CN113759130B - 一种缓冲液及胶质纤维酸性蛋白的冻干方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于胶质纤维酸性蛋白保存技术领域，具体涉及一种缓冲液及胶质纤维酸性蛋白的冻干方法。缓冲液，包括以下组分：4‑吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖。能够有效保存胶质纤维酸性蛋白，能够使胶质纤维酸性蛋白检测过程中的抗压冻干品复融后有效保存其活性，提高检测灵敏度；所述冻干保护方法对胶质纤维酸性蛋白的保存具有较好的保存效果，可以使得GFAP在4‑8℃储存期达到18个月、在‑20℃储存期达到3年。

Description

一种缓冲液及胶质纤维酸性蛋白的冻干方法
技术领域
本发明属于胶质纤维酸性蛋白保存技术领域，具体涉及一种缓冲液及胶质纤维酸性蛋白的冻干方法。
背景技术
中枢神经系统的主要成分是星形胶质细胞，它的主要功能是对神经元起支持、营养的作用，同时在损伤反应、宿主防御机制和组织修复等过程当中发挥重要的作用。当神经系统损伤时，星形胶质细胞可以大量表达并且活性增强。其中胶质纤维酸性蛋白是星形胶质细胞中的主要成分。
胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是一种Ⅲ型中间纤丝蛋白。它是星形胶质细胞的特异性标志物，是唯一的在该细胞表达并且表达丰富的这样的一种物质。在生理或生化损伤，以及病理和生理损害的双重作用下，都可以刺激星形胶质细胞它产生GFAP，释放进入脑脊液，再通过受损的血脑屏障释放入血。因此在理论上我们就可以在血当中检测GFAP，从而推断脑脊液当中或者是我们神经系统的星形胶质细胞，它是否产生了GFAP这样的特异性的标志物。
人的GFAP由432个氨基酸组成，主要分布于中枢神经系统的星形胶质细胞，参与细胞骨架的构成并维持其张力强度。GFAP是一种神经系统特异性蛋白，其在脑损伤中对神经系统功能的恢复有重要影响。在TBI发生后，GFAP在1小时内会通过血脑屏障进入血液，导致血清GFAP显著升高。对TBI的早期诊断，鉴别诊断和判断预后有重要的意义，临床上主要用于脑外伤的辅助诊断。
现有技术涉及到相关胶质纤维酸性蛋白的检测方法如中国专利申请CN201811391978.X公开一种人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)磁微粒分离化学发光免疫检测方法。中国专利申请CN201911101693.2公开一种胶质纤维酸性蛋白抗体检测试剂盒和应用。这些方法的应用过程中胶质纤维酸性蛋白的保存具有至关重要的作用。但是现有技术中并没有很好地针对胶质纤维酸性蛋白的保存技术或者保存，这对于胶质纤维酸性蛋白的保存或检测技术的发展及应用都具有较大的影响。
本发明的目的旨在提供一种缓冲液及胶质纤维酸性蛋白的冻干方法，以提高使胶质纤维酸性蛋白的保存活性，以期更好的发展胶质纤维酸性蛋白的检测技术。
发明内容
为克服以上技术问题，本发明提供了一种缓冲液，该缓冲液能够有效提高GFAP的活性、提高抗原冻干品的检测灵敏度，同时能够有效延长GFAP的保存期限。
为实现以上目的，本发明提供的技术方案如下：
一种缓冲液，包括以下组分：4-吗啉乙磺酸、NaCl(氯化钠)、ZnCl2(氯化锌)、MgCl2·6H2o(六水合氯化镁)、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖。
优选地，按照重量份数计，所述缓冲液，包括以下组分：4-吗啉乙磺酸5-30份、NaCl8-12份、ZnCl2 0.01-0.5份、MgCl2·6H2o 0.1-15份、牛血清白蛋白2-50份、酪蛋白2-50份、甘氨酸1-15份、聚乙二醇0.2-25份、海藻糖10-100份。
优选地，按照重量份数计，所述缓冲液，包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10-20份、NaCl 9-10份、ZnCl2 0.01-0.1份、MgCl2·6H2o 0.1-5份、牛血清白蛋白5-10份、酪蛋白5-10份、甘氨酸1-5份、聚乙二醇0.2-5份、海藻糖10-30份。
优选地，所述缓冲液中，甘氨酸：聚乙二醇：海藻糖的质量比为1-10:0.2-10:10-50。
优选地，所述缓冲液中还包括表面活性剂。
优选地，所述表面活性剂为吐温20、吐温60或吐温80中的任一种或多种，优选为吐温20；
优选地，所述缓冲液的pH值为5.8-7.5。
