CN115166244A - 一种缓冲液在pgp 9.5检测试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种缓冲液在脑特异性蛋白产物9.5(PGP 9.5)检测试剂盒中的应用,属于生物检测技术领域。Tris、NaCl、牛血清白蛋白、牛IgG、猪血清、氯化镁溶液、氯化锌溶液、甘油、甘氨酸等成分,将其应用于脑特异性蛋白产物9.5(PGP 9.5)检测试剂盒中,可快速、简便地检测人外周血中PGP 9.5的含量,从而为颅脑创伤伤情判断、预后预测和监测干预措施疗效提供重要依据,具有巨大的临床意义和战略意义。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种缓冲液在脑特异性蛋白产物9.5(PGP 9.5)检测试剂盒中的应用。
背景技术
颅脑创伤(TBI)是由外力引起的大脑损伤,会破坏大脑正常功能,导致人的认知能力或身体机能受损。颅脑创伤所导致的最常见的后遗症为头痛(47.9%)和记忆异常(42%),此外,约三成的颅脑创伤患者需要心理辅导或神经病学治疗。TBI由于其发病率较高,病情变化较快,是神经外科中最常见疾病,也是主要的死亡原因及致残因素之一,其后遗症对患者健康有永久性影响。目前,CT是广泛用于帮助临床评估TBI的唯一客观、简单且可靠的选择。然而,CT结果的正确性与CT设备的准确性及医师的阅片水平直接相关,和其他检测方法相比,是一种相对主观的判断方法。约90%轻度TBI(有时被称为“脑震荡”)的CT扫描结果呈阴性(Toth,2015),且这些TBI患者中只有不到1%的人需进行神经外科干预(PapaL,2012)。鉴于CT检测TBI阳性率较低且不必要影像学检测可能会增加辐射诱发癌变的风险,寻找开发其他的脑损伤诊断方法来准确判断颅脑损伤程度和评估预后,具有巨大的临床意义和战略意义。
颅脑创伤对脑部造成损伤的病理生理学基础为细胞和脑组织缺血缺氧、脑水肿、炎症、神经递质失调和生理性屏障受损等一系列复杂生理生化级联反应引起的神经细胞(包括神经胶质细胞和神经元)变性死亡。生物标志物则是颅脑创伤中由于神经细胞结构破坏、细胞损伤坏死使得一些细胞成分和生化产物直接释放入细胞外液和脑脊液中,并通过损伤的血脑屏障或其他可能途径进入外周血而可被直接检测到的脑特异性蛋白质。通过检测体液中的脑特异性蛋白质浓度,将可准确知晓脑组织损伤和脑保护情况,从而为颅脑创伤伤情判断、预后预测和监测干预措施疗效提供重要依据。
UCH-L1又称蛋白基因产物9.5(PGP 9.5),是一类由223个氨基酸组成的半胱氨酸水解酶,分子量约24KD,是泛素蛋白酶体系统中一种重要的去泛素化酶,可以将泛素从泛素前体蛋白移除。UCH-L1在神经系统中分布广泛,在大脑中的表达量远高于其他组织,其占脑组织总蛋白量的1-5%,尤其在神经元胞体和树突中均有分布,以维持神经元的正常突触结构和功能。当颅脑创伤时,由于神经元发生变性、崩解,该酶进入脑脊液和血液,因而其含量的高低可反映中枢神经系统受损的程度。目前,已有许多研究证明颅脑创伤动物模型和患者的血清UCH-L1浓度明显升高,并与脑损伤的严重程度相关。如专利CN201880020489.5公开了一种使用早期生物标记物泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)帮助诊断和评价已遭受或可能已遭受对头部的损伤、诸如轻度或中度至重度创伤性脑损伤(TBI)的人类受试者的方法。专利CN201710396942.X则公开了一种用于轻中度脑损伤的快速诊断试剂及含有该试剂的试剂盒及该试剂盒的制备和检测方法,该试剂和试剂盒包括S100、GFAP、UCHL1分别制得的单克隆捕获抗体;所述试剂盒还包括检测抗体S100、GFAP、UCHL1分别制得的多克隆抗体。
为了能够快速、简便地检测人外周血中PGP 9.5的含量,通过对缓冲液的不段优化,提供了一种操作简便、能为创伤性脑损伤提供辅助诊断的体外诊断试剂盒及其制备方法和应用。
发明内容
针对上述不足,本发明提供了一种缓冲液在脑特异性蛋白产物9.5(PGP 9.5)检测试剂盒中的应用。本发明所述的缓冲液包括Tris、NaCl、牛血清白蛋白、牛IgG、猪血清、氯化镁溶液、氯化锌溶液、甘油、甘氨酸等成分,将其应用于脑特异性蛋白产物9.5(PGP 9.5)检测试剂盒中,可快速、简便地检测人外周血中PGP 9.5的含量,从而为颅脑创伤伤情判断、预后预测和监测干预措施疗效提供重要依据,具有巨大的临床意义和战略意义。
为了实现上述发明目的,本发明的技术方案如下:
一方面,本发明提供了一种缓冲液,所述的缓冲液包括Tris(三羟甲基氨基甲烷)、NaCl、牛血清白蛋白、牛IgG、猪血清、1M氯化镁溶液、0.1M氯化锌溶液、甘油、甘氨酸。
具体地,所述的缓冲液包括Tris12.0-15.0g,NaCl9.0g,牛血清白蛋白1.0-50g、牛IgG5.0-20g、猪血清30-120g、1M氯化镁溶液0.5-5mL、0.1M氯化锌溶液0.5-5mL、甘油5.0-20.0g、甘氨酸5.0-40g。
