CN109164258A - 一种氨苯胂酸人工抗原、快速检测试纸条及其制备方法 - Google Patents

一种氨苯胂酸人工抗原、快速检测试纸条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氨苯胂酸人工抗原、快速检测试纸条及其制备方法，具体设计合成了一种氨苯胂酸的人工抗原，制备出了能识别氨苯胂酸的单克隆抗体，并研制得到氨苯胂酸快速检测试纸条。本发明的氨苯胂酸人工抗原以及单克隆抗体可以用于氨苯胂酸的免疫分析和筛选，提高检测效率，缩短检测时间，降低检测成本。本发明氨苯胂酸快速检测试纸条可检出动物饲料、土壤或可食性动物组织中氨苯胂酸的残留，特异性强，敏感性高，操作简便快速，在2分钟内即可判定检测结果；检测结果显示形象，直观，准确，成本低，投资少，不需要专用仪器设备及专业人员，容易推广实施。

Description

一种氨苯胂酸人工抗原、快速检测试纸条及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种氨苯胂酸人工抗原、快速检测试纸条及其制备方法属于生物技术领域。
背景技术
氨苯胂酸，又称对氨基苯砷酸，商品名为阿散酸，是白色、无嗅、无味的结晶性粉末，属于有机胂制剂类药物性饲料添加剂。早期氨苯胂酸主要用于鸡、猪的饲料中，作为抗菌剂、畜禽饲料添加剂，氨苯胂酸不仅起着补充畜禽所必需微量元素砷的营养性作用，它还起着重要药物作用，能促进蛋白质的合成，改变畜禽肠道细胞代谢，抑制肠道中有害细菌的生长，起着生长促进剂和抗菌剂等作用，是一种高度安全的多功能饲料添加剂，在美国、加拿大、拉丁美洲、东南亚等许多国家和地区得到广泛应用。
然而，俗话说“是药三分毒”，药物都具有双重作用。同样，兽药也是一把“双刃剑”，合理使用可以防治动物疾病，促进养殖业健康发展，不会出现抗生素残留超标情况；但不规范用药则会引发畜禽的群体性危害，造成兽药残留超标、产生细菌耐药性和畜禽产品质量安全等问题。
氨苯胂酸使用剂量过大、使用时间过长等会引起蓄积性中毒，导致动物发生中毒或死亡，且其可能残留在肉食品中，从而对人体产生危害。据文献报道，氨苯胂酸的LD50是1710mg/kg属低毒类，但其对水生生物和土壤生物具有遗传毒性效应。氨苯胂酸降解之前和降解的第4周对鲤鱼肾细胞DNA有显著损伤，表现出明显的遗传毒性作用。氨苯胂酸降解开始后，各浓度的降解混合物体系都能引起蚯蚓体腔细胞DNA的明显损伤，表现出较强的遗传毒性作用。氨苯胂酸的毒性反应是由五价砷引起的，它与无机砷化合物产生的毒性反应不同，其损害的特点是外周神经和视神经束的脱髓鞘作用及神经胶质增生。这种组织学病变要在喂后6-10d才能观察到，其临床症状为肌肉活动缺乏协调，共济运动失调和瘫痪，中毒的禽类会致盲甚至死亡。一般认为，在饲料中添加量如达到推荐剂量10倍时，动物在几天内便会发生中毒。猪氨苯胂酸中毒出现的最早症状是增重缓慢，并呈进行性发展，中毒初期出现后肢运动失调和轻瘫，中毒进一步发展，动物出现四肢轻瘫，病猪呈犬坐姿势或倒地，逐渐呈现失明。此外，病猪常出现皮炎。鸡日粮中添加对阿散酸达1000mg/kg时会引起生长率降低，添加量达1500mg/kg时出现中毒，当添加量为2000mg/kg或更高时，第9-12d就会发生大量死亡。鸡中毒的症状除生长率降低外，还表现为虚弱，头抖、缩头，共济失调，瘫痪，失明。
近年来，由于广大农户不了解氨苯胂酸的毒性，大剂量使用导致猪死亡的事件时有发生。1999年，武义县发生仔猪氨苯胂酸慢性蓄积中毒；2003年漳州市郊发生仔猪应激性死亡，是因为自配料有机砷中毒引发的。2005年陕西省某规模化猪场在生长育肥猪全价料中添加了0.2％的氨苯胂酸导致猪中毒。2006年广西某猪场为防止仔猪胃肠道疾病，按800mg/kg的添加量在断奶仔猪饲料中添加氨苯胂酸，饲喂后第3d陆续有20-30％的仔猪发生中毒。
