CN112067800A - 基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂及其制备方法，该免疫磁吸附剂是利用抗体Fc片段被氧化所得的醛基与磁载体表面修饰的己二酰肼特异性的亲和作用实现抗体定向偶联在磁载体表面。与传统方法相比，本方法最大程度地提高抗体Fab区域的利用率，进而提高免疫磁吸附剂对目标物的亲和力与吸附能力，并能有效控制批间差，值得进一步推广使用。所制备的免疫磁吸附剂可用于对多种食品样本进行检测前处理，根据所偶联抗体的不同可用于食品样本中危害物质如真菌毒素、农兽药残留、重金属以及病原微生物等的富集和纯化。

Description

基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂及其制备方法

技术领域

本发明属于食品安全检测和前处理技术领域，具体地说，涉及基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂及其制备方法。

背景技术

在食品危害因子的检测中，样品的分离、纯化等前处理步骤是必不可少的，是影响分析结果可靠性的关键环节。传统的样品前处理方法如液相萃取、固相萃取等，操作繁琐且特异性差，影响检测准确度。免疫亲和层析法基于配基与待检物之间的特异性识别，其准确度好，但成本高、耗时长。而基于免疫磁吸附剂的方法由于其特异性好、快速高效的优势，在食品安全检测样品前处理领域得到迅速发展。

免疫磁吸附剂由具有超顺磁性的磁载体和修饰在磁载体上的抗体构成，通过抗体特异性识别作用将目标待检物捕获在磁载体表面，然后在外加磁场的作用下，实现对待检物的富集分离。

目前免疫磁吸附剂制备方法的基本原理通常是通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)或戊二醛等作为偶联试剂将抗体修饰在羧基化或氨基化磁载体表面。但这种方法存在一个明显缺陷，即由于抗体Fab端(抗原识别区)和Fc端都具有大量的氨基，导致抗体在磁载体表面的取向随机不可控，这种随机取向减少了Fab端外露的数量，降低了抗体的免疫活性，从而降低了抗体的有效利用率，导致抗体用量大、成本过高、磁分离效率偏低、磁分离可重复性和稳定性偏低等后果。

因此，发展将抗体Fc端定向偶联在磁载体上的方法，使得抗原识别端Fab端充分暴露，减少抗原与抗体结合的空间位阻，从而提高免疫磁吸附剂的抗原亲和力，提高待检物的富集效率，有效控制批间差，同时降低成本，是本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术缺陷，本发明的目的在于提供基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂及其制备方法，所提供的免疫磁吸附剂表面抗体取向固定，抗原识别区Fab端外露。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供了一种基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂，包括磁载体，和偶联在磁载体上的抗体，所述免疫磁吸附剂通过磁载体表面酰肼基团与抗体Fc片段被氧化的醛基特异性的亲和作用定向偶联在磁载体表面。

进一步地，所述磁载体为任意具有超顺磁性的微纳米粒子，优选为Fe₂O₃、Fe₃O₄、CoFe₂O₄或MnFe₂O₄等磁纳米颗粒，或者为包裹微纳米粒子的聚合物微球。

进一步地，所述磁载体表面全部或部分为酰肼基团。

本发明还提供了一种基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂的制备方法，首先制备表面修饰有酰肼基团的磁载体，然后通过酰肼基团与抗体Fc片段碳水化合物中的羟基在温和条件下被高碘酸钠氧化成的醛基特异性的亲和作用将抗体定向固定在磁载体上。具体工艺步骤如下所述：

第一步，酰肼化磁载体的制备：

1)合成油溶性磁纳米颗粒；

2)通过对常见聚合物如聚马来酸酐-十八烯共聚物(PMAO)进行酰肼基团改性制备成含酰肼基团的聚合物，例如，单保护的己二酰肼与PMAO反应，后通过脱保护暴露出被保护的酰肼，合成末端含酰肼的聚合物；

3)将磁纳米颗粒封装在含酰肼基团的聚合物中制备酰肼化磁微球载体。可利用通过乳化-乳液溶剂挥发法，具体地，将含有油溶性磁纳米颗粒、聚合物、挥发性非极性溶剂如甲苯、氯仿等作为油相，含表面活性剂如十二烷基硫酸钠的水溶液作为水相，通过超声、搅拌等方式乳化制备水包油乳液，随后将乳液滴中的非极性溶剂通过挥发或旋蒸等方式去除即得到酰肼化磁载体。