进一步具体地,所述的缓冲液包括Tris 13.5g,NaCl9.0g,牛血清白蛋白30g、牛IgG15g、猪血清60g、1M氯化镁溶液3mL、0.1M氯化锌溶液3mL、甘油15g、甘氨酸20g。
具体地,所述的牛血清白蛋白、牛IgG、猪血清的重量比为1-50:5-20:30-120。
具体地,所述的牛血清白蛋白、牛IgG、猪血清的重量比为3:1:4。
另一方面,本发明提供了上述缓冲液在制备脑特异性蛋白产物9.5(PGP 9.5)检测试剂盒中的应用。
又一方面,本发明提供了一种PGP 9.5检测试剂盒,所述的试剂盒包括试剂A、试剂B、校准品、质控品,所述的试剂A为使用上述缓冲液与酶标记PGP9.5抗体偶联物混合均匀配制而成。
具体地,所述的试剂B为使用缓冲液9与PGP9.5抗体磁微粒偶联物混合均匀配制而成。
进一步具体的,所述的缓冲液9包括十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖、纤维素盐或纤维素衍生物、明胶。
具体地,所述的校准品和质控品的制备方法均为:使用缓冲液7与PGP9.5重组蛋白混合均匀配制而成。
进一步具体地,所述的缓冲液7包括三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、氯化钠、蔗糖。
进一步具体地,所述酶标记PGP9.5抗体偶联物的制备方法包括以下步骤:
(1)抗体1活化:按2-IT(2-亚氨基硫烷盐酸盐)与抗体摩尔比15:1-30:1的比例(即:1mg抗体加入10-20μL 2IT溶液)将2-IT溶液加入抗体溶液中进行活化;
(2)碱性磷酸酶(ALP)的活化:按SMCC与ALP摩尔比15:1-60:1的比例(即:1mg ALP加入8.5-34.5μL SMCC溶液)在ALP溶液中加入SMCC溶液进行活化;
(3)抗体和ALP的连接:按抗体与ALP质量比1:2-1:1的比例在抗体溶液中的加入ALP溶液(即:1.0mg抗体加入1.0-2.0mg ALP)进行连接;
(4)抗体偶联物的终止和纯化:按照1mg抗体加入10μL 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液的比例在上述抗体和ALP的连接产物中加入马来酰亚胺溶液,再按照1mg抗体加入10-50μL100mM乙醇胺溶液的比例加入乙醇胺溶液,混合均匀后,纯化制备得到酶标记PGP9.5抗体偶联物。
进一步具体地,所述的PGP9.5抗体磁微粒偶联物制备方法包括以下步骤:
(1)按磁微粒与抗体质量比100:1-100:10的比例在磁微粒溶液中加入抗体,按缓冲液4与磁微粒体积质量比100:1-100:10的比例在上述混合物中加入缓冲液4,混合均匀;
(2)按缓冲液5与磁微粒体积质量比100:1-100:10的比例在上述混合物中加入缓冲液5,混合均匀;
(3)用缓冲液6清洗磁微粒偶联物并重悬;
(4)用缓冲液8清洗清洗磁微粒偶联物并重悬,制备得到抗体磁微粒偶联物。
进一步具体地,所述的缓冲液4包括十水合四硼酸钠。
进一步具体地,所述的缓冲液5包括磷酸氢二钾。
进一步具体地,所述的缓冲液6包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、牛血清白蛋白、吐温20。
进一步具体地,所述的缓冲液8包括Tris(三羟甲基氨基甲烷)、NaCl、牛血清白蛋白、牛IgG、猪血清、1M氯化镁溶液、0.1M氯化锌溶液、甘油、甘氨酸。
在某些实施例中,本发明中涉及的缓冲液的配方以及制备方法具体如下所示:
(1)缓冲液1
称取14.8-15.1g的乙醇胺、5.8-6.0g的NaCl加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试pH值在7.3-7.6之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
(2)缓冲液2
称取75g的甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
(3)缓冲液3(六水合氯化镁溶液)
称取203.3g的MgCl2·6H2O加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
(4)缓冲液4
称取7.0-10.0g的Na2B4O7·10H2O(十水合四硼酸钠)加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试PH值在9.0-11.0之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
(5)缓冲液5
称取470-530g的K2HPO4加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试PH值在9.0-11.0之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
(6)缓冲液6
