CN104530226A - 辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及诊断生物制品领域，尤其涉及辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂及其制备方法，主要由BSA、Tween-20、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、明胶、防腐剂等组成。本发明提供的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂，含有复合型保护剂BSA和明胶，两种保护剂相互补充，可有效防止酶标抗体活性降低。用该稀释保护剂对辣根过氧化物酶标记的抗体进行稀释后，稀释后的酶标抗体可在2～8℃保存12个月其免疫活性基本不发生改变，常温15～25℃保存1个月其免疫活性基本不发生改变。

Description

辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及诊断生物制品领域，尤其涉及辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂及其制备方法。
背景技术
辣根过氧化物酶是一种糖蛋白，因辣根中该酶的含量最高而得名，该酶具有比活性高、稳定、分子量小、纯酶容易制备等优点，因此被广泛地用于临床检验中，特别是以该酶为基础的免疫酶技术在免疫学检测方面应用更加广泛。在各种人类及动物疾病的体外快速诊断方法特别是ELISA商品化检测试剂盒中，酶标抗体特别是辣根过氧化物酶标抗体应用十分广泛。
酶标抗体一般只能将其原液在-20℃以及更低温度条件下贮藏时，且不能经过反复冻融，其免疫活性才能在贮藏一年时间内不会大量地降低，才能有效地保证诊断方法结果的可靠性。目前经过酶标抗体技术的不断发展，酶标免疫活性得到大大的提升，同时为了确保酶标免疫活性的稳定，市售的酶标抗体都是制备成高纯度的浓缩液或冻干粉。市售的酶标抗体在使用时均需进行几千倍的大体积稀释才能进行使用。但是如果将酶标抗体放置于4℃条件下或将酶标抗体进行大体积稀释后，在很短的时间内其免疫活性将迅速下降。对于ELISA商品化试剂盒而言，其关键技术之一是确保试剂盒内的酶标抗体的免疫活性不发生改变，这不仅要求将酶标抗体稀释几千倍制备成工作液，还需在2～8℃甚至在常温条件下进行保存及运输，一种可以有效保护工作浓度的酶标抗体在2～8℃或常温条件下长期保存时效价不会发生改变的稀释剂就显得尤为重要。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂，使得ELISA商品化试剂盒中工作浓度的辣根过氧化物酶标记抗体在2～8℃或常温条件下免疫活性不发生改变。
具体技术方案为，辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂，通过以下方法制得：
(1)每800ml去离子水中溶解8gNaCl、1.44gNa2HPO4、0.2gKCl、0.2gKH2PO4，充分溶解后，每份溶液加去离子水定容至1000ml，配制成PBS缓冲液；
(2)以1000ml的PBS缓冲液为一份，每份PBS缓冲液中加入0.5～5ml的Tween-20，混合均匀后置于121℃、1bar进行灭菌处理，制备得到灭菌PBST缓冲溶液；
(3))以1000ml的灭菌PBST缓冲溶液为一份，每份灭菌PBST缓冲溶液中加入5～50gBSA和1～10g的明胶，充分溶解；
(4)向步骤(3)制备的每份溶液中加入0.5～5ml的液体防腐剂，用0.22μm的滤膜进行过滤除菌，得到辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂。
本发明提供的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂，含有复合型保护剂BSA和明胶，两种保护剂相互补充，可有效防止酶标抗体活性降低。用该稀释保护剂对辣根过氧化物酶标记的抗体进行稀释后，稀释后的酶标抗体可在2～8℃保存12个月其免疫活性基本不发生改变，常温15～25℃保存1个月其免疫活性基本不发生改变。
具体实施方式
结合实施例说明本发明的具体实施方式。
实施例1
辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂，通过以下方法制得：
(1)800ml去离子水中溶解8gNaCl、1.44gNa2HPO4、0.2gKCl、0.2gKH2PO4，充分溶解后，每份溶液加去离子水定容至1000ml，配制成PBS缓冲液；
(2)1000ml的PBS缓冲液中加入3ml的Tween-20，混合均匀后置于121℃、15PSI进行灭菌处理，制备得到灭菌PBST缓冲溶液；
(3)1000ml的灭菌PBST缓冲溶液中加入30gBSA和5g的明胶，充分溶解；
(4)向步骤(3)制备的溶液中加入3ml的液体防腐剂，用0.22μm的滤膜进行过滤除菌，得到辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂。
实施例2
辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂，通过以下方法制得：
