CN117529664A - 用于预测脓毒症和脓毒性休克的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的主题内容是一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症或脓毒性休克的方法，所述方法包括测定从所述受试者获得的体液中速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平，并将测定的速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平与脓毒症或脓毒性休克相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了脓毒症、严重脓毒症或脓毒性休克。

Description

用于预测脓毒症和脓毒性休克的方法
本发明的主题内容是一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症或脓毒性休克的方法，所述方法包括测定从所述受试者获得的体液中速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平，并将测定的速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平与脓毒症或脓毒性休克相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了脓毒症、严重脓毒症或脓毒性休克。
物质P(SP)是一种神经肽：一种起到神经递质和神经调节剂作用的十一肽。它属于速激肽神经肽家族。SP是速激肽家族的五个成员之一；除了SP之外，速激肽家族还包括神经激肽A、神经肽K、神经肽γ和神经激肽B。它们由前速激肽原A基因差异剪接后的蛋白质前体产生(Helke等，1990.FASEB Journal 4(6):1606-15)。SP在伤害感受、炎症、血浆外渗、毛细血管后小静脉中的血小板和白细胞聚集以及白细胞通过血管壁的趋化性迁移中发挥作用(Otsuka M,Yoshioka K，哺乳动物速激肽的神经递质功能(Neurotransmitter functions of mammalian tachykinins)，Physiol Rev.1993Apr；73(2):229-308)。物质P由神经元和包括免疫细胞在内的非神经元细胞产生(Bodkin和Fernandes 2012Brit J Pharmacol 170:1279-1292)。
SP在脓毒症中的作用尚不清楚。一方面，在某些研究中发现，SP可以通过释放促炎性细胞因子例如白介素(IL)-1、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α而在对脓毒症的炎性应答中发挥作用(Lotz等，1988.Science241:1218–1221；Laurenzi等，1990.Scand.J.Immunol.31: 529–533；Ansel等，1993J.Immunol.150:4478–4485；Yamaguchi等，2004.Inflamm.Res.53: 199–204)。另一方面，在其他研究中发现，SP可以通过降低TNF-α、IL-6和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)并增加IL-10而具有抗炎作用(Jiang等，2012.Neuroreport23:786–792；Jiang等， 2013.Neuroreport24:846–851)。此外，根据其他研究的发现，SP可以在调节吞噬能力的微生物清除中发挥作用(Verdrengh和Tarkowski2008.Scand.J.Immunol.67:253–259；Yang 等，2014.Crit.CareMed.42:2092–2100；Kincy-Cain和Bost1996.J.Immunol.157:255–264； Lighvani等，2005.Eur.J.Immunol.35:1567–1575)。
脓毒症患者中的循环SP浓度尚未得到很好的研究。在一项使用61位脓毒症患者的研究中，作者发现在脓毒症的最后阶段中，脓毒症患者中的血清SP浓度高于健康对照，非存活者中的血清SP浓度高于存活患者(Beer等，2002.Crit Care Med.30:1794-1798)。在另一项使用42位脓毒症患者的研究中发现，与健康对照相比，脓毒症患者中的血浆SP浓度更低(Arnalich等，1995.Life Sci56:75–81)。此外，已显示血清SP水平与脓毒症中的死亡率相关(Lorente等，2015.J.Crit.Care2015,30,924–928；Lorente等，2017.Int J MolSci18 (7):1531)。然而，与存活患者相比，非存活者显示出更低的血清SP水平(Lorente等， 2015.J.Crit.Care 2015,30,924–928)。
此外，在小鼠CLP模型中，SP存在着时间依赖性升高，在1-h时间点时在血浆中观察到最高的SP水平。从5-h时间点起SP水平开始下降，并在20-h时间点时在血浆中再次达到峰值，证实了物质P的双相响应(Puneet等，2006.J Immunol 176:3813–3820)。此外，向野生型小鼠给药LPS导致SP循环水平的显著提高(Ng等，2008.Journalof Leukocyte Biology 83: 288-295)。
SP在脓毒症中的潜在作用是广泛的(综述参见Bodkin和Fernandes 2012Brit J Pharmacol 170:1279-1292)。它诱导许多与脓毒症进展相关的炎性作用，其中大部分归因于NK1受体的激活。众所周知，SP是神经源性炎症的诱导物，所述神经源性炎症表现出血管舒张、水肿和白细胞浸润的特征。所有这些作用都可以由作用于NK1受体的SP诱导(O’ Connor等，2004 JCell Physiol 201:167–180)，并且在脓毒症中是有害的。内皮细胞上的NK1激活诱导细胞收缩，导致水肿，以及血管舒张剂如NO和前列环素的产生(Katz等，2003.J Vet Pharmacol Ther 26:361–368)，这造成低血压。在几种细胞类型中，NK1的激活还可以诱导炎症介质的转录，包括趋化因子、细胞因子和黏附分子(Maggi,1997.Regul Pept70: 75–90)。还已知SP引发中性粒细胞对趋化因子的趋化性反应，诱导趋化因子受体的表达，这种反应可以用NK1拮抗剂抑制(Sun等，2007.Am J Physiol CellPhysiol 293:C696–C704)。SP的这些作用在脓毒症期间是有害的，因为它们会加剧炎症并导致致命的器官损伤。水肿和血管舒张可以造成危险的低血压和肺功能下降，这与脓毒症的不良预后有关。
到目前为止，SP的非常短的半衰期(12min)阻碍了在人类中的研究(Conlon和 Sheehan.Regul.Pept.1983；7:335–345)。最近开发的一种用于稳定的速激肽原A(PTA)片段(N-端速激肽原A或NT-PTA)(其是不稳定SP的替代品)的测定法(Ernst等，Peptides2008； 29:1201–1206)使得能够研究这种速激肽系统在人类疾病中的作用。
到急诊科(ED)就诊的疑似感染的患者的治疗延迟可能导致住院时间延长、发病率提高和更高的感染相关死亡率。因此，为了给予快速且有针对性的治疗响应，准确评估宿主响应的严重程度以及疾病进一步发展为脓毒症、严重脓毒症、脓毒性休克和器官功能障碍的可能性是至关重要的。
因此，本发明的一个目的是速激肽原A或其片段的用途，其用于将更可能发生脓毒症、严重脓毒症或脓毒性休克或具有发生这些病症的高风险的需要强化治疗的患者与具有需要此类治疗的低风险的患者区分开。
本发明的令人吃惊的发现是速激肽原A或其片段是用于预测患者在晚些时候将发展成脓毒症、严重脓毒症和脓毒性休克的早期生物标志物。术语“早期生物标志物”意味着患者中的生物标志物速激肽原A或其片段的水平在患者发展成脓毒症、严重脓毒症或脓毒性休克之前升高。
本文所使用的术语“受试者”是指活的人类或非人类生物体。在本文中，优选地，所述受试者是人类受试者。如果未另行说明，所述受试者可以是健康的或患病的。
术语“升高的水平”意味着高于一定阈值水平的水平。
“体液”可以选自血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(CSF)和唾液。在一个特定实施方式中根据本发明的体液是血液样品。血液样品可以选自全血、血清和血浆。在诊断方法的特定实施方式中，所述样品选自人柠檬酸盐血浆、肝素血浆和EDTA血浆。
术语“预测”涉及受试者的结果或特定风险的预后。这也可以包括所述受试者的康复机会或不良结果的机会的估计。
本发明的方法也可用于监测、疗法监测、疗法指导和/或疗法控制。在本申请的上下文中，“监测”涉及对患者和可能发生的并发症保持跟踪，以例如分析愈合过程的进展或特定治疗或疗法对患者健康状态的影响。
在本发明的上下文中，术语“疗法监测”或“疗法控制”是指对所述患者的治疗性治疗的监测和/或调整，例如通过获得关于治疗疗效的反馈。本文所使用的术语“疗法指导”是指在一个或多个生物标志物和/或临床参数和/或临床评分的值/水平的基础上应用某些疗法、治疗行动或医学干预。这包括调整疗法或中止疗法。
在本发明中，术语“风险评估”和“风险分层”是指根据受试者的进一步预后将它们分为不同的风险组。风险评估还涉及对应用预防性和/或治疗性措施的分层。术语“疗法分层”具体来说涉及将患者分组或分类成不同的组，例如根据其分类而接受某些不同治疗措施的风险组或治疗组。术语“疗法分层”还涉及将感染或具有感染性疾病症状的患者分组或分类成不需要接受某些治疗措施的组。
脓毒症被定义为由宿主对感染的响应失调引起的危及生命的器官功能障碍(参见Singer等，2016.JAMA 315(8):801-810)。器官功能障碍可以被鉴定为感染后总SOFA评分的急性变化≥2分。在未知已预先存在器官功能障碍的患者中，可以假设基线SOFA评分为零。SOFA评分≥2反映了疑似感染的综合医院人群中大约10％的总体死亡风险。即使是表现出中度功能障碍的患者也可能进一步恶化，强调了这种病症的严重性以及采取及时且适当的干预的必要性(如果尚未采取的话)。脓毒症是当身体对感染的响应损害了自身组织和器官时出现的一种危及生命的病症。可能长期入住ICU或在医院死亡的疑似感染的患者可以在床边用qSOFA及时鉴定，即精神状态改变、收缩压≤100mm Hg或呼吸频率≥22/min。
脓毒性休克是脓毒症的一个子集，其中潜在的循环和细胞/代谢异常严重到足以显著提高死亡率。脓毒性休克患者可以通过脓毒症的临床结构以及需要血管升压药来维持平均动脉压(MAP)≥65mm Hg的持续低血压和尽管进行了充分的容量复苏但血清乳酸盐水平仍>2mmol/L(18mg/dL)来鉴定。使用这些标准，医院死亡率超过40％。
本申请的上下文中使用的术语“脓毒症”涉及脓毒症发展中的所有可能的阶段。