4)第二步，抗体的氧化。取适量的抗体，溶于醋酸盐缓冲液中(0.05mol/L,pH＝4.2)，再加入一定量的高碘酸钠溶液，在黑暗条件下4℃孵育2h，然后超滤除去高碘酸钠溶液，用PBS溶液将剩余溶液洗涤下来，即得到氧化后的抗体。

第三步，抗体与磁载体的定向偶联。将第一步合成的酰肼化磁载体和氧化后的抗体混合在缓冲液(0.01M磷酸盐缓冲液，pH为5.5-8.0，不同抗体最优pH不同)中于室温25℃孵育10～20min实现抗体的定向偶联，而后加入封闭剂，优先甘油醛或猪血清溶液，继续室温孵育10～20min以封闭磁载体上多余的酰肼基团，待反应结束后通过磁分离将未结合的抗体和封闭剂除去，复溶沉淀后即获得定向偶联的免疫磁吸附剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

相对传统抗体非定向偶联的免疫磁吸附剂，本发明提供的基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂及其制备，能够实现将抗体的Fc端定向偶联到磁载体上，使Fab端更加充分的暴露，从而减少抗原与抗体结合的空间位阻，提高免疫磁吸附剂的抗原亲和力以及待检物的富集效率，有效控制批间差，同时因能够提高抗体的利用率从而能够降低抗体用量而降低成本。

附图说明

图1为传统免疫磁吸附剂制备原理图；

图2为基于酰肼的定向免疫磁吸附剂制备原理图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，仅作为说明本发明具体内容而不用于限制本发明范围。

实施例1

本实施例基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂的制备用于伏马毒素B1(FB1)残留检测的样品前处理，包括酰肼化磁载体的制备，anti-FB₁ mAbs抗体的氧化，抗体与磁载体的偶联，免疫磁载体对FB₁的富集效果，以及利用免疫磁吸附剂纯化样品，具体工艺步骤如下所述：

1)酰肼化磁载体的制备

第一步：合成含酰肼的PMAO。

a)单保护己二酰肼的合成：2.8g己二酰肼溶解于40mL水中，0.8g二-叔丁基二碳酸溶解于10mL甲醇中，将二-叔丁基二碳酸滴加至己二酰肼溶液。反应结束后通过乙酸乙酯萃取除去双保护的己二酰肼，柱层析去除未保护的己二酰肼，得到二-叔丁基二碳酸酯单保护己二酰肼，反应过程如式一所示。

式一：

b)将上述合成的单保护己二酰肼加入二甲基甲酰胺溶解的450mg聚马来酸酐十八酯醇溶液中，75℃反应2h后，产物用氯仿萃取，后用饱和氯化钠水洗除去水溶性杂质，用无水MgSO₄干燥。产物过滤减压蒸干溶解得到据马来酸酐十八醇酯与二-叔丁基二碳酸酯保护的己二酰肼缩合物，反应过程如式二所示。

式二：

c)酰肼脱保护：将上述产物加入5mL二氯甲烷和5mL三氟乙酸的混合溶液中，室温搅拌1h后停止反应，旋转蒸发溶剂，将酰肼脱保护得到含酰肼链的PMAO，反应过程如式三所示。粉末密封保存于室温。

式三：

第二步：Fe₃O₄磁珠的合成。在500mL三口烧瓶中加入300mL超纯水，通入N₂以除去水中氧气，同时在50℃预热15min。加入3.2gFeCl₂·H₂O，5.2gFeCl₃磁力搅拌混匀后加入25mL氨水，黄色溶液迅速变为黑色，50℃恒温反应30min。将合成的磁珠通过磁吸分离，用超纯水洗3-5次直至磁吸后溶液pH至中性后复溶于300mL超纯水中。

第三步：Fe₃O₄磁珠的油酸化修饰。将上步所合成的磁珠加入三口烧瓶中，通入N₂，边搅拌边逐滴加入2.4mL油酸。由于油酸化的磁珠疏水，吸附于搅拌器或烧瓶壁上，70℃反应3h黑色溶液逐渐清澈，停止反应，倒掉烧杯中溶液，加入300mL乙醇将吸附的油酸化磁珠洗脱，磁吸2min弃去乙醇溶剂，重复此步骤3-5次直至乙醇液面无漂浮油酸层。

