CN106771140A

CN106771140A - 一种食品中链霉素的检测试剂盒

Info

Publication number: CN106771140A
Application number: CN201611027935.4A
Authority: CN
Inventors: 周朱晨; 张根义; 胡彬; 张进; 吴念绮; 周合
Original assignee: 100 Olson Jiangsu Food Safety Technology Co Ltd
Current assignee: 100 Olson Jiangsu Food Safety Technology Co Ltd
Priority date: 2016-11-22
Filing date: 2016-11-22
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明公开了一种食品中链霉素的检测试剂盒，包括：受体微球、供体微球、生物素化链霉素、链霉素标准品、样品稀释液；其中，受体微球包被有链霉素抗体，供体微球包被有链霉亲和素；样品稀释液为乙腈‑磷酸盐缓冲液。本发明检测试剂盒，通过特异性的抗原抗体反应将纳米微珠对极大的拉近，级联化学发光反应将信号放大，有效的提高链霉素检测的精度。该检测试剂盒中的检测试剂稳定，灵敏、准确，具备适用面广、检测范围宽、灵敏度高、特异性强、检测通量大、线性范围较宽等优点。

Description

一种食品中链霉素的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，具体是一种食品中链霉素的检测试剂盒。

背景技术

链霉素（Streptomycin）是一种重要的氨基糖苷类抗生素，被广泛应用于动物疾病的治疗，链霉素对鸡、羊、牛、猪的各类炎症，如鸡传染性鼻炎、猪急性支气管炎、猪白痢、奶牛子宫内膜炎等有很好的疗效，因此经常作为饲料添加剂使用。如果不正确使用，可造成链霉素残留超标。研究证明，链霉素可对肾脏和听神经造成不可逆转的损耗，长期使用还会使细菌产生耐药性。为了保障动物源性食品的安全，农业部第235号文件《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定链霉素在牛奶中为200μg/L，在肌肉、脂肪、肝中为600μg/kg，在肾中为1000μg/kg。

目前链霉素残留的检测主要有仪器分析和免疫学方法。其中仪器分析法主要用高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC），这些方法具有灵敏度高、结果准确、重复性好、假阳性少等优点，但仍存在一定缺点，如样品前处理过程复杂，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，不适合进行大规模现场检测等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、灵敏度和特异性高的食品中链霉素的检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种食品中链霉素的检测试剂盒，包括：受体微球、供体微球、生物素化链霉素、链霉素标准品、样品稀释液；其中，所述的受体微球包被有链霉素抗体，所述的供体微球包被有链霉亲和素；所述的样品稀释液为乙腈-磷酸盐缓冲液。

作为本发明进一步的方案：所述的受体微球的加入量为35μL，所述的生物素化链霉素的加入量为25μL，所述的样品或标准品的加入量为35μL，所述的供体微球的加入量为20μL。

作为本发明进一步的方案：所述的受体微球的浓度为14～18μg/ml，所述的供体微球的浓度为12～15μg/ml，所述的生物素化链霉素的浓度为6～8μg/ml。

作为本发明进一步的方案：所述的受体微球的浓度为15μg/ml，所述的供体微球的浓度为13μg/ml，所述的生物素化链霉素浓度为6μg/ml。

作为本发明进一步的方案：所述的受体微球的缓冲溶液为含有0.25wt.%鸡卵清白蛋白、0.03%v/v Proclin-300的磷酸盐缓冲液，所述的生物素化链霉素的缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述的供体微球的缓冲溶液为终浓度为20mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、0.15mol/L NaCl和0.04%v/v Proclin-300、pH值7.6的溶液。

