CN103645322A - 一种链霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测用试剂盒，特别是用于检测链霉素的化学发光试剂盒。包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂，所述酶标板的各孔包被有包被抗原；所述试剂包括：链霉素单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体、链霉素系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液；酶标板选择乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板，酶标板的各孔包被有以链霉素与卵清蛋白偶联制成的包被抗原。本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量缀，有望在动物性食品（动物组织、水产品）中的链霉素药物残留检测中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测用试剂盒，特别是用于检测链霉素的化学发光试剂盒。
背景技术
随着现代经济的迅速发展，现代养殖业近年来也迅速发展，由此引起的抗生素的滥用导致的大量药物残留已经成为威胁人类健康的严重经济社会问题。动物源性食品中抗菌素污染的问题已引起全世界广泛关注，许多国家均对各种动物源性食品中的抗菌素残留提出限量标准。我国农业部在2002年公告的《关于动物性食品中兽药最高残留限量的通知》中，规定了92种动物性食品中兽药最高残留限量，其中链霉素(Tylosin)在鸡、猪、牛的肌肉、脂肪、肝、肾组织中的最高残留限量为200 μg／kg。链霉素对革兰阳性菌、革兰阴性菌、类菌介质和某些病毒有抑制作用，尤其对禽败血支原体、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌极其有效。链霉素主要通过抑制细菌细胞内蛋白质的合成而发挥作用随着其广泛应用，在动物性食品中的残留问题也日益突出。
因此残留检测方法是非常有必要的，很多国家已经为此而建立了一些药物残留的监测方法。包括传统的仪器法，微生物检测法和新兴的酶联免疫检测法(ELISA)。传统检测药物残留的仪器分析方法包括HPLC、LC-UV、LC-Ms和LC-MS-MS等。这些方法优点是准确、稳定、特异性好，可以作为标准方法，但仪器设备昂贵，笨重，需要大量的溶剂，对操作人员要求很高，样品前处理复杂、费时、费力、不易普及，不适合对大规模的样品进行即时检测。微生物检测法虽然可以进行大量样品的即时检测，但是特异性差，不能进行准确的定性定量分析。酶联免疫检测法(ELISA)克服了以上方法的缺点，是一种快速、灵敏、方便的检测方法，可以用于大量样品的即时检测，有着广阔的发展前景。在酶联免疫基础上结合化学发光分析的酶联免疫检测法(CL—ELISA)，有着更高的灵敏度，更宽的线性范围，更适合药物残留检测。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种具备较高的灵敏度、特异性、而且具有较高的反应速度的一种链霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种链霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂，所述酶标板的各孔包被有以链霉素药物与卵清蛋白偶联制成的包被抗原；所述试剂包括：链霉素单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体、链霉素系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液；酶标板选择乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板，酶标板的各孔包被有以链霉素与卵清蛋白偶联制成的包被抗原。
其中所述包被抗原浓度优选1.5ug/mL，所述链霉素系列标准溶液从链霉素纯品中稀释得到，所用稀释液为含有10%甲醇的0.05mmol/L、pH-7.4的PBS，链霉素标准品浓度分别是0ng/mL，0.2ng/mL，0.4ng/mL，1.2ng/mL，3.6ng/mL和10.8ng/mL，所述百分比为体积百分比。
所述链霉素单克隆抗体是由链霉素药物与牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫动物制得的单克隆抗体，其链霉素单克隆抗体是用人工免疫抗原免疫动物制得的单克隆抗体，将所得链霉素单克隆抗体用洗涤溶液稀释成1：60000的工作浓度。
所用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体为辣根过氧化酶一羊抗鼠IgG原液，使用时用洗涤溶液配制成1：3000的工作浓度。
所述化学发光溶液包括A液和B液，其中，A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M PH-8.8的三（羟甲基）氨基甲烷溶液；B液为100mL含2.lg柠檬酸、2.82g无水Na2HPO4和0.64mL浓度0.75%的过氧化氢脲的溶液。
所述浓缩磷酸盐缓冲液由5.74g NaH2PO4·2H2O和32.6g Na2HPO4·12H2O溶于1L去离子水中制得。
所述浓缩洗涤液为按体积百分比在0.05%，pH为7.4，浓度为0.1mol/L的盐缓冲液中添加0.05%的吐温-20后制得。
所述的包被溶液为：1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L水中，并调节pH为9.5后制得，所述的封闭溶液为：10g OVA溶于1L洗涤溶液中，再加入重量百分比为0.02%的NaN3后制得。