根据SEPSIS-2定义，术语“脓毒症”还包括严重脓毒症或脓毒性休克(Bone等， 1992.Crit Care Med 20(6):864-874)。术语“脓毒症”还包括落于SEPSIS-3定义内的受试者(Singer等，2016JAMA 315(8):801-810)。本文中使用的器官功能障碍表示器官不能发挥其预期功能的病症或健康状态。“器官衰竭”表示器官功能障碍达到在没有外部临床干预的情况下无法维持正常体内平衡的程度。所述器官衰竭可能涉及选自肾、肝、心、肺、神经系统的器官。相比之下，器官功能代表相应器官在生理范围内的预期功能。本领域技术人员知道器官在医学检查期间的相应功能。
器官功能障碍可以通过顺序器官衰竭评估评分(SOFA评分)或其组分来定义。以前被称为脓毒症相关器官衰竭评估评分的SOFA评分(Singer等，2016.JAMA 315(8):801-10)被用于跟踪一个人在重症监护室(ICU)期间的状态，以确定一个人的器官功能的程度或衰竭率。所述评分基于六个不同评分，分别各自针对呼吸、心血管、肝脏、凝血、肾脏和神经系统，每个评分从0到4，评分增加反映了器官功能障碍的恶化。SOFA评分的评估标准描述在例如Lamden等中(综述参见Lambden等，2019.Critical Care 23:374)。SOFA评分传统上可以在入住ICU时以及随后的每个24-h时间段计算。具体来说，所述器官功能障碍选自肾功能下降、心脏功能障碍、肝功能障碍或呼吸道功能障碍。
快速SOFA评分(quickSOFA或qSOFA)由Sepsis-3组于2016年2月作为SOFA评分的简化版本引入，作为鉴定具有不良结果的高风险的感染患者的初始方法(Angus等， 2016.Critical Care Medicine.44(3):e113–e121)。qSOFA只包括其3项临床标准，并包括“任何精神状态改变”而不要求GCS<15，从而大大简化了SOFA评分。qSOFA可以在患者身上容易且快速地连续重复。评分范围为0至3分。1分用于：低血压(SBP≤100mmHg)、高呼吸频率(≥22次呼吸/分钟)和精神状态改变(GCS≤15)。在感染发作附近qSOFA为2分或更多分与更大的死亡风险或重症监护室住院时间延长有关。这些结果在可能患有脓毒症的感染患者中比在无并发症感染的患者中更加常见。基于这些发现，脓毒症第三次国际共识定义建议将qSOFA作为一种简单的提示，以鉴定ICU外可能发生脓毒症的感染患者(Seymour等， 2016.JAMA 315(8):762-774)。
在本发明的优选实施方式中，所述方法通过在患者组中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克来定义，对于所述患者组来说，以前很难(如果不是不可能的话)通过常规临床和/或分子诊断手段来确定是否存在医学病症的严重恶化，从而需要住院的严重风险。这个患者组可以被视为具有感染性疾病的轻度症状的患者或没有严重感染性疾病的症状例如没有脓毒症症状的患者。
在一个实施方式中，在提供样品时，所述患者显示出对应于qSOFA评分为0或1的感染性疾病的轻度症状。
在一个实施方式中，在提供样品时，所述患者未显示出脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的临床症状。
在一个实施方式中，在提供样品时，所述患者已被诊断为患有细菌、病毒、真菌或寄生虫起源的感染性疾病。
在一个实施方式中，在提供样品时，所述患者已被诊断为患有社区获得性肺炎(CAP)或尿路感染(UTI)。
完全令人吃惊的是，仅显示出感染性疾病的轻度症状的患者例如对应于qSOFA评分为0或1的患者，以及显示出感染性疾病的症状但未指示存在脓毒症的患者，可以在根据本发明确定速激肽原A或其片段的高风险水平的基础上分类为需要住院。这代表了本发明方法的一个极大优点，因为专科医生不会预期具有感染性疾病的轻度症状和/或不提示脓毒症的症状的患者需要住院以例如监测所述感染性疾病症状的进展并进行治疗。此类患者通常可能由医务人员检查，然后解除持续的医学观察，例如使用可以在没有专业医疗监督的情况下执行的治疗指示。然而，本发明的方法可以通过客观手段鉴定未表现出脓毒症的严重症状并且仍需要住院的患者。
在本发明的一个实施方式中，所述方法被用于将所述患者分层为风险组。
在一个实施方式中，PTA或其片段的高风险水平指示所述患者具有在48小时、24小时、12小时、6小时、4小时、优选地2小时内发生脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险，并且其中PTA或其片段的低风险水平指示所述患者没有在48小时、24小时、12小时、6小时、4小时、优选地2小时内发生脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险。
在一个实施方式中，所述体液样品中PTA或其片段的水平指示了在患者中发生需要住院的脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险。
在一个实施方式中，PTA或其片段的高风险水平指示所述患者具有在48小时、24小时、12小时、6小时、4小时、优选地2小时内发生需要住院的脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险，并且其中PTA或其片段的低风险水平指示所述患者没有在48小时、24小时、12小时、6小时、4小时、优选地2小时内发生需要住院的脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险。
在本发明的另一个实施方式中，所述方法被用于将所述患者分层为早期治疗组(例如需要抗生素给药)。术语“早期”被定义为在患者显示出脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的临床体征和症状之前或在患者被诊断为患有脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克之前的治疗时间。
在一个实施方式中，所述体液样品中PTA或其片段的水平指示了患者需要频繁监测和/或重症监护治疗。在一个实施方式中，具有高风险水平的患者需要在医院环境中提供的医学治疗。
这些治疗的实例包括但不限于流体疗法、血管升压药、静脉内抗生素，在某些实施方式中包括除了可以在家中自行给药的口服抗生素之外的基本上任何治疗。
取决于本发明的方法的结果，所述方法的实施方式可以包括随后的治疗决定和/或治疗行动。此类治疗决定可以包括医学治疗的开始、改变或修改。优选地，如果本发明的方法指示发展到需要在医院治疗的病症，则可以开始适合的治疗措施，例如某些药物或流体疗法的开始或改变。
在本发明的方法的情形中，本文公开的任何疗法、医学治疗或治疗行动均可用作后续的治疗决定或治疗行动，特别是如果所述治疗措施在医院中具体给予的话，包括但不限于静脉内流体疗法、透析、电解质异常(特别是钾、钙和磷)的管理。此外，可能指示在长时间段例如几天、几周甚至几个月内对患者进行持续的强化观察和护理。这可能涉及将患者留在ICU或转移到ICU和/或延长患者在ICU中的停留时间。
另一方面，如果本发明的方法的结果指示不存在发生需要住院的脓毒症、严重脓毒症或脓毒性休克的风险，则可能不需要针对这种并发症的特定治疗措施，或者可以开出不太严重的可以自行给药的治疗。
速激肽原A或其片段尤其适用于急诊科所有到访者的患者组中的上述医学用途。
在整个本说明书中，术语速激肽原和速激肽原A(PTA)被同义使用。所述术语包括速激肽原A的所有剪接变体，即αPTA、βPTA、γPTA和δPTA。在整个本说明书中，应该理解，如果未另行说明，则术语速激肽原A片段也包括物质P和神经激肽A、神经肽K、神经肽γ和神经激肽B。
术语“测定速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段(包括物质P和神经激肽)的水平”意味着通常测定对上述分子内的区域的免疫反应性。这意味着没有必要选择性测量某个片段。应该理解，用于测定速激肽原或其至少5个氨基酸的片段(包括物质P和神经激肽)的水平的结合剂与包含所述结合剂的结合区的任何片段结合。所述结合剂可以是抗体或抗体片段或非IgG支架。
根据本发明的主题内容是一种方法，其中通过使用针对速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的结合剂来测定速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平。
在本发明的一个实施方式中，所述结合剂选自与速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段结合的抗体、抗体片段或非Ig支架。
PTA基因转录本的选择性剪接产生四种不同的PTA-mRNA分子，分别被命名为αPTA、βPTA、γPTA和δPTA(Harmar等，1990.FEBS Lett 275:22–4；Kawaguchi等，1986.Biochem Biophys Res Comm 139:1040–6；Nawa等，1984.Nature 312:729–34)，区别在于它们的外显子组合。只有在β-PTA mRNA中才包含所有七个外显子。然而，编码SP和由37个氨基酸组成的共同N-端区域(SEQ ID NO.5)的前三个外显子存在于所有PTA前体分子中。
选择性剪接给出了下述速激肽原A序列：
SEQ ID NO.1(同种型αPTA)
EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDADSSIEKQVALLKALYGHGQISHKMAYERSAMQNYERRR
SEQ ID NO.2(同种型βPTA)
EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDADSSIEKQVALLKALYGHGQISHKRHKTDSFVGLMGKRALNSVAYERSAMQNYERRR
SEQ ID NO.3(同种型γPTA)
EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDAGHGQISHKRHKTDSFVGLMGKRALNSVAYERSAMQNYERRRSEQ
SEQ ID NO.4(同种型δPTA)
EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQ QFFGLMGKRDAGHGQISHKMAYERSAMQNYERRR
可以在体液中测定的速激肽原A片段可以例如选自下述片段：
SEQ ID NO.5(速激肽原A1-37、P37、NT-PTA)
EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA
SEQ ID NO.6(物质P)
RPKPQQFFGLM(-NH2)
SEQ ID NO.7(神经肽K)
DADSSIEKQVALLKALYGHGQISHKRHKTDSFVGLM(-NH2)
SEQ ID NO.8(神经肽γ)
GHGQISHKRHKTDSFVGLM(-NH2)
SEQ ID NO.9(神经激肽B)
HKTDSFVGLM(-NH2)
SEQ ID NO.10(C-端侧翼肽、PTA 92-107)
ALNSVAYERSAMQNYE
SEQ ID NO.11(PTA 3-22)
GANDDLNYWSDWYDSDQIK
SEQ ID NO.12(PTA 21-36)
