una primera reacción, el FvW de la muestra de prueba se enlaza al colágeno fijado a la tira de ensayo. En la respuesta inmune subsiguiente con el anticuerpo de FvW marcado con POD se forma un complejo tipo sandwich. La cantidad de complejos tipo sandwich es una medida del enlace de colágeno del FvW del material de prueba. En el paso de lavado subsiguiente se elimina el conjugado POD no enlazado. Después de añadir H_{2}O_{2} y solución de sustrato de POD, se determina la actividad de POD enlazado mediante fotometría.

Contenido del paquete

1: tira de microtitulación, con colágeno enlazado de forma covalente

2: conjugado de POD policlonal anti-FvW (firma Dakopatts, Dinamarca)

3: pastillas de sustrato POD (firma Bio-Rad)

4: tampón concentrado para dilución de muestras (Tris/HCl 100 mM, NaCl 1,5 M, 0,5% de Tween 20, 10% de albúmina)

5: solución de lavado concentrada (Tris/HCl 100 mM, NaCl 1,5 M, 0,5% de Tween 20)

6: estándar de FvW (100% plasma normal, IMMUNO AG)

Se necesita además

- peróxido de hidrógeno (al 30%)

- ácido sulfúrico (1 N)

Preparación de los reactivos

1.: Mezclar la solución de lavado concentrada a 1:10 con agua destilada.

2.: Mezclar el tampón concentrado a 1:10 con agua destilada.

3.: Preparar la solución del sustrato poco antes de su uso.

4.: Diluir el conjugado anticuerpo-POD a 1:1.000 con tampón concentrado diluido.

5.: Dilución de la muestra:

: 1 parte de plasma citratado + 50 partes de tampón concentrado diluido

: 1 parte de plasma citratado + 100 partes de tampón concentrado diluido

Fórmula de determinación

Longitud de onda: 450 nm

Temperatura de incubación: +15 -25ºC

En las cavidades de las tiras de microtitulación se pipetean 100 \mul de estándar/muestra diluida.

A continuación se incuba durante 1 hora, después se succiona y se lava 3 veces con 300 \mul de solución de lavado. Tras el lavado se incuba durante 1 hora con 100 \mul del conjugado de anticuerpo-POD diluido, después se succiona y se lava de nuevo 3 veces con 300 \mul de solución de lavado. Tras el nuevo lavado se incuba con 100 \mul de la solución de sustrato de POD, durante exactamente 5 minutos, se mezcla con 100 \mul de H_{2}SO_{4} 1 M y se mide la extinción en un plazo de 2 horas contra el valor de blanco.

Ejemplo 27

Una placa microtitulada de 96 pocillos (CovaLink™ - Nunc, Roskilde, Dinamarca) se incuba con colágeno de Tipo III digerido con pepsina y procedente de placenta humana (Southern Biotechnology Inc., Birmingham, EE.UU.) en una concentración de 3 \mug/ml en tampón PBS (fosfato sódico 8 mM, NaCl 135 mM, KCl 2,6 mM, pH 7,3) durante una hora. Después se bloquea la placa incubándola durante 15 minutos con el tampón SuperBlock™ Blocking Buffer (Pierce, Rockford, EE.UU.).

A continuación, la placa revestida se incuba durante una hora con diluciones en serie de un plasma de referencia dentro de un rango de 1:50 a 1:1.000 en tampón PBS (que contiene un 0,05% de Tween 20 y un 1% de albúmina de suero bovino), así como de la muestra que contiene el FvW. Para elaborar la curva de referencia se utiliza un plasma de referencia (Immuno AG, Viena, Austria), cuya actividad de enlace de colágeno (FvW:CB) está definida como 1 U/ml.

En el paso siguiente se detecta el FvW enlazado incubándolo durante una hora con un anticuerpo policlonal (Dako A082 biotinilado; Dako, Glostrup, Dinamarca) en tampón PBS, y a éste le sigue un paso de incubación con estreptavidina-peroxidasa de rábano en tampón PBS adicionando un 0,1% de Tween 20. A continuación se realiza la reacción del sustrato utilizando un sustrato cromógeno (sustrato monocomponente, TMB, Bio-Rad, Hercules, EE.UU.) y se mide la extinción a 450 nm con un ELISA-Reader. Todos los pasos de esta prueba se realizan a temperatura ambiente y con un volumen de incubación de 100 \mul/pocillo. Después de cada paso de incubación, la placa se lava 3 veces con 150 \mul de tampón PBS pH 7,3 adicionando un 0,1% de Tween 20.

