CN102199211A - 检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法及其专用酶联免疫试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法及其专用酶联免疫试剂盒。本发明所提供的酶联免疫试剂盒含有豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体；所述豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.4617的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体杂交瘤细胞株CpTI 3D6分泌产生的。本发明应用抗CpTI多克隆抗体及酶标记抗CpTI单克隆抗体，采用双抗夹心ELISA方法进行试剂盒制备，并应用制备的试剂盒鉴定转基因作物真伪，具有快速、灵敏的优点。

Description

检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法及其专用酶联免疫试剂盒

技术领域

本发明涉及检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法及其专用酶联免疫试剂盒。

背景技术

豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的Bowman-Birk类型的双头蛋白酶抑制剂，即一个抑制剂分子可以抑剂两个胰蛋白酶分子的催化活性。自上世纪80年代，CpTI基因作为一种抗虫基因成为转基因植物的备选基因，并在表达后与非转基因植物相比表现出优良的抗虫特性，目前已成为我国众多转基因棉花品种中所携带的基因。准确评价CpTI转基因作物的生态和食品安全性、进行转基因产品的强制标识，检验和监测转基因作物种子的纯度等，必须建立起一套具有自主知识产权的快速、准确的外源基因表达蛋白的检测方法。目前检验CpTI转基因植物常用的方法是基因层面的分子检测方法。由于酶联免疫测定技术具有高通量、快速及灵敏度高等特点，在转基因植物鉴定等方面已经获得了广泛的应用，但CpTI的双抗夹心酶免疫检测方法还未见报道，所以建立一种精确的CpTI免疫检测方法具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体。

本发明所提供的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.4617的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体杂交瘤细胞株CpTI 3D6分泌产生的。

本发明的另一个目的是提供保藏编号为CGMCC No.4617的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体杂交瘤细胞株CpTI 3D6。

所述豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体在制备检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的酶联免疫试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的又一个目的是提供一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的酶联免疫试剂盒。

本发明所提供的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的酶联免疫试剂盒，含有所述豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体、豇豆胰蛋白酶抑制剂的多克隆抗体、豇豆胰蛋白酶抑制剂标准品；所述豇豆胰蛋白酶抑制剂标准品为豇豆胰蛋白酶抑制剂。

所述豇豆胰蛋白酶抑制剂标准品的浓度为100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.1ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL和0.39ng/mL。

所述豇豆胰蛋白酶抑制剂标准品按照包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)将豇豆种子粉浸泡于质量百分比为0.3％的氯化钠水溶液中，得到浸泡后的混合物；将所述浸泡后的混合物离心，取上清液，即得到提取液；将所述提取液用饱和硫酸铵溶液进行盐析粗纯化，取30％-60％盐溶度间的蛋白溶液，即得到粗纯化的豇豆胰蛋白酶抑制剂溶液；所述浸泡的温度为4℃和浸泡时间为16h；所述粗纯化的温度为4℃和粗纯化时间为4h；

(2)将步骤(1)得到的粗纯化的豇豆胰蛋白酶抑制剂溶液在以下条件下进行凝胶过滤：葡聚糖G-50填料，16mmx100cm层析柱，0.1M pH7.0PBS缓冲液洗脱，流速0.3ml/h，1.5mL/管进行分步收集，取活性高部分浓缩，得到浓缩液；

(3)将步骤(2)得到的浓缩液在以下条件下进行亲和层析：CNBr-Sepherose4B填料，以猪胰蛋白酶作为配基，上样缓冲液为0.1M pH7.0PBS缓冲液，洗脱液为0.1MpH3.0甘氨酸-HCL缓冲液，流速1mL/min，每1mL进行分步收集，取浓度高收集液合并，0.1M PH7.0PBS缓冲液透析冻干，用体积比为1∶1的水∶甘油混合液进行溶解，即豇豆胰蛋白酶抑制剂。

