CN106243221A

CN106243221A - 一种卡那霉素抗体及其制备工艺

Info

Publication number: CN106243221A
Application number: CN201610707233.4A
Authority: CN
Inventors: 王作弟
Original assignee: SHAANXI SIER BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHAANXI SIER BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2016-08-23
Filing date: 2016-08-23
Publication date: 2016-12-21

Abstract

本发明公开了一种卡那霉素抗体及其制备工艺，按照重量份数由如下原料组成：硫酸卡那霉素58‑80份、牛血清白蛋白5‑25份、卵清白蛋白3‑5份、弗氏完全佐剂3‑5份、弗氏不完全佐剂3‑5份、碳二亚胺3‑5份、戊二醛1‑2份、羊抗鼠酶标二抗1‑3份、磷酸氢二钠2‑3份、醋酸钠8‑10份、十二烷基磺酸钠15‑20份、考马斯亮蓝R‑250 10‑15份、过氧化脲8‑12份、乙醇6‑11份、甲醛5‑7份、磷酸盐缓冲液1‑3份、洗涤液PBST 1‑3份、封闭液5%猪血清1‑3份，以硫酸卡那霉素和牛血清白蛋为主要原料，采用偶联方法制备出可以与酶标抗原竞争结合包被的抗体，整个反应过程具有简单、高效、经济、可操作性强等特点。

Description

一种卡那霉素抗体及其制备工艺

技术领域

本发明涉及卡那霉素抗体制备领域，具体涉及一种卡那霉素抗体及制备工艺。

背景技术

近年来，随着抗生素等兽药添加剂在农牧业领域里的应用不断扩张，抗生素污染问题、兽药残留问题已日益严重。抗生素等兽药半衰期长、自然条件下很难被分解，对环境危害巨大。如果不加控制的作为动物食品添加剂，抗生素在动物源性食品中会形成一定的残留，如果人类长期服用此类含有抗生素残留的食品，将对健康造成严重威胁。

细菌的耐药性指的是细菌与某种药物多次接触后，对该药物的敏感性下降甚至对其敏感性消失的现象。如果细菌长期接触这些残留的低浓度药物，就会使其产生一定的耐药性，而且细菌的耐药性可以通过动物群中的细菌、人群中的细菌与生态系统中的细菌互相传递，可能会达到无法操控的规模。细菌耐药性这一现象的危害不容忽视，它不仅能使得抗生素的疗效在一定程度上减弱或失效；更严峻的是，由于其疗效减弱，导致生产者增加投药剂量，势必造成药物残留量的增加，由此形成一个恶性循环，加重耐药菌的普遍化。由此将导致严峻的人类环境问题及公共卫生问题。

氨基糖苷类抗生素能有效抑制细菌生长，它主要作用于细菌体内的核糖体30s亚基发生集聚反应，从而抑制细菌体内蛋白质的合成、阻碍已合成蛋白的释放。具体过程为：氨基糖苷类抗生素通过细胞外膜的孔蛋白，然后经Ⅰ期转运系统摄入细胞内，此过程为能量依赖过程，受钙离子、镁离子等离子及高渗、低氧和酸碱性等因素的影响，可被此类因素阻断。当氨基糖苷类抗生素与细胞核糖体的30S亚基发生积聚时，可引起Ⅱ期转运系统参与，此过程可导致大量氨基糖苷类抗生素在细胞内迅速积聚，阻断正常的肽链延长过程，造成遗传密码mRNA的错误解读，从而阻碍正常蛋白质的合成。这些非正常蛋白质进入细菌细胞膜，可引起细胞膜断裂，致使胞内的核苷酸、钾离子、腺嘌呤等参与生命活动的重要物质外漏，从而直接导致细菌死亡。氨基糖苷类抗生素对革兰氏阴性细菌的抑制效果良好，但对革兰氏阳性细菌的抑制效果较差。

发明内容

针对以上问题，本发明提供了一种卡那霉素抗体及制备工艺，利用分子的官能团等功能基团，并添加一些偶联试剂，产生一定的化学反应从而实现半抗原与载体分子偶联，可以有效解决背景技术中的问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种卡那霉素抗体及制备工艺，按照重量份数由如下原料组成：