称取7.5-8.0g的Tris、9.0g的NaCl、3.0-10.0g的牛血清白蛋白加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,量取5-20mL吐温20加入上述溶液中,调试PH值在7.3-7.8之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
(7)缓冲液7
称取12.0-15.0g的Tris、20.0-60g的牛血清白蛋白、2.0-10.0gNaCl、10.0-100g蔗糖加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试PH值在7.5-10.0之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
(8)缓冲液8
称取12.0-15.0g的Tris、9.0g的NaCl、1.0-50g的牛血清白蛋白、5.0-20g牛IgG、30-120g猪血清、1M氯化镁溶液0.5-5mL、0.1M氯化锌溶液0.5-5mL、5.0-20.0g甘油、5.0-40g甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试PH值在7.5-8.7之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
(9)缓冲液9
称取5.6-5.9g的Na2HPO4·12H2O、0.55-0.60g的NaH2PO4、9.0g的NaCl、1.0-50g的牛血清白蛋白、80.0-140g蔗糖、1.0-5.0g纤维素盐或纤维素衍生物、5.0-50g明胶加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试PH值在6.2-8.0之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
在一些具体的实施方式中,所述酶标记PGP9.5抗体偶联物的制备方法包括以下步骤:
(1)抗体的活化:
称取4-8mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(2IT),用缓冲液1溶解至13.76mg/mL。按2IT与抗体摩尔比15:1-30:1的比例(即:1mg抗体加入10-20μL 2IT溶液)将2IT溶液加入抗体溶液中进行活化。震荡混匀后在室温下反应30分钟。终止活化,按1mg抗体加入5-20μL缓冲液2的比例,将缓冲液2加入抗体溶液中,室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的2IT,收集活化后的抗体。
(2)碱性磷酸酶(ALP)的活化:
称取2-4mg(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC),用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/mL。按SMCC与ALP摩尔比15:1-60:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液(即:1mg ALP加入8.5-34.5μL SMCC溶液)。震荡混匀后,室温下反应30分钟。终止活化,按1mg ALP加入10-50μL缓冲液2的比例,将缓冲液2加入ALP溶液中,室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC,收集活化后的ALP。
(3)抗体和ALP的连接:
按抗体与ALP质量比1:2-1:1的比例在抗体溶液中加入ALP溶液(即:1.0mg抗体加入1.0-2.0mg ALP)。震荡混匀后,将混合物在2-8℃环境中反应12-18小时。
(4)抗体偶联物的终止和纯化:
称取1-10mg马来酰亚胺,用DMF溶解至9.7mg/mL。按1/10比例,用缓冲液1稀释,得到0.97mg/mL马来酰亚胺溶液。按1mg抗体加入10μL 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液比例加入该溶液,在室温下反应15分钟。准确量取6μL乙醇胺,用缓冲液1溶解至100mM。即在6μL乙醇胺加入994μL缓冲液1。按1mg抗体加入10-50μL100mM乙醇胺溶液的比例加入该溶液,震荡混匀。使用超滤浓缩管将待纯化的抗体偶联物浓缩至0.5-2mg/mL。使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化,洗脱液为缓冲液2。纯化后的液体为酶标抗体偶联物。
在一些具体的实施方式中,所述抗体偶联磁微粒的制备方法包括以下步骤:
(1)将磁微粒用缓冲液4清洗后,重悬至5mg/mL。按磁微粒与抗体质量比100:1-100:10的比例在磁微粒溶液中加入抗体,按缓冲液4与磁微粒体积质量比100:1-100:10的比例在上述混合物中加入缓冲液4,室温反应10min。