本发明的另一目的在于提供所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值并定容，过滤，即可。
优选地，所述表面活性剂在缓冲液中的体积分数为0.02-1％。
优选地，所述过滤使用0.2-0.5μm的滤膜进行，优选0.22μm的滤膜。
本发明的另一目的还在于提供所述缓冲液在保存胶质纤维酸性蛋白中的应用。
本发明的目的还在于提供一种胶质纤维酸性蛋白的冻干方法，包括以下步骤：
(1)预冷冻段：在常温下，将胶质纤维酸性蛋白放入缓冲液中，制成含有胶质纤维酸性蛋白的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；
(2)升华干燥段：将样品舱的真空度降至0-5帕斯卡(pa)；再温度升至-40℃，保温；再升温至-30℃，保温；再升温至-20℃，保温；再升温至-10℃，保温；再升温至-5℃，保温；
(3)解析干燥段：将样品舱真空度维持在0-5pa；设置温度终点25℃，从-5℃提升至25℃；在25℃持续保温。
优选地，步骤(1)，所述预冷冻段，
常温降温至4℃过程中，降温速率为1-5℃/min，在4℃保温10-30min；
4℃降温至-40℃过程中，降温速率为0.45-1℃/min，在-40℃保温20-40min；
-40℃温至-55℃过程中，降温速率为0.25-0.5℃/min，保温160-200min；
优选地，步骤(2)，所述升华干燥段，
-55℃升至-40℃过程中，升温速率为0.5-1℃/min，在-40℃保温20-40min；
-40℃升温至-30℃过程中，升温速率为0.2-0.5℃/min，-30℃保温40-60min；
-30℃升温至-20℃过程中，升温速率为0.25-0.5℃/min，-20℃保温40-60min；
-20℃升温至-10℃过程中，升温速率为0.15-0.25℃/min，-10℃保温100-150min；
-10℃升温至-5℃过程中，升温速率为0.05-0.1℃/min，-5℃保温100-150min；
优选地，步骤(3)中，所述解析干燥段，
以5-10℃/h的升温速率将样本从-5℃提升至25℃；在25℃的持续保温时间为5-60分钟。
优选地，所述胶质纤维酸性蛋白的冻干方法，包括以下步骤：
(1)预冷冻段：在常温下(25℃)，将胶质纤维酸性蛋白放入缓冲液中，制成含有胶质纤维酸性蛋白的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先按照1-5℃/min的降温速率将缓冲液体系降温至4℃，保温；再以0.45-1℃/min的降温速率将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再以0.25-0.5℃/min的降温速率将缓冲液体系降温至-55℃，保温；
(2)升华干燥段：将样品舱的真空度在1-5分钟内降至0-5帕斯卡(pa)；再按照0.5-1℃/min的升温速率将温度升至-40℃，保温；再按照0.2-0.5℃/min的升温速率升温至-30℃，保温；再按照0.25-0.5℃/min的升温速率升温至-20℃，保温；再以0.15-0.25℃/min的升温速率升温至-10℃，保温；再以0.05-0.1℃/min的升温速率升温至-5℃，保温；
(3)解析干燥段：将样品舱真空度维持在0-5pa；设置温度终点25℃，以5-10℃/h的升温速率将样本从-5℃提升至25℃；在25℃的持续保温时间为5-60min。
优选地，所述胶质纤维酸性蛋白的冻干方法，包括以下步骤：
(1)预冷冻段：在常温下，将胶质纤维酸性蛋白放入缓冲液中，制成含有胶质纤维酸性蛋白的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先按照1-5℃/min的降温速率将缓冲液体系降温至4℃，保温10-30min；再以0.45-1℃/min的降温速率将缓冲液体系降温至-40℃，保温20-40min，再以0.25-0.5℃/min的降温速率将缓冲液体系降温至-55℃，保温160-200min；
(2)升华干燥段：将样品舱的真空度在1-5分钟内降至0-5帕斯卡(pa)；再按照0.5-1℃/min的升温速率将温度升至-40℃，保温20-40min；再按照0.2-0.5℃/min的升温速率升温至-30℃，保温40-60min；再按照0.25-0.5℃/min的升温速率升温至-20℃，保温40-60min；再以0.15-0.25℃/min的升温速率升温至-10℃，保温100-150min；再以0.05-0.1℃/min的升温速率升温至-5℃，保温100-150min；