所述酶标板采用将链霉素药物-OVA偶联物置于设定的包被溶液中，在37℃恒温箱中反应包被，包被液采用的是pH-9.5的碳酸钠一碳酸氢钠缓冲溶液。
本发明中微孔板中所包被的链霉素药物-OVA在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，可以经受多次洗板，采用的包被抗原浓度为1.5ug/mL，包被好的微孔板可以用封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选OVA，需加入NaN3防止变质。
本发明申链霉素单克隆抗体溶液是决定本发明中链霉素酶联免疫测试试剂盒测定范围及灵敏度的重要因素。
本发明中涉及的链霉素单克隆抗体溶液可以用洗涤溶液稀释成1：60000的工作浓度。
按照上述链霉素单克隆抗体溶液浓度制备的试剂盒可以达到很好的线性范围。
本发明的原理是将抗体一抗原反应的高度特异性与酶催化的高度灵敏性结合起来，利用酶催化底物的化学发光反应检测产物浓度。
有益效果：本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量缀，有望在动物性食品（动物组织、水产品）中的链霉素药物残留检测中发挥重要作用。
具体实施方式
一种链霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂，所述酶标板的各孔包被有以链霉素药物与卵清蛋白偶联制成的包被抗原；所述试剂包括：链霉素单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体、链霉素系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液；酶标板选择乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板，酶标板的各孔包被有以链霉素与卵清蛋白偶联制成的包被抗原。
其中所述包被抗原浓度优选1.5ug/mL，所述链霉素系列标准溶液从链霉素纯品中稀释得到，所用稀释液为含有10%甲醇的0.05mmol/L、pH-7.4的PBS，链霉素标准品浓度分别是0ng/mL，0.2ng/mL，0.4ng/mL，1.2ng/mL，3.6ng/mL和10.8ng/mL，所述百分比为体积百分比。
所述链霉素单克隆抗体是由链霉素药物与牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫动物制得的单克隆抗体，其链霉素单克隆抗体是用人工免疫抗原免疫动物制得的单克隆抗体，将所得链霉素单克隆抗体用洗涤溶液稀释成1：60000的工作浓度。
所用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体为辣根过氧化酶一羊抗鼠IgG原液，使用时用洗涤溶液配制成1：3000的工作浓度。
所述化学发光溶液包括：A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M PH-8.8的三（羟甲基）氨基甲烷溶液；B液为l00mL溶液含柠檬酸2.lg，的无水Na2HPO42.82g，0.75%的过氧化氢脲0. 64mL的溶液，采用辣根过氧化酶标记底物发光系统，主要是鲁米诺一过氧化氢系统。
所述浓缩磷酸盐缓冲液为5.74g的NaH2PO4·2H2O、32.6g的Na2HPO4·12H2O溶于1L去离子水中。
所述浓缩洗涤溶液为按体积分数0.05%将吐温-20添加至pH-7.4，0.Imol/L盐缓冲液中制成。
所述的包被溶液为：1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L水中，调节PH-9.5制得，所述的封闭溶液为：l0g OVA溶于1L洗涤溶液中，再加入重量比为0.02%的NaN3。
本发明中包被酶标板采用将链霉素药物-OVA偶联物置于设定的包被溶液中，以设定的浓度，在37℃恒温箱中反应包被，本发明包被液采用的是pH-9.5的碳酸钠一碳酸氢钠缓冲溶液。
本发明中微孔板中所包被的链霉素药物-OVA在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，可以经受多次洗板，采用的包被抗原浓度为1.5ug/mL，包被好的微孔板可以用封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选OVA，需加入NaN3防止变质。
本发明申链霉素单克隆抗体溶液是决定本发明中链霉素酶联免疫测试试剂盒测定范围及灵敏度的重要因素。
本发明中涉及的链霉素单克隆抗体溶液可以用洗涤溶液稀释成1：60000的工作浓度。
检测步骤：
1) 加样：向酶标板中加入50μL/孔的链霉素系列标准浓度溶液或样品溶液，然后加入链霉素抗体工作液50μL/孔，室温（25℃）恒温孵育2.5h;
2) 洗涤：倾出孔中液体，向酶标板中加入280μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；
3) 加酶标二抗：每孔加入酶标二抗工作液100uL，室温恒温孵育1.5h；
4) 洗涤：倾出孔中液体，向酶标板中加入280μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；
5) 加发光液：每孔加入发光液l00uL；
6) 检测：用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度。
结果判断：
以所测得的标准品发光值，除以第一个标准（0标准）的发光值再乘以100，得到抑制率（B/B0)，以抑制率为纵坐标，链霉素浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。