(1)800ml去离子水中溶解8gNaCl、1.44gNa2HPO4、0.2gKCl、0.2gKH2PO4，充分溶解后，每份溶液加去离子水定容至1000ml，配制成PBS缓冲液；
(2)1000ml的PBS缓冲液中加入0.5ml的Tween-20，混合均匀后置于121℃、15PSI进行灭菌处理，制备得到灭菌PBST缓冲溶液；
(3)1000ml的灭菌PBST缓冲溶液中加入5gBSA和10g的明胶，充分溶解；
(4)向步骤(3)制备的溶液中加入0.5ml的液体防腐剂，用0.22μm的滤膜进行过滤除菌，得到辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂。
实施例3
辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂，通过以下方法制得：
(1)800ml去离子水中溶解8gNaCl、1.44gNa2HPO4、0.2gKCl、0.2gKH2PO4，充分溶解后，每份溶液加去离子水定容至1000ml，配制成PBS缓冲液；
(2)1000ml的PBS缓冲液中加入5ml的Tween-20，混合均匀后置于121℃、1bar进行灭菌处理，制备得到灭菌PBST缓冲溶液；
(3)1000ml的灭菌PBST缓冲溶液中加入50gBSA和1g的明胶，充分溶解；
(4)向步骤(3)制备的溶液中加入5ml的液体防腐剂，用0.22μm的滤膜进行过滤除菌，得到辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂。
对实施例1所制得的辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂效果进行评估，以辣根过氧化物标记的羊抗猪IgG为例，采用抗原抗体直接反应法进行抗体稀释保护剂效果的评估。
(1)酶标抗体的稀释：用实施例制得辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG稀释至工作浓度；
(2)酶标抗体2～8℃保存：将稀释后的酶标抗体置于2～8℃进行保存，并分别于不同时间抽样进行检测；
(3)酶标抗体常温保存：将稀释后的酶标抗体置于常温15～25℃进行保存，并分别于不同时间抽样进行检测；
(4)酶标抗体物理性状检测：将稀释后的酶标抗体分别置于2～8℃及常温进行保存，并分别于不同时间抽样进行物理性状的检测，结果见表1及表2。
检测结果表明，稀释后的酶标抗体于2～8℃保存12个月，常温保存1个月，其物理性状均未发生改变。
表1稀释后的酶标抗体2～8℃保存后物理性状检测结果
表2稀释后的酶标抗体常温(15～25℃)保存后物理性状检测结果
(5)酶标抗体免疫活性检测：将稀释后的酶标抗体分别置于2～8℃以及常温15～25℃进行保存后，于不同时间抽样，按以下操作方式进行免疫活性的检测：
(a)猪IgG抗原的稀释：将从猪血清中分离纯化得到的IgG用抗原包被液稀释至适当的浓度；
(b)酶标板的包被：将稀释后的猪IgG抗原按100μl/孔的量加入至酶标板中，4℃包被过夜；
(c)酶标板的封闭：过夜包被的酶标板洗涤4次，每孔加入含1％BSA的PBST，37℃进行封闭；
(d)抗体检测：将不同条件及不同时间抽样的酶标羊抗猪IgG加入至酶标板中，置于37℃反应1小时；
(e)显色：弃酶标板内液体后洗涤4次，加入TMB底物显色液，37℃避光显色；
(f)终止及读数：加入终止液终止显色，并于酶标仪读取OD450nm值。
结果显示，将稀释后的辣根过氧化物标记的羊抗猪IgG置于2～8℃保存12个月后其生物活性未发生明显变化；将稀释后的酶标抗体置于常温15～25℃保存1个月后其生物活性未发生明显变化，结果见表3及表4。
结果表明酶标抗体稀释保护剂可使工作浓度的辣根过氧化物标记的羊抗猪IgG在2～8℃及常温长时间保存，且其生物活性基本不发生改变。
表3稀释后的酶标抗体置于2～8℃保存后生物活性检测结果
保存时间(月) 0 3 6 9 12
OD450nm值 1.856 1.849 1.834 1.812 1.797
表4稀释后的酶标抗体置于常温(15～25℃)保存后生物活性检测结果
保存时间(天) 0 7 14 21 30
OD450nm值 1.856 1.839 1.808 1.791 1.763

Claims (1)

1.辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂，通过以下方法制得：
(1)每800ml去离子水中溶解8gNaCl、1.44gNa2HPO4、0.2gKCl、0.2gKH2PO4，充分溶解后，每份溶液加去离子水定容至1000ml，配制成PBS缓冲液；
(2)以1000ml的PBS缓冲液为一份，每份PBS缓冲液中加入0.5～5ml的Tween-20，混合均匀后置于121℃、1bar进行灭菌处理，制备得到灭菌PBST缓冲溶液；
(3))以1000ml的灭菌PBST缓冲溶液为一份，每份灭菌PBST缓冲溶液中加入5～50gBSA和1～10g的明胶，充分溶解；
(4)向步骤(3)制备的每份溶液中加入0.5～5ml的液体防腐剂，用0.22μm的滤膜进行过滤除菌，得到辣根过氧化物酶标记抗体的稀释保护剂。
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