CN102766211A - 用于检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能识别阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂的特异性单克隆抗体, 它是由杂交瘤细胞株4F2所分泌的,所述的杂交瘤细胞株4F2,保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:C201248。本发明还公开了检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的酶联免疫方法及其试剂盒。与现有技术相比,本发明制备的单克隆抗体可以同时识别阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂,本发明的酶联免疫方法和试剂盒一次测定即可检出动物饲料或可食性动物组织中的残留,具有简便、快速、灵敏、准确等优点,同时具有样品处理方法简单,易操作,对操作者身体健康危害小等优点。
Description
技术领域
本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域,具体涉及一种能识别阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂的单克隆抗体和一种用于检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的酶联免疫方法(ELISA)及试剂盒。
背景技术
阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂属于有机胂类兽药,具有苯胂酸的基本结构,广谱抗菌,对多种肠道致病菌有较强的抑制和杀灭作用,同时对防止猪腹泻、鸡球虫、黑头病有良好的效果,在畜牧生产中广泛用作猪和鸡的饲料添加剂。
有机胂类为一种毒性很低的化合物,吸收率低,代谢和排泄快,组织中残留较少,毒副作用表现为食欲不振、体重减轻、神经麻痹、腹泻和共济失调,有时出现各种类型的皮炎,甚至有可能使部分家畜死亡。由于该类药物在畜禽养殖中广泛使用,大量的含砷的化合物进入环境中,造成土壤和水体污染,含砷化合物在环境中有较强的蓄积、迁移和转化能力,进入食物链后,直接或间接对人类健康造成的危害。鉴于此我国农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》对有机胂药物在动物性食品中残留制定了最高残留限量。现有的阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留量的方法主要是仪器分析法,其中液相色谱法(HPLC)是可食性动物产品和饲料中有机胂残留检测应用最广泛的方法。仪器分析方法虽然灵敏、准确、分离度高并且可进行多残留检测的定性、定量研究,但是需要昂贵的仪器、繁琐的前处理、熟练的专业操作员。如果采用仪器分析法进行大批量样品的检测,其成本将非常高;而且在目前的国家检测机构中大部分只有省市级才配备有精密的分析仪器,因此需要建立一个从筛选到确证的检测体系。有关有机胂的残留确证方法已经相对完善,但可用于大批量样品初筛的检测方法研究较少,免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附分析技术具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点,适合高通量样品筛选,因此对于快速检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂在动物组织中的残留,ELISA方法更具优势。
申请号为201010100397.3的中国发明专利公开了一种检测洛克沙胂残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法,该专利利用洛克沙胂重氮化后与人血清白蛋白(HSA),卵清蛋白(OVA)偶联,制备人工抗原后通过单克隆抗体技术得到对洛克沙胂具有特异性的抗体,通过胶体金标记,制备免疫层析试纸条。该产品只能用于洛克沙胂的检测(500μg/L消线),不能对多种有机胂药物进行残留监控。
发明内容
本发明的目的为:
(1)提供一种能识别阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂的单克隆抗体;
(2)提供所述单克隆抗体在制备阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留检测酶联免疫试剂盒中的应用;
(3)提供一种含有所述单克隆抗体的酶联免疫试剂盒;
(4)提供所述酶联免疫试剂盒在阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留检测中的应用;
(5)利用该单克隆抗体,建立一种能检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的ELISA方法;
(6)提供一种所述的ELISA方法在阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留检测中的应用。