试剂盒具体组分的制备
1）链霉素半抗原
购自美国Sigma公司。
2）链霉素免疫原的制备
称取40 mg羰基二咪唑，用0.8ml丙酮充分溶解，加入25 mg链霉素单克隆抗体37℃振荡反应3h后，真空干燥过夜；加入1ml用0．2 mol/LpH 8.0的硼酸缓冲液溶解的BSA 10mg，4℃振荡3d；用0.2mol/LPH8.0的硼酸缓冲液透析2 d，加入柳硫汞，置4℃保存；采用紫外扫描法进行鉴定，BSA在280 nm处应有一明显吸收峰；而链霉素单体紫外扫描图谱，在225nm处应有一明显吸收峰；BSA一链霉素偶联物经紫外扫描，若最大吸收峰发生蓝移，可初步认定偶联物结合成功。
3）单克隆抗体的制备
1动物免疫：用上述制备出的免疫原按100ug/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100ug/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
2细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂（PEG4000）进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5% CO2培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。
3杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/2时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原（预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度）包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，邻苯二胺(OPD)进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100 u g/mL的苏丹红等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的酶标板中。同时用PBS取代苏丹红对照，其余步骤同上。若经苏丹红阻断后的OD450nm值下降到对照孔的50%以下，则判为阳性，经2～3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。
4单克隆抗体制备：将2～3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8～10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7～10日后腹腔注射杂交瘤细胞l～2×106/只，7～10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。
实际样品中链霉素的检测
l、样本前处理
（一）肌肉、肝脏等组织前处理方法
用均质器均质样本；称取3g均质后的组织样本到50 mL聚苯乙烯离心管中 ， 加入 6mL乙酸乙酯，用振荡器振荡10min，3000g以上,室温( 2 0～25℃)离心 10min；移取4mL上层有机相至10mL干净的玻璃管中，于50～60℃水浴氮气吹干，加入1mL正己烷，用涡旋仪涡动1min，再加1m L复溶工作液，用涡旋仪涡 动10S，3000g以上，室温离心10min；除去上层有机相 ， 取下层5 0 L 用 于检测。
（二）原奶处理方法
将原奶样品回温到室温（25±2℃）后，上下颠倒20次以上，使其充分混匀；（注：切勿采用剧烈的方式混匀，否则将产生沉淀，影响结果）然后去50 u l上述混合后的样品于2ml离心管中，再加入950 u l样品稀释液，上下颠倒20次以上混匀，最后去50 u l进行检测。
（三）蛋处理方法
取50uL均质后的全蛋品于离心管中，加入950uL去离子水，充分涡动10s，取50uL进行检测。
Claims (9)
1.一种链霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂，其特征在于：所述酶标板的各孔包被有包被抗原；所述试剂包括：链霉素单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体、链霉素系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液；所述酶标板为乳白色不透明的聚苯乙烯96孔化学发光酶标板，酶标板的各孔包被有以链霉素与卵清蛋白偶联制成的包被抗原。
2.如权利要求1所述的一种链霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述包被抗原以链霉素药物与卵清蛋白偶联制成，其浓度为1.5ug/mL，所述链霉素系列标准溶液从链霉素纯品中稀释得到，所用稀释液为含有10%甲醇的0.05mmol/L、pH为7.4的PBS，链霉素标准品浓度分别是0ng/mL，0.2ng/mL，0.4ng/mL，1.2ng/mL，3.6ng/mL和10.8ng/mL，所述百分比为体积百分比。
3.如权利要求1所述的一种链霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述链霉素单克隆抗体是由链霉素药物与牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫动物制得的单克隆抗体，其工作浓度为为1：60000。
4.如权利要求1所述的一种链霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体为辣根过氧化酶一羊抗鼠IgG原液，使用时用洗涤溶液配制成1：3000的工作浓度。