La superficie de una placa de microtitulación revestida de colágeno, obtenida según estas instrucciones, con espaciadores fijados de forma covalente, presentaba una estabilidad extraordinariamente alta. El ensayo para la comprobación de la fuerza de enlace, que corresponde a la de un enlace covalente, puede realizarse de la siguiente manera. Tras un tratamiento con NaOH 0,4 M durante 15 minutos a temperatura ambiente, se determina la disminución de la capacidad de enlace de FvW. La disminución fue de menos de un 20% de la capacidad original. Siempre que la disminución de la capacidad de enlace sea inferior a un 30%, la superficie preparada es adecuada según la invención (porcentaje calculado a partir de la diferencia de las curvas ELISA antes y después del tratamiento con NaOH).

El procedimiento de determinación aquí utilizado puede emplearse en combinación con la determinación de la estructura multimérica (Ejemplo 12) para la clasificación de pacientes de vWD y es adecuado preferentemente para la diferenciación de pacientes con los Tipos 1 y 2 (Salder, J.E, Thrombosis and Haemostasis 71(4), 520-525, 1994). Se distingue entre una deficiencia parcial, cuantitativa (Tipo 1) y una deficiencia cualitativa de FvW. La tabla siguiente ilustra el empleo del sistema de prueba en la clasificación de los plasmas de pacientes con enfermedad de von Willebrand.

TABLA

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 28 Utilización del conjugado de colágeno con fines de diagnóstico

Se analizaron plasmas citratados de pacientes con enfermedad de von Willebrand (von Willebrand Disease, vWD) con un conjugado de colágeno preparado según uno de los Ejemplos 16 a 20 en cuanto al enlace FvW-colágeno según el Ejemplo 21.

Los patrones multiméricos de los plasmas analizados están representados en la Figura 9. Los resultados de la determinación de CBA, de Rist:CoF, FvW:Ag, CBA/FvW:Ag y Rist:CoF/FvW:Ag se hallan recogidos en la Tabla
3.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Caracterización funcional de la actividad de enlace de colágeno de plasmas con vWD

4

De la Tabla 3 y la Figura 9 se desprende que existe una clara correlación entre la multimerización, el tipo de vWD y la CBA. La vWD de Tipo 1 se caracteriza por una CBA reducida, un FvW:Ag reducido, una Rist:CoF reducida, pero una CBA/FvW:Ag o Rist:CoF/FvW:Ag normal. El tipo 2B de la vWD se caracteriza por una CBA muy reducida, un FvW:Ag reducido, una Rist:CoF reducida, una CBA/FvW:Ag o Rist:CoF/FvW:Ag reducida y presenta una pérdida de polímeros de FvW de alto peso molecular. El Tipo 2A de la vWD se caracteriza por una CBA reducida, una Rist:CoF reducida, una CBA/FvW:Ag o Rist:CoF/FvW:Ag reducida y presenta un enriquecimiento de polímeros de FvW de bajo peso molecular. Los datos de los pacientes no caracterizados (2x) corresponden a la vWD de Tipo 2B.

Ejemplo 29 Monitorización de pacientes de vWD durante la administración de DDAVP

Se analizaron plasmas citratados de pacientes con vWD de Tipo 1 antes y después de un tratamiento con DDAVP con un conjugado de colágeno preparado según uno de los Ejemplos 16 a 20 en cuanto al enlace FvW-colágeno según el Ejemplo 21.

Los patrones multiméricos de los plasmas analizados están representados en la Figura 10. Los resultados de la determinación de CBA, de Rist:CoF, FvW:Ag, CBA/FvW:Ag y Rist:CoF/FvW:Ag se hallan recogidos en la Tabla 4.

TABLA 4 Caracterización funcional de la actividad de enlace de colágeno de plasmas con vWD de Tipo 1 antes y 1 hora después de tratamiento con DDAVP

5

La Figura 10 y la Tabla 4 demuestran que mediante la administración de DDAVP aumenta la concentración de FvW:Ag y polímeros de FvW. La CBA disminuye correspondientemente.