上述目的是通过以下技术方案实现的:
一种鼠源单克隆抗体,能识别阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂,其特征在于:它是杂交瘤细胞株4F2所分泌的。
所述的杂交瘤细胞株4F2,保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:C201248。
所述的单克隆抗体,其特征在于,它是以阿散酸(ASA)与亚硝酸钠重氮化后的偶氮化合物(DIA-ASA)与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到的偶联物(DIA-ASA-BSA)作为免疫原制备得到的。
所述的单克隆抗体在制备检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的酶联免疫试剂盒中的应用。
包含所述的单克隆抗体的试剂盒。
所述的试剂盒是检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的酶联免疫试剂盒。
所述的试剂盒在阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留检测中的应用。
一种检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的酶联免疫方法,包括免疫原、包被原和抗体的制备,其步骤如下:
(1)将阿散酸与亚硝酸钠重氮化后的偶氮化合物(DIA-ASA)与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原(DIA-ASA-BSA);
(2)将阿散酸在戊二醛(glutaraldehyde, GA)作用下与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原(ASA-GA-OVA);
(3)用步骤(1)的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO:C201248的杂交瘤细胞株4F2;
(4)用保藏号为CCTCC NO:C201248的杂交瘤细胞株4F2制备单克隆抗体;
(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体;
(6)样品前处理:饲料样品粉碎后用饲料提取液温育,然后用稀释液稀释后检测;肌肉样品均质后用组织提取液提取,然后氮气吹干,最后用稀释液稀释,得待测物;
(7)对步骤(6)的待测物进行检测。
其中,
饲料提取液的组分及配比为:量取200mL甲醇,缓慢倒入800mL的样品稀释液中,混匀。
组织提取液的组分及配比为:称取50mL20%三氯乙酸,加入至950mL乙腈中,混匀。
样品稀释液的组分及配比为:NaCl 8.0g,KH2PO4 0.2g,Na2HPO4·12H2O 2.9g,KCl 0.2g,加双蒸水定容至1000mL。
所述的酶联免疫方法在阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留检测中的应用。
本发明的有益效果是:
1、本发明在抗体制备时,采用阿散酸作为半抗原,该半抗原体现了有机胂所共有的化学结构苯胂酸,由该半抗原制备的单克隆抗体可同时识别阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂。
2、本发明建立的ELISA方法和试剂盒能同时检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂,一次测定即可检出阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂在动物饲料中含量或可食性动物组织中的残留,本发明的ELISA方法和试剂盒在检测药物的种类上具有明显的优势,可以节省对样品的分析次数,具有更好的经济价值。
3、本发明的ELISA方法和试剂盒适用的检测样品包括动物饲料和动物肌肉,本发明涉及的样品处理方法简单,易操作,样品处理所用的主要有机试剂为乙腈和甲醇,对操作者身体健康危害相对较小。
4、本发明的ELISA方法和试剂盒检测灵敏度、准确度高,精密度好。
附图说明
图1为本发明的单克隆抗体与阿散酸标准品的间接竞争ELISA反应曲线,X轴为阿散酸(ASA)标准溶液浓度对数值,Y轴为阿散酸标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B0)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明,但不限制本发明。
实施例1 免疫原和包被原的制备
1.3 重氮化的阿散酸-牛血清白蛋白偶联物 (DIA-ASA-BSA)的制备
称取21.7mg阿散酸溶解于1mL 0.1mol HCl中,调pH=1~2,4℃缓慢加入100mg/mL NaNO2溶液至淀粉碘化钾试纸变蓝,冰浴避光反应45min。反应结束用少量50mg/mL氨基磺酸氨中和过量的NaNO2。取70mg BSA溶解于10mL的碳酸盐缓冲液(准确称取Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g,少量去离子水溶解,定容至1000 mL。),用1M NaOH调整PH=9~10,冰浴中缓慢滴加第一步反应液,并不断调整pH值8~9,4℃反应过夜。反应完毕后,用4℃生理盐水透析3d,每天更换透析液2次,即得偶联物DIA-ASA-BSA。离心后取上清冷冻干燥,置-20℃保存。反应式如下:
1.4 阿散酸-戊二醛-卵清蛋白偶联物(ASA-GA-OVA)的制备
取132mg OVA溶于15mL 磷酸盐缓冲液(PBS) 中,为A液。阿散酸21.7mg溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺中,为B液。室温条件下,将B液缓慢滴入A液中,然后缓缓加入0.1mL戊二醛溶液,室温反应6h。离心后取上清,4℃生理盐水中透析3d,每天更换透析液2次,即得偶联物ASA-GA-OVA。2000rpm离心后取上清冷冻干燥,置-20℃保存,作为包被原用。反应式如下:
实施例2 单克隆抗体的制备
2.1动物免疫
利用实施例1制备的重氮化的阿散酸-牛血清白蛋白偶联物(DIA-ASA-BSA)免疫Balb/C小鼠(购自湖北省医学科学院实验动物中心)。免疫程序是取含DIA-ASA-BSA偶联物50~100μg的蛋白溶液与佐剂等量混合后注入小鼠体内,使其产生特异性血清。
2.2细胞融合和克隆化
参照杨汉春《动物免疫学》,利用DIA-ASA-BSA免疫原免疫Balb/C小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心),免疫程序为:基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后,于小鼠背部皮下多点注射,以后每间隔2周加强免疫一次,换用不完全佐剂乳化。最后于融合前三天(最好于免疫结束后休整1月)腹腔注射,强化免疫,抗原量加倍,不加佐剂。
融合时,取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只,眼眶放血处死(收集血清,即为阳性血清),在75%酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏,分离出脾细胞,与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞来自本实验室)按1~2×107个SP2/0与108个免疫脾细胞(1:10~1:15)的比例于50mL离心管,用15mLRPMI-1640基础液重悬细胞,1500r/min离心5min,洗细胞1次。离心的间隙将温浴的培养基,温浴的水,温浴的聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)等放入超净台。然后取出灭菌的吸水纸,将装有骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的离心管上清倒尽后,倒扣在吸水纸上控干水滴,轻敲管底使细胞松动。打开计时器,用1mL吸管吸取0.8mLPEG,手持装有混合细胞的离心管,将其放置在水浴中片刻,将PEG缓慢的滴加到混合细胞上,边加边轻轻搅拌,1min内加完,持续搅拌30s。用吸管取10mL基础液,沿管壁缓慢加到融合细胞上,边加边轻轻摇动(不能吹打),5min内分别加1mL,2mL,3mL,4mL,最后补加基础液到40mL,加完后,盖上盖子,反复颠倒几次,使细胞混匀。800r/min 5min离心,弃上清。吸取含有饲养细胞的HAT培养基,用吸管将离心管中的融合细胞轻轻搅拌起来,液面附近逐滴滴入到含饲养细胞的血清瓶中,搅拌混匀,动作要轻将细胞轻轻搅拌起来,千万不要吹打。颠倒混匀。然后将细胞接种在细胞培养板上,每孔两滴,置于培养箱中培养。一次融合可接种4~6块96孔板。根据需要也可少种,一般按SP2/0的细胞数计算,每孔接种量约含104左右个SP2/0细胞。于37℃,5% CO2培养箱中培养。
融合的当天计为0d,前3d尽量不要动细胞板,保持培养箱内环境稳定。第3d每孔补加1滴HAT完全培养基;第5d每孔吸出l/2培养上清(100μL),再加入1滴HT完全培养基;以后每隔2d同上法吸去l/2~3/4培养上清,在7d后换入HT完全培养基。
待融合细胞集落长至培养孔1/10~1/5,同时用建立的间接ELISA方法进行筛选。与零药物孔相比,药物孔OD值能被抑制的判为阳性。根据抑制率和细胞集落生长状况,选择2~6个强阳性的仅有1-2个单集落的细胞孔,采用有限稀释方法进行克隆化。
经过3~4次克隆,最终筛选出分泌抗阿散酸抗体的单克隆杂交瘤细胞株,申请人将其命名为4F2,并于2012年4月6日送位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏编号为CCTCCNO:C201248。对该细胞系进行了染色体计数,结果显示,SP2/0的染色体的平均数为58,脾细胞染色体为40条,而杂交瘤细胞的染色体数目为102.1,说明融合细胞的确是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。将该细胞株经腹腔注射Balb/C小鼠,生产单克隆抗体。采用购自ROCKLAND公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse Mab Isotyping TestKit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定,结果为小鼠IgG2b亚型。
