CN114292325A - 一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法；S1、选取实验耗材；S2、半抗原的改造，制备化合物A；S3、制备化合物B；S4、洛克沙胂人工抗原的合成；S5、人工抗原鉴定与多克隆抗体制备；S6、间接ELISA方法的建立；本发明以4‑羟基苯胂酸作为半抗原修饰物，在第3位和第4位上分别引入硝基和羧基，合成了与ROX结构相似的衍生物，并采用碳二亚胺法将ROX衍生物与BSA、OA偶联，成功制备了ROX的人工抗原，经生物质谱鉴定，ROX‑BSA、ROX‑OA的偶联比分别为4.2:1、12.6:1，免疫新西兰白兔获得的多克隆抗体最大效价可达1.28×105，对ROX的IC50为41.08ng/mL，该抗体特异性较强。
Description
技术领域
本发明属于人工抗原制备技术领域，具体涉及一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法。
背景技术
合成抗原将氨基酸按一定顺序聚合成大分子多肽，使其具有抗原的性质，亦称合成多肽抗原。因其结构是已知的，故多用于蛋白质构型与抗原特性的关系和抗原抗体反应机理的研究，也可用以制备合成肽疫苗，洛克沙胂是用于畜禽促生长的一种最经济的多功能有机砷饲料添加剂，具有抗球虫、治痢疾、沉积色素、改善毛色、提高产蛋率、降低料肉比等功效，可与多种抗生素、促生长剂配合使用,洛克沙胂价格低廉，已广泛的应用在规模化的养鸡场中。洛克沙胂等砷类化合物具有一定毒性，可影响机体酶的活性，导致细胞代谢紊乱，进而容易造成中枢神经失调，亦可引起细胞DNA损伤。如果在饲养过程中洛克沙胂使用过量，必定会造成其在畜禽体内残留，严重威胁人类的健康，国内外文献中所报道的洛克沙胂残留检测方法多为高效液相色谱法、固相萃取-高效液相色谱法、超高效液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-电感耦合等离子体-串联质谱法、液相色谱-氢化物发生-原子荧光联用法等仪器方法，由于这些方法所需设备昂贵、操作复杂、耗费时间长，因此只适于实验室研究，不易推广。目前，关于洛克沙胂免疫学检测的文献报道较少，2011年，SHELVER以3-氨基-4-羟基苯胂酸(AHPA)为半抗原修饰物，将AHPA与钥孔血蓝蛋白偶联，合成了洛克沙胂的人工抗原，建立了一种鸡肉中洛克沙胂的间接ELISA检测方法，该方法的IC50为12.0±2.45ng/mL。2019年，刘红亮等采用碳二亚胺法将AHPA与BSA偶联，该抗体对洛克沙胂的IC50为3.147ng/μL，但未对实际样品进行检测。为了探索最适的免疫学检测方法，有必要通过多种方法合成洛克沙胂的多种人工抗原，筛选出一种具有高活性的人工抗原，更大程度的提高ELISA检测的特异性和灵敏度，以便于进一步应用和推广，然而市面上各种的洛克沙胂的多种人工抗原仍存在各种各样的问题。
如授权公告号为CN103232572B所公开的用于检测洛克沙胂的分子印迹聚合物及其制备方法，其虽然实现了分子印迹聚合物对洛克沙胂回收率为90％以上，对洛克沙胂显示高的交叉反应，具有高的选择性和特异性，作为分析饲料、动物组织及环境水等基质中洛克沙胂的样品净化前处理材料有着广泛的应用前景，但是并未解决现有洛克沙胂半抗原在制备生产的时候不能够快速的进行洛克沙胂半抗原的生成，使得抗体特异性较强，并且不能够实现对洛克沙胂半抗原的精准检测的问题，为此我们提出一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，以达到实现人工抗原制造、修饰改造的目的。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：包括有以下步骤：
S1、选取实验耗材：4-羟基苯胂酸，牛血清白蛋白、卵清白蛋白、弗氏佐剂、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、N，N-二甲基甲酰胺、1-乙基碳二亚胺、薄层硅胶板等；96孔可拆酶标板，其他化学制剂均为AR或GR；