第四步：酰肼修饰的磁载体的合成，5mg上述合成的双亲链和10mg粒径10nm左右的油酸化磁珠置于进样瓶中，加入100μL氯仿，涡旋充分混匀后加入250μL的10mg/mL十二烷基硫酸钠水溶液。将上述混合物超声乳化，超声参数设置为：功率80W，时间2min，超声5s间隔10s。超声乳化结束后置于60℃烘箱中4h以挥发氯仿。最后将合成的酰肼化磁载体悬浮于1mL超纯水中备用(12mg/mL)。

2)抗体的氧化：

取100μg的anti-FB₁ mAbs，溶于20μL醋酸钠缓冲溶液中(0.05mol/L,pH＝4.2)，再加入50μLNaIO₄水溶液(1mg/mL,pH 4.2)4℃避光震荡2h，然后使用超滤管1000rpm/min超滤10min，用50μL PBS 7.4(0.01M)将抗体洗涤下来，即得到氧化后的抗体(2mg/mL)。

3)抗体与磁载体的定向偶联：

取200μg合成的酰肼化磁载体溶于500μLpH 6.0的磷酸(PB)缓冲液中，加入8μg氧化后的anti-FB₁ mAbs，于室温下孵育10min实现抗体的定向偶联。而后加入100μL猪血清继续室温孵育10min封闭磁载体上剩余的酰肼基团，待反应结束后磁分离，将沉淀复溶于100μL复溶液中(复溶液成分：0.01MPB缓冲液(pH＝7.4)中含25％蔗糖与0.1％叠氮钠)，即获得抗体定向偶联的免疫磁吸附剂。

4)免疫磁吸附剂的富集效果：

取5μL免疫磁吸附剂，与200μL 10ng/mLFB₁标准品孵育30min，磁回收10min去除未反应的标准品，将沉淀用1mL的甲醇溶液洗脱下来，然后用高效液相色谱法测定伏马毒素B₁的浓度，即可计算出本发明的免疫磁吸附剂对抗原的富集效率。

对数据进行处理后，当免疫磁吸附剂上的抗体含量在40μg/mg时，对标品中FB1的富集效率最高，可达到81％的富集率。同时，我们使用了EDC活化羧基，与抗体上的氨基反应的共价偶联法制备的免疫磁吸附剂的富集效果进行比较，发现，基于EDC活化法制备的免疫磁吸附剂在抗体用量为100μg/mg时，对标品中FB1的富集效率最高，可达到60％的富集率。从这个结果可以看出，本专利所发明的基于酰肼的免疫磁吸附剂可以明显节约抗体的使用，并且对抗原的富集效果更好。

5)免疫磁吸附剂纯化样品：

第一步：样品的处理

首先将粮食样品用钢磨粉碎，过分样筛。取过筛粉碎的样品加入缓冲液溶液混匀。

第二步：利用基于酰肼的伏马毒素B1定向免疫磁微球纯化和检测样品

首先加入1mg/mL伏马毒素B1定向免疫磁微球，与样品充分混匀后室温放置半个小时。然后将反应后的磁珠混合液放到磁力架上吸附5分钟，待磁珠贴壁用吸管去掉其余的缓冲液。再加入pH 7.4PBS洗涤磁珠，然后将磁珠再放入磁力架中待磁珠贴壁后，用吸管去除缓冲液。重复洗涤步骤3次。在磁珠中加入的甘氨酸缓冲液，混匀。使磁珠上的伏马毒素B1洗脱下来。再将磁珠放入磁力架中使磁珠贴壁,将洗脱的缓冲液取出到另一试管中，马上加入Tris缓冲液,充分混合。洗脱后的缓冲液用高效液相色谱检测其含量。

实施例2

本实施例基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂的制备用于牛奶中单增李斯特菌残留检测的样品前处理，包括酰肼化磁载体的制备，抗体的氧化，抗体与磁载体的偶联，以及免疫磁载体对单增李斯特菌的富集效果，以及利用免疫磁吸附剂纯化样品，具体工艺步骤如下所述：

1)酰肼化磁载体的制备：与实施例1中的制备方式相同。

2)抗体的氧化：

取100μg的anti-OTAmAbs抗体，溶于20μL醋酸钠缓冲溶液中(0.05mol/L,pH＝4.2)，再加入30μLNaIO₄水溶液(1.5mg/mL,pH 4.2)4℃避光震荡2h，然后使用超滤管1000rpm/min超滤10min，用50μL PBS 7.4(0.01M)将抗体洗涤下来，即得到氧化后的抗体(2mg/mL)。

