CN104101707B

CN104101707B - 2,4-二氯苯氧乙酸残留快速检测试纸条

Info

Publication number: CN104101707B
Application number: CN201310121654.5A
Authority: CN
Inventors: 席俊; 龚芳; 高学梅; 贺梦雪
Original assignee: Henan University of Technology
Current assignee: Henan University of Technology
Priority date: 2013-04-09
Filing date: 2013-04-09
Publication date: 2016-12-07
Anticipated expiration: 2033-04-09
Also published as: CN104101707A

Abstract

本发明涉及一种检测除草剂的器具，特别是涉及一种2,4‑二氯苯氧乙酸残留快速检测试纸条。本发明2,4‑二氯苯氧乙酸残留快速检测试纸条含有底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护层固定在吸附层上，吸附层从测试样品端依次为纤维层，吸附偶联2,4‑二氯苯氧乙酸的金标载体蛋白Xi纤维层，纤维素膜层，手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上有用2,4‑二氯苯氧乙酸的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“||”。该快速检测试纸条，特异性强，敏感性高，操作简便快速；检测结果显示形象，直观，准确，成本低，投资少，不需专用仪器设备及专业人员，容易推广实施。

Description

2,4-二氯苯氧乙酸残留快速检测试纸条

技术领域

本发明涉及一种检测除草剂的器具，特别是涉及一种2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxy，简称2,4-D）残留快速检测试纸条。

背景技术

俗话说：“民以食为天”，食品安全问题是关系千千万万人民群众切身利益和国计民生的大问题。但是随着畜牧业的现代化和高科技，食品安全问题日益严峻，令人心惊胆战。为了除草和虫害，有人大量使用有毒，甚至剧毒农药，致使蔬菜、果品农药残留严重超标，对人的身体健康和生命健康构成严重的威胁。如2,4-二氯苯氧乙酸是一种世界广泛使用的除草剂也是一种人工合成的植物激素具有与生长素相似得生理效应。它可以通过我们的皮肤和呼吸系统进入体内，具有潜在的致癌性和致突变性，能刺激人体分泌大量的雌性激素，干扰内分泌系统，对生殖和免疫系统会产生很不良的影响。除此之外，2,4-二氯苯氧乙酸还能使血红细胞聚集，阻碍红细胞的携氧能力，损伤肌肉、肾脏、肝脏和脑组织。鉴于2,4-二氯苯氧乙酸对人类健康和生态环境造成的危害, 许多国家都制订了该农药在农产品中的最高残留限量, 我国2001年新颁布的《饮用水水质卫生规范》将2,4-二氯苯氧乙酸的极限值规定为0.03 mg/L。世界卫生组织2003年8月颁布的《饮用水水质指南》规定饮用水中2,4-二氯苯氧乙酸的最大检出浓度为30 μg/L。充分认识2,4-二氯苯氧乙酸的性质，研究出快速方便的检测方法、建立有效的监控体系和控制标准是十分必要的。

目前，2,4-二氯苯氧乙酸残留的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、联用技术等。色谱法具有分离速度快、检测效率高、重现性好、灵敏度高等显著优点，但由于前处理比较复杂、仪器昂贵、技术难度大、检测费用高而且需要专业的技术人员等不足，较适合于确证使用，难以应对大批量样品的检测，大大限制了其广泛应用。ELISA也是一种常用的检测技术，它是以竞争性酶联反应为检测原理，检测全过程约需2～4 h。但是由于ELISA是一种敏感性很强的检测方法，不同的操作者往往会出现不同的结果，所以该方法常常造成人为的误检和漏检。因此要研制特异、敏感、快速、简便的2,4-二氯苯氧乙酸检测方法具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的：研制出特异、敏感、快速、简便的2,4-二氯苯氧乙酸快速检测试纸条。

本发明的技术方案：一种2,4-二氯苯氧乙酸快速检测试纸条，含有底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为纤维层、吸附金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联2,4-二氯苯氧乙酸的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“||”。