S2、半抗原的改造，制备化合物A：将4-羟基苯胂酸2.9-3.4g溶于20mL蒸馏水中，加入KOH0.8-1.2g，在95-100℃的油浴的条件下搅拌1.5-2.5h，加入氯乙酸1.7-2.2mg，继续搅拌5-8h，在室温条件下搅拌40-50h，采用薄层色谱法跟踪反应进程，加0.8-2mol/L的HCl调pH＝1.8-2.4，静置析出固体，抽滤得化合物A；
S3、制备化合物B：称取化合物A溶于10mL浓硫酸中，加入0.09-0.4gKNO3进行反应，采用薄层色谱法跟踪反应完成后，加蒸馏水静置待淡黄色固体析出，抽滤得化合物B，即改造半抗原；
S4、洛克沙胂人工抗原的合成:称取改造半抗原80.23-85mg，分别加入2-6mLDMF、120-160mgEDC充分溶解，活化5-7h，将40-60mgBSA溶于少量PBS缓冲液中，加入420-440μL活化液，2-6℃低速搅拌过夜，用生理盐水透析纯化5d，换液13-17次，即得洛克沙胂-牛血清白蛋白，用作免疫原，以同种方法将BSA换成OA，即得洛克沙胂-卵清蛋白，用作包被原；
S5、人工抗原鉴定与多克隆抗体制备：将BSA标准品、ROX-BSA、OA、ROX-OA经脱盐后分别与基质溶液混合，点到样品靶，置入质谱仪内进行激光扫描，确定人工抗原的偶联效果，半抗原与载体蛋白的偶联比按以下公式计算：C半抗原/C载体蛋白＝(MW人工抗原－MW载体蛋白)/MW半抗原；选取3只健康雌性新西兰大白兔接种ROX-BSA，免疫前采血作为阴性对照，免疫剂量为1mg/只，免疫间隔周期为2周，共免疫7次，提取血清；
S6、间接ELISA方法的建立：采用方阵滴定法确定最适包被浓度、抗体稀释浓度，建立洛克沙胂间接竞争ELISA检测方法，将无竞争物时的D值作为B0值，各浓度抑制时的D值作为B值，以B/B0为纵坐标，各竞争物浓度的对数为横坐标，绘制竞争抑制曲线，将ROX标准品溶液换成系列浓度的2-氨基苯胂酸、4-羟基苯胂酸、AHPA、阿散酸、苯胂酸等5种竞争物，计算IC50和交叉反应率，评价方法的特异性，交叉反应率按以下公式计算:CR(％)＝IC50洛克沙胂/IC50各竞争物×100％。
优选的，所述S2中的蒸馏水通过Milli-Q型超纯水仪进行净化制备，所述Milli-Q型超纯水仪的参数是流量：0.8-1.2LPM，过滤颗粒小于等于1/ml，微生物净化度小于等于1CFU/ml。
优选的，所述S2的搅拌过程采用的是90-2型恒温磁力搅拌器，所述90-2型恒温磁力搅拌器的参数是工作电压：AC220V±10％；50HZ，搅拌容量：20-3000ml，搅拌速度：0-1250转/分，定时时间：0-120分。
优选的，所述S2中的PH检测采用的是BPP-7800型精密PH计，所述BPP-7800型精密PH计的测量范围是-2.000-20.000pH之间，且精度是±0.002pH。
优选的，所述S4中的洛克沙胂-牛血清白蛋白在纯化后冻存保存在-20℃的DRH-A100型电热恒温培养箱中。
优选的，所述S3中的薄层色谱法采用的是MultiskanFC型全自动酶标仪，所述MultiskanFC型全自动酶标仪的参数为检测波长范围从340到850nm，并且采用所述96孔可拆酶标板。
优选的，所述S5中的质谱仪采用的4800PlusMALDI-TOF/TOTM基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，所述4800PlusMALDI-TOF/TOTM基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的质量准确度：MS模式≤200ppm，MS模式：外标≤20ppm，MS/MS模式：≤0.2Da，质量分辨率：MS模式≥20000，MS/MS模式：≥8000，灵敏度：MS模式：100amolNeurotensin，S/N≥10:1。
优选的，所述S3中的薄层色谱法跟踪化合物A(DCM:MeOH＝5:1，Rf＝0.1)、化合物B(DCM:MeOH＝1:1，Rf＝0.1)的合成反应，当反应原料完全消失即可终止反应，干燥处理后，所得化合物A、化合物B的质量分别为2.5g和0.2g，产率分别为70％和36％，改造半抗原的分子质量为321.06，BSA、ROX-BSA的相对分子质量分别为66405.0938、67767.5234，ROX-BSA比BSA质荷比增加了1362.4296，表明半抗原与载体蛋白偶联成功，其偶联比为4.2:1，BSA、ROX-OA的相对分子质量分别为44377.9015、47281.3725，偶联比为12.6:1。