(3)解析干燥段：将样品舱真空度维持在0-5pa；设置温度终点25℃，以5-10℃/h的升温速率将样本从-5℃提升至25℃；在25℃的持续时间为5-60分钟。
与现有技术比，本发明的技术优势在于：
(1)本发明提供了一种缓冲液，能够有效保存胶质纤维酸性蛋白，能够使胶质纤维酸性蛋白检测过程中的抗压冻干品复融后有效保存其活性，提高检测灵敏度。
(2)本发明提供的冻干保护方法对胶质纤维酸性蛋白的保存具有较好的保存效果，可以使得GFAP在4-8℃储存期达到18个月、在-20℃储存期达到3年。
(3)本发明中4-吗啉乙磺酸、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖等组分具有较好的协同作用，能有效提高缓冲液的对胶质纤维酸性蛋白的保存效果，提高生物活性。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
一种缓冲液，包括以下组分：包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10g、NaCl 9g、ZnCl20.1g、MgCl2·6H2o 0.1g、牛血清白蛋白10g、酪蛋白5g、甘氨酸10g、聚乙二醇0.2g、海藻糖20g，吐温20 5ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。
所述胶质纤维酸性蛋白的冻干方法，包括以下步骤：
(1)预冷冻段：在常温下，将胶质纤维酸性蛋白放入缓冲液中，制成含有胶质纤维酸性蛋白的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；
(2)升华干燥段：调节样品舱的真空度；再温度升至-40℃，保温；再升温至-30℃，保温；再升温至-20℃，保温；再升温至-10℃，保温；再升温至-5℃，保温；
(3)解析干燥段：调节样品舱真空度；设置温度终点25℃；在25℃持续保温；
冻干程序，如下表1：
表1实施例1的冻干程序
Figure BDA0003282421350000051
Figure BDA0003282421350000061
实施例2
一种缓冲液，包括以下组分：4-吗啉乙磺酸20g、NaCl 10g、ZnCl2 0.01g、MgCl2·6H2o 5g、牛血清白蛋白5g、酪蛋白10g、甘氨酸1g、聚乙二醇5g、海藻糖10g，吐温60 0.2ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至5.8并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。
所述胶质纤维酸性蛋白的冻干方法，包括以下步骤：
(1)预冷冻段：在常温下，将胶质纤维酸性蛋白放入缓冲液中，制成含有胶质纤维酸性蛋白的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；
(2)升华干燥段：调节样品舱的真空度；再温度升至-40℃，保温；再升温至-30℃，保温；再升温至-20℃，保温；再升温至-10℃，保温；再升温至-5℃，保温；
(3)解析干燥段：调节样品舱真空度；设置温度终点25℃；在25℃持续保温；
冻干程序，如下表2：
表2实施例2的冻干程序
Figure BDA0003282421350000062
Figure BDA0003282421350000071
实施例3
一种缓冲液，包括以下组分：4-吗啉乙磺酸5g、NaCl 8g、ZnCl2 0.5g、MgCl2·6H2o0.1g、牛血清白蛋白2g、酪蛋白20g、甘氨酸5g、聚乙二醇0.2g、海藻糖25g，吐温80 10ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至7.5并定容至1000ml，使用0.45μm的滤膜过滤，即可。
所述胶质纤维酸性蛋白的冻干方法，包括以下步骤：
(1)预冷冻段：在常温下，将胶质纤维酸性蛋白放入缓冲液中，制成含有胶质纤维酸性蛋白的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；
(2)升华干燥段：调节样品舱的真空度；再温度升至-40℃，保温；再升温至-30℃，保温；再升温至-20℃，保温；再升温至-10℃，保温；再升温至-5℃，保温；
(3)解析干燥段：调节样品舱真空度；设置温度终点25℃；在25℃持续保温；
冻干程序，如下表3：
表3实施例3的冻干程序
Figure BDA0003282421350000072
实施例4