肉类食品中残留的重金属砷并不能通过水洗、浸泡、加热、烹炒等人们常用的方法来减少，因为重金属是通过饲养等生长过程中逐步渗入食品中的，并不存在于表面，所以通常的办法是无效的。当使用剂量过大时，休药后期砷不能全部排出，就会造成肉品中砷的残留。美国一消费者协会的检测结果发现，超市和快餐店出售的许多品牌的鸡肉产品普遍含有砷。在美国大约有70％的禽类饲料中添加有机砷。在抽查的155份超市生鸡肉产品中55％含有砷，IATP检测的90份快餐鸡肉产品中也全部含砷。专家指出，鸡肉中砷的平均含量可能高于以往所估计的水平。齐德生等报道，在蛋鹌鹑饲料中添加氨苯胂酸，经25d饲养后，添加氨苯胂酸组鹌鹑肌肉组织、脏器、蛋中总砷含量显著提高，且随氨苯胂酸添加水平的增加而增加。
张玮等(2007)从生命周期的角度识别并定量评价了氨苯胂酸生产、使用和残留过程的环境影响，结果表明氨苯胂酸在土壤中最终残留的环境影响占其整个生命周期的99％以上。环境中的重金属及其它金属元素会通过食物链在鸟体内富集。另外，土壤中过量的砷会危害植物的生长。
氨苯胂酸添加剂严重危害畜禽健康，它几乎是以原有的形态从家禽和猪的体内快速排出，摄入的砷最终都出现在粪便和尿液中。我国畜禽养殖业规模庞大，因此由畜禽排泄物向环境中排放砷的数量巨大。氨苯胂酸通过畜禽排泄物进入生态环境，砷化物的毒性，不但对人体有害，还会造成严重的环境污染。因此，为保障动物产品质量安全，维护公共卫生安全和生态安全，农业部组织对喹乙醇预混剂、氨苯胂酸预混剂、洛克沙胂预混剂3种兽药产品开展了风险评估和安全再评价，该评价认为喹乙醇、氨苯胂酸、洛克沙胂等3种兽药的原料药及各种制剂可能对动物产品质量安全、公共卫生安全和生态安全存在风险隐患。根据《兽药管理条例》第六十九条规定，农业部于2017年7月建议停止氨苯胂酸等3种药物饲料添加剂在食品动物使用；2018年1月农业部停止受理喹乙醇、氨苯胂酸、洛克沙胂等3种兽药的原料药及各种制剂兽药产品批准文号的申请；2018年5月1日起，停止生产喹乙醇、氨苯胂酸、洛克沙胂等3种兽药的原料药及各种制剂，相关企业的兽药产品批准文号同时注销，2018年4月30日前生产的产品，可在2019年4月30日前流通使用；自2019年5月1日起，停止经营、使用喹乙醇、氨苯胂酸、洛克沙胂等3种兽药的原料药及各种制剂。
目前氨苯胂酸的检测方法主要有：液相色谱分离(HPLC)与原子荧光光谱(AFS)以及石墨炉原子吸收光谱(GFAAS)等联用技术。但原子荧光光谱(AFS)分析实际样品时有干扰效应，同时样品基体产生的光散射和背景也会影响结果的读取，并且将HPLC直接与GFAAS连接极为困难。HPLC与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)联用，使HPLC的高分离能力与ICP-MS在元素分析中极高的灵敏度有效结合，成为元素形态分析最为有效的途径。近年来HPLC与ICP.MS联用技术在水及水产品中得到应用，虽然该技术具有灵敏度高、线性范围宽等优点受到青睐，但是其价格昂贵、维护费用高、导致应用不够广泛。用了微波消解法的提取方法，但是由于微波消解每次处理的样品量较少限制了测定的效率。因此在实际生产中急需一种快速检测氨苯胂酸的检测方法。目前各级检测部门加强氨苯胂酸的检测力度，以确保人民群众动物性食品的安全。因此研制灵敏、快速、准确的氨苯胂酸检测方法，检测家畜组织及饲料中是否含氨苯胂酸的残留有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种氨苯胂酸人工抗原、快速检测试纸条及其制备方法，该试纸条具有简便、快速、敏感、特异等优点，可实现现场实时检测。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种氨苯胂酸人工抗原，分子结构式如下：
其中，Protein表示载体蛋白。
载体蛋白为BSA、OVA、或KLH。
一种氨苯胂酸人工抗原的制备方法，是利用EDC活化BSA的羧基基团，然后使氨苯胂酸苯环上的氨基与BSA上活化的羧基发生缩合反应，得到氨苯胂酸人工抗原ASA-BSA。
具体的，氨苯胂酸人工抗原ASA-BSA的制备方法，包括以下步骤：
(1)A液：准确称取10mg BSA、55mg EDC和33mg NHS，充分溶解于2mL 0.01M PBS中，4℃避光条件下混合反应6h，得到反应液A；
B液：准确称取氨苯胂酸7mg，充分溶解于2.5mL 0.01M PBS中，得到反应液B；
(2)将B液逐滴滴加至A液中，边滴加边搅拌，密封避光，4℃反应过夜，反应完毕后，在4℃条件下，用PBS透析72h，每天更换透析液3-6次，即得。