实施例3 阿散酸间接竞争ELISA检测方法的建立
3.1 试剂的配制(本实施例使用的试剂除另注明外均采用以下方法配制)
磷酸盐缓冲液:NaCl 8.0g,KH2PO4 0.2g,Na2HPO4.12H2O 2.9g,KCl 0.2g,加双蒸水至1000mL,调节pH至7.4;
包被液:取Na2CO3 1.59g,NaHCO3 2.93g,加三蒸水至1000mL,调节pH值至9.6;
洗涤液:NaCl 8.0g,KH2PO4 0.2g,Na2HPO4.12H2O 2.9g,KCl0.2g,Tween 20 0.5mL,加双蒸水至1000mL,调节pH至7.4;
封闭液:卵清蛋白1g溶于100mL磷酸盐缓冲液中;
底物液A:3, 3', 5', 5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg,无水乙醇100mL,加双蒸水至1000mL;
底物液B:Na2HPO4 14.6g,柠檬酸9.3g,0.75%过氧化氢脲6.4mL,加双蒸水至1000mL;
底物混合液:将A液和B液按体积比1:1混合即得,现配现用;
终止液:2mol/L硫酸溶液。
3.2 包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定
选择上述合成的ASA-GA-OVA作为包被原,用包被液稀释成16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L、0.125mg/L等8个浓度,在96孔酶标板,从第一至第八列依次加入,4℃过夜;洗涤3次,拍干,加入封闭液200μL,37℃封闭60min;洗涤3次,拍干,在酶标板的第一行至第八行依次加入100μL磷酸盐缓冲液稀释的稀释倍数为8000、16000、32000、64000、128000、256000、512000、1024000的单克隆抗体,37℃孵育30min,洗涤3次,拍干;各孔加入1:5000倍磷酸盐缓冲液稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(简称二抗,以下所指二抗均为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体,购自武汉飞弈生物技术有限公司)100μL,37℃孵育30min,洗涤5次,拍干;各孔加入100μL底物混合液,避光显色15min,加入50μL终止液,用自动酶标仪在450nm波长处测定光密度值(OD值),结果见表1。
结果表明,初步确定包被原ASA-GA-OVA的包被浓度为1mg/L或2mg/L,抗体工作浓度为1:256000或1:512000。
表1 包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定
3.3 最佳包被原浓度和抗体工作浓度的确定
以初步确定的包被原ASA-GA-OVA包被浓度,设置2mg/L、1mg/L 2个浓度包被酶标板。将阿散酸用磷酸盐缓冲液稀释成4800μg/L、2400μg/L、1200μg/L、600μg/L、300μg/L、0μg/L 6个浓度,将1:256000磷酸盐缓冲液稀释的单克隆抗体(因为作间接竞争ELISA时,单克隆抗体的加样体积减小了一半,相应地单克隆抗体稀释度减小一半)和上述阿散酸溶液各加50μL进行间接竞争ELISA。以阿散酸浓度对数值作为横坐标,以阿散酸标准溶液的OD值与“零”孔OD值的比值(B/B0)作为纵坐标绘制抑制曲线,选择线性较佳、产生50%抑制时阿散酸浓度(IC50)较低者作为包被浓度。以最佳包被原浓度包被酶标板,将阿散酸稀释成4800μg/L、2400μg/L、1200μg/L、600μg/L、300μg/L、0μg/L 6个浓度,将抗体以中心浓度1:300000等差设置4个稀释度,单克隆抗体和系列浓度阿散酸标准溶液各加50μL进行间接竞争ELISA,绘制抑制曲线,选择线性较佳、IC50值较低者作为最佳抗体工作浓度。结果见表2。
表2 最佳包被原浓度和抗体工作浓度的确定
包被原浓度(mg/L) | IC50(μg/L) | 抗体稀释度(1:X) | IC50(μg/L) |
2 | 1203 | 260000 | 1220 |
1 | 1015 | 300000 | 970 |
340000 | 1034 | ||
380000 | 997 |
结果表明,随着包被原浓度降低,IC50有所降低,考虑到包被原过低时,“零”孔OD值偏低,因此采用1mg/L作为最佳包被浓度。随着单克隆抗体稀释度的增加,IC50逐渐降低并保持稳定,但考虑抗体稀释度过大时,“零”孔OD值偏低,因此采用1:300000作为最佳抗体工作浓度。
3.4 标准曲线的建立
将阿散酸用磷酸盐缓冲液配制成4800μg/L、2400μg/L、1200μg/L、600μg/L、300μg/L、0μg/L 6个系列浓度,每个浓度重复5孔,按照间接竞争ELISA方法测定,重复测定5次。以阿散酸溶液浓度的对数值为横坐标,B/B0为纵坐标绘制标准曲线,求出IC50。本试剂盒的IC50值为913.72±70.05 μg/L。