IKEELPEPFEHLLQRI
测定速激肽原A或其片段的水平可以意味着测定对PTA或其片段(包括物质P和神经激肽)的免疫反应性。根据结合区，用于测定PTA或其片段的结合剂可能与超过一种上面显示的分子结合。这对于本领域技术人员来说是清楚的。
在本发明的更特定实施方式中，PTA片段可以选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
在根据本发明的方法的更特定实施方式中，测定也被称为PTA 1-37或NT-PTA、SEQID NO.5的肽37(P37)的水平。在根据本发明的甚至更特定实施方式中，使用与PTA 1-37(NT-PTA)、SEQ ID NO.5结合的至少一种或两种结合剂，在超过一种结合剂的情况下，它们优选地与PTA 1-37(NT-PTA)、SEQ ID NO.5内的两个不同区域结合。所述结合剂优选地可以是抗体或其结合片段。
在甚至更特定实施方式中，使用结合剂来测定PTA、其变体或片段，所述结合剂分别与PTA 1-37(NT-PTA)内的下述区域中的一者或两者结合：PTA 3-22(GANDDLNYWSDWYDSDQIK，其是SEQ ID NO.11)和PTA 21-36(IKEELPEPFEHLLQRI，其是SEQ IDNO.12)。
因此，根据本发明，通过使用与上述肽和肽片段中的任一者(即根据序列1至12中任一项的速激肽原A(PTA)和片段)的氨基酸序列内的区域结合的至少一种结合剂，测定了从所述受试者获得的体液中的免疫反应性分析物的水平；并将其与临床相关性的特定实施方式相关联。
在根据本发明的方法的更特定实施方式中，测定了PTA 1-37(SEQ ID NO.5：NT-PTA)的水平。
在更特定实施方式中，通过使用与速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段结合的至少一种结合剂测定了免疫反应性分析物的水平，并将其与根据本发明的上述实施方式的临床相关性的特定实施方式相关联：
·将所述免疫反应性分析物的水平与脓毒症或脓毒性休克相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了脓毒症、严重脓毒症或脓毒性休克。
或者，可以通过其他分析方法例如质谱术来测定任何上述分析物的水平。
本申请的主题内容是一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法，所述方法包括：
·测定从所述受试者获得的体液中速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平，并
·将测定的速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平与脓毒症或脓毒性休克相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克。
本申请的一个实施方式涉及一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症或脓毒性休克的方法，其中所述患者的体液样品在所述患者未显示出脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的临床症状时获取。
本申请的另一个实施方式涉及一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法，其中所述速激肽原A选自SEQ ID NO.1至4，并且其片段选自SEQ IDNO.5至12。
本申请的另一个实施方式涉及一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法，其中所述速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平通过使用速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的结合剂来测定。
本申请的另一个特定实施方式涉及一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法，其中所述结合剂选自与速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段结合的抗体、抗体片段或非Ig支架。
本申请的另一个优选实施方式涉及一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法，其中所述结合剂与选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12的氨基酸序列内的区域结合。
本申请的另一个实施方式涉及一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法，其中所述阈值范围在75至200pmol/L之间，更优选地在90至175pmol/L之间，甚至更优选地在100至150pmol/L之间，最优选地所述阈值水平为120pmol/L。
本申请的另一个实施方式涉及一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法，其中所述速激肽原A的水平使用免疫测定法测量，并且所述结合剂是与速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段结合的抗体或抗体片段。
本申请的另一个实施方式涉及一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法，其中使用的测定法包含两种结合剂，它们与速激肽原A的第3-22位氨基酸(SEQ ID NO.11)和第21-36位氨基酸(SEQ ID NO.12)区域内的两个不同区域结合，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。
本申请的另一个特定实施方式涉及一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法，其中测定法被用于测定速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平，并且其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康受试者的速激肽原A或速激肽原A片段，并且<10pmol/L。
本申请的另一个实施方式涉及一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法，其中所述体液可以选自血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(CSF)和唾液。
本申请的另一个实施方式涉及一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法，其中测定另外至少一种生物标志物和/或临床参数和/或临床评分，其选自D-二聚体、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)、乳酸盐、penKid、ADM-NH2、MR-proADM、NT-proBNP、BNP、前脓毒素(presepsin)、正五聚蛋白-3(PTX-3)、CD-64、钙卫蛋白、白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、血红蛋白、血小板计数、白蛋白、丙氨酸转氨酶、肌酸酐、血尿素、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、心肌肌钙蛋白I、凝血酶原时间、血清铁蛋白、白介素-6(IL-6)、IL-10、IL-2、IL-7、干扰素γ(IF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、IP-10、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、MIP-1α、SOFA、qSOFA、APACHE II。
本申请的另一个优选实施方式涉及一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法，其中所述测定在一位患者中进行超过一次。
本申请的一个实施方式涉及一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法，以便将所述受试者分层为风险组。
本申请的主题内容还是一种用于执行在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法的护理点(POC)设备，其中所述护理点设备包含针对第3-22位氨基酸(SEQID NO.11)和第21-36位氨基酸(SEQ ID NO.12)的至少两种抗体或抗体片段。
本申请的主题内容还是一种用于执行在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含针对第3-22位氨基酸(SEQ ID NO.11)和第21-36位氨基酸(SEQ ID NO.12)的至少两种抗体或抗体片段。
本申请的主题内容还是一种用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法，所述方法包括：
·测定从所述受试者获得的体液样品中速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平，并且
·将测定的速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平与脓毒症或脓毒性休克相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了发生脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险。
本申请的一个实施方式涉及一种用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法，其中所述患者的体液样品在所述患者未显示出脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的临床症状时获取。
本申请的另一个实施方式涉及一种用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法，其中所述速激肽原A选自SEQ ID NO.1至4，并且其片段选自SEQ ID NO.5至12。
本申请的另一个实施方式涉及一种用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法，其中所述速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平通过使用速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的结合剂来测定。