一种氨苯胂酸单克隆抗体，是能与氨苯胂酸人工抗原发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。
一种氨苯胂酸单克隆抗体的制备方法，将氨苯胂酸人工抗原免疫小鼠，并进行细胞融合、克隆化，得到氨苯胂酸单克隆抗体。
一种氨苯胂酸单克隆抗体在制备氨苯胂酸快速检测试纸条中的应用。
一种氨苯胂酸快速检测试纸条，包括支撑板和吸附层，吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫、检测膜及吸水垫，其中在检测膜上有用氨苯胂酸人工抗原溶液印制的检测印迹，和用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的对照印迹；结合垫上吸附有胶体金标记的氨苯胂酸单克隆抗体。
一种氨苯胂酸快速检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)氨苯胂酸人工抗原的合成
用EDC活化BSA的羧基基团，然后使氨苯胂酸苯环上的氨基与BSA上活化的羧基发生缩合反应，得到氨苯胂酸人工抗原ASA-BSA；
(2)单克隆抗体的制备
将合成的ASA-BSA免疫小鼠，并进行细胞融合、克隆化，得到氨苯胂酸单克隆抗体；
(3)羊抗或兔抗小鼠IgG的制备
以纯化小鼠IgG免疫健康羊或家兔，制备羊抗或兔抗小鼠IgG；
(4)金标抗体的制备
以柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金，并标记步骤(2)制备的单克隆抗体；
(5)试纸的研制
(a)将氨苯胂酸人工抗原溶液和羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液分别喷点于检测膜中央，形成检测印迹T和质控印迹C；
(b)将金标抗体喷点于玻璃棉，制得结合垫；
(c)将样品垫、结合垫、检测膜及吸水垫依次组装在支撑板上。
一种氨苯胂酸快速检测试纸条在检测氨苯胂酸残留中的应用。
本发明有益效果：
(1)本发明在抗体制备时，采用氨苯胂酸作为半抗原，利用EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)活化BSA或OVA的羧基，进而与氨苯胂酸的氨基进行偶联，研制出氨苯胂酸的人工抗原，该免疫原ASA-BSA具有良好的免疫原性，用30μg ASA-BSA免疫小鼠，三免后测小鼠血清效价可达1:102400，间接竞争ELISA测得小鼠三免血清IC50为312.5ng/mL。
(2)本发明研制的ASA快速检测试纸条具有较高的特异性和敏感性。该试纸以胶体金标记的高亲和力的单克隆抗体10G9为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，两者通过异性电荷间的范德华力相结合，对胶体金标记的单克隆抗体10G9特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，该快速检测试纸条具有较高的特异性和敏感性，可检测到1.25ng/mL的微量ASA。
(3)本发明研制的试纸操作简便快速。使用本发明试纸进行检测时无需任何其他试剂，只需要将其插入进过处理的待检样品10s左右，在2min内即可判定检测结果。
(4)本发明研制的试纸以显示红棕色“|”及“||”印迹作为检测的阳性和阴性标记。在检测膜上显示一条棕红色“|”印迹表示在检测样品液中含有ASA，两条棕红色“||”印迹表示在样品液中不含有ASA，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。
(5)本发明的快速检测试纸条成本低，投资少。不需要另外配置昂贵的仪器及其他试剂，随时随地可以进行检测，费用低，节省大量昂贵仪器和设备的费用。
(6)本发明的快速检测试纸条操作简单，应用范围广，易于推广应用。能满足不同层次人的需要，涉及专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖和个体养殖等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
