JP5184738B2 - 修飾第ｖｉｉ因子の安定化された固体組成物 - Google Patents

Description

発明の分野

本発明は、室温で保存、取り扱い、使用することができる、修飾第ＶＩＩ因子を含んだ化学的かつ物理的に安定な組成物に関する。

発明の背景

修飾第ＶＩＩ因子分子は、血液凝固第ＶＩＩ因子の誘導体であり、組織因子への結合能を保ちつつ、活性型第ＶＩＩａ因子の触媒活性が減少するように、その触媒部位が修飾を受けている。第ＶＩＩ因子（ヒト野生型）は、米国特許第４，７８４，９５０号に記載されている。修飾第ＶＩＩ因子分子の例は、ＷＯ ９２／１５６８６号、ＷＯ ９４／２７６３１号、ＷＯ ９６／１２８００号、ＷＯ ９７／４７６５１号に記載されている。このように、ネイティブの第ＶＩＩａ因子分子と同様に、修飾第ＶＩＩａ因子は組織因子に結合するが、ネイティブの第ＶＩＩａ因子とは異なり、修飾第ＶＩＩ因子は凝固の外因性経路におけるその後の工程を活性化することはない。これにより、修飾第ＶＩＩ因子はフィブリン血餅形成の阻害剤として作用する。従って、修飾された第ＶＩＩａ因子分子は、トロンビンの産生とこれに引き続くフィブリンの沈着を遮断することによって、血管の傷害を治療できる可能性が示唆されている（ＷＯ ９７／４７６５１）。

修飾第ＶＩＩ因子分子は、タンパク質であるため、変性やダイマー、オリゴマー、ポリマーの形態にある可溶性若しくは不溶性凝集物の形成などの凝集を含む物理的な分解、又は、例えば、加水分解、脱アミド化、及び酸化を含む化学的分解を受ける。その結果、修飾第ＶＩＩ因子分子の活性の喪失、有毒で免疫原性のある分解産物の形成、分解された修飾第ＶＩＩ因子分子を注射した際に血栓を導入する深刻なリスク、注射に用いた針の目詰まり、不均一性のリスクが生じる。このため、修飾第ＶＩＩ因子を含む医薬の安全性と効力は、第ＶＩＩ因子の安定性と直接関連している。

現在、修飾第ＶＩＩ因子は、液体調合物として調製することができるが、これは、−８０℃で凍結保存する必要がある。

このように、修飾第ＶＩＩ因子分子を含む組成物は安定化することが必要である。特に、凍結装置の必要なしに、外界条件下で、修飾第ＶＩＩ因子を含む医薬を保存し、取り扱うことが必要とされており、この場合、前記組成物は、使用前に、長期間（例えば、少なくとも６ヶ月間）保存することができる。

タンパク質を安定化させるためのアプローチの１つは、例えば、タンパク質を凍結乾燥ケーキ（フリーズドライプロセスで得られる最後の物体）の形態にするなど、タンパク質から水を除去することである。しかし、フリーズドライプロセス自体もタンパク質に対して有害である。フリーズドライの最中には、タンパク質溶液中の十分に凍結した大部分の水がこの段階で氷を形成するまで、タンパク質溶液をまず冷却する。これにより、タンパク質は凍結によって生じたストレスを受けやすくなるため、変形と沈殿が生じる。一般に第一乾燥工程と称される次の工程では、氷が昇華し、第二乾燥工程では、吸着又は結合された水が上昇した温度下で除去される。このように水分が除去される間に、タンパク質は、主に水素結合を通じて与えられる適切なコンフォメーションを緩くさせることがある。

従って、フリーズドライの間にタンパク質のコンフォメーション、活性、及び安定性を保つために、タンパク質溶液には、凍結保護及び／又は凍結乾燥保護特性を有する適切な賦形剤を十分量補充して、それぞれ、凍結によって生じるストレス及び／又は水分除去時のストレスからタンパク質を保護する必要がある。