所述试剂盒中含有用于标记所述豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体的标记酶。

所述试剂盒中包括包被缓冲液、洗涤液、底物缓冲液、终止缓冲液和封闭液；

所述包被缓冲液由Na₂CO₃、NaHCO₃和水组成；

以上各成分在包被缓冲液中的浓度分别为：Na₂CO₃0.01M和NaHCO₃0.04M；

所述洗涤液由Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl、吐温-20和水组成；

以上各成分在洗涤液中的浓度分别为：Na₂HPO₄0.02M、KH₂PO₄0.0015M、NaCl0.14M和吐温-20的体积百分比浓度为0.1％；

所述底物缓冲液由柠檬酸三钠、Na₂HPO₄和水组成；

以上各成分在底物缓冲液中的浓度分别为：柠檬酸三钠0.01M和Na₂HPO₄0.03M。

所述终止缓冲液由硫酸和水组成；

所述硫酸在所述终止缓冲液中的浓度为2M；

所述封闭液由Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl、脱脂牛奶和水组成；

以上各成分在封闭液中的浓度分别为：Na₂HPO₄0.02M、KH₂PO₄0.0015M、NaCl0.14M和脱脂牛奶的质量百分比浓度为3％。

所述标记酶为辣根过氧化物酶。

本发明的又一个目的是提供一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法。

本发明所提供的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法，包括如下步骤：将待测样品进行前处理，得到样品检测液；再用所述试剂盒对样品检测液进行检测；

所述前处理的方法包括如下步骤：将所述待测样品研磨后，用PBS缓冲液进行浸泡，得到浸泡后的混合物；将所述混合物进行离心，取上清，即得到样品检测液；所述浸泡的时间为12小时；所述离心的转速为8000r/min和离心的温度为4℃；

所述PBS缓冲液由Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和水组成；

以上各成分在PBS缓冲液中浓度分别为：Na₂HPO₄ 0.02M、KH₂PO₄ 0.0015M和NaCl 0.14M。

所述豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体、所述试剂盒或所述方法在鉴别转CpTI基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的又一个目的是提供一种辅助鉴别转CpTI基因植物的方法。

本发明所提供的辅助鉴别转CpTI基因植物的方法，包括如下步骤：用所述试剂盒对待测植物进行检测，以已知的非转基因植物作为对照，若对待测植物进行检测时检测孔的吸光值大于所述对照的3倍，则确认所述待测植物为候选的转CpTI基因植物。

本发明应用抗CpTI多克隆抗体及酶标记抗CpTI单克隆抗体，采用双抗夹心ELISA方法进行试剂盒制备，并应用制备的试剂盒鉴定转基因作物真伪，具有快速、灵敏的优点。本发明所提供的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法及其专用酶联免疫试剂盒将有广阔的应用前景。

附图说明

图1为酶联免疫试剂盒检测CpTI蛋白浓度的标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、制备检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的酶联免疫试剂盒

一、试剂盒的制备

(一)CpTI免疫原和CpTI标准品的制备

CpTI免疫原和CpTI标准品经由豇豆蛋白提取、盐析、凝胶过滤和亲和层析步骤获得，具体方法如下：

(1)CpTI蛋白提取和粗纯化

以高盐溶液进行豇豆总蛋白提取，具体方法为：取80克黑梅一号豇豆种子(购白益农蔬菜种子商行)研磨成粉用400ml 0.3％氯化钠水溶液进行浸泡，浸泡条件为：温度为4℃，时间为16h，期间进行摇动，离心，取上清液，即得到提取液。

将得到的提取液以饱和硫酸铵溶液进行盐析粗纯化，粗纯化条件为：温度为4℃，时间为4h，静置，取30％-60％盐溶度间的蛋白溶液，即得到粗纯化CpTI蛋白溶液。

(2)凝胶过滤

取步骤(1)所得粗纯化的CpTI蛋白溶液进行凝胶过滤，凝胶过滤的条件为葡聚糖G-50填料，16mmx100cm层析柱，0.1M pH7.0PBS缓冲液洗脱，流速0.3ml/h，1.5mL/管进行分部收集，监测各管收集液蛋白浓度及抑制活性，取活性高部分浓缩，得到浓缩液。