本申请的另一个特定实施方式涉及一种用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法，其中所述结合剂选自与速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段结合的抗体、抗体片段或非Ig支架。
本申请的另一个优选实施方式涉及一种用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法，其中所述结合剂与选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.11和SEQID NO.12的氨基酸序列内的区域结合。
本申请的另一个实施方式涉及一种用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法，其中所述阈值范围在75至200pmol/L之间，更优选地在90至175pmol/L之间，甚至更优选地在100至150pmol/L之间，最优选地所述阈值水平为120pmol/L。
本申请的另一个实施方式涉及一种用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法，其中所述速激肽原A的水平使用免疫测定法测量，并且所述结合剂是与速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段结合的抗体或抗体片段。
本申请的另一个实施方式涉及一种用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法，其中使用的测定法包含两种结合剂，它们与速激肽原A的第3-22位氨基酸(SEQ ID NO.11)和第21-36位氨基酸(SEQ ID NO.12)区域内的两个不同区域结合，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。
本申请的另一个特定实施方式涉及一种用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法，其中测定法被用于测定速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平，并且其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康受试者的速激肽原A或速激肽原A片段，并且<10pmol/L。
本申请的另一个实施方式涉及一种用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法，其中所述体液可以选自血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(CSF)和唾液。
本申请的另一个实施方式涉及一种用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法，其中测定另外至少一种生物标志物和/或临床参数和/或临床评分，其选自D-二聚体、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)、乳酸盐、penKid、ADM-NH2、MR-proADM、NT-proBNP、BNP、前脓毒素、正五聚蛋白-3(PTX-3)、CD-64、钙卫蛋白、白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、血红蛋白、血小板计数、白蛋白、丙氨酸转氨酶、肌酸酐、血尿素、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、心肌肌钙蛋白I、凝血酶原时间、血清铁蛋白、白介素-6(IL-6)、IL-10、IL-2、IL-7、干扰素γ(IF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、IP-10、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、MIP-1α、SOFA、qSOFA、APACHE II。
本申请的另一个优选实施方式涉及一种用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法，其中所述测定在一位患者中进行超过一次。
本申请的一个实施方式涉及一种用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法，以便将所述受试者分层为风险组。
本申请的主题内容还是一种用于执行在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法的护理点设备，其中所述护理点设备包含针对第3-22位氨基酸(SEQ ID NO.11)和第21-36位氨基酸(SEQ ID NO.12)的至少两种抗体或抗体片段。
本申请的主题内容还是一种用于执行在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含针对第3-22位氨基酸(SEQ IDNO.11)和第21-36位氨基酸(SEQ ID NO.12)的至少两种抗体或抗体片段。
因此，本发明的主题内容是一种用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法，所述方法包括：
·通过使用与选自SEQ ID NO.1至12的肽和片段的肽的氨基酸序列内的区域结合的至少一种结合剂，来测定从所述受试者获得的体液中免疫反应性分析物的水平；并且
将所述速激肽原或其片段的水平与脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克相关联，其中高于一定阈值的升高的水平指示了发生脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险。在本申请的更特定实施方式中，通过使用与速激肽原1-37、N-端速激肽原A片段、NT-PTA(SEQ ID NO.5)的氨基酸序列内的区域结合的至少一种结合剂来测定从所述受试者获得的体液中免疫反应性分析物的水平。
在本申请的特定实施方式中，速激肽原A或其片段的水平通过使用与速激肽原A或其片段结合的抗体或抗体片段的免疫测定法来测量。可用于测定速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平的免疫测定法可以包括实施例1中所概述的步骤。所有阈值和值都必须与根据实施例1使用的测试和校准相关联来看待。本领域技术人员可以知道，阈值的绝对值可能受到所使用的校准的影响。这意味着本文给出的所有值和阈值都将在本文中使用的校准(实施例1)的上下文中理解。
根据本发明，针对速激肽原A的诊断性结合剂选自抗体例如IgG这种典型的全长免疫球蛋白，或至少含有重链和/或轻链的F可变结构域的抗体片段，例如化学偶联抗体(抗原结合片段)，包括但不限于Fab片段，包括Fab微型抗体、单链Fab抗体、具有表位标签的单价Fab抗体例如Fab-V5Sx2；用CH3结构域二聚化的二价Fab(微型抗体)；二价Fab或多价Fab，例如在异源结构域的帮助下通过多聚化形成的，例如通过dHLX结构域的二聚化形成的，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab‘)2-片段、scFv-片段、多聚化的多价或/和多特异性scFv-片段、二价和/或双特异性双体抗体、(双特异性T-细胞衔接物)、三功能抗体、多价抗体，例如来自与G不同的类别；单域抗体，例如源自骆驼或鱼免疫球蛋白的纳米抗体。
在本申请的特定实施方式中，速激肽原A或其片段的水平通过使用与速激肽原A或其片段结合的结合剂的测定法来测量，所述结合剂选自下文更详细描述的抗体、抗体片段、适体、非Ig支架。
可用于测定速激肽原A或其片段水平的结合剂对速激肽原A或其片段表现出至少107M-1、优选地108M-1的亲和常数，优选的亲和常数大于109M-1，最优选地大于1010M-1。本领域技术人员知道，可以考虑通过应用较高剂量的化合物来补偿较低的亲和性，并且这种措施不会超出本发明的范围。结合亲和性可以使用Biacore方法来测定，其在例如Biaffin,Kassel,Germany(http://www.biaffin.com/de/)作为服务分析提供。
为了测定抗体的亲和性，使用Biacore 2000系统(GE Healthcare Europe GmbH,Freiburg,Germany)，利用无标记物表面等离子体共振来测定PTA剪接变体或其片段与固定化抗体的结合动力学。抗体的可逆固定化按照制造商的说明书，使用以高密度共价偶联到CM5传感器表面的抗小鼠Fc抗体来进行(小鼠抗体偶联试剂盒；GE Healthcare)。(Lorenz 等，“靶向金黄色葡萄球菌IsaA的功能性抗体增强宿主免疫应答并为抗细菌疗法开辟新前 景”(Functional Antibodies Targeting IsaA of Staphylococcus aureus Augment Host Immune Response and Open New Perspectives for Antibacterial Therapy)； Antimicrob Agents Chemother.2011January；55(1):165–173)。
所述测定法可以通过合成的(对于我们的实验来说，我们使用合成的P37，SEQ IDNO.5)或重组的PTA剪接变体或其片段来校准。
除了抗体之外，在本领域中公知其他生物聚合物支架可以与靶分子复合，并且已被用于产生高度靶特异性的生物聚合物。实例是适体、spiegelmer、anticalin和芋螺毒素。非Ig支架可以是蛋白质支架，并且可以用作抗体模拟物，因为它们能够与配体或抗原结合。非Ig支架可以选自基于四连结素的非Ig支架(例如在US 2010/0028995中所述)、纤连蛋白支架(例如在EP 1266 025中所述)、基于脂钙蛋白的支架(例如在WO 2011/154420中所述)、遍在蛋白支架(例如在WO 2011/073214中所述)、转铁蛋白支架(例如在US 2004/0023334中所述)、蛋白A支架(例如在EP 2231860中所述)、基于锚蛋白重复序列的支架(例如在WO 2010/060748中所述)、微量蛋白优选为形成胱氨酸结的微量蛋白支架(例如在EP 2314308中所述)、基于Fyn SH3结构域的支架(例如在WO 2011/023685中所述)、基于EGFR-A结构域的支架(例如在WO 2005/040229中所述)和基于Kunitz结构域的支架(例如在EP 1941867中所述)。
本申请的另一个优选实施方式涉及一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法，其中PTA或其片段的阈值水平在75至200pmol/L之间，更优选地在90至175pmol/L之间，甚至更优选地在100至150pmol/L之间，最优选地所述阈值水平为120pmol/L。
本申请的另一个优选实施方式涉及一种用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法，其中PTA或其片段的阈值水平在75至200pmol/L之间，更优选地在90至175pmol/L之间，甚至更优选地在100至150pmol/L之间，最优选地所述阈值水平为120pmol/L。