优选的，所述S6的方阵滴定法筛选确定最佳包被浓度、抗体稀释浓度，选择TMB作为底物37℃显色25min，加2mol/LH2SO4终止反应，在D450nm/D630nm处进行双波长扫描，选择D450nm大于2倍阴性对照孔的血清最高稀释倍数作为抗体的ELISA效价，同时选择D值在1.0右的包被浓度和抗体稀释度为最佳工作浓度，结果表明，1号兔的血清效价可达1.28×105，优于2号兔和3号兔，故选其进行后续试验，包被原和抗体最稀释倍数分别为1.6×104、8.0×103，建立竞争抑制曲线，拟合曲线方程为Y＝-38.8X+106.457，R2＝0.9891，将产生50％抑制时ROX的浓度作为IC50，经计算IC50为41.08ng/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明以4-羟基苯胂酸作为半抗原修饰物，在第3位和第4位上分别引入硝基和羧基，合成了与ROX结构相似的衍生物，并采用碳二亚胺法将ROX衍生物与BSA、OA偶联，成功制备了ROX的人工抗原，经生物质谱鉴定，ROX-BSA、ROX-OA的偶联比分别为4.2:1、12.6:1，免疫新西兰白兔获得的多克隆抗体最大效价可达1.28×105，对ROX的IC50为41.08ng/mL，该抗体特异性较强，对常用饲料添加剂阿散酸的交叉反应率仅为1.63％，可用于ROX的ELISA方法检测。
附图说明
图1为本发明的制备步骤结构示意图；
图2为本发明的牛血清白蛋白的质谱鉴定结果；
图3为本发明的洛克沙胂-牛血清白蛋白的质谱鉴定结果；
图4为本发明的ROX对抗血清的抑制曲线；
图5为本发明的抗血清与几种抑制物的交叉反应率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-图5，本发明提供一种技术方案：一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，包括有以下步骤：
实施例一：
S1、选取实验耗材：4-羟基苯胂酸，牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OA)、弗氏佐剂、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(HRP-IgG)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、薄层硅胶板等；96孔可拆酶标板，其他化学制剂均为AR或GR；
S2、半抗原的改造，制备化合物A：将4-羟基苯胂酸2.9g溶于20mL蒸馏水中，加入KOH0.8g，在95℃的油浴的条件下搅拌1.5h，加入氯乙酸1.7mg，继续搅拌5-8h，在室温条件下搅拌40h，采用薄层色谱法跟踪反应进程，加0.8mol/L的HCl调pH＝1.8，静置析出固体，抽滤得化合物A；
S3、制备化合物B：称取化合物A(0.25g)溶于10mL浓硫酸中，加入0.09gKNO3进行反应，采用薄层色谱法跟踪反应完成后，加蒸馏水静置待淡黄色固体析出，抽滤得化合物B，即改造半抗原；
S4、洛克沙胂人工抗原的合成：称取改造半抗原80.23mg，分别加入2mLDMF、120mgEDC充分溶解，活化5h，将40mgBSA溶于少量PBS缓冲液中，加入420μL活化液，2℃低速搅拌过夜，用生理盐水透析纯化5d，换液13次，即得洛克沙胂-牛血清白蛋白(ROX-BSA)，用作免疫原，以同种方法将BSA换成OA，即得洛克沙胂-卵清蛋白(ROX-OA)，用作包被原；
S5、人工抗原鉴定与多克隆抗体制备：将BSA标准品、ROX-BSA、OA、ROX-OA经脱盐后分别与基质溶液混合，点到样品靶，置入质谱仪内进行激光扫描，确定人工抗原的偶联效果，半抗原与载体蛋白的偶联比按以下公式计算：C半抗原/C载体蛋白＝(MW人工抗原－MW载体蛋白)/MW半抗原；选取3只健康雌性新西兰大白兔接种ROX-BSA，免疫前采血作为阴性对照，免疫剂量为1mg/只，免疫间隔周期为2周，共免疫7次，提取血清；