利用所述的食品中链霉素的检测试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：

（1）将链霉素标准品配置成具有浓度梯度的标准品；

（2）反应板每孔加入包被有链霉素抗体的受体微球、生物素化链霉素抗原之后，分别在各孔加入待测样品、步骤1）制备的标准品或磷酸盐缓冲液；

（3）振荡，室温或37℃避光孵育6～8min；

（4）每孔加入包被链霉亲和素的供体微球，振荡条件下，室温或37℃避光孵育6～8min；

（5）结果读取：将反应板置于均相免疫检测仪上读数；

（6）检测结果分析：根据标准品检测的结果绘制标准曲线，将样品的检测结果对应标准曲线，即获得检测样品中链霉素的含量。

作为本发明进一步的方案：所述的步骤（3）中，37℃避光孵育的时间为6min；所述的步骤（4）中，37℃避光孵育的时间为8min。

作为本发明进一步的方案：所述的步骤（6）检测结果分析包括：

a.用所获得的每个浓度的标准品溶液的荧光计数值除以链霉素浓度为0的荧光计数值再乘以100，得到百分荧光计数值；以链霉素标准品浓度的半对数值为X轴，百分荧光计数值为Y轴，绘制标准曲线图；

b.按步骤a所述的百分荧光计数值计算方法，计算样品溶液的百分荧光计数值，相对应该待测样品的百分荧光计数值则可从标准曲线上读出所述待测样品中链霉素的含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明检测试剂盒，通过特异性的抗原抗体反应将纳米微珠对极大的拉近，级联化学发光反应将信号放大，有效的提高链霉素检测的精度。该检测试剂盒中的检测试剂稳定，灵敏、准确，具备适用面广、检测范围宽、灵敏度高、特异性强、检测通量大、线性范围较宽等优点。

本发明检测试剂盒操作简单、混合后即可测定，避免了传统免疫分析中洗脱、分离等繁琐过程，一方面，有效降低了非特异性反应的可能性以及背景噪音的影响，显著提高了分析效率和检测灵敏度；另一方面大大缩短检测时间，并可在现场快速检测食品中的链霉素残留，检测全过程控制在20min之内，检测限符合中国及欧盟的限量标准。

本发明检测试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，检测链霉素的灵敏度为0.1mg/L。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明实施例中，一种食品中链霉素的检测试剂盒，包括：包被有链霉素抗体的受体微球、生物素化链霉素、链霉素标准品、包被有链霉亲和素的供体微球。

其中，受体微球包被链霉素抗体，生物素化链霉素具体步骤如下。

1、受体微球包被链霉素抗体，具体步骤如下：

（1）抗体的预处理

将一定量链霉素抗体加入美国Millipore公司的带有滤膜的离心管中，9000rpm离心8min。将浓缩后的抗体加入0.2ml缓冲液A（用0.15mol/L、pH值7.8的磷酸盐缓冲液配制25mg/ml氰基硼氧化钠，现配现用。保存缓冲液：为含有0.25wt.%鸡卵清白蛋白、0.018%v/vProclin-300的磷酸盐缓冲液，具体配置如下：1L的双蒸水加入KCl 0.25g、KH₂PO₄ 0.22g、NaCl 7.5g、Na₂HPO₄·12H₂O 3g、鸡卵清白蛋白2.5g、Proclin-300 0.18ml，混匀，室温保存。），9000rpm离心8min后弃掉滤液，此步骤重复5～6次。将几次离心后的离心管取出，弃掉滤液，把离心管的滤膜反转，8000rpm离心6min，收集所得滤液，即所需要的抗体。完成后再次将滤膜反转，加入50μL缓冲液A，静置片刻，使滤膜将待连接抗体的缓冲液A吸收，留在滤膜上的残余抗体溶解下来，将滤膜重新反转过来，8000rpm离心6min，收集滤膜上的液体，以上步骤重复1～3次，以使滤膜上的抗体尽可能多的被回收。

（2）抗体浓度的检测

采用聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白定量分析试剂确定步骤（1）中抗体的浓度，按照聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白定量分析试剂的说明书进行操作，具体步骤如下：

1）配置标准品系列浓度：用去离子水将聚氰基丙烯酸正丁酯标准品稀释成以下系列浓度：2mg/ml、1.5mg/ml、lmg/ml、0.75mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.025mg/ml、0mg/ml；

2）配置聚氰基丙烯酸正丁酯工作液：根据标准品和样品数量配置聚氰基丙烯酸正丁酯工作液，将A液、B液按体积比为50：1的比例进行配置，充分混匀；

3）待检测样品用去离子水作适当稀释，将25μL上述聚氰基丙烯酸正丁酯标准品及样品分别加入到96孔透明板的样品孔中；各孔加入200μL聚氰基丙烯酸正丁酯工作液，37℃孵育30min；