在另一个优选实施方式中，PTA或其片段的阈值可以是正常范围上限(99百分位数，107pmol/L)。
在本申请的一个特定实施方式中，速激肽原A或其片段的水平使用免疫测定法来测量，并且所述结合剂是与速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段结合的抗体或抗体片段。
在本申请的一个特定实施方式中，所使用的测定法包含两种结合剂，它们与速激肽原A的第3-22位氨基酸(序列SEQ ID NO.11)和第21-36位氨基酸(序列SEQ ID NO.12)区域内的两个不同区域结合，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。
在本申请的一个实施方式中，在根据本发明的用于测定体液样品中的速激肽原A或速激肽原A片段的测定法中，所述测定法的测定灵敏度能够定量健康受试者的速激肽原A或速激肽原A片段，并且<20pmol/L，优选地<10pmol/L，更优选地<5pmol/L。
本发明的主题内容是与从所述受试者获得的体液中选自SEQ ID NO.1至12的肽和片段的肽的氨基酸序列内的区域结合的至少一种结合剂的用途，其用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法中。
本发明的主题内容是与从所述受试者获得的体液中选自SEQ ID NO.1至12的肽和片段的肽的氨基酸序列内的区域结合的至少一种结合剂的用途，其用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法中。
在本发明的一个实施方式中，所述结合剂选自与速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段结合的抗体、抗体片段或非Ig支架。在特定实施方式中，所述至少一种结合剂与具有选自SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9 10、11和12的序列的区域结合。在特定实施方式中，所述结合剂不与SEQ ID NO.6、7、8和9结合。在特定实施方式中，所述至少一种结合剂与具有选自SEQ ID No.1、2、3、4、5、11和12的序列的区域结合。在另一个特定实施方式中，所述至少一种结合剂与具有选自SEQ ID No.5、11和12的序列的区域结合。在另一个非常特定实施方式中，所述结合剂与速激肽原A1-37、N-端速激肽原A片段、NT-PTA(SEQ ID NO.5)结合。
在本申请的更特定实施方式中，所述至少一种结合剂与从所述受试者获得的体液中的速激肽原A1-37、N-端速激肽原A片段、NT-PTA(SEQ ID NO.5)的氨基酸序列内的区域结合，更具体来说与第3-22位氨基酸(GANDDLNYWSDWYDSDQIK，SEQ ID NO.11)和/或第21-36位氨基酸(IKEELPEPFEHLLQRI，SEQ ID NO.12)结合，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。
因此，根据本发明的方法，测定了从所述受试者获得的体液中上述结合剂的免疫反应性水平。免疫反应性水平意味着通过结合剂与此类分析物的结合反应而定量、半定量或定性测定的分析物的浓度，其中优选地所述结合剂与所述分析物结合的亲和常数为至少108M-1，并且所述结合剂可以是抗体或抗体片段或非IgG支架，并且所述结合反应是免疫测定法。
本发明的主题内容也是根据前述实施方式中任一者所述的用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法，其中将从所述受试者获得的体液中速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平单独地或与其他有用生物标志物和/或临床参数和/或临床评分相结合使用，其可以选自下述替代方案：
·与在“健康”或“表面健康”的受试者群体中预先测定的样品的集合中从所述受试者获得的体液中速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平的中位数进行比较，
·与在“健康”或“表面健康”的受试者群体中预先测定的样品的集合中从所述受试者获得的体液中速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平的分位数进行比较，
·基于Cox比例风险分析或通过使用风险指数计算例如NRI(净重新分类指数)或IDI(综合判别指数)进行计算。
本发明的主题内容也是根据前述实施方式中任一者所述的用于在患者中评估患脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险的方法，其中将从所述受试者获得的体液中速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平单独地或与其他有用生物标志物和/或临床参数和/或临床评分相结合使用，其可以选自下述替代方案：
·与在“健康”或“表面健康”的受试者群体中预先测定的样品的集合中从所述受试者获得的体液中速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平的中位数进行比较，
·与在“健康”或“表面健康”的受试者群体中预先测定的样品的集合中从所述受试者获得的体液中速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平的分位数进行比较，
·基于Cox比例风险分析或通过使用风险指数计算例如NRI(净重新分类指数)或IDI(综合判别指数)进行计算。
可以测定所述另外至少一种生物标志物和/或临床参数和/或临床评分，其选自D-二聚体、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)、乳酸盐、penKid、ADM-NH2、MR-proADM、NT-proBNP、BNP、前脓毒素、正五聚蛋白-3(PTX-3)、CD-64、钙卫蛋白、白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、血红蛋白、血小板计数、白蛋白、丙氨酸转氨酶、肌酸酐、血尿素、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、心肌肌钙蛋白I、凝血酶原时间、血清铁蛋白、白介素-6(IL-6)、IL-10、IL-2、IL-7、干扰素γ(IF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、IP-10、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、MIP-1α、SOFA、qSOFA、APACHE II。
阈值水平可以从例如Kaplan-Meier分析中获得，其中疾病的发生与群体中生物标志物的四分位数相关。根据这种分析，生物标志物水平高于第75百分位数的受试者患有根据本发明的疾病的风险显著提高。通过Cox回归分析并对经典风险因子进行全面调整，进一步支持了这一结果：与所有其他受试者相比，最高四分位数与患有根据本发明的疾病的风险提高非常显著地相关。
其他优选的截止值是例如正常群体的第90、95或99百分位数。通过使用比第75百分位数更高的百分位数，可以减少鉴定出的假阳性受试者的数量，但可能无法鉴定出风险中等(但仍然提高)的受试者。因此，可以采用所述截止值，这取决于是否认为以也鉴定出“假阳性”为代价而鉴定出大多数有风险受试者更加合适，或者是否认为以遗漏几个中等风险受试者为代价而主要鉴定出高风险受试者更加合适。
上述阈值在其他测定法中可能不同，如果这些测定法与本发明中使用的测定系统已进行了不同校准的话。因此，将校准的差异考虑在内，上述阈值应相应地适用于此类不同校准的测定法。定量校准差异的一种可能性是通过使用两种方法测量样品中的相应生物标志物(例如NT-PTA)，将所讨论的测定法(例如NT-PTA测定法)与本发明中使用的相应生物标志物测定法进行方法比较分析(相关性)。另一种可能性是，鉴于所讨论的测定法具有足够的分析灵敏度，使用该测定法测定代表性正常群体的中值生物标志物水平，将结果与所述平均生物标志物水平进行比较(参见实施例2)，并在通过该比较获得的差异的基础上重新计算校准。利用本发明中使用的校准，已测量了来自正常(健康)受试者的样品：平均血浆NT-PTA为55.2pmol/L(SD+/-17.8pmol/L)。
各种免疫测定法是已知的，并且可用于本发明的测定法和方法中，这些测定法包括放射免疫测定法(“RIA”)、均相酶倍增免疫测定法(“EMIT”)、酶联免疫吸附测定法(“ELISA”)、脱辅基酶再激活免疫测定法(“ARIS”)、化学发光和荧光免疫测定法、基于Luminex的珠子阵列、蛋白质微阵列测定法和快速测试格式例如免疫层析试纸条测试(“试纸条免疫测定法”)和免疫层析测定法。
在本发明的一个实施方式中，这种测定法是使用包括但不限于酶标记物、化学发光标记物、电化学发光标记物的任何种类的检测技术的夹心免疫测定法，优选为全自动测定法。在本发明的一个实施方式中，这种测定法是酶标记的夹心测定法。自动或全自动测定法的实例包括可用于下述系统之一的测定法：RocheAbbott/>Siemens/>Brahms/>Biomerieux/>Alere/>
在本发明的一个实施方式中，它可以是所谓的POC测试(护理点)，这是一种不需要全自动测定系统，允许在患者附近在不到1小时内进行测试的测试技术。这种技术的一个实例是免疫层析测试技术。
在本发明的一个实施方式中，为了进行检测，所述两种结合剂中的至少一者被标记。
在优选实施方式中，所述标记物选自化学发光标记物、酶标记物、荧光标记物、放射性碘标记物。
所述测定法可以是均相或非均相测定法、竞争性和非竞争性测定法。在一个实施方式中，所述测定法采取夹心测定法的形式，这是一种非竞争性免疫测定法，其中将待检测和/或定量的分子结合到第一抗体和第二抗体。所述第一抗体可以结合到固相，例如珠子、孔或其他容器的表面、芯片或条，所述第二抗体是用例如染料、放射性同位素或反应性或催化活性部分标记的抗体。然后通过适合的方法测量与分析物结合的标记的抗体的量。与“夹心测定法”相关的一般性组合物和程序是已确立的，并且为本领域技术人员所知(The Immunoassay Handbook,Ed.David Wild,Elsevier LTD,Oxford；3rd ed.(May 2005), ISBN-13:978-0080445267；Hultschig C等，Curr Opin Chem Biol.2006Feb；10(1):4- 10.PMID:16376134)。
在另一个实施方式中，所述测定法包含两种捕获分子，优选为均作为分散体存在于液体反应混合物中的抗体，其中第一标记组分被附连到第一捕获分子，其中所述第一标记组分是基于荧光或化学发光猝灭或扩增的标记系统的一部分，并且所述标记系统的第二标记组分被附连到第二捕获分子，使得在两个捕获分子与分析物结合后产生可测量的信号，其允许检测在包含所述样品的溶液中形成的夹心复合物。