附图说明
图1为氨苯胂酸人工免疫抗原ASA-BSA紫外扫描鉴定结果。
图2为氨苯胂酸人工包被抗原ASA-OVA紫外扫描鉴定结果。
图3为氨苯胂酸人工抗原SDS-PAGE鉴定结果。
图4为氨苯胂酸快速检测试纸条结构示意图。
图5为氨苯胂酸快速检测试纸条结果判定示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
本发明氨苯胂酸快速检测试纸条的制备方法包括：(1)氨苯胂酸人工抗原的合成；(2)单克隆抗体的制备；(3)羊抗或兔抗小鼠IgG的制备；(4)金标抗体的制备；(5)试纸的研制。
实施例1、氨苯胂酸人工抗原的合成
1.1人工抗原的制备
采用碳化亚胺法，将氨苯胂酸(半抗原)与载体蛋白进行偶联制备人工完全免疫抗原和包被抗原：
(1)A液：准确称取10mg牛血清白蛋白BSA(或13mg鸡卵清白蛋白OVA)、55mg EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)和33mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，充分溶解于2mL 0.01M PBS中，4℃避光条件下混合反应6h，得到反应液A；
B液：准确称取氨苯胂酸7mg，充分溶解于2.5mL 0.01M PBS中，得到反应液B；
(2)将B液以50μL/滴逐滴滴加至A液中，边滴加边搅拌，密封避光，4℃反应过夜；
(3)将氨苯胂酸人工抗原混合液转移至透析袋内，在4℃条件下，用0.01M PBS(pH7.4)透析72h，每天更换透析液3-6次，最后将透析袋中的液体分装至1.5mL离心管中，1mL/管，得到氨苯胂酸人工免疫抗原(ASA-BSA)或包被抗原(ASA-OVA)混合液，于-20℃保存。
透析袋前处理：将透析袋剪成10cm左右小段，在含有20g/L NaHCO3(2％w/v)和372mg/mL EDTA·2Na(1mmol/L)的溶液中，将透析袋煮沸10min，用双蒸水彻底漂洗，并煮沸3-5min，保存在4℃30％-50％(v/v)的乙醇中备用。
合成路线如下：
1.2人工抗原的鉴定
氨苯胂酸的人工抗原采用分光光度法鉴定其偶联结果，利用标准蛋白得到标准曲线，计算其偶联比(图1、2)。从图1和图2中可以看出，载体蛋白BSA和OVA在220nm和280nm处两个最大吸收峰，ASA的最大紫外吸收峰在245nm和263nm处。而ASA-BSA的最大紫外吸收峰为236nm，相对于BSA和ASA都发生了偏移；ASA-OVA的最大吸收峰为225nm，相对于OVA和ASA均发生了偏移，因此证明人工抗原ASA-BSA和人工包被原ASA-OVA均偶联成功。
氨苯胂酸的人工抗原进行琼脂糖凝胶电泳(SDS)，并用BSA作对照鉴定其偶联结果(图3)。从图3中可以看出，ASA-BSA的泳动速率明显区别于BSA的泳动速率，说明BSA偶联ASA之后其分子质量发生了明显变化，ASA-BSA可能受分子带电荷量的影响导致ASA-BSA泳动速率小于BSA。
实施例2、单克隆抗体的制备
2.1动物免疫
利用EDC法合成的氨苯胂酸-牛血清白蛋白偶联物(ASA-BSA)溶液作为免疫抗原免疫Balb/C小鼠，免疫程序为：基础免疫将免疫抗原以30μg/只与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮下多点注射，以后每间隔3周加强免疫一次，且换用不完全佐剂乳化，基础免疫共四次，使其产生特异性血清。最后于融合前三天(最好于免疫结束后休整1月)腹腔注射，强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。
2.2小鼠多抗血清抗体效价的测定
用间接ELISA测定小鼠多抗血清的抗体效价，主要步骤如下：
(1)用0.05M CBS缓冲液(pH9.6)将ASA-OVA稀释至1mg/mL，100μL/孔包被酶标板，37℃下孵育2h(或4℃过夜)，用含0.05％(w/v)Tween-20的PBST洗6遍。
(2)用含5％猪血清(v/v)的封闭液封闭，每孔300μL，37℃下温育15min，用PBST洗6遍，可置于4℃保存备用。