不吸水的支撑层薄片层用硬质塑胶片条，或不吸水的硬纸条制成。测试端纤维层用玻璃棉、或尼龙膜、或聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜制成，优选玻璃棉。吸水材料层用吸水纸制成。纤维素膜层用硝酸纤维素膜、或纯纤维素膜、或羧化纤维素膜制成。

金标抗体纤维层用吸附2,4-二氯苯氧乙酸的金标抗体玻璃棉，2,4-二氯苯氧乙酸金标抗体为胶体金标记2,4-二氯苯氧乙酸的单克隆抗体或多克隆抗体，偶联2,4-二氯苯氧乙酸的载体蛋白溶液为2,4-二氯苯氧乙酸与载体蛋白偶联的复合溶液。

在测试端吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0.5cm处。

偶联2,4-二氯苯氧乙酸的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，或为鸡卵清白蛋白(OVA)，或为铁蛋白，或为血蓝蛋白。

本发明的2,4-二氯苯氧乙酸残留快速检测试纸条具有以下优点：

(1)特异性强，敏感性高。该试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体(Wl)为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单克隆抗体(Wl)特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸条具有较高的特异性和敏感性，可检测到0.l ng的微量2,4-二氯苯氧乙酸残留；

(2)操作简便、快速。使用本发明试纸条时无需任何其它试剂，只要将其插入待检样品10 s左右，在2 min内即可判定检测结果；

(3)结果显示形象、直观、准确。本发明测试纸条以显示红棕色“|”及“||” 印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色“|”印迹表示在被检测样品液中含有2,4-二氯苯氧乙酸，两条棕红色“||”印迹表示在被检样品中不含2,4-二氯苯氧乙酸。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判；

(4)成本低，投资少。使用快速检测试纸条，不需另配仪器设备及其它试剂，随时随地进行检测，费用低廉，节省大量贵重仪器及设备费用；

(5)应用范围广，便于推广应用。本发明快速检测试纸操作简单，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

附图说明

图1为2,4-二氯苯氧乙酸残留快速检测试纸条示意图；

图2为2,4-二氯苯氧乙酸残留快速检测试纸条俯视结构示意图。

具体实施方式

要制成2,4-二氯苯氧乙酸残留快速检测试纸条，首先需制备偶联2,4-二氯苯氧乙酸的载体蛋白和金标抗体，从而制备检测印迹和金标抗体纤维；其次需制备羊抗或兔抗小鼠IgG抗体，用于制备对照印迹。

1． 2,4-二氯苯氧乙酸与载体蛋白Xi的偶联

采用碳化二亚胺（EDC）法，将2,4-二氯苯氧乙酸与载体蛋白进行偶联制备免疫抗原。称取2,4-二氯苯氧乙酸标准品 6 mg溶于1mL无水二氧六环中，加浓度为0.1 M的NaOH200 µL，振荡使之充分溶解；称取载体蛋白BSA (或鸡卵清白蛋白、铁蛋白、血蓝蛋白)溶于1mL PBS中，按摩尔比25：1加入上反应中。EDC 8mg溶于1mL蒸馏水中。将2,4-二氯苯氧乙酸与载体蛋白的混合液在室温条件下振荡18 h，4000 rpm离心10 min，取上清液逐滴加入振荡的EDC溶液中，加入后继续振荡5 h，4000 rpm离心10 min，将反应液装入透析袋；PBS透析3天，每天换液3次，收集后－20℃备用。