在另一个实施方式中，所述标记系统包含稀土穴合物或稀土螯合物与荧光染料或化学发光染料、特别是花青类型的染料的组合。
在本发明的情形中，基于荧光的测定法包括使用染料，所述染料可以例如选自FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、花青染料例如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、呫吨、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素类例如伞形酮、苯甲酰亚胺类例如Hoechst 33258、菲啶类例如德克萨斯红、雅吉瓦黄、Alexa Fluor、PET、溴化乙锭、吖啶染料、咔唑染料、吩嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料等。
在本发明的情形中，基于化学发光的测定法包括使用基于文献中为化学发光材料所描述的物理原理的染料(Kirk-Othmer，《化学技术百科全书》(Encyclopedia of chemical technology)，第4版，执行主编J.I.Kroschwitz；编辑M.Howe-Grant,John Wiley&Sons,1993,vol.15,p.518-562，通过引用并入本文，包括第551-562页上的引用)。优选的化学发光染料是吖啶酯类。
如本文中所述，“测定法”或“诊断测定法”可以是应用于诊断领域的任何类型。这种测定法可以基于待检测的分析物与具有一定亲和性的一种或多种捕获探针的结合。关于捕获分子与靶分子或感兴趣的分子之间的相互作用，亲和常数优选地大于108M-1。
在本发明的情形中，“结合剂分子”是可用于结合来自样品的靶分子或感兴趣的分子即分析物(在本发明的情形中是速激肽原A及其片段)的分子。因此，结合剂分子必须在空间和表面特征例如表面电荷、疏水性、亲水性、路易斯供体和/或受体的存在或不存在两方面充分塑造，以特异性结合靶分子或感兴趣的分子。因此，结合可以例如由捕获分子与靶分子或感兴趣的分子之间的离子、范德华、π-π、σ-π、疏水或氢键相互作用或上述两种或更多种相互作用的组合来介导。在本发明的情形中，结合剂分子可以例如选自核酸分子、碳水化合物分子、PNA分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋白。优选地，所述结合剂分子是抗体，包括其对感兴趣的靶或分子具有足够亲和性的片段，并包括重组抗体或重组抗体片段，以及所述抗体及其衍生自长度为至少12个氨基酸的变体链的片段的化学和/或生物化学修饰的衍生物。
化学发光标记物可以是吖啶酯标记物、甾类标记物包括异鲁米诺标记物等。
酶标记物可以是乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CPK)、碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、酸性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等。
在本发明的一个实施方式中，所述两种结合剂中的至少一者被结合到固相，例如磁性粒子和聚苯乙烯表面。
在根据本发明的用于测定体液样品中的速激肽原A或片段的测定法的一个实施方式中，此类测定法是夹心测定法，优选为全自动测定法。它可以是全自动或手动ELISA。它可以是所谓的POC测试(护理点)。自动或全自动测定法的实例包括可用于下述系统之一的测定法：RocheAbbott/>Siemens/>Brahms/>Biomerieux/>Alere/>测试格式的实例在上文提供。
在根据本发明的用于测定体液样品中的速激肽原A或片段的测定法的一个实施方式中，为了进行检测，所述两种结合剂中的至少一者被标记。标记物的实例在上文提供。
在根据本发明的用于测定体液样品中的速激肽原A或片段的测定法的一个实施方式中，所述两种结合剂中的至少一者被结合到固相。固相的实例在上文提供。
在根据本发明的用于测定体液样品中的速激肽原A或片段的测定法的一个实施方式中，所述标记物选自化学发光标记物、酶标记物、荧光标记物、放射性碘标记物。本发明的另一个主题内容是一种包含根据本发明的测定法的试剂盒，其中所述测定法的组分可以被包含在一个或多个容器中。
在一个实施方式中，本发明的主题内容是一种用于执行根据本发明的方法的护理点设备，其中所述护理点设备包含针对第3-22位氨基酸(GANDDLNYWSDWYDSDQIK，SEQ IDNO.11)或第21-36位氨基酸(IKEELPEPFEHLLQRI，SEQ ID NO.12)的至少一种抗体或抗体片段，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。
在一个实施方式中，本发明的主题内容是一种用于执行根据本发明的方法的护理点设备，其中所述护理点设备包含针对第3-22位氨基酸(GANDDLNYWSDWYDSDQIK，SEQ IDNO.11)和第21-36位氨基酸(IKEELPEPFEHLLQRI，SEQ ID NO.12)的至少两种抗体或抗体片段，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。
在一个实施方式中，本发明的主题内容是一种用于执行根据本发明的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含针对第3-22位氨基酸(GANDDLNYWSDWYDSDQIK，SEQ ID NO.11)或第21-36位氨基酸(IKEELPEPFEHLLQRI，SEQ ID NO.12)的至少一种抗体或抗体片段，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。
在一个实施方式中，本发明的主题内容是一种用于执行根据本发明的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含针对第3-22位氨基酸(GANDDLNYWSDWYDSDQIK，SEQ ID NO.11)和第21-36位氨基酸(IKEELPEPFEHLLQRI，SEQ ID NO.12)的至少两种抗体或抗体片段，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。
本发明的方法可以部分地由计算机实现。例如，可以在计算机系统中执行将检测到的标志物例如NT-PTA的水平与参比和/或阈值水平进行比较的步骤。例如，可以将所述测定的值输入(由卫生专业人员手动地或者从测定相应标志物水平的装置自动地)到计算机系统中。计算机系统可以直接位于护理点(例如初级监护病房或ED)，也可以位于通过计算机网络连接的远程位置(例如通过因特网或专业医疗云系统，任选地可以与其他IT系统或平台例如医院信息系统(HIS)相组合)。可选地或除此之外，将为用户(通常是卫生专业人员例如医生)显示和/或打印相关的疗法指导和/或疗法分层。
下面的实施方式也是本发明的主题内容：
1.一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法，所述方法包括：
·测定从所述受试者获得的体液样品中速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平，并且
·将测定的速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平与脓毒症或脓毒性休克相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克。
2.根据实施方式1所述的方法，其中所述患者的体液样品在所述患者未显示出脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的临床症状或显示出感染性疾病的轻度症状时获取。
3.根据实施方式1至2所述的方法，其中所述速激肽原A选自SEQ ID NO.1至4，并且其片段选自SEQ ID NO.5至12。
4.根据实施方式1至3所述的方法，其中所述速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平通过使用速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的结合剂来测定。
5.根据实施方式1至4所述的方法，其中所述结合剂选自与速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段结合的抗体、抗体片段或非Ig支架。
6.根据实施方式1至5中任一者所述的方法，其中所述结合剂与选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12的氨基酸序列内的区域结合。
7.根据前述实施方式中任一者所述的方法，其中所述阈值范围在75至200pmol/L之间，更优选地在90至175pmol/L之间，甚至更优选地在100至150pmol/L之间，最优选地所述阈值水平为120pmol/L。
8.根据前述实施方式中任一者所述的方法，其中所述速激肽原A的水平使用免疫测定法测量，并且所述结合剂是与速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段结合的抗体或抗体片段。
9.根据实施方式1至8中任一者所述的方法，其中使用的测定法包含两种结合剂，它们与速激肽原A的第3-22位氨基酸(SEQ ID NO.11)和第21-36位氨基酸(SEQ ID NO.12)区域内的两个不同区域结合，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。
10.根据实施方式1至9中任一者所述的方法，其中测定法被用于测定速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平，并且其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康受试者的速激肽原A或速激肽原A片段，并且<10pmol/L。
11.根据实施方式1至10中任一者所述的方法，其中所述体液可以选自血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(CSF)和唾液。
12.根据实施方式1至11所述的方法，其中可以测定另外至少一种生物标志物和/或临床参数和/或临床评分，其选自D-二聚体、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)、乳酸盐、penKid、ADM-NH2、MR-proADM、NT-proBNP、BNP、前脓毒素、正五聚蛋白-3(PTX-3)、CD-64、钙卫蛋白、白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、血红蛋白、血小板计数、白蛋白、丙氨酸转氨酶、肌酸酐、血尿素、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、心肌肌钙蛋白I、凝血酶原时间、血清铁蛋白、白介素-6(IL-6)、IL-10、IL-2、IL-7、干扰素γ(IF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、IP-10、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、MIP-1α、SOFA、qSOFA、APACHE II。