S6、间接ELISA方法的建立：采用方阵滴定法确定最适包被浓度、抗体稀释浓度，建立洛克沙胂间接竞争ELISA检测方法，将无竞争物时的D值作为B0值，各浓度(系列浓度的ROX标准品溶液依次为2、5、10、20、30、40、50、100、200、500ng/mL)抑制时的D值作为B值，以B/B0为纵坐标，各竞争物浓度的对数(LgC)为横坐标，绘制竞争抑制曲线，将ROX标准品溶液换成系列浓度的2-氨基苯胂酸、4-羟基苯胂酸、AHPA、阿散酸、苯胂酸等5种竞争物，计算IC50和交叉反应率(CR)，评价方法的特异性，交叉反应率按以下公式计算:CR(％)＝IC50洛克沙胂/IC50各竞争物×100％。
为了使得实验中使用的蒸馏水能够保存干净，本实施例中，优选的，所述S2中的蒸馏水通过Milli-Q型超纯水仪进行净化制备，所述Milli-Q型超纯水仪的参数是流量：0.8-1.2LPM，过滤颗粒小于等于1/ml，微生物净化度小于等于1CFU/ml。
为了实现对实验过程进行搅拌混合，本实施例中，优选的，所述S2的搅拌过程采用的是90-2型恒温磁力搅拌器，所述90-2型恒温磁力搅拌器的参数是工作电压：AC220V±10％；50HZ，搅拌容量：20-3000ml，搅拌速度：0-1250转/分(无级调速)，定时时间：0-120分。
为了实现对实验过程中的PH值进行控制调节，本实施例中，优选的，所述S2中的PH检测采用的是BPP-7800型精密PH计，所述BPP-7800型精密PH计的测量范围是-2.000-20.000pH之间，且精度是±0.002pH。
为了实现对实验中的洛克沙胂-牛血清白蛋白和洛克沙胂-卵清蛋白进行保存，本实施例中，优选的，所述S4中的洛克沙胂-牛血清白蛋白(ROX-BSA)在纯化后冻存保存在-20℃的DRH-A100型电热恒温培养箱中。
为了实现对半抗原的改造的实验进程进行跟踪，本实施例中，优选的，所述S3中的薄层色谱法采用的是MultiskanFC型全自动酶标仪，所述MultiskanFC型全自动酶标仪的参数为检测波长范围从340到850nm，并且采用所述96孔可拆酶标板。
为了实现对人工抗原鉴定与多克隆抗体进行制备，本实施例中，优选的，所述S5中的质谱仪采用的4800PlusMALDI-TOF/TOTM基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，所述4800PlusMALDI-TOF/TOTM基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的质量准确度：MS模式(线性)≤200ppm(MW≥10,000)，MS模式(反射)：外标≤20ppm，MS/MS模式：≤0.2Da，质量分辨率：MS模式(反射)≥20000，MS/MS模式：≥8000，灵敏度：MS模式(反射)：100amolNeurotensin，S/N≥10:1。
为了实现对化合物A和化合物B进行反应化合的到产物改造半抗原，本实施例中，优选的，所述S3中的薄层色谱法跟踪化合物A(DCM:MeOH＝5:1，Rf＝0.1)、化合物B(DCM:MeOH＝1:1，Rf＝0.1)的合成反应，当反应原料完全消失即可终止反应，干燥处理后，所得化合物A、化合物B的质量分别为2.5g和0.2g，产率分别为70％和36％，改造半抗原的分子质量为321.06，BSA、ROX-BSA的相对分子质量分别为66405.0938、67767.5234，ROX-BSA比BSA质荷比增加了1362.4296，表明半抗原与载体蛋白偶联成功，其偶联比为4.2:1，BSA、ROX-OA的相对分子质量分别为44377.9015、47281.3725，偶联比为12.6:1。
为了实现对人工抗原进行最佳包被浓度、抗体稀释浓度的检测实验结果，本实施例中，优选的，所述S6的方阵滴定法筛选确定最佳包被浓度、抗体稀释浓度，选择TMB作为底物37℃显色25min，加2mol/LH2SO4终止反应，在D450nm/D630nm处进行双波长扫描，选择D450nm大于2倍阴性对照孔的血清最高稀释倍数作为抗体的ELISA效价，同时选择D值在1.0右的包被浓度和抗体稀释度为最佳工作浓度，结果表明，1号兔的血清效价可达1.28×105，优于2号兔和3号兔，故选其进行后续试验，包被原和抗体最稀释倍数分别为1.6×104、8.0×103，建立竞争抑制曲线，拟合曲线方程为Y＝-38.8X+106.457，R2＝0.9891，将产生50％抑制时ROX的浓度作为IC50，经计算IC50为41.08ng/mL。