(2)按缓冲液5与磁微粒体积质量比100:1-100:10的比例在上述混合物中加入缓冲液5,在37℃环境中反应16-24小时。
(3)用缓冲液6清洗磁微粒偶联物,重悬至5mg/mL。在37℃环境中反应16-24小时。
(4)用缓冲液8清洗清洗磁微粒偶联物,重悬至10mg/mL。制成物为抗体磁微粒偶联物。
与现有技术相比,本发明的积极和有益效果在于:
1、本发明使用免疫学检测手段对创伤性脑损伤进行血液检测,与影像学检测手段(主要为CT)相比,本专利更能客观的反映样本的真实情况,减少了因主观判断造成的误判和漏判。
2、本发明使用的磁微粒化学发光法可以使检测灵敏度达到皮克级别(10-12g/mL),而CT依赖像素达到更高的分辨率。由于本发明是对脑损伤特异性标志物进行检测,检测窗口比CT提前很多。在CT阴性的情况下,即可对正常人和轻度TBI患者进行有效区分。
3、本发明使用全自动仪器进行检测,只需加入血清样本,30分钟即可得到准确结果。而CT检测时间较长,一般需要等待4小时才可能取得检测结果。
4、本发明使用浓度数值进行判断,取得结果即可得知患者是否患病,客观性较强。而CT检测需要医师进行阅片,依医师的业务水平,主观判断性较强,容易造成漏判、误判。
附图说明
图1为本发明反应流程图。
图2为本发明工艺流程图。
图3为检测试剂条示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,对本发明作进一步详细的阐述,下述实施例不用于限制本发明,仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
值得说明的是,本发明中使用的原料均为普通市售产品,因此对其来源不做具体限定。
1检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心法测定PGP9.5的含量。样本中PGP9.5和试剂A中的抗体及试剂B中的PGP9.5抗体结合,形成“三明治”夹心结构。经洗涤,发光底物被复合物中的酶催化裂解,形成不稳定的激发态中间体,当激发态中间体回到基态时便发出光子。产生的光子数与样本中PGP9.5的浓度成正相关。
2组分
2.1试剂盒组分
PGP9.5试剂盒由检测试剂条、校准品、质控品、二维码组成。其中检测试剂条由一系列溶液和附件组成一个整体,可以独立检测一个样本。校准品由含有两个浓度的PGP9.5抗原和缓冲液配制而成,用于校准标准曲线;质控品由含有两个浓度的PGP9.5抗原和缓冲液配制而成;二维码中录入了当批次的标准曲线。具体如下表1所示。
表1.试剂盒主要组分
试剂盒主要组分 | 装量 |
检测试剂条 | 10条 |
质控品 | 200μL×1 |
校准品1 | 200μL×1 |
校准品2 | 200μL×1 |
盒签二维码 | 1个 |
检测试剂条由试剂A、试剂B、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套、吸头组成。试剂A为含一定浓度碱性磷酸酶标记的PGP9.5抗体溶液;试剂B为含一定浓度磁微粒标记的PGP9.5抗体溶液;清洗液用于反应过程的清洗;发光底物为ALP催化的发光底物;测读孔用于最终的检测读值。具体如下表2所示。检测试剂条示意图如图3所示。
表2
位置 | 检测试剂条组分 | 装量/数量 |
1 | 【无】样本孔位 | / |
2 | 吸头 | 1个 |
3 | 洗脱套 | 1个 |
4 | 清洗液 | 2.0mL |
5 | 发光底物 | 180μL |
6 | 试剂B | 60μL |
7 | 【无】 | / |
8 | 试剂A | 80μL |
9 | 【无】 | / |
10 | 【无】 | / |
11 | 【无】反应孔位 | / |
12 | 【无】清洗孔位 | / |
13 | 【无】清洗孔位 | / |
14 | 【无】清洗孔位 | / |
15 | 测读孔 | 1个 |
3.生产工艺
3.1校准品、质控品的生产
将PGP9.5重组蛋白作为校准品的原料。以缓冲液7将其溶解,充分混合后配制成2个校准品,浓度为160pg/mL、1280pg/mL。
将PGP9.5重组蛋白作为质控品的原料。以缓冲液7将其溶解,充分混合配制成质控品。浓度为320pg/mL。
3.2试剂A的生产
将酶标记PGP9.5抗体偶联物作为试剂A的原料。以缓冲液8将其充分混匀配制成试剂A。
3.3试剂B的生产
将PGP9.5抗体磁微粒偶联物作为试剂B的原料。以缓冲液9将其充分混匀配制成试剂B。
4.应用实施例及对比例
实施例1
一种试剂盒,包括检测试剂条、校准品、质控品、二维码。所述的检测试剂条由试剂A、试剂B、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套、吸头组成。所述的试剂A使用本发明所述的缓冲液(即缓冲液8)与酶标记PGP9.5抗体偶联物混匀配制而成。所述的试剂B为使用缓冲液9与PGP9.5抗体磁微粒偶联物混合均匀配制而成。
所述酶标记PGP9.5抗体偶联物的制备方法包括以下步骤:
(1)抗体的活化:
称取6mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(2IT),用缓冲液1溶解至13.76mg/mL。按2IT与抗体摩尔比15的比例(即:1mg抗体加入10 2IT溶液)将2IT溶液加入抗体溶液中进行活化。震荡混匀后在室温下反应30分钟。终止活化,按1mg抗体加入10μL缓冲液2的比例,将缓冲液2加入抗体溶液中,室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的2IT,收集活化后的抗体。
(2)碱性磷酸酶(ALP)的活化:
称取3mg(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC),用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/mL。按SMCC与ALP摩尔比15:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液(即:1mg ALP加入8.5μL SMCC溶液)。震荡混匀后,室温下反应30分钟。终止活化,按1mg ALP加入30μL缓冲液2的比例,将缓冲液2加入ALP溶液中,室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC,收集活化后的ALP。
(3)抗体和ALP的连接:
按抗体与ALP质量比1:1.5的比例在抗体溶液中加入ALP溶液(即:1.0mg抗体加入1.5mg ALP)。震荡混匀后,将混合物在2-8℃环境中反应15小时。
(4)抗体偶联物的终止和纯化:
称取10mg马来酰亚胺,用DMF溶解至9.7mg/mL。按1/10比例,用缓冲液1稀释,得到0.97mg/mL马来酰亚胺溶液。按1mg抗体加入10μL 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液比例加入该溶液,在室温下反应15分钟。准确量取6μL乙醇胺,用缓冲液1溶解至100mM。即在6μL乙醇胺加入994μL缓冲液1。按1mg抗体加入30μL 100mM乙醇胺溶液的比例加入该溶液,震荡混匀。使用超滤浓缩管将待纯化的抗体偶联物浓缩至1mg/mL。使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化,洗脱液为缓冲液2。纯化后的液体为酶标抗体偶联物。
所述抗体偶联磁微粒的制备方法包括以下步骤:
(1)将磁微粒用缓冲液4清洗后,重悬至5mg/mL。按磁微粒与抗体质量比100:5的比例在磁微粒溶液中加入抗体,按缓冲液4与磁微粒体积质量比100:5的比例在上述混合物中加入缓冲液4,室温反应10min。
(2)按缓冲液5与磁微粒体积质量比100:5的比例在上述混合物中加入缓冲液5,在37℃环境中反应20小时。
(3)用缓冲液6清洗磁微粒偶联物,重悬至5mg/mL。在37℃环境中反应20小时。
(4)用缓冲液8清洗清洗磁微粒偶联物,重悬至10mg/mL。制成物为抗体磁微粒偶联物。
缓冲液的配方以及制备方法具体如下所示:
(1)缓冲液1
称取15.0g的乙醇胺、5.8g的NaCl加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试pH值在7.3-7.6之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
(2)缓冲液2
称取75g的甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
(3)缓冲液3(六水合氯化镁溶液)
称取203.3g的MgCl2·6H2O加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
(4)缓冲液4
称取8.0g的Na2B4O7·10H2O(十水合四硼酸钠)加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试PH值在9.0-11.0之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
(5)缓冲液5
称取500g的K2HPO4加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试PH值在9.0-11.0之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
(6)缓冲液6
称取8.0g的Tris、9.0g的NaCl、7.0g的牛血清白蛋白加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,量取15mL吐温20加入上述溶液中,调试PH值在7.3-7.8之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
(7)缓冲液7