(3)亲和层析

取步骤(2)得到的浓缩液进行亲和层析，此步骤的条件为CNBr-Sepherose4B填料，以猪胰蛋白酶(购自Sigma公司，产品目录号为9002-07-7)作为其配基，上样缓冲液为0.1M pH7.0PBS缓冲液，洗脱液为0.1M pH3.0甘氨酸-HCL缓冲液，流速1mL/min，每1mL进行分部收集，检测各管蛋白浓度及抑制活性，取浓度高收集液合并，0.1M PH7.0PBS缓冲液透析冻干，得到CpTI蛋白，-20℃保存。以超纯水溶解得到的CpTI蛋白，使其终浓度为1mg/mL，作为CpTI免疫原溶液；以水∶甘油(1∶1)溶解得到的CpTI蛋白，使其终浓度为1mg/mL，作为CpTI蛋白标准品溶液。

上述步骤(2)和步骤(3)中所述蛋白抑制活性实验的具体方法为：以N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐BAPNA为底物，取待测液0.1ml加入10ml试管中，加50mg/L的猪胰蛋白酶0.5mL。最后体积均用pH8.0、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液补至1mL，37℃保温5min，加BAPNA溶液2.5mL(1×10^-3mol/L)，37℃反应5min，立即加入0.4ml 60％醋酸溶液终止反应，以不加待测液的试样做对照，410nm处测定OD值。计算各分部收集液抑制活性，即对照吸光值与收集液吸光值的差值，再与对照吸光值的比值。该比值越高说明抑制活性越强，反之则弱。当分部收集液的抑制活性出现快速持续增长时，合并收集液，直至抑制活性下降至平缓水平。

(二)抗CpTI的多克隆抗体的制备

CpTI多克隆抗体为免疫原免疫家兔，经过血清提取及抗体纯化步骤得到，具体方法如下：

(1)取3月兔龄的新西兰大耳白兔(购自军事医学科学院实验动物中心)，体重2kg以上，作为实验动物。

(2)基础免疫：将实验(一)得到的CpTI免疫原溶液(1mg/mL)经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂(购自Sigma公司，商品目录号为F5881)，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。用乳化好的免疫原采用后脚趾间隙注射白兔，注射剂量为1mg抗原/只。

(3)加强免疫：基础免疫一个月后，取1mL实验(一)得到的CpTI免疫原溶液，加入1mL弗氏不完全佐剂(购自Sigma公司，商品目录号为F5506)，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。将乳化好的免疫原采用后腿股淋巴结或背部、颈部皮下多点注射白兔，每只白兔的注射剂量为1mg。

加强免疫每隔20天免疫一次，第五次免疫后第7天，在颈动脉采全血，置4℃冰箱过夜，以3000r/min离心，分离血清，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的血清进行纯化，得到多克隆抗体，-20℃保存。

(三)抗CpTI的单克隆抗体的制备

CpTI单克隆抗体为免疫原免疫小鼠经过细胞融合、筛选、亚克隆、腹水制备及抗体纯化步骤得到。

免疫方法：

(1)取8-10周龄的Bal b/C小白鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)作为实验动物。

(2)基础免疫：将实验(一)得到的CpTI免疫原溶液(1mg/mL)经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。用乳化好的免疫原采用腹腔及背部皮下多点注射Bal b/C小鼠，注射剂量为0.1mg抗原/只。

(3)加强免疫：基础免疫2周后，取1mL实验(一)得到的CpTI免疫原溶液，加入1mL弗氏不完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。将乳化好的免疫原采用腹腔及背部皮下多点注射Bal b/C小鼠，每只小鼠的注射剂量为0.1mg。

加强免疫每隔10天免疫一次，从第三次加强免疫开始，每次免疫后第7天，从小鼠眼眶采血，测定抗体效价，效价的定义为OD值为1时的血清稀释倍数。待效价大于1∶8000后，选择血清效价最佳的小鼠(效价为1∶40000)进行细胞融合筛选单克隆抗体。有限稀释法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；采取间接非竞争ELISA方法筛选分泌抗体效价高的单克隆细胞株。

细胞融合和克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌抗CpTI的单克隆抗体的单克隆杂交瘤细胞株。将此细胞株命名为CpTI 3D6，分类命名为杂交瘤细胞，该细胞株已于2011年03月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4617。