凍結乾燥された生成物を得る場合、重要な特徴は凍結乾燥ケーキの特性に関連する。凍結乾燥ケーキは、形態と構造に関して優れた特性を有する必要がある。すなわち、凍結乾燥ケーキは崩壊してはならない。崩壊したケーキは、使用前に溶解（再構成）するのが困難であるか、時には不可能だからである。逆に凍結乾燥ケーキの物理的構造は、緩すぎず且つ柔らすぎてはいけない。従って、フリーズドライの前に、いわゆる充填剤が１以上、タンパク質溶液に添加されている。充填剤（bulking agent）とは、優れた凍結乾燥ケーキ特性を与え、凍結乾燥工程に伴う様々なストレス（例えば、剪断／凍結）をタンパク質が乗り越えるのを助ける物質である。さらに、充填剤は、薬学的に洗練され且つ見た目にも優れた生成物を形成する際にも役立ち、凍結乾燥中とその後の保存中にタンパク質に保護を与え得る。

非経口投与に適切で且つ外界条件で保存するのに適切な修飾第ＶＩＩ因子を含む安定な医薬を開発する場合、適切な賦形剤を加えなければならず、血漿と概ね等張であり、注射又は注入に適した生理的範囲のｐＨを有する生成物を与えるために、それらのレベルを慎重に調整しなければならない。張度を変更することができる物質の選択は、塩の形態を採る多くの張度調整物質が凍結乾燥プロセスを困難にする点で、重要である。

このため、外界条件（ambient condition）で長期にわたって保存した後でも、実質的に分解生成物が存在せず且つ修飾第ＶＩＩ因子の活性が減少しない、修飾第ＶＩＩ因子の安定な組成物を提供することが本発明の目的である。さらに、安定な組成物が非経口投与に適しているため、患者に何らの不都合も生じさせない生理的に適切な張度とｐＨ域を有することが、必須の目的である。

発明の概要

本研究者らは、２５℃で少なくとも約１２ないし１８ヶ月間保存できる十分安定な組成物中に修飾第ＶＩＩ因子を加え得ることを発見した。

従って、本発明は、第一の側面において、
ｉ）修飾第ＶＩＩ因子と、
ii）当該組成物を水に溶かしたときに、当該組成物のｐＨを４ないし７の範囲に維持するのに適した物質と、
iii）最大３％の水分含量と、
を含む安定化された組成物に関する。

さらなる側面において、本発明は、安定な修飾第ＶＩＩ因子を調製する方法であって、
ｉ）ｐＨが４ないし７の範囲にある溶液中に前記修飾第ＶＩＩ因子を与える工程と、
ii）前記溶液を加工して、水分含量が最大３％ ｗ／ｗである固形組成物を得る工程と、
を備えた方法に関する。

先述したように、有害な現象が生じるリスクを最小化し、治療目的のために修飾第ＶＩＩ因子を投与したときに安全性と効力を向上させることが、安定化された修飾第ＶＩＩ因子に求められる。従って、本発明のさらなる側面は、血液凝固及び／又は組織因子媒介反応を抑制するための医薬を調製するための修飾第ＶＩＩ因子の使用に関し、前記医薬は、
ｉ）修飾第ＶＩＩ因子と、
ii）当該組成物を水に溶かしたときに、４ないし７の範囲に当該組成物のｐＨを維持するのに適した物質と、
iii）最大３％の水分含量と、
を備えた組成物を含む。

最後に、本発明は、血液凝固を防止し及び／又は組織因子媒介反応を抑制するために前記安定化された修飾第ＶＩＩ因子を患者に投与することに関し、この方法では、これを必要としている患者に有効量の組成物を投与することを備え、該組成物は、
ｉ）修飾第ＶＩＩ因子と、
ii）前記組成物を水に溶かしたときに、前記組成物のｐＨを４ないし７の範囲に維持するのに適した物質と、
iii）最高３％の水分含量と、
を備える。