3)抗体与磁载体的定向偶联：

取200μg合成的酰肼化磁载体溶于500μLpH 6.0的PB缓冲液中，加入10μg氧化后的抗体，于室温下孵育10min实现抗体的定向偶联。而后加入100μL猪血清继续室温孵育10min封闭磁载体上剩余的酰肼基团，待反应结束后磁分离，将沉淀复溶于100μL复溶液中(复溶液成分：0.01MPB缓冲液(pH＝7.4)中含25％蔗糖与0.1％叠氮钠)，即获得抗体定向偶联的免疫磁吸附剂。

4)免疫磁吸附剂的富集效果：

取5μL免疫磁吸附剂，与200μL10⁴ CFU/mL标准品孵育30min，磁回收10min去除未反应的标准品，将沉淀用1mL的PBS溶液洗脱下来，将富集的目的菌重悬液进行梯度稀释后，用平板对每个梯度计数，通过捕获效率公式计算目标菌的捕获效率，每次实验重复三次。捕获效率的计算公式如下：(被富集吸附的菌落总数/所有的细菌总数)×100％。

对数据进行处理后，当免疫磁吸附剂上的抗体含量在80μg/mg时，对标品的富集效率最高，可达到68％的富集率。同时，我们使用了EDC活化羧基，与抗体上的氨基反应的共价偶联法制备的免疫磁吸附剂的富集效果进行比较，发现，基于EDC活化法制备的免疫磁吸附剂在抗体用量为160μg/mg时，对标品的富集效率最高，可达到53％的富集率。从这个结果可以看出，本专利所发明的基于酰肼的免疫磁吸附剂可以明显节约抗体的使用，并且对抗原的富集效果更好。

5)免疫磁吸附剂纯化样品：

第一步：样品的处理

无菌牛奶为样品待测样品溶液，加入单增李斯特菌调节菌落浓度至至10⁴CFU/mL备用。

第二步：利用基于酰肼的单增李斯特菌定向免疫磁微球加入到样品溶液中，置于混匀仪上，室温孵育10min捕获样品中的单增李斯特菌，然后将反应后的磁珠混合液放到磁力架上吸附5分钟，待磁珠贴壁用吸管去掉其余的缓冲液。再加入pH 7.4PBS洗涤磁珠，然后将磁珠再放入磁力架中待磁珠贴壁后，用吸管去除缓冲液。重复洗涤步骤3次。即得富集和纯化的单增李斯特菌。

实施例3

本实施例基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂的制备用于盐酸克伦克罗残留检测的样品前处理，包括酰肼化磁载体的制备，anti-CLE mAbs抗体的氧化，抗体与磁载体的偶联，免疫磁载体对CLE的富集效果，以及利用免疫磁吸附剂纯化及检测样品，具体工艺步骤如下所述：

1)酰肼化磁载体的制备：与实施例1中的制备方式相同。

2)抗体的氧化：

取100μg的anti-CLEmAbs，溶于20μL醋酸钠缓冲溶液中(0.05mol/L,pH＝4.2)，再加入40μLNaIO₄水溶液(1.5mg/mL,pH 4.2)4℃避光震荡2h，然后使用超滤管1000rpm/min超滤10min，用50μL PBS 7.4(0.01M)将抗体洗涤下来，即得到氧化后的抗体(2mg/mL)。

3)抗体与磁载体的定向偶联：

取200μg合成的酰肼化磁载体溶于500μLpH 6.0的PB缓冲液中，加入10μg氧化后的anti-CLEmAbs，于室温下孵育10min实现抗体的定向偶联。而后加入100μL猪血清继续室温孵育10min封闭磁载体上剩余的酰肼基团，待反应结束后磁分离，将沉淀复溶于100μL复溶液中(复溶液成分：0.01MPB缓冲液(pH＝7.4)中含25％蔗糖与0.1％叠氮钠)，即获得抗体定向偶联的免疫磁吸附剂。

4)免疫磁吸附剂的富集效果：

取5μL免疫磁吸附剂，与200μL 1ng/mL盐酸克伦特罗标准品孵育30min，磁回收10min去除未反应的标准品，将沉淀用1mL的甲醇溶液洗脱下来，然后用高效液相色谱法测定盐酸克伦特罗的浓度，即可计算出本发明的免疫磁吸附剂的富集效率。