2．抗2,4-二氯苯氧乙酸单克隆抗体（W1）的制备

以20 µg/只～50 µg/只的偶联2,4-二氯苯氧乙酸的载体蛋白免疫BALB/c系小鼠，采用背部皮下多点注射，共免疫四次，每次间隔15～30天。第四次加强免疫后3～4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75%酒精浸泡5～l0 min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，l000 r/min离心l0 min，收集脾细胞；将1×10⁸的脾细胞与2～5×10⁷的NSO浆细胞瘤细胞混合，l000 r/min离心l0 min弃上清，细胞沉淀于37℃的水溶中缓缓加入0.7～lml的40～50% PEG4000 (pH 8.5～9.0)作用1 min，然后缓慢加入无血清1640培养基15 ml，以终止PEG的作用，37℃水浴5～l0 min，1000 r/min离心l0 min弃上清，将细胞沉淀重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养板（100 µL～200 µL/孔），置于37℃ 5% CO₂培养箱中培养。培养7～10天后，以5～10 µg/ml的偶联2,4-二氯苯氧乙酸的载体蛋白包被酶标板（96孔/块），以酶联免疫吸附试验( ELISA)检测杂交瘤的培养上清，挑取强性细胞克隆（OD₄₉₂=0.8以上），进行连续三次的有限稀释法克隆化，所生产的杂交瘤细胞染色体数为92～98，其分泌的单克隆抗体(Wl)特异地与2,4-二氯苯氧乙酸反应，而不与其它蛋白发生交叉反应，亲和力常数达l0¹⁰，重链亚型为IgG1，针对2,4-二氯苯氧乙酸特异抗原决定簇的单克隆抗体(Wl)，用于制备金标抗体。

3．2,4-二氯苯氧乙酸金标抗体（W1）和金标抗体（W1）玻璃棉的制备

以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在50～l00 ml沸腾的0.01～0.05%氯金酸水溶液中加入2～4 ml的0.5～2%柠檬酸三钠溶液，获得直径15 nm左右的胶体金。以0.1 mol/L的K₂CO₃调胶体金pH至8.5～9.5，置于以1:1000～1300的标记比将待标记的2,4-二氯苯氧乙酸单克隆抗体加入pH8.5～9.5的金溶胶中，标记l0 min后，加20% PEG10000至终浓度0.05%，4℃、1500～3000 rpm离心20 min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000 rpm离心1h，弃上清，获初步纯化金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得2,4-二氯苯氧乙酸胶体金标记抗体。将1：(100～500)稀释的胶体金标记抗体吸附于精制玻璃棉中，4℃低温真空干燥，制备2,4-二氯苯氧乙酸金标抗体棉。

4．羊抗或兔抗小鼠IgG的制备

以饱和硫酸铵提取小鼠血清IgG，取1份小鼠血清加2份PBS (pH 7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵混匀，置4℃冰箱2 h，4℃、1200 r/min离心15 min，弃上清；以适量PBS(pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵至终浓度33%，置4℃冰箱内用PBS（pH7.2)过夜透析，换液2～3次，4℃、12000 r/min离心15 min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以50µg～100 µg/kg体重（小鼠血清IgG）经皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3～4次，末次免疫10天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1：2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其血清，以饱和硫酸铵提取羊抗或兔抗小鼠IgG（方法与提取小鼠血清IgG相同，不重述），用于2,4-二氯苯氧乙酸快速检测试纸条对照显示印迹的制备。

5．2,4-二氯苯氧乙酸快速检测试纸条实施检测反应原理

当2,4-二氯苯氧乙酸快速检测试纸条样品端插入待检测样品溶液后，待检溶液通过虹吸带动待检2,4-二氯苯氧乙酸及金标抗体棉中的金标抗体（W1）一起向硝酸纤维素膜扩散，并最终渗入手柄端滤纸中，扩散过程中待检2,4-二氯苯氧乙酸可与金标抗体（Wl）相结合，进而封闭金标抗体（W1）上2,4-D的抗原结合点，阻止金标抗体（W1）与纤维素膜上偶联2,4-二氯苯氧乙酸的载体蛋白（Xi）的检测印迹结合，不能显示检测印迹，而羊抗或兔抗小鼠IgG（Y）则可与金标抗体（W1）结合，形成红棕色对照印迹“|”，即一条红棕色“|”印迹为阳性标记，反之样品溶液中无2,4-二氯苯氧乙酸则不能阻止金标抗体(Wl)与纤维素膜上偶联2,4-二氯苯氧乙酸的载体蛋白（Xi）检测印迹结合，显示红棕色检测印迹“|”，同样羊抗或兔抗小鼠IgG（Y）也与金标抗体（W1）结合，显示红棕色对照印迹“|”，形成两条红棕色“||”为阴性标记，如果纤维素膜上没有红棕色标记显示，则表明试纸条已失效。