实施例二：
S1、选取实验耗材：4-羟基苯胂酸，牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OA)、弗氏佐剂、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(HRP-IgG)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、薄层硅胶板等；96孔可拆酶标板，其他化学制剂均为AR或GR；
S2、半抗原的改造，制备化合物A：将4-羟基苯胂酸3.4g溶于20mL蒸馏水中，加入KOH1.2g，在100℃的油浴的条件下搅拌2.5h，加入氯乙酸2.2mg，继续搅拌8h，在室温条件下搅拌50h，采用薄层色谱法跟踪反应进程，加2mol/L的HCl调pH＝2.4，静置析出固体，抽滤得化合物A；
S3、制备化合物B：称取化合物A(0.88g)溶于10mL浓硫酸中，加入0.4gKNO3进行反应，采用薄层色谱法跟踪反应完成后，加蒸馏水静置待淡黄色固体析出，抽滤得化合物B，即改造半抗原；
S4、洛克沙胂人工抗原的合成：称取改造半抗原85mg，分别加入6mLDMF、160mgEDC充分溶解，活化7h，将60mgBSA溶于少量PBS缓冲液中，加入440μL活化液，6℃低速搅拌过夜，用生理盐水透析纯化5d，换液17次，即得洛克沙胂-牛血清白蛋白(ROX-BSA)，用作免疫原，以同种方法将BSA换成OA，即得洛克沙胂-卵清蛋白(ROX-OA)，用作包被原；
S5、人工抗原鉴定与多克隆抗体制备：将BSA标准品、ROX-BSA、OA、ROX-OA经脱盐后分别与基质溶液混合，点到样品靶，置入质谱仪内进行激光扫描，确定人工抗原的偶联效果，半抗原与载体蛋白的偶联比按以下公式计算：C半抗原/C载体蛋白＝(MW人工抗原－MW载体蛋白)/MW半抗原；选取3只健康雌性新西兰大白兔接种ROX-BSA，免疫前采血作为阴性对照，免疫剂量为1mg/只，免疫间隔周期为2周，共免疫7次，提取血清；
S6、间接ELISA方法的建立：采用方阵滴定法确定最适包被浓度、抗体稀释浓度，建立洛克沙胂间接竞争ELISA检测方法，将无竞争物时的D值作为B0值，各浓度(系列浓度的ROX标准品溶液依次为2、5、10、20、30、40、50、100、200、500ng/mL)抑制时的D值作为B值，以B/B0为纵坐标，各竞争物浓度的对数(LgC)为横坐标，绘制竞争抑制曲线，将ROX标准品溶液换成系列浓度的2-氨基苯胂酸、4-羟基苯胂酸、AHPA、阿散酸、苯胂酸等5种竞争物，计算IC50和交叉反应率(CR)，评价方法的特异性，交叉反应率按以下公式计算:CR(％)＝IC50洛克沙胂/IC50各竞争物×100％。
为了使得实验中使用的蒸馏水能够保存干净，本实施例中，优选的，所述S2中的蒸馏水通过Milli-Q型超纯水仪进行净化制备，所述Milli-Q型超纯水仪的参数是流量：0.8-1.2LPM，过滤颗粒小于等于1/ml，微生物净化度小于等于1CFU/ml。
为了实现对实验过程进行搅拌混合，本实施例中，优选的，所述S2的搅拌过程采用的是90-2型恒温磁力搅拌器，所述90-2型恒温磁力搅拌器的参数是工作电压：AC220V±10％；50HZ，搅拌容量：20-3000ml，搅拌速度：0-1250转/分(无级调速)，定时时间：0-120分。
为了实现对实验过程中的PH值进行控制调节，本实施例中，优选的，所述S2中的PH检测采用的是BPP-7800型精密PH计，所述BPP-7800型精密PH计的测量范围是-2.000-20.000pH之间，且精度是±0.002pH。
为了实现对实验中的洛克沙胂-牛血清白蛋白和洛克沙胂-卵清蛋白进行保存，本实施例中，优选的，所述S4中的洛克沙胂-牛血清白蛋白(ROX-BSA)在纯化后冻存保存在-20℃的DRH-A100型电热恒温培养箱中。