对数据进行处理后，当免疫磁吸附剂上的抗体含量在40μg/mg时，对标品的富集效率最高，可达到72％的富集率。同时，我们使用了EDC活化羧基，与抗体上的氨基反应的共价偶联法制备的免疫磁吸附剂的富集效果进行比较，发现，基于EDC活化法制备的免疫磁吸附剂在抗体用量为100μg/mg时，对标品的富集效率最高，可达到57％的富集率。从这个结果可以看出，本专利所发明的基于酰肼的免疫磁吸附剂可以明显节约抗体的使用，并且对抗原的富集效果更好。

5)免疫磁吸附剂纯化样品：

第一步：样品的处理

取10g绞碎肉试样，加0.1mol/L高氯酸20mL匀浆，超声提取20min，80℃加热30min，冷却后离心(4000r/min)15min。沉淀加0.1mol/L高氯酸5mL洗涤、离心，将上清夜合并，用1mol/L氢氧化钠调pH至11，加入25mL乙醚，振荡提取20min，回收有机相，再用20mL乙醚重复萃取2次，合并有机相，蒸发至干。用0.1mol/LHC1溶解，纯水定容至10mL。

第二步：利用基于酰肼的盐酸克仑特罗定向免疫磁微球纯化样品。

具体操作与实例1中相同。

6)免疫磁吸附剂检测样品：

将一定梯度浓度的样品与2μL的基于酰肼的定向免疫磁吸附剂/基于EDC的免疫磁吸附剂孵育5min，取70μL加入到试纸条中(T线为竞争CLE的全抗原，C线为羊抗鼠二抗)，15min后读数。

对数据进行处理，可以看出，酰肼的定向免疫磁吸附剂的灵敏更高，LOD为1pg/mL。

基于EDC方法制备的免疫磁吸附剂对CLE的检测灵敏度为2.5pg/mL。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂，包括磁载体，和偶联在磁载体上的抗体，其特征在于，所述抗体是通过磁载体表面酰肼基团与抗体Fc片段被氧化的醛基特异性的亲和作用定向偶联在磁载体表面的。

2.根据权利要求1所述的基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂，其特征在于，所述磁载体为任意具有超顺磁性的纳米颗粒，或者为包裹纳米颗粒的聚合物微球。

3.根据权利要求2所述的基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂，其特征在于，所述纳米颗粒为Fe₂O₃、Fe₃O₄、CoFe₂O₄或MnFe₂O₄纳米颗粒。

4.根据权利要求1所述的免疫磁吸附剂，其特征在于所述磁载体表面全部或部分为酰肼基团。

5.根据权利要求1所述的免疫磁吸附剂，其特征在于所述抗体Fc片段糖蛋白分子中的邻二羟基在温和条件下被高碘酸钠氧化成醛基。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)酰肼修饰的磁载体的制备：先合成油溶性磁纳米颗粒，再通过对聚合物进行酰肼基团改性制备成含酰肼基团的聚合物，然后将磁性纳米颗粒封装进含酰肼基团的聚合物中制备酰肼化磁载体微球；

2)抗体的氧化：取适量的抗体，再加入一定量的高碘酸钠溶液，在黑暗条件下4℃孵育2h，然后超滤除去高碘酸钠溶液，用0.01M PBS溶液将剩余溶液洗涤下来，即得到氧化后的抗体；

3)抗体的定向偶联：将氧化后的抗体加入到含酰肼化磁载体缓冲液中室温孵育，使之定向偶联到磁载体上；而后加入适量封闭剂封闭磁载体上多余的酰肼基团；磁分离洗涤去除未结合的抗体和封闭剂，将磁珠重悬在含有25％蔗糖的pH7.4 0.01M PBS中，放于4℃保存将获得免疫磁吸附剂。

7.根据权利要求6所述的基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的聚合物为聚马来酸酐-十八烯共聚物(PMAO)。

8.根据权利要求6所述的基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述封装的方法为乳化-乳液溶剂挥发法：将含有油溶性磁纳米颗粒、含酰肼基团的聚合物、挥发性非极性溶剂，含表面活性剂的水溶液作为水相，制备水包油乳液，随后将乳液滴中的非极性溶剂通过挥发或旋蒸的方式去除。

9.根据权利要求6所述的基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述封闭剂为甘油醛或猪血清。

10.根据权利要求1所述的基于酰肼定向偶联抗体的免疫磁吸附剂的应用，其特征在于，利用所述的免疫磁吸附剂对食品样本中目标危害物质进行富集和纯化。

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