一种缓冲液，包括以下组分：4-吗啉乙磺酸20gg、NaCl 12g、ZnCl2 0.01g、MgCl2·6H2o5g、牛血清白蛋白5g、酪蛋白2g、甘氨酸1g、聚乙二醇10g、海藻糖10g，吐温20 5ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至7.0并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。
所述胶质纤维酸性蛋白的冻干方法，包括以下步骤：
(1)预冷冻段：在常温下，将胶质纤维酸性蛋白放入缓冲液中，制成含有胶质纤维酸性蛋白的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；
(2)升华干燥段：调节样品舱的真空度；再温度升至-40℃，保温；再升温至-30℃，保温；再升温至-20℃，保温；再升温至-10℃，保温；再升温至-5℃，保温；
(3)解析干燥段：调节样品舱真空度；设置温度终点25℃；在25℃持续保温；
冻干程序，如下表4：
表4实施例4冻干程序
Figure BDA0003282421350000081
对比例1
与实施例1相比，区别在于将4-吗啉乙磺酸替换为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合物。
一种缓冲液，包括以下组分：包括以下组分：磷酸二氢钠4.86g、磷酸氢二钠5.14g、NaCl9g、ZnCl2 0.1g、MgCl2·6H2o 0.1g、牛血清白蛋白10g、酪蛋白5g、甘氨酸10g、聚乙二醇0.2g、海藻糖20g，吐温20 5ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入磷酸二氢钠和磷酸氢二钠、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。
所述胶质纤维酸性蛋白的冻干方法，同实施例1。
对比例2
与实施例1相比，区别在于将海藻糖替换为葡萄糖。
一种缓冲液，包括以下组分：包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10g、NaCl 9g、ZnCl20.1g、MgCl2·6H2o 0.1g、牛血清白蛋白10g、酪蛋白5g、甘氨酸10g、聚乙二醇0.2g、葡萄糖20g，吐温20 5ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、葡萄糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。
所述胶质纤维酸性蛋白的冻干方法，同实施例1。
对比例3
与实施例1相比，区别在于将酪蛋白替换为水解酪蛋白。
一种缓冲液，包括以下组分：包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10g、NaCl 9g、ZnCl20.1g、MgCl2·6H2o 0.1g、牛血清白蛋白10g、水解酪蛋白5g、甘氨酸10g、聚乙二醇0.2g、海藻糖20g，吐温20 5ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、水解酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。所述胶质纤维酸性蛋白的冻干方法，同实施例1。
对比例4
与实施例1相比，区别在于将ZnCl2替换为ZnSO4。
一种缓冲液，包括以下组分：包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10g、NaCl 9g、ZnSO40.1g、MgCl2·6H2o 0.1g、牛血清白蛋白10g、酪蛋白5g、甘氨酸10g、聚乙二醇0.2g、海藻糖20g，吐温20 5ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnSO4、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。所述胶质纤维酸性蛋白的冻干方法，同实施例1。
对比例5
与实施例1相比，区别在于pH值不同。
一种缓冲液，包括以下组分：包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10g、NaCl 9g、ZnCl20.1g、MgCl2·6H2o 0.1g、牛血清白蛋白10g、酪蛋白5g、甘氨酸10g、聚乙二醇0.2g、海藻糖20g，吐温20 5ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至8.1并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。