间接非竞争ELISA方法步骤如下：

包被：在96孔酶标板中每孔加入100mL实验(一)得到的CpTI免疫原溶液，37℃包被3小时，用PBS缓冲液洗涤4次。

封闭：封闭液150μL/孔，在37℃湿盒中封闭1h，弃封闭液，洗涤3次。

加抗体：将不同稀释倍数的增量培养法得到的单抗加至酶标板中，置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。

加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP(购自Jackson公司，商品目录号为79556)(0.1mg/mL)稀释1000倍，每孔加100μL，置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。

显色：取20mgOPD溶于10mL底物稀释液中，加4μL 30％H₂O₂，将底物溶液加入酶标板中，每孔100μL。避光显色15min。

终止：每孔加入50μL终止液，用酶标仪490nm处测定各孔的OD值。

单克隆抗体的制备与纯化：

增量培养法：将杂交瘤细胞CpTI 3D6置于细胞培养基中，在37℃条件下于二氧化碳培养箱中进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向DMEM培养基中添加小牛血清(购自GIBCOBRL，产品目录号为26170-043)和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。

(四)酶标抗体的制备

(1)HRP的活化：将10mg辣根过氧化物酶(HRP)(购自Sigma公司，产品目录号为P6782)溶于1mL水中，加入0.2mL 100mM NaIO₄水溶液，25℃搅拌反应20min，将得到的溶液记作溶液I；HRP与NaIO₄的投料配比为10mgHRP：0.02molNaIO4；此步骤的目的是使HRP糖基上的邻二羟基被氧化成活性醛基，生成的醛基与抗体蛋白的氨基共价键结合，避免了因酶分子上的氨基或羧基参与偶联反应而使酶的活性产生较大损失。

(2)向所述溶液I中加入20μl的1M的乙二醇水溶液，25℃搅拌反应10min，将反应溶液置于透析袋中与PH7.5的PBS缓冲液中4℃透析4小时。将得到的溶液记作溶液II；乙二醇与NaIO₄的投料摩尔比为1∶1。加入乙二醇的目的是使其与过量的NaIO₄反应，终止NaIO₄氧化反应并去除其对后续实验的干扰。

(3)将7mg上述实验(三)得到的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体溶于1mL PH值为9.5的碳酸盐缓冲液中，再加入所述溶液II，调节PH值至8.0，25℃反应2小时，将得到的溶液记作溶液III；HRP与单克隆抗体的投料摩尔比为2∶1。

(4)向所述溶液III中加入0.1mL浓度为0.1M的NaBH₄水溶液，4℃搅拌反应2小时，得到溶液IV。此步骤的目的是还原过碘酸钠氧化法产生的不稳定的醛基与氨基形成的C＝N双键(C＝N双键指酶与抗体蛋白之间的连接键)。

(5)将步骤(4)的得到的溶液IV置于PBS中透析完全，得到抗体蛋白与HRP的偶联物，即得到辣根过氧化物酶标记的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体。

二、检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的酶联免疫试剂盒

1、包被原：上述实验(二)制备得到的抗CpTI的兔多克隆抗体。

2、酶标抗体：上述实验(四)制备得到的辣根过氧化物酶标记的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体。

3、包被缓冲液：由Na₂CO₃、NaHCO₃和水缓冲液组成；

以上各成分在包被缓冲液中的浓度分别为：Na₂CO₃0.01M和NaHCO₃0.04M；

所述包被缓冲液的pH值为9.6。

4、洗涤液：由Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl、吐温-20和水组成；

以上各成分在洗涤液中的浓度分别为：Na₂HPO₄0.02M、KH₂PO₄0.0015M、NaCl0.14M和吐温-20的体积百分比浓度为0.1％；

所述洗涤液的pH值为7.5。

5、标准品溶液：用PBS缓冲液将上述实验(一)制备得到的CpTI蛋白标准品溶液(1mg/mL)稀释至以下浓度：

标准品溶液中CpTI蛋白浓度分别为100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.1ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL和0.39ng/mL。