4）将板条放置室温数分钟，将其冷却至室温，用酶标仪570nm波长测定，根据标准曲线计算抗体浓度，并将抗体浓度调整成2mg/ml。

（3）抗体和微球的偶联

将链霉素抗体和包被有链霉素抗体的受体微球按照1：10的浓度比进行混匀，用缓冲液A将体积补充到200μL，室温下振荡1小时。

（4）纯化

16000rpm离心15min后去上清，再加入一定量的保存缓冲液将受体微球重悬，再次16000rpm离心15min后去上清，重复此步骤二次，最后用保存缓冲液将其沉淀超声重悬，得到己连接抗体的受体微球，调整受体微球的浓度为14～18μg/ml待用。

（5）保存

分装为50μL的小管，4℃保存。

如上所用缓冲液的配置方法如下：

2、生物素化链霉素

（1）链霉素-牛血清白蛋白（链霉素-BSA）偶联物的制备：取24mg链霉素、0.95mol马来酸酐以及0.055mol的DMAP，溶于2m1甲苯，78℃搅拌14小时，蒸干溶剂，酸化，萃取，重结晶后得到链霉素半抗原。将50mg链霉素半抗原溶于9.8m1的0.012mol/L、pH值5.2的磷酸盐缓冲液中，加入12mg EDC，再加入1ml DMF溶解的9.8mg链霉素半抗原，28℃搅拌反应2小时，再加入6.5mg EDC，置于阴暗处搅拌反应14小时，用0.015mol/L磷酸盐缓冲液透析3天，每天换3次透析液，即得到链霉素-BSA偶联物。

（2）将NHS-生物素和链霉素-BSA偶联抗原按照1：4的摩尔比进行混匀，室温下振荡4小时，4℃保存透析2天，每天换2次透析缓冲液，分装使生物素化链霉素的浓度为6～8μg/ml待用。

为了延长生物素化链霉素的使用有效期，可在缓冲溶液中加入Proclin-300，其浓度优选为0.04%v/v。

其中，透析缓冲液采用磷酸盐缓冲液，配置方法为：1L的双蒸水加入KCl 0.25g、KH₂PO₄ 0.22g、NaCl 7.5g、Na₂HPO₄·12H₂O 3g，混匀，室温保存。

3、供体微球

供体微球包被有链霉亲和素，其缓冲液为含20mmol/L HEPES、0.15mol/L NaCl、0.04%v/v Proclin-300、pH值7.6的溶液，其中，供体微球的浓度优选为12～15μg/ml。

链霉素抗体可采用羊抗、兔抗、鼠抗；包被有链霉素抗体的受体微球中的二抗可采用与链霉素抗体相应对应的兔抗羊IgG、鼠抗羊IgG、羊抗兔IgG、鼠抗兔IgG；兔抗鼠IgG、羊抗鼠IgG或SPA。

链霉素抗体、包被有链霉素抗体的受体微球、供体微球可采用商品化试剂，可市售得到。

利用所述的食品中链霉素的检测试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：

1）配置具有一定浓度梯度的链霉素作为标准品；

2）反应板每孔加入包被有链霉素抗体的受体微球、生物素化链霉素抗原；之后，分别在各孔加入待测样品、标准品或磷酸盐缓冲液；

3）振荡，室温或37℃避光孵育6～8min；

4）每孔加入包被链霉亲和素的供体微球，振荡条件下，室温或37℃避光孵育6～8min；

5）结果读取：将反应板置于均相免疫检测仪上读数；

6）检测结果分析：根据标准品检测的结果绘制标准曲线，将样品的检测结果对应标准曲线，即可获得检测样品中链霉素的含量。

具体地，检测方法如下：

1）配置不同浓度的链霉素标准品：采用8个浓度，使链霉素终浓度分别为0mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L、1.6mg/L、3.2mg/L、6.4mg/L；