13.根据实施方式1至12中任一者所述的方法，其中所述测定在一位患者中进行超过一次。
14.根据实施方式1至13中任一者所述的方法，用于将所述受试者分层为风险组。
15.一种用于执行根据实施方式1至14中任一者所述的方法的护理点设备，其中所述护理点设备包含针对第3-22位氨基酸(SEQ ID NO.11)和第21-36位氨基酸(SEQ IDNO.12)的至少两种抗体或抗体片段。
16.一种用于执行根据实施方式1至14中任一者所述的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含针对第3-22位氨基酸(SEQ ID NO.11)和第21-36位氨基酸(SEQ ID NO.12)的至少两种抗体或抗体片段。
实施例
实施例1-抗体的开发
用于免疫接种的肽/偶联物
合成了用于免疫接种的肽(JPT Technologies,Berlin,Germany)，其具有额外的N-端胱氨酸残基，用于将所述肽偶联到牛血清白蛋白(BSA)。使用Sulfo–SMCC(Perbio-science,Bonn,Germany)将肽共价连接到BSA。所述偶联程序按照Perbio的手册进行。
表1：
单克隆抗体的产生
将BALB/c小鼠在第0和14天用100μg肽-BSA-偶联物(在100μl完全弗氏佐剂中乳化)免疫接种，并在第21和28天用50μg所述偶联物(在100μl不完全弗氏佐剂中)免疫接种。在进行融合实验前3天，动物接受溶解在100μl盐水中的50μg偶联物，其作为一次腹膜内注射和一次静脉内注射提供。用1ml 50％聚乙二醇将来自免疫接种小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞在37℃下融合30s。在清洗后，将细胞接种在96孔细胞培养板中。通过在HAT培养基(增补有20％胎牛血清和HAT增补剂的RPMI 1640培养基)中生长来选择杂交克隆。两周后，将HAT培养基用HT培养基替换进行三次传代，然后返回到正常细胞培养基。融合后三周对细胞培养上清液进行抗原特异性IgG抗体的初步筛选。将测试呈阳性的微量培养物转移到24孔板中进行繁殖。在重新测试后，使用有限稀释技术对所选培养物进行克隆和再克隆，并确定同种型(Lane,1985.J.Immunol.Meth.81:223-228；Ziegler等， 1996.Horm.Metab.Res.28:11-15)。抗体通过标准的抗体产生方法产生(Marx等， 1997.Monoclonal Antibody Production,ATLA 25,121)并通过蛋白A层析进行纯化。基于SDS凝胶电泳分析，抗体纯度>95％。
抗体的标记和包被
标记的化合物(示踪剂，抗PTA 3-22)：将100μg(100μl)抗体(1mg/ml，在pH 7.4的PBS中)与10μl NHS-吖啶酯(1mg/ml，在乙腈中，InVent GmbH,Germany)混合，并在室温下温育20min。在Bio-Sil SEC 400-5(Bio-Rad Laboratories,Inc.,USA)上通过凝胶过滤HPLC纯化标记的抗体。将纯化的标记抗体在(300mmol/L磷酸钾，100mmol/L NaCl，10mmol/L Na-EDTA，5g/L牛血清白蛋白，pH 7.0)中稀释。终浓度为每200μL大约800.000个相对光单位(RLU)的标记化合物(约20ng标记的抗体)。使用AutoLumat LB 953(BertholdTechnologies GmbH&Co.KG)测量吖啶酯化学发光。
包被(固相，抗PTA 22-36抗体)：将聚苯乙烯管(Greiner Bio-One InternationalAG,Austria)用抗体(1.5μg抗体/0.3mL 100mmol/L NaCl，50mmol/L TRIS/HCl，pH 7.8)包被(在室温下18h)。在用5％牛血清白蛋白阻断后，将管用pH 7.4的PBS清洗并真空干燥。
速激肽原A免疫测定法和校准
将50μl样品(或校准品)移液到包被的管中，在添加标记的抗体(200ul)后，将管在18-25℃下温育2h。通过用清洗溶液(20mmol/l PBS，pH 7.4，0.1％Triton X-100)清洗5次(每次1ml)，除去未结合的示踪剂。使用Luminometer LB 953,Berthold,Germany测量管结合的标记的抗体。所述测定法使用在20mM K2PO4，6mM EDTA，0.5％ BSA，50μM氨肽酶抑制剂，100μM亮抑肽酶，pH 8.0中稀释的合成P37的稀释液来校准。PTA对照血浆在ICI-diagnostics,Berlin,Germany获得。图1示出了典型的PTA剂量/信号曲线。
分析测定灵敏度(通过0校准品(不添加PTA)的20次测定产生的信号中位数+2SD2标准偏差(SD)，相应的PTA浓度从标准曲线计算)为4.4pmol/L。
实施例2-健康受试者中的NT-PTA
使用NT-PTA测定法测量来自禁食健康受试者(n＝4435，平均年龄56岁)的EDTA血浆样品。所述群体中NT-PTA的中位数值为55.2pmol/L，标准偏差为+/-17.8pmol/L，最低值为9.07pmol/L，第99百分位数为107.6pmol/L。由于测定灵敏度为4.4pmol/L，因此所有值均可使用所述测定法检测。健康受试者中PTA值的分布示出在图2中。
实施例3-人类中的内毒素研究
将32名健康男性志愿者(平均(±SE)年龄23.9[±0.7岁])招入医院临床研究室。筛查测试均为正常。参与者在t＝0h时用以4ng/kg的剂量(这是标准化剂量)静脉推注的LPS(大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)脂多糖，0311.H10:k)进行攻击。从LPS注射前2h至其后24h每隔一段时间采集血液。立即将血液离心(4℃，10min，3000rpm)，并将血浆储存在-20℃下直至测定。在用内毒素处理的测试人员中对不同的炎症生物标志物白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和降钙素原(PCT)以及N-端速激肽原A(NT-PTA)的测定，显示出血液中所述物质浓度的时间依赖性过程(参见图3)。
首先，正如预期，在注射内毒素后约1小时发生TNFα的增加。此后不久跟随有细胞毒素IL-6的增加(注射内毒素后约1.5小时)。3小时后，TNFα和IL-6的浓度逐渐下降，而此时令人吃惊的是发生A肽浓度的增加，其在仅仅约7小时后达到起始水平。PCT在5小时后显示出浓度增加，并且在进一步过程中稳定地增加。NT-PTA的分泌可以通过单独注射内毒素诱导，并且是免疫级联反应中TNFα/IL-6与PCT之间的一个事件。
PCT是脓毒症诊断的一种已确立的标志物，并在本研究中显示出脓毒症的发作。然而，在脓毒症生物标志物PCT升高之前约3小时，NT-PTA浓度升高。因此可以得出结论，NT-PTA是一种用于预测脓毒症的标志物。
实施例4-PTA用于在CAP患者中在48小时内预测脓毒症
调查了218名因社区获得性肺炎(CAP)住院的受试者的组群。主要结果是脓毒症和严重脓毒症，它们按照国际共识会议标准来定义(Singer等，2016.JAMA 315(8):801-10)。在48小时内总共105名患者发生脓毒症/严重脓毒症。在入组时测量EDTA血浆样品中的NT-PTA。在入组后48小时内发生脓毒症/严重脓毒症的患者与未发生脓毒症/严重脓毒症的患者相比具有显著更高的NT-PTA浓度(p＝0.0007)(图4)，AUC为0.632(p＝0.08)(图5)。表2示出了示例性截止值和相应的灵敏度和特异性。
表2：示例性截止值(CAP研究)
实施例5-疑似脓毒症患者中的PTA
对712名因疑似脓毒症而住院的患者进行调查。纳入标准为年龄≥18岁，qSOFA为至少1(GCS<15)，呼吸频率≥22/min，收缩压≤100mmHg。198名患者在住院后发生脓毒症或脓毒性休克。在入院时测量了EDTA血浆样品中的NT-proTA(图6)。发生脓毒症的患者的NT-proTA浓度(中位数125.8pmol/L[IQR 77.8-237.8])显著高于未发生脓毒症的患者(76.9pmol/L[55.55-115.2])。此外，与未发生脓毒性休克或发生脓毒症的患者相比，在进一步发生脓毒性休克的患者(n＝23)中NT-proTA水平显著升高(209.2pmol/L[118.7-402.3])。用于区分入院后会发生脓毒症或脓毒性休克的患者和不会发生脓毒症或脓毒性休克的患者的ROC图分析揭示出NT-proTA的AUC为0.703(p<0.0001)(图7)。
表3示出了用于区分患者组(从不发生脓毒症/脓毒性休克相比于发生脓毒症/脓毒性休克)的示例性截止值和相应的灵敏度和特异性。
表3：用于区分患者组(从不发生脓毒症/脓毒性休克相比于发生脓毒症/脓毒性休克)的示例性截止值。
用于区分入院后会发生脓毒性休克的患者和不会发生脓毒性休克的患者的ROC图分析揭示出NT-proTA的AUC为0.757(p<0.0001)(图8)。
表4示出了用于区分患者组(从不发生脓毒性休克相比于发生脓毒性休克)的示例性截止值和相应的灵敏度和特异性。
表4：用于区分患者组(从不发生脓毒性休克相比于发生脓毒性休克)的示例性截止值。
实施例6-急诊科(ED)入院患者中的PTA
这是一项前瞻性观察性试验，招募了97名因急性病理状况连续入住罗马Sant’Andrea医院急诊科并进一步住院的患者。对于每位登记的患者，在抵达时收集临床实验室数据和血浆NT-proTA值。表5中总结了患者的特征。出院后进行了为期60天的电话随访。
表5：患者特征(ED试验)
存活率为81.4％，事件(死亡)主要发生在入院后的第一周。入院时测量NT-proTA。我们将PTA初始值与住院死亡率相关联。NT-proTA对住院ED患者的结果具有高度预后性(AUC/C指数0.795；p<0.00001)。图9显示了根据a)入院时PTA的四分位数和b)入院时NT-proTA的100pmol/L的截止值，ED患者存活率的Kaplan-Meier图。
在入院时及其后24/48和72小时测量降钙素原。PCT值被用作脓毒症诊断的替代品。脓毒症类别定义如下：高-高(HH)-发生过脓毒症并且尚未缓解，低-高(LH)-脓毒症正在发生，高-低(HL)-脓毒症正在缓解，低-低(LL)-无脓毒症。变化定义如下：如果PCT t0<1ng/mL并且在t24-t72时PCT最大值>1ng/mL，则低-高(LH)；如果PCT t0>1ng/mL并且在t24-t72时PCT最大值<t0的75％，则高-低(HL)；如果在所有时间点PCT t0均<1ng/mL，则低-低(LL)；如果在所有时间点PCT t0均>1ng/mL，则高-高(HH)。脓毒症类别的NT-proTA值(72小时内，p＝0.049)示出在图10中。相应亚组中的NT-proTA浓度示出在表6中。
表6：脓毒症类别亚组中的NT-proTA水平