所述PBS缓冲液由Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和水组成；

以上各成分在PBS缓冲液中浓度分别为：Na₂HPO₄0.02M、KH₂PO₄0.0015M和NaCl 0.14M。

6、底物缓冲液：所述底物缓冲液由柠檬酸三钠、Na₂HPO₄和水组成；

以上各成分在底物缓冲液中的浓度分别为：柠檬酸三钠0.01M和Na₂HPO₄0.03M；所述底物缓冲液的pH值为5.5。

7、终止缓冲液：2.0M的硫酸水溶液。

8、封闭液：由Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl、脱脂牛奶和水组成；

以上各成分在封闭液中的浓度分别为：Na₂HPO₄0.02M、KH₂PO₄0.0015M、NaCl0.14M和脱脂牛奶的质量百分比浓度为3％。

9、样品稀释液：与洗涤液的成分相同。

实施例2、试剂盒的应用

一、制作标准曲线

(1)多克隆抗体的包被：将1mg/mL抗CpTI的兔多克隆抗体用包被缓冲液进行稀释，按照抗CpTI的兔多克隆抗体与包被缓冲液的体积比为1∶1000的比例稀释后加入到酶标板中，每孔100μl，37℃温育3小时；倒去酶标板中的溶液，用PBS缓冲液洗板4次，甩干。

(2)在步骤(1)的酶标板中分别加入不同浓度的CpTI蛋白标准品溶液(实验孔)，每孔100μl，对照孔中不添加标准品溶液而加入100μl PBS缓冲液；37℃温育30min；倒掉酶标板中的溶液，用PBS缓冲液洗板4次，甩干；

所述不同浓度的CpTI蛋白标准品溶液中CpTI蛋白浓度分别为100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.1ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL和0.39ng/mL。

(3)将1mg/mL的辣根过氧化物酶标记的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体(酶标记抗体)用PBS缓冲液进行稀释，按照酶标记抗体与PBS缓冲液的体积比为1∶500稀释后，分别向上述步骤(2)的酶标板中加入100μl稀释后的酶标记抗体；37℃温育30min；倒掉酶标板中的溶液，用PBS缓冲液洗板4次，甩干。

(4)向步骤(3)的酶标板中分别加入100μl底物缓冲液，室温反应15min后，再向每孔中加入50μl 2.0M的硫酸水溶液终止反应。

(5)在492nm下测定吸光值。

(6)绘制标准曲线：以不同浓度的CpTI蛋白标准品溶液浓度(ng/mL)的对数值作为X轴，以吸光度值B作为Y轴，运用Origin7.0绘制标准曲线。

实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线图如图1所示。标准曲线方程为y＝0.2875x+0.165(R2＝0.9932)。

二、转基因作物真伪的鉴定

(1)将转基因棉花SGK321(公众可从中国农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是：眭书祥，赵国忠，李爱国等.转Bt+CpTI基因抗虫棉品种SGK321性状分析和种质利用.科技导报.2008，26(9)：42～45)的叶片于研钵中研磨，用PBS缓冲液于4℃浸泡12小时，8000r/min 4℃离心取上清，得到转基因作物样本溶液。用同样的方法得到非转基因棉花石远321(公众可从中国农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是：眭书祥，赵国忠，李爱国等.转Bt+CpTI基因抗虫棉品种SGK321性状分析和种质利用.科技导报.2008，26(9)：42～45)叶片的样本溶液。所述PBS缓冲液由Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和水组成；以上各成分在PBS缓冲液中浓度分别为：Na₂HPO₄0.02M、KH₂PO₄0.0015M和NaCl 0.14M。

(2)多克隆抗体的包被：与上述实验一(即制作标准曲线的实验)中步骤(1)相同。

(3)除将CpTI蛋白标准品溶液替换为上述步骤(2)得到样本溶液以外，其余方法均与上述实验一(即制作标准曲线的实验)中步骤(2)相同。

(4)与上述实验一(即制作标准曲线的实验)中步骤(3)相同。

(5)与上述实验一(即制作标准曲线的实验)中步骤(4)相同。

(6)与上述实验一(即制作标准曲线的实验)中步骤(5)相同。

(7)含有转基因样品提取液的孔与含有非转基因样品提取液的孔颜色有明显不同，含有转基因样品提取液的孔颜色深，含有非转基因样品提取液的孔颜色浅。以非转基因样品为对照，待肉眼观测到鉴定样品的颜色明显深于非转基因样品时，认为其为转基因样品，颜色没有差别时，认为所鉴定样品为非转基因样品。由此可初步鉴定转基因作物的真伪。