硫酸卡那霉素58-80份、牛血清白蛋白5-25份、卵清白蛋白3-5份、弗氏完全佐剂3-5份、弗氏不完全佐剂3-5份、碳二亚胺3-5份、戊二醛1-2份、羊抗鼠酶标二抗1-3份、磷酸氢二钠2-3份、醋酸钠8-10份、十二烷基磺酸钠15-20份、考马斯亮蓝R-250 10-15份、过氧化脲8-12份、乙醇6-11份、甲醛5-7份、硼氢化钠8-13份、甲醇1-3份、浓硫酸1-3份、磷酸盐缓冲液1-3份、包被用碳酸盐缓冲液CBS1-3份、洗涤液PBST 1-3份、封闭液5%猪血清1-3份，ELISA试验显色液1-3份、ELISA试验终止液1-3份。

根据上述技术方案，所述ELISA试验显色液必须现用现配，由两种试剂（试剂一、试剂二）等体积混合而成，试剂一：取150mL0.1mol的柠檬酸与850mL等摩尔浓度的醋酸钠混合，在此混合液中加入0.5g的过氧化脲，充分溶解后再在混合液中加入0.08g非那西汀，混匀，于4℃保存；准确称取1.27g四甲基联苯胺，加热搅拌使其充分溶于甲醇溶液中，再将混合液加入500mL甘油中，充分混合4℃保存备用。

根据上述技术方案，所述ELISA试验终止液配置：取约43mL浓硫酸，缓慢加入356.5mL去离子水中边加边搅拌，制成2mol/L的硫酸溶液，室温保存备用。

根据上述技术方案，所述封闭液5%猪血清在4℃条件下保存备用。

根据上述技术方案，所述乙醇的纯度为30%。

另外本发明还设计了一种卡那霉素抗体的制备工艺，包括如下步骤：

（1）准确称取牛血清白蛋白20mg，碳二亚胺55mg，使之充分溶解于2mL0.01M的PBS中，得到反应液为A液；

（2）按配方进行配料，准确称取卡那霉素标准品50mg，加入1.5mL0.01M的PBS中，边加边搅拌，使之充分溶解后所得溶液称为B液；

（3）将上述B液逐滴加入A液中（边加入边搅拌），密封，避光，在4℃下搅拌过夜；

（4）待上述反应完后，将反应液转移到处理好的透析袋中，在4℃环境下用0.01M的PBS透析3天。

根据上述技术方案，所述步骤（1）中，反应液在0.01M的PBS中在4℃环境下避光搅拌反应6h。

根据上述技术方案，所述步骤（4）中，反应液的透析分为恒温透析、换液透析和降温透析。

根据上述技术方案，所述恒温透析是将温度调至4℃，并保持恒定；所述换液透析是指透析液需要每间隔一定的时间进行换液，在透析第一天每3h换液一次，以后每8-10h换液一次；所述降温透析是指在透析完成后，将偶联产物分装于1.5ml离心管中，将温度降至-20℃保存备用。

本发明的有益效果：本发明以硫酸卡那霉素和牛血清白蛋为主要原料，加入一定量的碳二亚胺、醋酸钠、包被用碳酸盐缓冲液CBS，采用偶联方法制备出可以与酶标抗原竞争结合包被的抗体，整个反应过程具有简单、高效、经济、可操作性强等特点。

附图说明

图1为本发明抗卡那霉素多抗血清稀释倍数与ELISA测定多抗血清敏感性的关系图。

图2为本发明KAN标准品浓度与ELISA测定多抗血清敏感性关系图。

图3为本发明ELISA测定多抗血清敏感性的关系曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

一种卡那霉素抗体，按照重量份数由如下原料制备而成：

硫酸卡那霉素58份、牛血清白蛋白5份、卵清白蛋白3份、弗氏完全佐剂3份、弗氏不完全佐剂3份、碳二亚胺3份、戊二醛1份、羊抗鼠酶标二抗1份、磷酸氢二钠2份、醋酸钠8份、十二烷基磺酸钠15份、考马斯亮蓝R-250 10份、过氧化脲8份、乙醇6份、甲醛5份、硼氢化钠8份、甲醇1份、浓硫酸1份、磷酸盐缓冲液2份、包被用碳酸盐缓冲液CBS 1份、洗涤液PBST 1份、封闭液5%猪血清1份，ELISA试验显色液1份、ELISA试验终止液2份。

所述ELISA试验显色液选用0.25毫升；所述ELISA试验终止液选用0.5毫升；所述封闭液5%猪血清在4℃条件下保存备用；所述乙醇的纯度为30%。

其制备工艺，包括如下步骤：

（3）将上述B液逐滴加入A液中（边加入边搅拌），密封，避光，在4℃下搅拌过夜，反应液在0.01M的PBS中在4℃环境下避光搅拌反应6h；

（4）待上述反应完后，将反应液转移到处理好的透析袋中，在4℃环境下用0.01M的PBS透析3天；反应液的透析分为恒温透析、换液透析、和降温透析；所述恒温透析是将温度调至4℃，并保持恒定；所述换液透析是指透析液需要每间隔一定的时间进行换液，在透析第一天每3h换液一次，以后每8-10h换液一次；所述降温透析是指在透析完成后，将偶联产物分装于1.5ml离心管中，将温度降至-20℃保存备用。