(3)用PBS将多抗血清倍比稀释成1:200、1:400…1:204800，每孔100μL，设阴性血清对照(NC)和空白对照(BC)，37℃下孵育15min，用PBST洗6遍。
(4)加HRP标记的羊抗鼠IgG，用封闭液1:1000稀释，每孔100μL，37℃下温育30min，用PBST洗6遍。
(5)加酶底物TMB显色，室温反应5min。
(6)终止显色反应，每孔加入2mol/L H2SO4终止液100μL，用酶标仪读取OD450值。
(7)结果判定，以待测孔OD450/NC OD450≥2.1即P/N≥2.1，判为阳性，阳性孔的最大稀释度为待检样品的抗体效价。
测得小鼠多抗血清效价为1:102400，由此可知，该人工抗原具有良好的免疫原性。
2.3检测限测定
采用间接竞争ELISA测定半抗原对多抗血清的半数抑制浓度(IC50)，鉴定其对半抗原的检测限，步骤如下：
(1)首先以间接ELISA测定的多抗血清的抗体效价，以OD450值为1.0的抗体稀释度为最适工作浓度。
(2)在包被ASA-OVA的酶标板中加入适当稀释的多抗血清，100μL/孔，设PBS对照。
(3)再加入倍比稀释的标品ASA 100μL/孔，充分混匀，设置ASA空白对照，37℃下温育15min，洗板。
(4)加HRP标记的羊抗鼠IgG，用封闭液1:1000稀释，100μL/孔，37℃温育30min。
(5)加酶底物TMB显色，室温反应5min。
(6)终止显色反应，每孔加入2mol/L H2SO4终止液50μL，用酶标仪读取OD450值。
(7)结果判定：按公式IC50＝(OD空白-OD药物)/OD空白×100％，计算ASA对多抗血清的半数抑制浓度，确定抗体对半抗原的检测限。
ASA对多抗血清生物半数抑制浓度为312.5ng/mL，由此说明以ASA-BSA作为人工抗原产生的多抗血清含有针对ASA的抗体，再次证明本发明制备的人工抗原具有良好的免疫原性。
2.4细胞融合和克隆化
融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％(v/v)酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞按10:1-15:1的比例于50mL离心管，用RPMI-1640基础液重悬细胞，1500r/min离心5min，洗细胞1次。离心的间隙将温浴的培养基，温浴的水，温浴的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)等放入超净台。然后取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴，轻敲管底使细胞松动。
打开计时器，用1mL吸管吸取0.8mL PEG，手持装有混合细胞的离心管，将其放置在水浴中片刻，将PEG缓慢的滴加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，60s内加完，持续搅拌30s，静置1min。用吸管取10mL RPMI-1640基础液，沿管壁缓慢加到融合细胞上，边加边轻轻摇动(不能吹打)，5min内分别加1mL，2mL，3mL，4mL，最后补加RPMI-1640基础液到40mL，加完后，盖上盖子，反复颠倒几次，使细胞混匀。800r/min离心5min，弃上清。吸取含有饲养细胞的HAT培养基，用吸管将离心管中的融合细胞轻轻搅拌起来，液面附近逐滴滴入到含饲养细胞的血清瓶中，搅拌混匀，动作要轻将细胞轻轻搅拌起来，千万不要吹打，颠倒混匀，然后将细胞接种在细胞培养板上，每孔两滴，置于培养箱中培养。一次融合可接种4-6块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含104左右个SP2/0细胞。于37℃，5％CO2培养箱中培养。
融合的当天计为0d，前3d尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。第3d每孔补加1滴HAT完全培养基；第5d每孔吸出l/2培养上清(100μL)，再加入1滴HT完全培养基；以后每隔2d同上法吸去l/2-3/4培养上清，在7d后换入HT完全培养基。