为了实现对半抗原的改造的实验进程进行跟踪，本实施例中，优选的，所述S3中的薄层色谱法采用的是MultiskanFC型全自动酶标仪，所述MultiskanFC型全自动酶标仪的参数为检测波长范围从340到850nm，并且采用所述96孔可拆酶标板。
为了实现对人工抗原鉴定与多克隆抗体进行制备，本实施例中，优选的，所述S5中的质谱仪采用的4800PlusMALDI-TOF/TOTM基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，所述4800PlusMALDI-TOF/TOTM基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的质量准确度：MS模式(线性)≤200ppm(MW≥10,000)，MS模式(反射)：外标≤20ppm，MS/MS模式：≤0.2Da，质量分辨率：MS模式(反射)≥20000，MS/MS模式：≥8000，灵敏度：MS模式(反射)：100amolNeurotensin，S/N≥10:1。
为了实现对化合物A和化合物B进行反应化合的到产物改造半抗原，本实施例中，优选的，所述S3中的薄层色谱法跟踪化合物A(DCM:MeOH＝5:1，Rf＝0.1)、化合物B(DCM:MeOH＝1:1，Rf＝0.1)的合成反应，当反应原料完全消失即可终止反应，干燥处理后，所得化合物A、化合物B的质量分别为2.5g和0.2g，产率分别为70％和36％，改造半抗原的分子质量为321.06，BSA、ROX-BSA的相对分子质量分别为66405.0938、67767.5234，ROX-BSA比BSA质荷比增加了1362.4296，表明半抗原与载体蛋白偶联成功，其偶联比为4.2:1，BSA、ROX-OA的相对分子质量分别为44377.9015、47281.3725，偶联比为12.6:1。
为了实现对人工抗原进行最佳包被浓度、抗体稀释浓度的检测实验结果，本实施例中，优选的，所述S6的方阵滴定法筛选确定最佳包被浓度、抗体稀释浓度，选择TMB作为底物37℃显色25min，加2mol/LH2SO4终止反应，在D450nm/D630nm处进行双波长扫描，选择D450nm大于2倍阴性对照孔的血清最高稀释倍数作为抗体的ELISA效价，同时选择D值在1.0右的包被浓度和抗体稀释度为最佳工作浓度，结果表明，1号兔的血清效价可达1.28×105，优于2号兔和3号兔，故选其进行后续试验，包被原和抗体最稀释倍数分别为1.6×104、8.0×103，建立竞争抑制曲线，拟合曲线方程为Y＝-38.8X+106.457，R2＝0.9891，将产生50％抑制时ROX的浓度作为IC50，经计算IC50为41.08ng/mL。
本发明的工作原理及使用流程：
第一步、选取实验耗材：4-羟基苯胂酸，牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OA)、弗氏佐剂、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(HRP-IgG)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、薄层硅胶板等；96孔可拆酶标板，其他化学制剂均为AR或GR；
第二步、半抗原的改造，制备化合物A：将4-羟基苯胂酸2.9-3.4g溶于20mL蒸馏水中，加入KOH0.8-1.2g，在95-100℃的油浴的条件下搅拌1.5-2.5h，加入氯乙酸1.7-2.2mg，继续搅拌5-8h，在室温条件下搅拌40-50h，采用薄层色谱法跟踪反应进程，加0.8-2mol/L的HCl调pH＝1.8-2.4，静置析出固体，抽滤得化合物A；
第三步、制备化合物B：称取化合物A(0.25-0.88g)溶于10mL浓硫酸中，加入0.09-0.4gKNO3进行反应，采用薄层色谱法跟踪反应完成后，加蒸馏水静置待淡黄色固体析出，抽滤得化合物B，即改造半抗原；
第四步、洛克沙胂人工抗原的合成：称取改造半抗原80.23-85mg，分别加入2-6mLDMF、120-160mgEDC充分溶解，活化5-7h，将,40-60mgBSA溶于少量PBS缓冲液中，加入420-440μL活化液，2-6℃低速搅拌过夜，用生理盐水透析纯化5d，换液13-17次，即得洛克沙胂-牛血清白蛋白(ROX-BSA)，用作免疫原，以同种方法将BSA换成OA，即得洛克沙胂-卵清蛋白(ROX-OA)，用作包被原；