同时，以步骤(6)所得到吸光值鉴别转基因作物真伪，即所鉴定样品吸光值大于对照样品吸光值三倍时，认为所鉴定样品为转基因样品，否则为非转基因样品。实验设三次重复，结果取平均值。

在本实验中，转基因棉花SGK321样品测得的吸光值为0.355，非转基因棉花石远321样品测得吸光值为0.113，转基因棉花SGK321样品的吸光值大于非转基因棉花石远321样品吸光值三倍，说明该方法准确、可靠。

对转基因样品进行半定量检测：将所得鉴定样品的OD值代入上述实验一得到标准曲线方程，即可得到鉴定样品溶液中CpTI的蛋白含量。由该方法得到的转基因棉花SGK321样品溶液中CpTI的蛋白含量为1.939ng/mL。

Claims (10)

1.一种豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.4617的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体杂交瘤细胞株CpTI 3D6分泌产生的。

2.保藏编号为CGMCC No.4617的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体杂交瘤细胞株CpTI 3D6。

3.权利要求1中所述的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体在制备检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的酶联免疫试剂盒中的应用。

4.一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的酶联免疫试剂盒，含有权利要求1所述豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体、豇豆胰蛋白酶抑制剂的多克隆抗体、豇豆胰蛋白酶抑制剂标准品；所述豇豆胰蛋白酶抑制剂标准品为豇豆胰蛋白酶抑制剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述豇豆胰蛋白酶抑制剂标准品的浓度为100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.1ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL和0.39ng/mL。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有用于标记所述豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体的标记酶。

7.根据权利要求4-6中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括包被缓冲液、洗涤液、底物缓冲液、终止缓冲液和封闭液；

所述包被缓冲液由Na₂CO₃、NaHCO₃和水组成；

以上各成分在包被缓冲液中的浓度分别为：Na₂CO₃0.01M和NaHCO₃0.04M；

所述洗涤液由Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl、吐温-20和水组成；

以上各成分在洗涤液中的浓度分别为：Na₂HPO₄0.02M、KH₂PO₄0.0015M、NaCl0.14M和吐温-20的体积百分比浓度为0.1％；

所述底物缓冲液由柠檬酸三钠、Na₂HPO₄和水组成；

以上各成分在底物缓冲液中的浓度分别为：柠檬酸三钠0.01M和Na₂HPO₄0.03M。

所述终止缓冲液由硫酸和水组成；

所述硫酸在所述终止缓冲液中的浓度为2M；

所述封闭液由Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl、脱脂牛奶和水组成；

以上各成分在封闭液中的浓度分别为：Na₂HPO₄0.02M、KH₂PO₄0.0015M、NaCl0.14M和脱脂牛奶的质量百分比浓度为3％。

所述标记酶为辣根过氧化物酶。

8.一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法，包括如下步骤：将待测样品进行前处理，得到样品检测液；再用权利要求4-7中任一所述的试剂盒对样品检测液进行检测；

所述前处理的方法包括如下步骤：将所述待测样品研磨后，用PBS缓冲液进行浸泡，得到浸泡后的混合物；将所述混合物进行离心，取上清，即得到样品检测液；所述浸泡的时间为12小时；所述离心的转速为8000r/min和离心的温度为4℃。

9.权利要求1中所述豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体、权利要求4-7中任一所述试剂盒或权利要求8所述方法在鉴别转CpTI基因植物中的应用。

10.一种辅助鉴别转CpTI基因植物的方法，包括如下步骤：用权利要求4-7中任一所述试剂盒对待测植物进行检测，以已知的非转基因植物作为对照，若对待测植物进行检测时检测孔的吸光值大于所述对照的3倍，则确认所述待测植物为候选的转CpTI基因植物。

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