所述胶质纤维酸性蛋白的冻干方法，同实施例1。
对比例6
与实施例1相比，区别在于升温程序不同。
一种缓冲液，组分同实施例1。
所述胶质纤维酸性蛋白的冻干方法，包括以下步骤：
(1)预冷冻段：在常温下，将胶质纤维酸性蛋白放入缓冲液中，制成含有胶质纤维酸性蛋白的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；
(2)升华干燥段：调节样品舱的真空度；再温度升至-40℃，保温；再升温至-30℃，保温；再升温至-20℃，保温；再升温至-10℃，保温；再升温至-5℃，保温；
(3)解析干燥段：调节样品舱真空度；设置温度终点25℃；在25℃持续保温；
冻干程序，如下表5：
表5对比例6的冻干程序
Figure BDA0003282421350000111
检测效果评价
使用实施例1-4及对比例1-6制成的缓冲液，配制不同浓度的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)冻干品。免疫反应相关检测采用北京美联泰科生物技术有限公司自研的全自动化学发光免疫分析仪进行检测。
检测指标
1.含水量
取浓度为20pg/mL、160pg/mL的冻干品各5瓶。将冻干品去除顶盖和胶塞后称重，记为M1n(n＝1、2、3……10)。将其在200℃条件下进行烘干，直至质量不再发生变化为止，再次称重，记为M2n(n＝1、2、3……10)。将这些装有样品的冻干瓶将依次清洗干净，在200℃条件下进行烘干，直至质量不再发生变化为止，对这些冻干瓶依次称重，记为M3n(n＝1、2、3……10)。按下列公式进行计算含水量。冻干品含水量应小于2％。
含水量＝[(M1n-M3n)/(M2n-M3n)-1]×100％
使用上述方法测试实施例1-4及对比例6对应冻干品的平均含水量，结果见表6。
表6含水量
试验组 含水量％
实施例1 1.4
实施例2 0.8
实施例3 1.7
实施例4 1.3
对比例6 4.5
2.准确度
将浓度约为800pg/mL(允许偏差±10％)的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)液(A)加入到浓度范围0pg/mL-20pg/mL的血清样本B中，所加入GFAP抗原与样本B之间的体积比例为1:9，使用冻干品和配套的胶质纤维酸性蛋白检测试剂盒(磁微粒化学发光法)进行检测。根据下式计算回收率R，其回收率应在85％～115％范围内。
Figure BDA0003282421350000121
式中：R为回收率；V为样品A液的体积；V0为血清样品B液的体积；C为血清样品B液加入A液后的3次测量平均值；
C0为血清样品B液的3次测量平均值；CS为样品A液的浓度。
3.线性区间
将接近线性区间上限的高值样本与接近线性区间下限的低值样本或零浓度样本混合成5个浓度，分别为20pg/mL、40pg/mL、80pg/mL、160pg/mL、320pg/mL。对每一浓度的样本各重复测试3次得到发光值，记录各样品的测量结果，并计算各样品3次测量值的平均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按下式计算线性回归的相关系数(r)，在[10,320]pg/mL的线性区间内，相关系数r应≥0.990。
Figure BDA0003282421350000122
式中：r为相关系数；xi为稀释比例；yi为各个样本测定结果均值；
Figure BDA0003282421350000123
为稀释比例的均值；
Figure BDA0003282421350000124
为样本测定结果总均值。
4.重复性
重复测试浓度为40pg/mL的冻干品10次，计算10次测试结果的平均值
Figure BDA0003282421350000125
和标准差SD。
按下式计算变异系数(CV)，结果CV应≤8％。
Figure BDA0003282421350000126
式中：S为样本测试值的标准差；
Figure BDA0003282421350000131
为样本测试值的平均值。
5.灵敏度
将不含任何分析物的样本重复测试20次，得到20次测试结果的浓度值，计算其平均值
Figure BDA0003282421350000132
和标准差(SD)。平均值
Figure BDA0003282421350000133