患有脓毒症并且在接下来的72小时内不会缓解的患者(HH)显示出比在72小时内发生脓毒症的患者(LH)更高的NT-proTA值，后者又高于处于缓解期的脓毒症患者(HL)和未发生脓毒症的患者(LL)中的NT-proTA值。
表7示出了患者亚组和分别高于100、120和140pmol/L的示例性截止值的患者的百分率。
表7：
附图说明
图1：典型的NT-速激肽原A的剂量信号曲线。
图2：健康群体(n＝4463)中NT-ProTA的频率分布。
图3：用内毒素处理后健康人类血浆中的炎症生物标志物(IL-6、TNFα、PCT、NT-PTA)。
图4：入院后48小时内不发生脓毒症/严重脓毒症的CAP患者相比于入院后48小时内发生脓毒症/严重脓毒症的CAP患者中的NT-proTA值的盒须图(p＝0.0007)。
图5：入院后48小时内不发生脓毒症/严重脓毒症的CAP患者相比于入院后48小时内发生脓毒症/严重脓毒症的CAP患者中的NT-proTA值ROC图(AUC 0.632；p＝0.08)。
图6：疑似脓毒症/脓毒性休克的住院患者在入院时的NT-proTA值的盒须图。
图7：将会发生脓毒症或脓毒性休克的患者相比于不会发生脓毒症或脓毒性休克的患者中NT-proTA值的ROC图(AUC 0.703；p<0.0001)。
图8：入院后将会发生脓毒性休克的患者相比于不会发生脓毒性休克的患者中NT-proTA值的ROC图(AUC 0.757；p<0.0001)。
图9a)：ED患者入院时存活率的Kaplan-Meier图(根据PTA四分位数)。
图9b)：ED患者入院时存活率的Kaplan-Meier图(PTA截止值为100pmol/L)
图10：脓毒症类别变化的NT-proTA中位数。
序列表
<110> 思芬构技术有限公司（SphingoTec GmbH）
<120> 用于预测脓毒症和脓毒性休克的方法
<130> S75471WO
<150> EP21180359.8
<151> 2021-06-18
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 92
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
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20 25 30
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35 40 45
Met Gly Lys Arg Asp Ala Asp Ser Ser Ile Glu Lys Gln Val Ala Leu
50 55 60
Leu Lys Ala Leu Tyr Gly His Gly Gln Ile Ser His Lys Met Ala Tyr
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85 90
<210> 2
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
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<213> 智人（Homo sapiens）
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<213> 智人（Homo sapiens）
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<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
Asp Ala Asp Ser Ser Ile Glu Lys Gln Val Ala Leu Leu Lys Ala Leu
1 5 10 15
Tyr Gly His Gly Gln Ile Ser His Lys Arg His Lys Thr Asp Ser Phe
20 25 30
Val Gly Leu Met
35
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
Gly His Gly Gln Ile Ser His Lys Arg His Lys Thr Asp Ser Phe Val
1 5 10 15
Gly Leu Met
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
His Lys Thr Asp Ser Phe Val Gly Leu Met
1 5 10
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
Ala Leu Asn Ser Val Ala Tyr Glu Arg Ser Ala Met Gln Asn Tyr Glu
1 5 10 15
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
Gly Ala Asn Asp Asp Leu Asn Tyr Trp Ser Asp Trp Tyr Asp Ser Asp
1 5 10 15
Gln Ile Lys
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
Ile Lys Glu Glu Leu Pro Glu Pro Phe Glu His Leu Leu Gln Arg Ile
1 5 10 15

Claims (16)

1.一种用于在患者中预测脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的方法，所述方法包括：
●测定从所述受试者获得的体液样品中速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平，并且
●将测定的速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平与脓毒症或脓毒性休克相关联，其中高于一定阈值的升高的水平预测了脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者的体液样品在所述患者未显示出脓毒症、严重脓毒症和/或脓毒性休克的临床症状或显示出感染性疾病的轻度症状时获取。
3.根据权利要求1至2所述的方法，其中所述速激肽原A选自SEQ ID NO.1至4，并且其片段选自SEQ ID NO.5至12。
4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平通过使用速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的结合剂来测定。
5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述结合剂选自与速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段结合的抗体、抗体片段或非Ig支架。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述结合剂与选自SEQ ID NO.5、SEQID NO.11和SEQ ID NO.12的氨基酸序列内的区域结合。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阈值范围在75至200pmol/L之间，更优选地在90至175pmol/L之间，甚至更优选地在100至150pmol/L之间，最优选地所述阈值水平为120pmol/L。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述速激肽原A的水平使用免疫测定法测量，并且所述结合剂是与速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段结合的抗体或抗体片段。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中使用的测定法包含两种结合剂，它们与速激肽原A的第3-22位氨基酸(SEQ ID NO.11)和第21-36位氨基酸(SEQ ID NO.12)区域内的两个不同区域结合，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中测定法被用于测定速激肽原A或其至少5个氨基酸的片段的水平，并且其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康受试者的速激肽原A或速激肽原A片段，并且<10pmol/L。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述体液可以选自血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(CSF)和唾液。
12.根据权利要求1至11所述的方法，其中可以测定另外至少一种生物标志物和/或临床参数和/或临床评分，其选自D-二聚体、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)、乳酸盐、penKid、ADM-NH2、MR-proADM、NT-proBNP、BNP、前脓毒素、正五聚蛋白-3(PTX-3)、CD-64、钙卫蛋白、白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、血红蛋白、血小板计数、白蛋白、丙氨酸转氨酶、肌酸酐、血尿素、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、心肌肌钙蛋白I、凝血酶原时间、血清铁蛋白、白介素-6(IL-6)、IL-10、IL-2、IL-7、干扰素γ(IF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、IP-10、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、MIP-1α、SOFA、qSOFA、APACHEII。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述测定在一位患者中进行超过一次。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，用于将所述受试者分层为风险组。
15.一种用于执行根据权利要求1至14中任一项所述的方法的护理点设备，其中所述护理点设备包含针对第3-22位氨基酸(SEQ ID NO.11)和第21-36位氨基酸(SEQ ID NO.12)的至少两种抗体或抗体片段。
16.一种用于执行根据权利要求1至14中任一项所述的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含针对第3-22位氨基酸(SEQ ID NO.11)和第21-36位氨基酸(SEQ ID NO.12)的至少两种抗体或抗体片段。
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