5.如权利要求1所述的一种链霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光溶液包括A液和B液，其中，A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M PH-8.8的三（羟甲基）氨基甲烷溶液；B液为100mL含2.lg柠檬酸、2.82g无水Na2HPO4和0.64mL浓度0.75%的过氧化氢脲的溶液。
6.如权利要求1所述的一种链霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩磷酸盐缓冲液由5.74g NaH2PO4·2H2O和32.6g Na2HPO4·12H2O溶于1L去离子水中制得。
7.如权利要求1所述的一种链霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤液为按体积百分比在0.05%，pH为7.4，浓度为0.1mol/L的盐缓冲液中添加0.05%的吐温-20后制得。
8.如权利要求1所述的一种链霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的包被溶液为：1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L水中，并调节pH为9.5后制得，所述的封闭溶液为：10g OVA溶于1L洗涤溶液中，再加入重量百分比为0.02%的NaN3后制得。
9.如权利要求1所述的一种链霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述酶标板采用将链霉素药物-OVA偶联物置于设定的包被溶液中，在37℃恒温箱中反应包被，包被液采用的是pH-9.5的碳酸钠一碳酸氢钠缓冲溶液。
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| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PP01 | Preservation of patent right |
Effective date of registration: 20160822 Granted publication date: 20151230 |
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| RINS | Preservation of patent right or utility model and its discharge | ||
| PD01 | Discharge of preservation of patent |
Date of cancellation: 20170116 Granted publication date: 20151230 |
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| RINS | Preservation of patent right or utility model and its discharge | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Li Xiumei Inventor after: Xiang Chaorong Inventor after: Zhong Weiping Inventor after: Wang Junxia Inventor after: Wang Yanfeng Inventor after: Pan Yanyan Inventor after: Yang Liangzhen Inventor after: Zhang Chunyan Inventor after: Wu Weijie Inventor after: Zhang Baogui Inventor after: Wang Damin Inventor after: Liu He Inventor after: Li Zejun Inventor after: Jiang Changcheng Inventor before: Wang Shanpu Inventor before: Liu Panpan Inventor before: Zheng Ming Inventor before: Wang Yudong Inventor before: Zhi Xueling |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20170316 Address after: 471000 Luoyang, Luolong, science and Technology Park, west of Peony Road, No. N3, No. Patentee after: LUOYANG LAIPSON INFORMATION TECHNOLOGY CO., LTD. Patentee after: Luoyang Modern Biotechnology Research Institute Co., Ltd. Address before: 471000 Luoyang, Luolong, science and Technology Park, west of Peony Road, No. N3, No. Patentee before: LUOYANG LAIPSON INFORMATION TECHNOLOGY CO., LTD. |
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| TR01 | Transfer of patent right |