即为空白限，结果应＜10pg/mL的要求。
6.批间差
用3个批号的试剂盒分别重复测试浓度为80pg/mL的质控品10次，计算30次测试结果的平均值
Figure BDA0003282421350000134
和标准差SD，根据下列公式得出变异系数(CV)应≤15％。
Figure BDA0003282421350000135
式中：s为样本测试值的标准差；
Figure BDA0003282421350000136
为样本测试值的平均值。
采用以上方法对冻干品冻干保存0个月、18个月、20个月、36个月、39个月的各项性能指标进行评价，结果如下：
表7检测数据(常温0月)
试验组 线性区间r 准确度％ 重复性CV 灵敏度(pg/mL) 批间差CV
实施例1 0.9941 95.46 5.92 4.21 8.29
实施例2 0.9922 91.93 6.69 6.22 6.65
实施例3 0.9972 97.92 6.67 8.45 6.57
实施例4 0.9924 93.01 8.06 3.45 5.47
对比例1 0.9839 77.11 12.11 13.27 15.68
对比例2 0.9731 83.86 13.73 19.11 13.19
对比例3 0.9807 74.81 12.84 18.82 16.05
对比例4 0.9862 80.86 12.02 14.47 16.54
对比例5 0.9891 76.34 15.62 25.33 18.23
对比例6 0.9803 70.87 19.08 31.68 14.79
表8稳定性效果数据(4-8℃保存18个月)
试验组 线性区间r 准确度％ 重复性CV 灵敏度(pg/mL)
实施例1 0.9944 88.02 7.13 8.73
实施例2 0.9932 89.15 8.46 7.16
实施例3 0.9965 86.25 7.42 7.28
实施例4 0.9921 90.7 6.19 8.08
对比例1 0.9845 75.18 20.79 19.93
对比例2 0.9872 72.04 16.47 19.18
对比例3 0.9811 81.68 16.67 19.07
对比例4 0.9839 83.39 14.73 16.73
对比例5 0.9806 74.27 23.31 31.75
对比例6 0.9861 73.15 19.75 20.66
表9稳定性效果数据(4-8℃保存20个月)
试验组 线性区间r 准确度％ 重复性CV 灵敏度(pg/mL)
实施例1 0.9816 83.9 11.58 12.95
实施例2 0.9744 84.69 12.93 12.16
实施例3 0.9829 83.29 13.86 13.81
实施例4 0.9878 84.05 11.08 14.08
对比例1 0.9809 70.24 22.63 23.15
对比例2 0.9814 71.16 18.72 25.77
对比例3 0.9705 73.02 19.41 25.36
对比例4 0.9760 78.59 26.93 23.71
对比例5 0.9757 71.15 24.96 39.11
对比例6 0.9661 68.74 20.32 26.77
表10稳定性效果数据(-20℃保存36个月)
Figure BDA0003282421350000141
Figure BDA0003282421350000151
表11稳定性效果数据(-20℃保存39个月)
试验组 线性区间r 准确度％ 重复性CV 灵敏度(pg/mL)
实施例1 0.9858 85.32 13.35 13.23
实施例2 0.9743 79.99 12.78 14.55
实施例3 0.9813 81.76 18.88 16.84
实施例4 0.9871 78.36 16.66 13.67
对比例1 0.9716 72.67 23.19 27.57
对比例2 0.9745 75.38 25.72 29.85
对比例3 0.9704 67.69 26.42 32.64
对比例4 0.9856 68.27 27.95 39.21
对比例5 0.9812 64.11 33.52 46.96
对比例6 0.9802 65.17 29.63 33.77
由此可知，本发明提供的缓冲液及冻干方法能够有效保存GFAP，能够使胶质纤维酸性蛋白检测过程中的抗压冻干品复融后有效保存其活性，提高检测灵敏度。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种缓冲液在保存胶质纤维酸性蛋白中的应用，其特征在于，所述缓冲液由以下组分制成：4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2O、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖、水；