第五步、人工抗原鉴定与多克隆抗体制备；将BSA标准品、ROX-BSA、OA、ROX-OA经脱盐后分别与基质溶液混合，点到样品靶，置入质谱仪内进行激光扫描，确定人工抗原的偶联效果，半抗原与载体蛋白的偶联比按以下公式计算：C半抗原/C载体蛋白＝(MW人工抗原－MW载体蛋白)/MW半抗原；选取3只健康雌性新西兰大白兔接种ROX-BSA，免疫前采血作为阴性对照，免疫剂量为1mg/只，免疫间隔周期为2周，共免疫7次，提取血清；
第六步、间接ELISA方法的建立：采用方阵滴定法确定最适包被浓度、抗体稀释浓度，建立洛克沙胂间接竞争ELISA检测方法，将无竞争物时的D值作为B0值，各浓度(系列浓度的ROX标准品溶液依次为2、5、10、20、30、40、50、100、200、500ng/mL)抑制时的D值作为B值，以B/B0为纵坐标，各竞争物浓度的对数(LgC)为横坐标，绘制竞争抑制曲线，将ROX标准品溶液换成系列浓度的2-氨基苯胂酸、4-羟基苯胂酸、AHPA、阿散酸、苯胂酸等5种竞争物，计算IC50和交叉反应率(CR)，评价方法的特异性，交叉反应率按以下公式计算:CR(％)＝IC50洛克沙胂/IC50各竞争物×100％。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：包括有以下步骤：
S1、选取实验耗材：4-羟基苯胂酸，牛血清白蛋白、卵清白蛋白、弗氏佐剂、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、N，N-二甲基甲酰胺、1-乙基碳二亚胺、薄层硅胶板等；96孔可拆酶标板，其他化学制剂均为AR或GR；
S2、半抗原的改造，制备化合物A：将4-羟基苯胂酸2.9-3.4g溶于20mL蒸馏水中，加入KOH0.8-1.2g，在95-100℃的油浴的条件下搅拌1.5-2.5h，加入氯乙酸1.7-2.2mg，继续搅拌5-8h，在室温条件下搅拌40-50h，采用薄层色谱法跟踪反应进程，加0.8-2mol/L的HCl调pH＝1.8-2.4，静置析出固体，抽滤得化合物A；
S3、制备化合物B：称取化合物A溶于10mL浓硫酸中，加入0.09-0.4gKNO3进行反应，采用薄层色谱法跟踪反应完成后，加蒸馏水静置待淡黄色固体析出，抽滤得化合物B，即改造半抗原；
S4、洛克沙胂人工抗原的合成：称取改造半抗原80.23-85mg，分别加入2-6mLDMF、120-160mgEDC充分溶解，活化5-7h，将40-60mgBSA溶于少量PBS缓冲液中，加入420-440μL活化液，2-6℃低速搅拌过夜，用生理盐水透析纯化5d，换液13-17次，即得洛克沙胂-牛血清白蛋白，用作免疫原，以同种方法将BSA换成OA，即得洛克沙胂-卵清蛋白，用作包被原；
S5、人工抗原鉴定与多克隆抗体制备：将BSA标准品、ROX-BSA、OA、ROX-OA经脱盐后分别与基质溶液混合，点到样品靶，置入质谱仪内进行激光扫描，确定人工抗原的偶联效果，半抗原与载体蛋白的偶联比按以下公式计算：C半抗原/C载体蛋白＝(MW人工抗原－MW载体蛋白)/MW半抗原；选取3只健康雌性新西兰大白兔接种ROX-BSA，免疫前采血作为阴性对照，免疫剂量为1mg/只，免疫间隔周期为2周，共免疫7次，提取血清；
S6、间接ELISA方法的建立：采用方阵滴定法确定最适包被浓度、抗体稀释浓度，建立洛克沙胂间接竞争ELISA检测方法，将无竞争物时的D值作为B0值，各浓度抑制时的D值作为B值，以B/B0为纵坐标，各竞争物浓度的对数为横坐标，绘制竞争抑制曲线，将ROX标准品溶液换成系列浓度的2-氨基苯胂酸、4-羟基苯胂酸、AHPA、阿散酸、苯胂酸等5种竞争物，计算IC50和交叉反应率，评价方法的特异性，交叉反应率按以下公式计算:CR(％)＝IC50洛克沙胂/IC50各竞争物×100％。
2.根据权利要求1所述的一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：所述S2中的蒸馏水通过Milli-Q型超纯水仪进行净化制备，所述Milli-Q型超纯水仪的参数是流量：0.8-1.2LPM，过滤颗粒小于等于1/ml，微生物净化度小于等于1CFU/ml。