待融合细胞集落长至培养孔1/10-1/5，同时用建立的间接ELISA方法进行筛选。与零药物孔相比，药物孔OD值能被抑制的判为阳性。根据抑制率和细胞集落生长状况，选择2-6个强阳性的仅有1-2个单集落的细胞孔，采用有限稀释方法进行克隆化。
经过3-4次克隆，最终筛选出分泌抗氨苯胂酸抗体的单克隆杂交瘤细胞株，将其命名为10G9。对该细胞系进行了染色体计数，结果显示，SP2/0的染色体的平均数为58，脾细胞染色体为40条，而杂交瘤细胞的染色体数目为102.1，说明融合细胞的确是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。将该细胞株经腹腔注射Balb/C小鼠，生产单克隆抗体。采用购自武汉艾美捷公司的抗鼠单克隆抗体亚型检测试剂盒对所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG2a亚型。
实施例3、羊抗或兔抗小鼠IgG的制备
用饱和硫酸铵法提取小鼠血清IgG，取1份体积小鼠血清加2份体积PBS(pH7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵混匀，置4℃冰箱2h，4℃、1200r/min离心15min，弃上清；以少量PBS(pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵至终浓度33％，置于4℃冰箱2h，4℃、1200r/min离心15min，弃上清，以少量PBS(pH7.2)溶解沉淀，置于4℃冰箱中，用PBS(pH7.2)过夜透析，换液2-3次，4℃、12000r/min离心15min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以50μg-100μg/kg体重(小鼠血清IgG)经皮下和肌肉，注射免疫健康羊或家兔3-4次，末次免疫10天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1:2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清，用饱和硫酸铵提取羊抗或兔抗小鼠IgG，用于ASA快速检测试纸条对照印迹的制备。
实施例4、金标抗体的制备
以柠檬酸钠还原法制备金标蛋白，即在50-100mL沸腾的0.01-0.05％(w/v)氯金酸水溶液中加入2-4mL的0.5-2％(w/v)柠檬酸三钠溶液，获得直径15nm左右的胶体金。以0.1mol/L的K2CO3调胶体金pH至8.5-9.5，置于以1:1000-1300的标记比将待标记的ASA单克隆抗体(10G9)加入pH8.5-9.5的胶体金中，标记10min后，加20％(w/v)PEG1000至终浓度0.05％，4℃、1500-3000rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000rpm离心1h，弃上清，获初步纯化金标蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖凝胶S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得ASA胶体金标记抗体。
实施例5、试纸的研制
5.1检测膜的制备
检测膜是用硝酸纤维膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。将检测膜置于XYZ3000喷点仪平台上，并以压条固定；用PBS分别将ASA-BSA人工抗原和兔抗小鼠IgG稀释至1mg/mL，经0.22μm滤膜过滤后，以1μL/cm分别将ASA-BSA人工抗原溶液和兔抗小鼠IgG抗体溶液喷点于检测膜中央，形成检测印迹T和质控印迹C(检测印迹与质控印迹相距0.5cm)，置42℃干燥箱30min或室温自然干燥后，于4℃干燥密闭保存。
5.2结合垫的制备