称取13.0g的Tris、40.0g的牛血清白蛋白、6.0gNaCl、50.0g蔗糖加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试PH值在7.5-10.0之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
(8)缓冲液8
称取13.5g的Tris、9.0g的NaCl、30g的牛血清白蛋白、15g牛IgG、60g猪血清、1M氯化镁溶液3mL、0.1M氯化锌溶液3mL、15g甘油、20g甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试PH值在7.5-8.7之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
(9)缓冲液9
称取5.8g的Na2HPO4·12H2O、0.55g的NaH2PO4、9.0g的NaCl、20g的牛血清白蛋白、110g蔗糖、3.0g纤维素盐或纤维素衍生物、30g明胶加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试PH值在6.2-8.0之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
实施例2
与实施例1的区别仅在于,缓冲液8具体为:Tris 12.0g,NaCl 9.0g,牛血清白蛋白50g、牛IgG 5.0g、猪血清30g、1M氯化镁溶液0.5mL、0.1M氯化锌溶液0.5mL、甘油20.0g、甘氨酸5.0g。
制备方法同实施例1。
实施例3
与实施例1的区别仅在于,缓冲液8具体为:Tris 15.0g,NaCl 9.0g,牛血清白蛋白1.5g、牛IgG 20g、猪血清120g、1M氯化镁溶液5mL、0.1M氯化锌溶液5mL、甘油5.0g、甘氨酸40g。
制备方法同实施例1。
对比例1
与实施例1的区别仅在于,缓冲液8具体为:所述的缓冲液包括Tris 13.5g,NaCl9.0g,牛血清白蛋白105g、1M氯化镁溶液3mL、0.1M氯化锌溶液3mL、甘油15g、甘氨酸20g。
5.检测方法
采用北京美联泰科生物技术有限公司自研的全自动酶联免疫分析仪进行检测。反应所需样本量为30μL,自动检验流程为:
(1)免疫反应:将30μL样本、50μL试剂B、50μL试剂A依次加入11号孔位,在37℃条件下反应40min。
(2)磁分离及清洗:在12号孔位加入300μL清洗液,将含磁微粒的混合物用磁力吸出11号孔位,在12号孔位脱磁。清洗2min后。在13、14号孔位分别进行1次磁分离及清洗。
(3)读值:在15号孔位加入150μL发光底物,将含磁微粒的混合物用磁力吸出14号孔位,在15号孔位脱磁.。碱性磷酸酶催化的发光底物发光后用自研仪器检测相对发光强度(RLU)。
(4)根据检测的校准品数值可获得一条PGP9.5浓度-发光值标准曲线。该曲线使用四参数Logistic方程拟合。
(5)样本的检测值可以和这条曲线上获得唯一的浓度值对应,从而实现对未知样本的浓度检测。
5.检测指标
5.1准确度
将浓度约为3000pg/mL(允许偏差±10%)的脑特异性蛋白产物(PGP9.5)液(A)加入到浓度范围0pg/mL-80pg/mL的样本B中,所加入PGP9.5抗原与样本B之间的体积比例为1:9,根据公式(1)计算回收率R,其回收率应在85%-115%范围内。
式中:
R为回收率;
V为样品A液的体积;
V0为血清样品B液的体积;
C为血清样品B液加入A液后的3次测量平均值;
C0为血清样品B液的3次测量平均值;
CS为样品A液的浓度。
5.2空白限
5.3线性区间
将接近线性区间上限的高值样本与接近线性区间下限的低值样本或零浓度样本混合成不少于5个稀释浓度,其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。对每一浓度的样本各重复测试3次得到发光值,记录各样品的测量结果,并计算各样品3次测量值的平均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量,以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(2)计算线性回归的相关系数(r),在80-2560pg/mL的线性区间内,相关系数r应≥0.990。
式中:
r为相关系数;
xi为稀释比例;
yi为各个样本测定结果均值;
5.4重复性
式中:s为样本测试值的标准差;
5.5批间差
5.6校准品和质控品瓶间差
检测同一批号10瓶校准品(或质控品)各1次,按公式(5)计算,测定结果的均值与标准差(S1)。另取上述10瓶校准品(或质控品)中的1瓶连续测定10次,计算结果的均值和标准差(S2),按照公式(6)、(7)计算瓶间重复性CV%,测量结果CV应<10%。
(说明:当S1<S2时,令CV瓶间=0)
式中:S为标准差。
检测结果:
(1)准确度
表3
实例 | 回收率% |
实施例1 | 99.24 |