实施例2：

一种卡那霉素抗体，按照重量份数由如下原料制备而成：

硫酸卡那霉素69份、牛血清白蛋白15份、卵清白蛋白4份、弗氏完全佐剂4份、弗氏不完全佐剂4份、碳二亚胺4份、戊二醛1.5份、羊抗鼠酶标二抗2份、磷酸氢二钠2.5份、醋酸钠9份、十二烷基磺酸钠17.5份、考马斯亮蓝R-250 12.5份、过氧化脲10份、乙醇8.5份、甲醛6份、硼氢化钠10.5份、甲醇2份、浓硫酸2份、磷酸盐缓冲液1份、包被用碳酸盐缓冲液CBS 1份、洗涤液PBST1份、封闭液5%猪血清1份，ELISA试验显色液1份、ELISA试验终止液1份。

其制备工艺，包括如下步骤：

实施例3：

一种卡那霉素抗体，按照重量份数由如下原料制备而成：

硫酸卡那霉素80份、牛血清白蛋白25份、卵清白蛋白5份、弗氏完全佐剂5份、弗氏不完全佐剂5份、碳二亚胺5份、戊二醛2份、羊抗鼠酶标二抗3份、磷酸氢二钠3份、醋酸钠10份、十二烷基磺酸钠20份、考马斯亮蓝R-250 15份、过氧化脲12份、乙醇11份、甲醛7份、硼氢化钠13份、甲醇3份、浓硫酸3份、磷酸盐缓冲液1份、包被用碳酸盐缓冲液CBS 1份、洗涤液PBST 1份、封闭液5%猪血清1份，ELISA试验显色液1份、ELISA试验终止液3份。

其制备工艺，包括如下步骤：

实施例4

通过以下测试方法研究了卡那霉素完全抗原的免疫学鉴定。

间接ELISA测定多抗血清效率（如图1和图2所示）

用pH9.6的碳酸盐缓冲液（CBS）将包被原KAN-GDA-OVA稀释至4μg/mL，以每孔50μL包被在96孔酶标板上，37℃孵育3h，弃去酶标板内包被液，用PBST洗涤5次；每孔加200μL5%的猪血清4℃封闭过夜，封闭完成后弃去酶标板内封闭液；将待测抗血清用PBS倍比稀释（稀释浓度为1：1600~1：102400），以每孔50μL分别加入酶标板；同时设置阴性对照（等量阴性血清）和空白对照（等量PBS）；37℃温育40min，洗涤；加入用封闭液稀释的羊抗鼠酶抗（1:1000倍稀释），每孔加入50μL，于37℃孵育30min，洗涤方法同上；每加入TMB底物显色液50μL，37℃显色1~2min；每孔加入50μL2mol/L的硫酸溶液终止反应。

用酶标仪记录450nm波长处的吸光值（OD₄₅₀）。以待测血清的OD₄₅₀大于或等于阴性对照OD₄₅₀的2.1倍时，所对应的血清稀释倍数为抗体效价，从图中可以看出人工偶联产物KAN-BSA、KAN-GDA-OVA的蛋白电泳条带分别与载体蛋白BSA、OVA的条带相比有一定的滞后现象，初步说明KAN半抗原小分子与载体蛋白偶联成功。

实施例5

间接竞争ELISA测定多抗血清敏感性（如图3所示）

步骤如下：

包被：用pH9.6的碳酸盐缓冲液（CBS）将包被原KAN-GDA-OVA稀释至4μg/mL，以每孔50μL包被在96孔酶标板上，37℃孵育3h，弃去酶标板内包被液，用PBST洗涤5次；

封闭：每孔加入200μL5%的猪血清于4℃封闭过夜，封闭完成后弃去酶标板内封闭液；

加标品：用0.01M的PBS稀释KAN标准品，将其浓度设定为0、30、60、125、250、500、1000ng／mL。每孔加入标准品溶液各50µL，设阴性对照（NC)和空白对照（BC），其中阴性对照不含标品；