将玻璃纤维棉置于XYZ 3000喷点仪平台上，并以压条固定；取1mL金标抗体加入2mL含2％(w/v)BSA、3％(w/v)蔗糖、0.6mol/L NaCl、0.2％Tween 20(v/v)和0.1％(w/v)叠氮钠的20mmol/L硼酸钠溶液(pH 8.0)；以15μL/cm将金标抗体溶液喷点于玻璃棉，置50℃干燥箱干燥30min，置于塑料袋中，加干燥剂4℃密闭保存备用。
5.3样品垫的制备
样品垫是用玻璃棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成。以含0.1mol/L NaCl、0.2％(v/v)Tween 20和0.1％(w/v)叠氮钠的PBS(pH 7.2)溶液浸泡玻璃棉条，置50℃干燥箱干燥30min，置于塑料袋中，加干燥剂室温密闭保存备用。
5.4吸水垫的制备
吸水垫是用吸水纸制成，将吸水垫置于塑料袋中，加干燥剂室温密闭保存备用。
5.5支撑板的制备
支撑板是用不吸水的硬质塑料胶条或硬纸条制成，将双面胶贴于支撑板。
5.6试纸的组装
利用LM5000试纸装配仪或手工将上述材料装配成试纸条。先将检测膜粘贴于支撑板中央，然后将含有金标抗体的结合垫和样品垫依次粘贴于检测膜的样品端，各层间重叠1-2mm，再将吸水垫粘贴于检测膜的另一端，与检测膜重叠1-2mm(图4)。在样品端以白色塑胶膜包裹样品垫和结合垫，塑胶膜上印有检测方向及检测溶液上限标记，在手柄端以蓝色塑胶膜包裹吸水垫。
检测原理：
当氨苯胂酸快速检测试纸条测试端插入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作用带动待测ASA及结合垫中的金标抗体一起向检测膜扩散，并最终渗入手柄端吸水垫。在扩散过程中，待测ASA可与金标抗体相结合，进而封闭金标抗体上ASA的抗原结合点，阻止金标抗体与检测膜上氨苯胂酸人工抗原的检测印迹结合，不能显示检测印迹，而羊抗或兔抗小鼠IgG则可与金标抗体结合，形成棕红色对照印迹带“︱”，即一条棕红色带“︱”印迹为阳性表示。反之样品溶液中无氨苯胂酸则不能阻止金标抗体与检测膜上氨苯胂酸人工抗原的检测印迹结合，显示棕红色检测印迹带“︱”，同样羊抗或兔抗小鼠IgG也与金标抗体结合，显示棕红色对照印迹带“︱”，形成两条棕红色带“︱︱”为阴性表示。如果检测膜上对照印迹带没有棕红色显示，则表明试纸条已失效。
实施例6、检测方法
6.1 ASA标准样品的制备
称取10mg ASA标准品溶解在10mL PBS(pH 7.2)中，配置1mg/mL ASA标准母液，将ASA标准母液用PBS稀释到终浓度为5ng/mL作为阳性标准样品，PBS作为阴性标准样品。
6.2 ASA试纸产品的测试
检测ASA时，将ASA试纸样品端分别进入待检样品和阳性、阴性标准样品中10-20s，取出试纸水平放置2min观察结果，并进行对比。试纸条显现两条棕色条带(检测印迹和质控印迹)，且检测印迹显色强度与阴性标准品无明显差别为阴性，表示待检样品中无ASA的残留或污染；检测印迹显色强度显著弱于阴性标准样品，表示待检样品有ASA残留或污染。其含量可通过与ASA阳性标准样品显色比对进行估测，显色强于ASA阳性标准样品，表示样品ASA含量低于5ng/mL，反之则高于5ng/mL。试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需另取试纸重新检测(图5)。
实施例7、抗ASA胶体金免疫层析试纸条性能的测试
7.1抗氨苯胂酸试纸条特异性的鉴定
选择有机胂类添加剂氨苯胂酸、洛克沙胂、硝苯胂酸、卡巴胂标准品，用PBS将这三种标品分别稀释成10ng/mL的溶液，按照实施例6的检测方法进行特异性鉴定。鉴定结果显示该试纸只对氨苯胂酸有特异性反应。
7.2抗氨苯胂酸试纸条灵敏度的鉴定
将ASA标准品用PBS分别稀释到浓度为0.625ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL，然后用本发明试纸检测，每个样品重复测定3次，2min内读取结果，观察能使检测印迹出现的ASA的最小浓度即为该试纸的检测限，即灵敏度。结果显示该试纸对ASA的检测限为1.25ng/mL。
7.3抗氨苯胂酸试纸条稳定性检测