6．2,4-二氯苯氧乙酸快速检测试纸条检测操作方法

检测样品液的制备，若检测蔬菜可将样品放入缓冲液，振荡1 min～2 min，倒出提取液进行检测；若用动物的血液作为待测样品，则提取血清，用血清作为待测样品，或直接取动物的尿液作为检测样品；若检测水中的2,4-二氯苯氧乙酸方可直接检测样品。将2,4-二氯苯氧乙酸快速检测试纸条样品端插入待检测样品液中，插入深度不超过标记线9，约10s后取出检测试纸条，水平放置约2 min，观察结果。检测结果判断：如果在纤维素膜上有一条红棕色标记“|”显示，表示测检结果呈阳性，说明在被检测的样品液中含有2,4-二氯苯氧乙酸，即该农产品农药使用超标，会影响身体健康，不能被人食用。如果2,4-二氯苯氧乙酸快速检测试纸条上的纤维素膜出现有两条红棕色标记“||”表示检测结果呈阴性，即在待检样品中不含2,4-二氯苯氧乙酸，此类农产品可以食用。

实施例1

参见图1和图2。图中1为支撑层，用塑胶薄片条制成，2为测试样品端的纤维层，用玻璃棉制成，3为吸附有2,4-二氯苯氧乙酸的金标抗体（W1）纤维层，根据上述具体实施方式3中所述的制备方法，制备吸附有2,4-二氯苯氧乙酸单克隆抗体的金标抗体（W1）玻璃棉，4为纤维素膜层，本实施例采用硝酸纤维素膜，5为吸水材料层，用吸水滤纸制成，将编号2、3、4、5各层从左至右粘贴在塑胶薄片条l上，彼此之间交界处纤维互相交叉渗透。在硝酸纤维素膜层4上，6为用偶联2,4-二氯苯氧乙酸的载体蛋白BSA溶液印上检测印迹“|”，7为用羊抗小鼠IgG（Y）溶液印上对照印迹“|”，两条印迹带平行排列形成组合印迹带“||”。8-1为覆盖在纤维层2和金标抗体纤维层3上面的样品端白色保护膜，在2和3交界处对应保护膜8-1位置上偏向于玻璃棉2一侧0.5 cm她印有标记线9，9的右端印有箭头及max字样，吸水层5（手柄端）上覆盖有黄色保护膜8-2。待测样品溶液的制备及检测操作步骤，同具体实施方式6中的检测操作方法，不重述。

实施例2

2,4-二氯苯氧乙酸残留快速检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：支撑层l用不吸水的硬纸条制成，测试端纤维层2用尼龙膜，2,4-二氯苯氧乙酸金标抗体纤维层3吸附有胶体金标记2,4-二氯苯氧乙酸多克隆抗体，纤维素膜层4采用纯纤维素膜，隐形检测印迹带6中偶联2,4-二氯苯氧乙酸载体蛋白溶液为铁蛋白，隐形对照印迹带7用兔抗小鼠IgG溶液在纤维素膜上制备而成。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同具体实施方式6中的操作方法，不重述。

实施例3

2,4-二氯苯氧乙酸残留快速检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：测试端吸附纤维层2用聚偏二氟乙烯( PVDF)膜，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜，隐形检测印迹带6中偶联2,4-二氯苯氧乙酸载体蛋白溶液为鸡卵清白蛋白（OVA），隐形对照印迹带7用羊抗小鼠IgG溶液在纤维素膜上制备而成。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同具体实施方式6中的检测操作方法，不重述。

实施例4

2,4-二氯苯氧乙酸残留快速检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：测试端吸附纤维层2用聚酯膜，隐形检测印迹带6中偶联2,4-二氯苯氧乙酸载体蛋白溶液为血蓝蛋白。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同具体实施方式6中的检测操作方法，不重述。