3.5 交叉反应试验
将有机胂类药物用磷酸盐缓冲液配制成适当浓度,用建立的ELISA方法测定各药物的IC50值,每个药物3个复孔,以单克隆抗体对阿散酸的交叉反应率为100%,利用公式1计算单克隆抗体对各药物的交叉反应率,结果见表3。
表3 本发明试剂盒对各种有机胂类药物的交叉反应率
药物 | IC50(μg/L) | 交叉反应率(%) |
阿散酸 | 913.7 | 100 |
硝苯胂酸 | 78.8 | 1159.5 |
卡巴胂 | 107.6 | 849.2 |
苯胂酸 | 603.4 | 151.4 |
洛克沙胂 | >90000 | <1 |
结果表明,单克隆抗体对阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂有较高的交叉反应率,可用于饲料和动物组织中阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的ELISA检测。
实施例4 本发明阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂多残留检测ELISA试剂盒的组装
4.1本发明ELISA试剂盒由下述部分组成:
1)包被有包被原ASA-GA-OVA的固相载体(酶标板);
2)阿散酸标准溶液6瓶,浓度分别为4800μg/L、2400μg/L、1200μg/L、600μg/L、300μg/L、0μg/L;
3)保藏号为CCTCC NO:C201248的杂交瘤细胞株4F2分泌的单克隆抗体;
4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液;
5)浓缩磷酸盐缓冲液:NaCl 80.0g,KH2PO4 2.0g,Na2HPO4.12H2O 29.0g,KCl 2.0g,加双蒸水至1000mL;
6)浓缩洗涤液:NaCl 80.0g,KH2PO4 2.0g,Na2HPO4.12H2O 29.0g,KCl 2.0g,Tween20 5mL,加双蒸水至1000mL;
7)底物液A:3, 3', 5', 5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg,无水乙醇100mL,加双蒸水至1000mL;
8)底物液B:Na2HPO4 14.6g,柠檬酸9.3g,0.75%过氧化氢尿素6.4mL,加双蒸水至1000 mL,调节pH至5.0~5.4;
9)终止液:2mol/L硫酸溶液。
4.2 酶标板的制备
用包被液将ASA-GA-OVA稀释成1mg/L,每孔加入100μL,4℃过夜,倾去包被液,每孔加入250μL洗涤液洗涤3次,拍干,然后每孔加入封闭液250μL,37℃孵育60min,倾去孔内液体,洗涤液洗涤3次,拍干,用锡箔纸真空密封保存。
实施例5 本发明的酶联免疫试剂盒的测定程序
5.1 试剂的配制
1)样品稀释液:将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用三蒸水稀释10倍后使用。
2)洗涤液:将试剂盒中提供的洗涤液用三蒸水稀释10倍后使用。
3)底物混合液:根据每次所需用量,将配制的底物液A和底物液B按体积1:1混匀,现配现用。
5.2样品前处理
1、猪、鸡、鱼肌肉样品的前处理:
1)称取肌肉样品均质物2.0g于50mL离心管中,加入酸化乙腈8mL,剧烈振荡5min后,室温4000 rpm离心10min;
2)取上清液4mL,50℃氮气吹干,加入样品稀释液 0.5mL(阿散酸)或样品稀释液 4mL(硝苯胂酸和卡巴胂),充分溶解后供试剂盒测定,本处理对组织样品的稀释系数为0.5(阿散酸)或4(硝苯胂酸和卡巴胂)。
2、猪、鸡、鱼饲料样品的前处理(注:本研究选用的为中猪料和肉鸡料):
1)称取粉碎饲料2.0g于50mL离心管中,加入20%甲醇水溶液10mL,剧烈振荡5min后,60℃加热30min,室温4000rpm离心10min;
2)取上清液稀释10倍,后供试剂盒检测(用于阿散酸的检测),本处理对饲料样品的稀释系数为50;取上清液稀释200倍,后供试剂盒检测(用于硝苯胂酸和卡巴胂的检测)本处理对饲料样品的稀释系数为1000;
其中,
饲料提取液的组分及配比为:量取200mL甲醇,缓慢倒入800mL的样品稀释液中,混匀。
组织提取液的组分及配比为:称取50mL20%三氯乙酸,加入至950mL乙腈中,混匀。
样品稀释液的组分及配比为:NaCl 8.0g,KH2PO4 0.2g,Na2HPO4·12H2O 2.9g,KCl 0.2g,加双蒸水定容至1000mL。
5.3 测定步骤
1)加样:向酶标板微孔中加入阿散酸系列浓度标准溶液或样品溶液50μL,然后加入单克隆抗体工作液50μL,置于湿盒中,37℃恒温孵育30min;
2)洗涤:倒出孔中的液体,每孔中加入洗涤液250μL洗涤3次并拍干;
3)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液:每孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL,置于湿盒中,37℃恒温孵育30min;