Claims

1. Procedimiento para la determinación de una sustancia de enlace de colágeno, especialmente para determinar la actividad de una proteína de adhesión en una muestra, caracterizado porque se fija el colágeno de forma covalente a una fase sólida mediante una modificación en su parte glucídica, se enlaza la sustancia de enlace de colágeno de la muestra al colágeno y se determina la sustancia enlazada al colágeno.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se determina la actividad hemostática primaria de la muestra en un sistema dinámico.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se determina la actividad hemostática primaria de factor von Willebrand (FvW).

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se fija colágeno nativo o un derivado de colágeno con una capacidad de enlace de, como mínimo, 1 unidad RCoF de FvW/mg, preferentemente más de 10 unidades RCoF/mg, y de forma especialmente preferente más de 100 unidades RCoF/mg.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se fija colágeno nativo o un derivado del colágeno con una capacidad de enlace de, como mínimo, 13 \mug de antígeno de FvW/mg, preferentemente más de 130 \mug/mg, y de forma especialmente preferente más de 1.300 \mug/mg.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se fija colágeno seleccionado del grupo de colágeno sometido a un proceso proteolítico, desintegrado y homogeneizado.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se fija colágeno de origen humano, preferentemente de Tipo III.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la determinación de la sustancia de enlace de colágeno se realiza mediante una reacción de detección específica, preferentemente mediante un inmunoanálisis.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque el inmunoanálisis se realiza en forma de enzimoinmunoanálisis, cromoinmunoanálisis, luminoinmunoanálisis, fluoroinmunoanálisis o radioinmunoanálisis.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la sustancia de enlace de colágeno enlazada es una proteína de adhesión, especialmente el FvW enlazado, el derivado de FvW o fibronectina, y se determina mediante su enlace ulterior a un anticuerpo marcado.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la sustancia de enlace de colágeno enlazada, especialmente el FvW enlazado, se determina mediante un enlace ulterior de plaquetas o sus equivalentes.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la sustancia de enlace de colágeno enlazada, especialmente el FvW enlazado, se determina midiendo la variación de la densidad óptica, por ejemplo mediante agregometría.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque la sustancia de enlace de colágeno enlazada, especialmente el FvW enlazado, se determina aplicando un método de haz luminoso, especialmente mediante amplificación de luz.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque como sustancia de enlace de colágeno se determina una proteína de enlace de colágeno, especialmente FvW, un derivado del mismo o fibronectina.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque como muestra se emplea un material biológico de origen natural o un material obtenido mediante técnicas de ingeniería genética.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque como material biológico se utiliza sangre, plasma, una fracción plasmática, un cultivo celular o un excedente de cultivo celular.

17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el límite de sensibilidad para la detección de la sustancia de enlace de colágeno en una muestra, especialmente de FvW, es preferentemente de 2 ng, y de forma especialmente preferente de 1 ng de FvW.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque el límite de sensibilidad es de 0,5 ng de FvW.

19. Conjugado de colágeno, caracterizado porque el colágeno presenta, como mínimo, una modificación en su parte glucídica, a través de la cual se realiza un enlace estable a una fase sólida, por lo cual no se influye de un modo esencial en la capacidad de enlace del colágeno con respecto a una sustancia de enlace de colágeno.

20. Conjugado de colágeno según la reivindicación 19, caracterizado porque la modificación en la parte glucídica es una oxidación.

21. Conjugado de colágeno según la reivindicación 19 ó 20, caracterizado porque el colágeno presenta como modificación un grupo reactivo en la parte glucídica.

22. Conjugado de colágeno según una de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque la fase sólida presenta, como mínimo, un grupo reactivo que puede formar un enlace covalente con, como mínimo, un grupo reactivo del colágeno, especialmente del colágeno modificado.

23. Conjugado de colágeno según una de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizado porque la fase sólida es un portador sólido, especialmente un polímero natural o sintético.

24. Conjugado de colágeno según la reivindicación 23, caracterizado porque el polímero constituye un polímero empleable para un implante corporal, una articulación o una unión articular artificial, o un revestimiento de herida.

25. Conjugado de colágeno según una de las reivindicaciones 19 a 24, caracterizado porque la fase sólida es una matriz sólida.