实施例2 | 108.57 |
实施例3 | 105.33 |
对比例1 | 71.04 |
(2)空白限
表4
(3)线性区间
表5
实例 | 相关系数r |
实施例1 | 0.9993 |
实施例2 | 0.9975 |
实施例3 | 0.9961 |
对比例1 | 0.9301 |
(4)重复性
表6
(5)批间差
表7
(6)瓶间差
表8
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种缓冲液,其特征在于:所述的缓冲液包括Tris、NaCl、牛血清白蛋白、牛IgG、猪血清、1M氯化镁溶液、0.1M氯化锌溶液、甘油、甘氨酸。
2.根据权利要求1所述的缓冲液,其特征在于:所述的缓冲液包括Tris 12.0-15.0g,NaCl 9.0g,牛血清白蛋白1.0-50g、牛IgG 5.0-20g、猪血清30-120g、1M氯化镁溶液0.5-5mL、0.1M氯化锌溶液0.5-5mL、甘油5.0-20.0g、甘氨酸5.0-40g。
3.根据权利要求2所述的缓冲液,其特征在于:所述的缓冲液包括Tris 13.5g,NaCl9.0g,牛血清白蛋白30g、牛IgG 15g、猪血清60g、1M氯化镁溶液3mL、0.1M氯化锌溶液3mL、甘油15g、甘氨酸20g。
4.根据权利要求1所述的缓冲液,其特征在于:所述的牛血清白蛋白、牛IgG、猪血清的重量比为1-50:5-20:30-120。
5.根据权利要求4所述的缓冲液,其特征在于:所述的牛血清白蛋白、牛IgG、猪血清的重量比为3:1:4。
6.权利要求1-5任一项所述的缓冲液在制备PGP 9.5检测试剂盒中的应用。
7.一种PGP 9.5检测试剂盒,其特征在于:所述的试剂盒包括试剂A、试剂B、校准品、质控品;所述的试剂A为使用权利要求1-5任一项所述的缓冲液与酶标记PGP9.5抗体偶联物混合均匀配制而成。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于:所述的酶标记PGP9.5抗体偶联物的制备方法包括以下步骤:
(1)抗体1活化:按2-IT与抗体摩尔比15:1-30:1的比例将2-IT溶液加入抗体溶液中进行活化;
(2)碱性磷酸酶ALP的活化:按SMCC与ALP摩尔比15:1-60:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液进行活化;
(3)抗体和ALP的连接:按抗体与ALP质量比1:2-1:1的比例在抗体溶液中的加入ALP溶液进行连接;
(4)抗体偶联物的终止和纯化:按照1mg抗体加入10μL 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液的比例在步骤(3)制备的连接产物中加入马来酰亚胺溶液,再按照1mg抗体加入10-50μL 100mM乙醇胺溶液的比例加入乙醇胺溶液,混合均匀后,纯化制备得到酶标记PGP9.5抗体偶联物。
9.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于:所述的试剂B为使用缓冲液9与PGP9.5抗体磁微粒偶联物混合均匀配制而成;所述的缓冲液9包括十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖、纤维素盐或纤维素衍生物、明胶。
10.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于:所述的校准品和质控品的制备方法为:使用缓冲液7与PGP9.5重组蛋白混合均匀配制而成;所述的缓冲液7包括三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、氯化钠、蔗糖。
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Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106243221A (zh) * | 2016-08-23 | 2016-12-21 | 陕西思尔生物科技有限公司 | 一种卡那霉素抗体及其制备工艺 |
CN107907690A (zh) * | 2017-11-15 | 2018-04-13 | 南通伊仕生物技术股份有限公司 | 一种超敏c反应蛋白检测试剂盒及其使用方法 |
US20190033327A1 (en) * | 2017-07-03 | 2019-01-31 | Abbott Laboratories | Methods for measuring ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 levels in blood |
US20190227070A1 (en) * | 2015-03-11 | 2019-07-25 | J-Pharma Co., Ltd. | Kit and method for determining prostate cancer malignancy |