将试纸条放在4℃保存，间隔2个月检测一次。每次检测的参数包括：试纸条的外观、灵敏性和特异性等，且每次检测重复3次，分别在第0、2、4、6、8、10、12、14个月取出试纸条，用试纸条检测分别检测50份阴性样品及50份含ASA 1.25ng/mL的阳性样品，观察试纸条阴性样品T线显色情况及试纸条出现的假阴率及假阳性率，从而判定试纸条的保质期。从结果可以看出，试纸条在4℃条件下12个月内没有观察到假阳性及假阴性，T线显色正常，而4℃条件下保存到第12个月后试纸条显色变弱，说明试纸条的稳定性变差，所以试纸条对应的4℃左右条件下保质期应该定为1年，但应注意保存条件需要干燥避光。
以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种氨苯胂酸人工抗原，其特征在于，分子结构式如下：
其中，Protein表示载体蛋白。
2.根据权利要求1所述的氨苯胂酸人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为BSA、OVA、或KLH。
3.一种如权利要求2所述的氨苯胂酸人工抗原的制备方法，其特征在于，是利用EDC活化BSA的羧基基团，然后使氨苯胂酸苯环上的氨基与BSA上活化的羧基发生缩合反应，得到氨苯胂酸人工抗原ASA-BSA。
4.根据权利要求3所述的氨苯胂酸人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)A液：准确称取10mg BSA、55mg EDC和33mg NHS，充分溶解于2mL 0.01M PBS中，4℃避光条件下混合反应6h，得到反应液A；
B液：准确称取氨苯胂酸7mg，充分溶解于2.5mL 0.01M PBS中，得到反应液B；
(2)将B液逐滴滴加至A液中，边滴加边搅拌，密封避光，4℃反应过夜，反应完毕后，在4℃条件下，用PBS透析72h，每天更换透析液3-6次，即得。
5.一种氨苯胂酸单克隆抗体，其特征在于，是能与权利要求1所述的氨苯胂酸人工抗原发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。
6.一种如权利要求5所述的氨苯胂酸单克隆抗体的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的氨苯胂酸人工抗原免疫小鼠，并进行细胞融合、克隆化，得到氨苯胂酸单克隆抗体。
7.一种如权利要求5所述的氨苯胂酸单克隆抗体在制备氨苯胂酸快速检测试纸条中的应用。
8.一种氨苯胂酸快速检测试纸条，包括支撑板和吸附层，其特征在于，吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫、检测膜及吸水垫，其中在检测膜上有用氨苯胂酸人工抗原溶液印制的检测印迹，和用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的对照印迹；结合垫上吸附有胶体金标记的氨苯胂酸单克隆抗体。
9.一种如权利要求8所述的氨苯胂酸快速检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)氨苯胂酸人工抗原的合成
用EDC活化BSA的羧基基团，然后使氨苯胂酸苯环上的氨基与BSA上活化的羧基发生缩合反应，得到氨苯胂酸人工抗原ASA-BSA；
(2)单克隆抗体的制备
将合成的ASA-BSA免疫小鼠，并进行细胞融合、克隆化，得到氨苯胂酸单克隆抗体；
(3)羊抗或兔抗小鼠IgG的制备
以纯化小鼠IgG免疫健康羊或家兔，制备羊抗或兔抗小鼠IgG；
(4)金标抗体的制备
以柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金，并标记步骤(2)制备的单克隆抗体；
(5)试纸的研制
(a)将氨苯胂酸人工抗原溶液和羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液分别喷点于检测膜中央，形成检测印迹T和质控印迹C；
(b)将金标抗体喷点于玻璃棉，制得结合垫；
(c)将样品垫、结合垫、检测膜及吸水垫依次组装在支撑板上。
10.一种如权利要求8所述的试纸条在检测氨苯胂酸残留中的应用。
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