Claims

1.一种2,4-二氯苯氧乙酸残留快速检测试纸条，含有底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护层固定在吸附层上，其特征是：吸附层从测试端依次为纤维层、吸附金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联2,4-二氯苯氧乙酸的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“||”；

金标抗体纤维层用吸附2,4-二氯苯氧乙酸的金标抗体玻璃棉，2,4-二氯苯氧乙酸金标抗体为胶体金标记的2,4-二氯苯氧乙酸的单克隆抗体或多克隆抗体，偶联2,4-二氯苯氧乙酸的载体蛋白溶液为2,4-二氯苯氧乙酸与载体蛋白偶联的复合溶液；

抗2,4- 二氯苯氧乙酸单克隆抗体W1的制备

以20μg/只～50μg/只的偶联2,4-二氯苯氧乙酸的载体蛋白免疫BALB/c系小鼠，采用背部皮下多点注射，共免疫四次，每次间隔15～30天；第四次加强免疫后3～4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75% 酒精浸泡5～10min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100 目尼龙网过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞；将1×10⁸的脾细胞与2～5×10⁷的NSO 浆细胞瘤细胞混合，1000r/min离心10 min 弃上清，细胞沉淀于37℃的水溶中缓缓加入0.7～lml的40～50% pH 8.5～9.0的PEG4000作用1min，然后缓慢加入无血清1640培养基15ml，以终止PEG的作用，37℃水浴5～l0min，1000r/min离心l0min 弃上清，将细胞沉淀重悬于HAT选择培养基中，并以100μL～200μL/孔加入96孔培养板，置于37℃ 5% CO₂培养箱中培养；培养7～10天后，以5～10μg/ml的偶联2,4-二氯苯氧乙酸的载体蛋白包被酶标板，酶标板96孔/块，以酶联免疫吸附试验( ELISA) 检测杂交瘤的培养上清，挑取OD₄₉₂=0.8以上的强性细胞克隆，进行连续三次的有限稀释法克隆化，所生产的杂交瘤细胞染色体数为92～98，其分泌的单克隆抗体Wl特异地与2,4-二氯苯氧乙酸反应，而不与其它蛋白发生交叉反应，亲和力常数达10¹⁰，重链亚型为IgG1，针对2,4- 二氯苯氧乙酸特异抗原决定簇的单克隆抗体Wl，用于制备金标抗体；

2,4-二氯苯氧乙酸金标抗体W1和金标抗体玻璃棉的制备

以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在50～l00ml沸腾0.01～0.05%氯金酸水溶液中加入2～4ml的0.5～2%柠檬酸三钠溶液，获得直径15nm左右的胶体金；以0.1mol/L的K₂CO₃调胶体金pH至8.5～9.5，置于以1:1000～1300的标记比将待标记的2,4-二氯苯氧乙酸单克隆抗体加入pH8.5～9.5的金溶胶中，标记l0min后，加20%PEG10000至终浓度0.05%，4℃、1500～3000rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000rpm离心1h，弃上清，获初步纯化金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得2,4-二氯苯氧乙酸胶体金标记抗体；将1：(100～500)稀释的胶体金标记抗体吸附于精制玻璃棉中，4℃低温真空干燥，制备2,4-二氯苯氧乙酸金标抗体棉。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：不吸水的支撑层薄片层用硬质塑胶片条，或不吸水的硬纸条制成。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：测试端纤维层用玻璃棉、或尼龙膜、或聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜制成。

4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征是：测试端纤维层用玻璃棉制成。

5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：吸水材料层用吸水纸制成。

6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：纤维素膜层用硝酸纤维素膜、或纯纤维素膜、或羧化纤维素膜制成。

7.根据权利要求l所述的试纸条，其特征是：在测试端吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0.5cm处。

8.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：偶联2,4-二氯苯氧乙酸的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，或为鸡卵清白蛋白(OVA)，或为铁蛋白，或为血蓝蛋白。