按照重量份数计：4-吗啉乙磺酸 5-30份、NaCl 8-12份、ZnCl2 0.01-0.5份、MgCl2·6H2O 0.1-15份、牛血清白蛋白 2-50份、酪蛋白 2-50份、甘氨酸 1-15份、聚乙二醇 0.2-25份、海藻糖 10-100份。
2.如权利要求1所述缓冲液的应用，其特征在于，按照重量份数计，所述缓冲液，包括以下组分：4-吗啉乙磺酸 10-20份、NaCl 9-10份、ZnCl2 0.01-0.1份、MgCl2·6H2O 0.1-5份、牛血清白蛋白 5-10份、酪蛋白 5-10份、甘氨酸 1-5份、聚乙二醇 0.2-5份、海藻糖 10-30份。
3.如权利要求1所述缓冲液的应用，其特征在于，所述缓冲液中还包括表面活性剂，所述表面活性剂为吐温20、吐温60或吐温80中的任一种或多种。
4.如权利要求3所述缓冲液的应用，其特征在于，所述表面活性剂为吐温20。
5.如权利要求1所述缓冲液的应用，其特征在于，所述缓冲液中，甘氨酸：聚乙二醇：海藻糖的质量比为1-10:0.2-10:10-50，所述缓冲液的pH值为5.8-7.5。
6.如权利要求3所述缓冲液的应用，其特征在于，所述的缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2O、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值并定容，过滤，即可。
7.如权利要求6所述缓冲液的应用，其特征在于，所述表面活性剂在缓冲液中的体积分数为0.02-1%；所述过滤使用0.2-0.5μm的滤膜进行。
8.如权利要求6所述缓冲液的应用，其特征在于，所述过滤使用0.2μm的滤膜进行。
9.一种胶质纤维酸性蛋白的冻干方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）预冷冻段：在常温下，将胶质纤维酸性蛋白放入缓冲液中，制成含有胶质纤维酸性蛋白的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；
（2）升华干燥段：将样品舱的真空度降至0-5pa；再温度升至-40℃，保温；再升温至-30℃，保温；再升温至-20℃，保温；再升温至-10℃，保温；再升温至-5℃，保温；
（3）解析干燥段：将样品舱真空度维持在0-5pa；设置温度终点25℃，从-5℃提升至25℃；在25℃持续保温；
所述缓冲液由以下组分制成：4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2O、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖、水；
按照重量份数计：4-吗啉乙磺酸 5-30份、NaCl 8-12份、ZnCl2 0.01-0.5份、MgCl2·6H2O 0.1-15份、牛血清白蛋白 2-50份、酪蛋白 2-50份、甘氨酸 1-15份、聚乙二醇 0.2-25份、海藻糖 10-100份。
10.如权利要求9所述胶质纤维酸性蛋白的冻干方法，其特征在于，
步骤（1），所述预冷冻段，常温降温至4℃过程中，降温速率为1-5℃/min，在4℃保温10-30min；4℃降温至-40℃过程中，降温速率为0.45-1℃/min，在-40℃保温20-40min；
-40℃温至-55℃过程中，降温速率为0.25-0.5℃/min，保温160-200min；
步骤（2），所述升华干燥段：-55℃升至-40℃过程中，升温速率为0.5-1℃/min，在-40℃保温20-40min；
-40℃升温至-30℃过程中，升温速率为0.2-0.5℃/min，-30℃保温40-60min；
-30℃升温至-20℃过程中，升温速率为0.25-0.5℃/min，-20℃保温40-60min；
-20℃升温至-10℃过程中，升温速率为0.15-0.25℃/min，-10℃保温100-150min；
-10℃升温至-5℃过程中，升温速率为0.05-0.1℃/min，-5℃保温100-150min；
步骤（3）中，所述解析干燥段：以5-10℃/h的升温速率将样本从-5℃提升至25℃；在25℃的持续保温时间为5-60分钟。
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