3.根据权利要求1所述的一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：所述S2的搅拌过程采用的是90-2型恒温磁力搅拌器，所述90-2型恒温磁力搅拌器的参数是工作电压：AC220V±10％；50HZ，搅拌容量：20-3000ml，搅拌速度：0-1250转/分，定时时间：0-120分。
4.根据权利要求1所述的一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：所述S2中的PH检测采用的是BPP-7800型精密PH计，所述BPP-7800型精密PH计的测量范围是-2.000-20.000pH之间，且精度是±0.002pH。
5.根据权利要求1所述的一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：所述S4中的洛克沙胂-牛血清白蛋白在纯化后冻存保存在-20℃的DRH-A100型电热恒温培养箱中。
6.根据权利要求1所述的一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：所述S3中的薄层色谱法采用的是MultiskanFC型全自动酶标仪，所述MultiskanFC型全自动酶标仪的参数为检测波长范围从340到850nm，并且采用所述96孔可拆酶标板。
7.根据权利要求1所述的一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：所述S5中的质谱仪采用的4800PlusMALDI-TOF/TOTM基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，所述4800PlusMALDI-TOF/TOTM基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的质量准确度：MS模式≤200ppm，MS模式：外标≤20ppm，MS/MS模式：≤0.2Da，质量分辨率：MS模式≥20000，MS/MS模式：≥8000，灵敏度：MS模式：100amolNeurotensin，S/N≥10:1。
8.根据权利要求1所述的一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：所述S3中的薄层色谱法跟踪化合物A(DCM:MeOH＝5:1，Rf＝0.1)、化合物B(DCM:MeOH＝1:1，Rf＝0.1)的合成反应，当反应原料完全消失即可终止反应，干燥处理后，所得化合物A、化合物B的质量分别为2.5g和0.2g，产率分别为70％和36％，改造半抗原的分子质量为321.06，BSA、ROX-BSA的相对分子质量分别为66405.0938、67767.5234，ROX-BSA比BSA质荷比增加了1362.4296，表明半抗原与载体蛋白偶联成功，其偶联比为4.2:1，BSA、ROX-OA的相对分子质量分别为44377.9015、47281.3725，偶联比为12.6:1。
9.根据权利要求1所述的一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法，其特征在于：所述S6的方阵滴定法筛选确定最佳包被浓度、抗体稀释浓度，选择TMB作为底物37℃显色25min，加2mol/LH2SO4终止反应，在D450nm/D630nm处进行双波长扫描，选择D450nm大于2倍阴性对照孔的血清最高稀释倍数作为抗体的ELISA效价，同时选择D值在1.0右的包被浓度和抗体稀释度为最佳工作浓度，结果表明，1号兔的血清效价可达1.28×105，优于2号兔和3号兔，故选其进行后续试验，包被原和抗体最稀释倍数分别为1.6×104、8.0×103，建立竞争抑制曲线，拟合曲线方程为Y＝-38.8X+106.457，R2＝0.9891，将产生50％抑制时ROX的浓度作为IC50，经计算IC50为41.08ng/mL。
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