26. Conjugado de colágeno según una de las reivindicaciones 19 a 25, caracterizado porque es estable al almacenamiento.

27. Conjugado de colágeno según una de las reivindicaciones 19 a 26, caracterizado porque el colágeno derivado es del Tipo I, Tipo III, Tipo IV, Tipo V, Tipo VI, Tipo VII o Tipo VIII.

28. Conjugado de colágeno según una de las reivindicaciones 19 a 27, caracterizado porque el colágeno se deriva de colágeno humano de Tipo III.

29. Conjugado de colágeno según una de las reivindicaciones 19 a 28, que puede obtenerse sometiendo colágeno no modificado a una reacción química, con lo que se modifican químicamente moléculas de su parte glucídica y se forma, como mínimo, un grupo reactivo, que forma un enlace covalente con una fase sólida, en caso dado activada.

30. Conjugado de colágeno según una de las reivindicaciones 19 a 29, caracterizado porque el colágeno no modificado se somete a una reacción de oxidación, con lo que se oxidan moléculas de su parte glucídica.

31. Dispositivo para la realización de un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque comprende un conjugado de colágeno según una de las reivindicaciones 19 a 30.

32. Dispositivo según la reivindicación 31, que comprende además un recipiente para muestras, para el alojamiento de la muestra, preferentemente pocillos de una placa de microtitulación.

33. Dispositivo según la reivindicación 31 ó 32, que comprende un peine como fase sólida para la introducción en el recipiente para muestras.

34. Dispositivo según una de las reivindicaciones 31 a 33, que comprende micropartículas, preferentemente de poliestireno o látex, como fase sólida.

35. Dispositivo según la reivindicación 34, caracterizado porque las micropartículas están marcadas, por ejemplo mediante un colorante, un marcador de fluorescencia, o mediante propiedades magnéticas.

36. Dispositivo según una de las reivindicaciones 31 a 35, caracterizado porque éste se presenta en una forma estable al almacenamiento, preferentemente liofilizado.

37. Kit para la realización del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 17, que contiene:

a) un dispositivo según una de las reivindicaciones 31 a 36 y

b) un componente que contiene una actividad estandarizada de la sustancia de enlace de colágeno, preferentemente del FvW.

38. Kit según la reivindicación 37, caracterizado porque el dispositivo y el componente se presentan en una forma estable al almacenamiento, preferentemente liofilizados.

39. Kit según la reivindicación 37 ó 38, caracterizado porque además contiene un medio para la determinación de la sustancia de enlace de colágeno enlazada, especialmente del FvW.

40. Kit según una de las reivindicaciones 37 a 39, que comprende además sustancias o reactivos para una reacción de detección específica, especialmente para la determinación de una sustancia enlazada a colágeno.

41. Kit según la reivindicación 40, caracterizado porque la sustancia para la determinación de un enlace es un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo monoclonal.

42. Kit según la reivindicación 41, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal dirigido contra un epítopo funcionalmente activo del sitio de enlace de plaquetas del FvW.

43. Procedimiento para la fabricación de un dispositivo según una de las reivindicaciones 31 a 36, que comprende la preparación de una solución de un colágeno que presenta como mínimo una modificación en su parte glucídica, la fijación química del colágeno mediante la modificación en la parte glucídica a la fase sólida, y en caso dado la liofilización.

44. Procedimiento según la reivindicación 43, caracterizado porque la solución de colágeno ávido se prepara con una concentración de menos de 20 \mug/ml, preferentemente de menos de 10 \mug/ml.

45. Procedimiento para la determinación de la actividad fisiológica del FvW en una muestra, caracterizado porque la muestra se pone en contacto con un conjugado de colágeno según una de las reivindicaciones 19 a 30, de modo que el FvW de la muestra se enlaza con el colágeno, y se determina la cantidad de FvW enlazada.

46. Utilización del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 17 para la determinación de la funcionalidad de una sustancia de enlace de colágeno.

47. Utilización de un conjugado de colágeno según una de las reivindicaciones 19 a 30 para la obtención de un implante, una articulación artificial o un revestimiento de herida.

48. Utilización de un conjugado de colágeno según una de las reivindicaciones 19 a 30 como portador de afinidad en la purificación y obtención de proteínas de enlace de colágeno.