4)洗涤:倒出孔中的液体,每孔中加入洗涤液250μL,洗涤3次并拍干;
5)加底物:每孔中加入底物混合液100μL,置于湿盒中,37℃恒温孵育15min;
6)加终止液:每孔中加入终止液50μL;
7)测定:用酶标仪在450nm处测定每孔的光密度值(OD值)。
5.4 结果判断
标准曲线:
以所测定的标准品OD值除以“零”孔OD值(B/B0)为纵坐标,阿散酸浓度的对数值为横坐标作标准曲线,并进行线性回归,给出回归方程。
肌肉中阿散酸浓度计算:
计算样品的抑制率(所获得的样品的OD值除以“零”孔OD值),代入标准曲线的回归方程中,并乘以稀释系数0.5,计算出肌肉中阿散酸浓度(μg/kg)按照公式2折算成硝苯胂酸或卡巴胂浓度(稀释倍数4,μg/kg)。
饲料中阿散酸、硝苯胂酸或卡巴胂浓度计算:
计算样品的抑制率(所获得的样品的OD值除以“零”孔OD值),代入标准曲线的回归方程中,并乘以稀释系数50,计算出饲料中阿散酸浓度(μg/kg),按照公式2折算成硝苯胂酸(NPA)或卡巴胂(CBA)浓度(稀释倍数1000,μg/kg)。
实施例6 本发明试剂盒的灵敏度、精密度、准确度、重复性试验
6.1 本发明试剂盒的灵敏度试验
以标准曲线的IC50值和组织最低检测限(LOD)作为本发明检测试剂盒的灵敏度指标。将阿散酸标准品稀释成为4800μg/L、2400μg/L、1200μg/L、600μg/L、300μg/L、0μg/L 6个浓度,每个浓度5个复孔,按照间接竞争ELISA方法重复测定5次,取5次测定的IC50的平均值。LOD通过以下步骤决定,测定20份空白饲料和肌肉样品的OD值,根据标准曲线的回归方程计算出相应的阿散酸浓度,然后计算出阿散酸浓度的平均值()和标准差(SD),根据公式LOD=+3SD计算出组织中的最低检测限。本发明的IC50值为913.72±70.05 μg/L,阿散酸在饲料和动物肌肉中的最低检测线详见表4、表5。
表4 饲料中三种药物的最低检测限
表5 动物肌肉中的最低检测限
6.2 本发明试剂盒的精密度试验
将阿散酸标准品稀释成4800μg/L、2400μg/L、1200μg/L、600μg/L、300μg/L、0μg/L 6个浓度,每浓度5个复孔,按照间接竞争ELISA 方法重复测定5次,应用标准曲线的回归方程计算出各浓度阿散酸标准溶液的测定值,计算板内和板间变异系数,结果见表6。
表6 标准曲线的板内及板间误差
6.3 本发明试剂盒的准确度、重复性试验
将三个浓度的三种有机胂药物分别添加到饲料样品中,其添加回收率在56.7%~113.5%之间,批内与批间变异系数≤10.9%;将三个浓度的三种有机胂药物添加到动物肌肉组织中,其添加回收率在63.9%~109.9%之间,批内与批间变异系数≤11.8%。具体测定结果见表7-13。
公式3:
表7 猪饲料中添加回收率
表8 鸡饲料中添加回收率
表9 鱼饲料中添加回收率
表10 鱼肌肉中添加回收率
表11 猪肌肉中添加回收率
表12 鸡肌肉中添加回收率
表13 鱼肌肉中添加回收率
Claims (9)
1.一种能识别阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂的单克隆抗体,其特征在于:它是由杂交瘤细胞株4F2所分泌的。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株4F2,保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:C201248。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,它是以阿散酸与亚硝酸钠重氮化后的偶氮化合物与牛血清白蛋白偶联后作为免疫原制备得到的。
4.权利要求1或3所述的单克隆抗体在制备检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的酶联免疫试剂盒中的应用。
5.包含权利要求1或3所述的单克隆抗体的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,该试剂盒是检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的酶联免疫试剂盒。
7.权利要求5所述的试剂盒在阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留检测中的应用。
8.一种检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的酶联免疫方法,其步骤如下:
(1)将阿散酸与亚硝酸钠重氮化后的偶氮化合物与牛血清白蛋白偶联得到免疫原;
(2)将阿散酸在戊二醛作用下与卵清蛋白偶联得到包被原;
(3)用步骤(1)的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO:C201248的杂交瘤细胞株4F2;
(4)用保藏号为CCTCC NO:C201248的杂交瘤细胞株4F2制备单克隆抗体;
(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体;