CN111781386A (zh) * | 2020-08-21 | 2020-10-16 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种包被抗体的磁微粒缓冲液、胃泌素17测定试剂盒及其制备方法 |
CN112067800A (zh) * | 2020-09-03 | 2020-12-11 | 南昌大学 | 基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂及其制备方法 |
CN112129950A (zh) * | 2020-09-11 | 2020-12-25 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种检测白介素6的磁微粒化学发光试剂盒 |
CN112630430A (zh) * | 2020-11-16 | 2021-04-09 | 北京美联泰科生物技术有限公司 | 一种定量检测uchl-1的试剂盒及其应用 |
CN112710825A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-04-27 | 深圳天辰医疗科技有限公司 | 碱性磷酸酶酶标缓冲液和碱性磷酸酶酶标试剂 |
CN112782156A (zh) * | 2021-01-04 | 2021-05-11 | 美康生物科技股份有限公司 | 一种壳多糖酶3样蛋白1试剂盒及其制备方法 |
CN114236122A (zh) * | 2021-11-22 | 2022-03-25 | 深圳市雅为泓源生物科技有限公司 | 试剂盒及其制备方法和应用 |
-
2022
- 2022-06-28 CN CN202210747401.8A patent/CN115166244A/zh active Pending
Patent Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20190227070A1 (en) * | 2015-03-11 | 2019-07-25 | J-Pharma Co., Ltd. | Kit and method for determining prostate cancer malignancy |
CN106243221A (zh) * | 2016-08-23 | 2016-12-21 | 陕西思尔生物科技有限公司 | 一种卡那霉素抗体及其制备工艺 |
US20190033327A1 (en) * | 2017-07-03 | 2019-01-31 | Abbott Laboratories | Methods for measuring ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 levels in blood |
CN107907690A (zh) * | 2017-11-15 | 2018-04-13 | 南通伊仕生物技术股份有限公司 | 一种超敏c反应蛋白检测试剂盒及其使用方法 |
CN111781386A (zh) * | 2020-08-21 | 2020-10-16 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种包被抗体的磁微粒缓冲液、胃泌素17测定试剂盒及其制备方法 |
CN112067800A (zh) * | 2020-09-03 | 2020-12-11 | 南昌大学 | 基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂及其制备方法 |
CN112129950A (zh) * | 2020-09-11 | 2020-12-25 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种检测白介素6的磁微粒化学发光试剂盒 |
CN112630430A (zh) * | 2020-11-16 | 2021-04-09 | 北京美联泰科生物技术有限公司 | 一种定量检测uchl-1的试剂盒及其应用 |
CN112710825A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-04-27 | 深圳天辰医疗科技有限公司 | 碱性磷酸酶酶标缓冲液和碱性磷酸酶酶标试剂 |
CN112782156A (zh) * | 2021-01-04 | 2021-05-11 | 美康生物科技股份有限公司 | 一种壳多糖酶3样蛋白1试剂盒及其制备方法 |
CN114236122A (zh) * | 2021-11-22 | 2022-03-25 | 深圳市雅为泓源生物科技有限公司 | 试剂盒及其制备方法和应用 |
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