加抗血清：选择用间接ELISA方法测定的抗体效价中OD₄₅₀值为1.0左右的孔所对应的抗体的稀释浓度配置抗卡那霉素多抗血清，每孔加入50µL，空白对照不加抗血清，于37℃温育30min；

加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗用PBST稀释（1:1000倍稀释），每孔加入50µL，37℃温育30min；

显色：将显色液A液和B液等体积充分混匀，每孔加入50µL，显色5min；每孔加50µL终止反应，用酶标仪读取450nm波长处的吸光值即OD₄₅₀，并记录结果以备分析。

根据实验结果计算出卡那霉素标准品对卡那霉素多抗血清效价的半数抑制浓度（IC₅₀），以IC₅₀衡量其敏感度，具体计算方法：用KAN标准品浓度的对数值作为横坐标，用B/B0的值为纵坐标（B为不同浓度的KAN标准品OD₄₅₀的值，B0为不添加KAN标准品时OD₄₅₀的值，即NC对照的OD₄₅₀值），用EXCEL绘制卡那霉素标品对多抗血清的抑制曲线，根据所绘制的曲线生成回归方程，并计算IC₅₀。

由实验结果可知，免疫的3只小鼠多抗血清的效价均达到了1：2.56×10⁴以上，从而说明本实验制备的卡那霉素人工抗原KAN-BSA具有良好的免疫原性。

基于上述，本发明的优点在于，本发明以硫酸卡那霉素和牛血清白蛋为主要原料，加入一定量的碳二亚胺、醋酸钠、包被用碳酸盐缓冲液CBS，采用偶联方法制备出可以与酶标抗原竞争结合包被的抗体，整个反应过程具有简单、高效、经济、可操作性强等特点，该工艺生产效率得到大大的提高，所得的抗体的效价及敏感性均良好，生产工艺操作方便，成本较低。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种卡那霉素抗体，其特征在于，按照重量份数计由如下原料制备而成：

硫酸卡那霉素58-80份、牛血清白蛋白5-25份、卵清白蛋白3-5份、弗氏完全佐剂3-5份、弗氏不完全佐剂3-5份、碳二亚胺3-5份、戊二醛1-2份、羊抗鼠酶标二抗1-3份、磷酸氢二钠2-3份、醋酸钠8-10份、十二烷基磺酸钠15-20份、考马斯亮蓝R-250 10-15份、过氧化脲8-12份、乙醇6-11份、甲醛5-7份、硼氢化钠8-13份、甲醇1-3份、浓硫酸1-3份、磷酸盐缓冲液1-3份、包被用碳酸盐缓冲液CBS 1-3份、洗涤液PBST 1-3份、封闭液5%猪血清1-3份，ELISA试验显色液1-3份、ELISA试验终止液1-3份。

2.根据权利要求1所述的一种卡那霉素抗体，其特征在于，所述ELISA试验显色液必须现用现配，由试剂一、试剂二等体积混合而成；

试剂一：取150mL0.1mol的柠檬酸与850mL等摩尔浓度的醋酸钠混合，在此混合液中加入0.5g的过氧化脲，充分溶解后再在混合液中加入0.08g非那西汀，混匀，于4℃保存；

试剂二：准确称取1.27g四甲基联苯胺，加热搅拌使其充分溶于甲醇溶液中，再将混合液加入500mL甘油中，充分混合4℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种卡那霉素抗体，其特征在于，所述ELISA试验终止液的配置：取约43mL浓硫酸，缓慢加入356.5mL去离子水中边加边搅拌，制成2mol/L的硫酸溶液，室温保存备用。

4.根据权利要求1所述的一种卡那霉素抗体，其特征在于，所述封闭液5%猪血清在4℃条件下保存备用。

5.根据权利要求1所述的一种卡那霉素抗体，其特征在于，所述乙醇的纯度为30%。

6.一种卡那霉素抗体的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的一种卡那霉素抗体的制备工艺，其特征在于，所述步骤（1）中，反应液在0.01M的PBS中在4℃环境下避光搅拌反应6h。

8.根据权利要求6所述的一种卡那霉素抗体的制备工艺，其特征在于，所述步骤（4）中，反应液的透析分为恒温透析、换液透析和降温透析。

9.根据权利要求6所述的一种卡那霉素抗体的制备工艺，其特征在于，所述恒温透析是将温度调至4℃，并保持恒定；所述换液透析是指透析液需要每间隔一定的时间进行换液，在透析第一天每3h换液一次，以后每8-10h换液一次；所述降温透析是指在透析完成后，将偶联产物分装于1.5ml离心管中，将温度降至-20℃保存备用。