発明の詳細な説明

本発明は、修飾第ＶＩＩ因子を含む安定に保存できる組成物に関する。本組成物は、修飾第ＶＩＩ因子の実質的な分解を引き起こさずに、長期にわたって、外界温度を含む様々な温度で保存することができる。

本発明は、２５℃の暗所に保存した際に、少なくとも約１２ないし１８ヶ月間安定である、修飾第ＶＩＩ因子の安定に保存できる組成物を発見したことに基づいて為されたものである。本発明は、３２ヶ月などさらに長い保存期間を経ても安定な修飾第ＶＩＩ因子を含む組成物も包含する。このように、本発明によれば、このような組成物を投与した際に、患者に有害な現象が生じるリスクを増加させることなく、室温でこのような組成物を保存することが可能となる。有利には、保存時の安定性が向上しているために、保存時に特別な冷却条件が不要となるためにコストも低減し、使用者による前記組成物の取り扱いがさらに便利となるであろう。

修飾第ＶＩＩ因子という用語は、組織因子への結合能を保ちつつ、第ＶＩＩａ因子の触媒活性が減少するように修飾された任意の第ＶＩＩ因子タンパク質を意味する。その結果、修飾第ＶＩＩ因子分子は、組織因子への結合につきネイティブの第ＶＩＩ因子又はＶＩＩａ因子と競合することにより、一連の凝固反応において後続する第Ｘ因子と第ＩＸ因子の活性化を阻害する。前記修飾は、例えば、触媒部位内に位置してもよい。

「修飾第ＶＩＩ因子」という用語には、第ＶＩＩａ因子の生物活性が（米国特許第４，７８４，９５０号に開示されているような）野生型ヒト第ＶＩＩａ因子の活性に比べて実質的に減少したポリペプチドが包含されるが、これに限定されるものではない。これらのポリペプチドには、化学的に修飾された第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩａ因子、及びポリペプチドの生物活性を修飾し又は崩壊させる１以上の特定のアミノ酸配列の改変が導入された第ＶＩＩ因子バリアントが含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、「修飾第ＶＩＩ因子」という用語には、ヒト第ＶＩＩ因子と比較してアミノ酸配列が末端切断されたポリペプチド（すなわち、第ＶＩＩ因子断片）、及び／又はＮ末端のアミノ酸の欠失又は付加及び／又は翻訳後修飾を含む修飾されたＮ末端を有するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されるものではない。前記修飾第ＶＩＩ因子は、高い親和性と特異性で組織因子に結合するが、血液凝固は開始させない。

本明細書において使用する修飾第ＶＩＩ因子は、チモーゲンの形態であってもよく（すなわち、一本鎖分子）又はその活性化部位が切断されていてもよい。このように「修飾第ＶＩＩ因子」という用語は、修飾第ＶＩＩａ因子及び組織因子を結合できる修飾第ＶＩＩａ因子分子へと活性化された際に、真正の第ＶＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩａ因子と凝固カスケード中で組織因子への結合を競合することが可能で、それにより、第ＩＸ因子の第ＩＸａへの活性化及び第Ｘ因子の第Ｘａ因子への活性を阻害することができる修飾第ＶＩＩ因子を意味するものとする。このような競合は、例えば本明細書に記載されているように、ヒト膀胱カルシノーマ細胞株Ｊ８２（Sakai et al. J. Biol. Chem. 264: 9980-9988 (1989)）（本明細書に参照により援用される）などの細胞表面組織因子を有する細胞株を用いた競合凝固アッセイ、競合ＦＩＸａ又はＦＸａ生成アッセイ、又は競合結合アッセイによって容易に測定することができる（下記の「アッセイ」の部を参照）。