2）取96孔板，优选地，反应板每孔加入35μL受体微球，受体微球的浓度为15μg/ml，25μL生物素化链霉素，生物素化链霉素的浓度优选为6μg/mL；

3）在标记为待检样品的孔中加入35μL待测样品；标记为标准曲线的孔中分别加入不同浓度的标准品；标记为本底的孔中加入磷酸盐缓冲液作为空白对照；

4）振荡条件为振荡速度为40～100转/分，37℃避光孵育6分钟；

5）每孔加入供体微球20μL，供体微球的浓度可优选13μg/ml，振荡条件为振荡速度为40～100转/分，37℃避光孵育8分钟；

6）结果读取：将反应板置于均相免疫检测仪上读数；

7）检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的荧光计数值（B）除以第一个标准品溶液（0标准）的荧光计数值（B₀）再乘以100，得到百分荧光计数值。计算公式为：百分荧光计数值（%）=（B/B₀）×100%。

公式中B为标准品溶液的荧光计数值，B₀为0mg/L标准溶液的荧光计数值。以链霉素标准品浓度的半对数值为X轴，百分荧光计数值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分荧光计数值，相对应该样品的百分荧光计数值，则可从标准曲线上读出该样品中链霉素的含量。

为了获得比较准确的检测结果，各浓度梯度的标准品或样品，可多做几个平行样，计算时，采用平行样的平均值绘制标准曲线或测得样品中链霉素的含量。

具体到检测样品中链霉素的残留，要先对固态样品进行前处理，前处理可采用：称取固态食品样品1g，每份样品加入3ml乙腈-磷酸盐缓冲液，在涡旋振荡器上振荡3～5min，然后静置3～5min，取上清液待测。

样品稀释液采用乙腈-磷酸盐缓冲液，其配置方法为乙腈与磷酸盐缓冲液体积比为1：4。采用乙腈-磷酸盐缓冲液可使链霉素完全溶于溶液中，且对检测检测不会要任何影响。

试剂盒IC₅₀测定

采用上述检测方法，利用试剂盒对标准曲线进行检测，每个标准样品做平行孔5个。IC₅₀测定结果为0.3mg/L。

试剂盒灵敏度的测定

通过对20组链霉素为零浓度的平行样进行检测，经测定，获得20组标准曲线零浓度点计数的平均值和标准差，以平均值的计数减2倍标准偏差所得的计数，从标准曲线中找到对应浓度即为本发明方法及检测试剂盒的检测灵敏度。经测定，计算获得牛奶中链霉素的灵敏度为0.1mg/L。

试剂盒特异性检测

分别配制链霉素、三聚氰胺、磺胺类、氟喹诺酮类、氯霉素、大环内酯类、四环素类药物的标准品，进行检测。按照公式计算：交叉反应率（CR）=50%抑制率时链霉素浓度/50%抑制率时类似物浓度×100%。结果说明，本发明制备的试剂盒检测链霉素的特异性较高。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一种食品中链霉素的检测试剂盒，其特征在于，包括：受体微球、供体微球、生物素化链霉素、链霉素标准品、样品稀释液；其中，所述的受体微球包被有链霉素抗体，所述的供体微球包被有链霉亲和素；所述的样品稀释液为乙腈-磷酸盐缓冲液。

2.根据权利要求1所述的食品中链霉素的检测试剂盒，其特征在于，所述的受体微球的加入量为35μL，所述的生物素化链霉素的加入量为25μL，所述的样品或标准品的加入量为35μL，所述的供体微球的加入量为20μL。

3.根据权利要求2所述的食品中链霉素的检测试剂盒，其特征在于，所述的受体微球的浓度为14～18μg/ml，所述的供体微球的浓度为12～15μg/ml，所述的生物素化链霉素的浓度为6～8μg/ml。

4.根据权利要求3所述的食品中链霉素的检测试剂盒，其特征在于，所述的受体微球的浓度为15μg/ml，所述的供体微球的浓度为13μg/ml，所述的生物素化链霉素浓度为6μg/ml。

5.根据权利要求1所述的食品中链霉素的检测试剂盒，其特征在于，所述的受体微球的缓冲溶液为含有0.25wt.%鸡卵清白蛋白、0.03%v/v Proclin-300的磷酸盐缓冲液，所述的生物素化链霉素的缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述的供体微球的缓冲溶液为终浓度为20mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.15mol/L NaCl和0.04%v/v Proclin-300、pH值7.6的溶液。