(6)样品前处理:饲料样品粉碎后用饲料提取液温育,然后用稀释液稀释后检测;肌肉样品均质后用组织提取液提取,然后氮气吹干,最后用稀释液稀释,得待测物;
(7)对步骤(6)的待测物进行检测,
其中,
饲料提取液的组分及配比为:量取200mL甲醇,缓慢倒入800mL的样品稀释液中,混匀;
组织提取液的组分及配比为:称取50mL20%三氯乙酸,加入至950mL乙腈中,混匀;
样品稀释液的组分及配比为:NaCl 8.0g,KH2PO4 0.2g,Na2HPO4·12H2O 2.9g,KCl0.2g,加双蒸水定容至1000mL。
9.权利要求8所述的酶联免疫方法在阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留检测中的应用。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109164258A (zh) * | 2018-10-16 | 2019-01-08 | 郑州大学 | 一种氨苯胂酸人工抗原、快速检测试纸条及其制备方法 |
CN109187948A (zh) * | 2018-08-17 | 2019-01-11 | 郑州大学 | 一种洛克沙胂和硝苯胂酸双联检测试纸 |
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CN114292325A (zh) * | 2020-09-14 | 2022-04-08 | 安顺学院 | 一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4485093A (en) * | 1982-08-13 | 1984-11-27 | Runge Richard G | Immunotoxin conjugate which comprises arsanilic acid, useful for treating malignant tumors, particularly pancreatic cancer |
US20040101920A1 (en) * | 2002-11-01 | 2004-05-27 | Czeslaw Radziejewski | Modification assisted profiling (MAP) methodology |
CN102199211A (zh) * | 2011-04-12 | 2011-09-28 | 中国农业大学 | 检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法及其专用酶联免疫试剂盒 |
-
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4485093A (en) * | 1982-08-13 | 1984-11-27 | Runge Richard G | Immunotoxin conjugate which comprises arsanilic acid, useful for treating malignant tumors, particularly pancreatic cancer |
US20040101920A1 (en) * | 2002-11-01 | 2004-05-27 | Czeslaw Radziejewski | Modification assisted profiling (MAP) methodology |
CN102199211A (zh) * | 2011-04-12 | 2011-09-28 | 中国农业大学 | 检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法及其专用酶联免疫试剂盒 |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109187948A (zh) * | 2018-08-17 | 2019-01-11 | 郑州大学 | 一种洛克沙胂和硝苯胂酸双联检测试纸 |
CN109187948B (zh) * | 2018-08-17 | 2021-10-29 | 郑州大学 | 一种洛克沙胂和硝苯胂酸双联检测试纸 |
CN109164258A (zh) * | 2018-10-16 | 2019-01-08 | 郑州大学 | 一种氨苯胂酸人工抗原、快速检测试纸条及其制备方法 |
CN114292325A (zh) * | 2020-09-14 | 2022-04-08 | 安顺学院 | 一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法 |
CN114292325B (zh) * | 2020-09-14 | 2024-03-22 | 安顺学院 | 一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法 |
CN113470757A (zh) * | 2021-04-16 | 2021-10-01 | 甘肃省化工研究院有限责任公司 | 一种重氮化工艺的热危险性分析方法 |
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