本発明の１つの実施形態では、修飾第ＶＩＩ因子は、本明細書に記載されているような１以上のＴＦ結合アッセイにおいて調べたときに、野生型第ＶＩＩａ因子の特異的なＴＦ結合親和性の少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、又は少なくとも約１２０％の親和性を示すポリペプチドが包含される。好ましい実施形態では、前記ＴＦアンタゴニストは、野生型第ＶＩＩａ因子の結合親和性の少なくとも約７５％を示す。本明細書で使用される「ＴＦ結合活性」という用語は、ＦＶＩＩａポリペプチド又はＴＦアンタゴニストが組換えヒト１２５Ｉ−ＦＶＩＩａの細胞表面ヒトＴＦへの結合を阻害できることを意味する。ＴＦ結合活性は、例えば、（本明細書の）アッセイ３に記載されているように測定することができる。別の実施形態では、修飾第ＶＩＩ因子には、本明細書のアッセイ１−２及び４−７に記載されているような凝固アッセイ、ＦＩＸａ若しくはＦＸａ生成アッセイ、アミド分解若しくはタンパク質分解アッセイのうち１つ以上のアッセイで調べたときに、野生型第ＶＩＩａ因子の約２５％未満、より好ましくは約１０％、又は５％、又は３％、又は２％未満、最も好ましくは約１％の比活性を示すポリペプチドが包含される。

「触媒性部位」又は「活性部位」という用語をＦＶＩＩａに関して本明細書中で使用する場合、チモーゲン基質を結合する触媒性部位を意味するものとし、Schecter, I. and Berger, A., (1967) Biochem. Biophys. Commun. 7: 157-162による本用語の定義のとおり、ＦＶＩＩａの「Ｓ_１」部位を含む。

ヒト及びウシの第ＶＩＩ因子タンパク質の触媒部位には、いわゆる触媒性「三連構造」を形成しているアミノ酸Ｓｅｒ３４４、Ａｓｐ２４２、Ｈｉｓ１９３（数字は配列中の位置を表す）が含まれている。他の哺乳類種から得られる第ＶＩＩ因子中の触媒部位は、とりわけ、タンパク質の単離とアミノ酸配列分析などの現時点で利用可能な技術を用いて決定することができる。他のセリンプロテアーゼ、特に、活性部位が既に決定されているキモトリプシン（Sigler et al., J. Mol. Biol., 35: 143-164 (1968)、参照により本明細書に援用）の配列とともに当該配列を並列させ、そのアラインメントから類似の活性部位の残基を決定することにより、触媒部位を決定してもよい。このように、本明細書で使用する場合、修飾第ＶＩＩ因子には、任意の哺乳類種から得られた第ＶＩＩ因子ポリペプチドが包含される。

第ＶＩＩａ因子の触媒活性の修飾は、化学的な誘導化、酵素的な反応、又はアミノ酸の置換、挿入、若しくは欠失を含む（これらに限定されるものではない）数多くの方法によって、実施することができる。

１つの実施形態において、第ＶＩＩａ因子の触媒活性は、触媒部位すなわち三連構造の化学的な誘導化によって阻害される。誘導化は、非限定的な例を挙げれば、有機リン化合物、スルホニルフルオリド、ペプチドハロメチルケトン又はアザペプチドのような不可逆的な阻害剤と第ＶＩＩ因子を反応させることによって、又はアシル化によって行うことができる。阻害剤としては、ペプチドクロロメチルケトン若しくはペプチジルクロロメタン；アザペプチド；様々なグアニジノベンゾエート誘導体や３−アルコキシ−４−クロロイソクマリンなどのアシル化剤；フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）などのスルホニルフルオリド；ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）；トシルプロピルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）；トシルリシルクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）；ニトロフェニルスルフォネート；イソクマリンやクマリンなどの複素環式プロテアーゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

好ましいペプチドハロメチルケトンには、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ＦＦＲ−ｃｍｋ）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン（Ｄ−ＦＦＲ−ｃｍｋ）、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ＦＰＲ−ｃｍｋ）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン（Ｄ−ＦＰＲ−ｃｍｋ）（米国特許第４，３１８，９０４号を参照、本明細書に参照により援用）、Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ＥＧＲ−ｃｍｋ）、及びＤ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン（Ｄ−ＥＧＲ−ｃｍｋ）、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、及びダンシル−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトンが含まれる。

前記修飾第ＶＩＩ因子分子が活性化型である実施形態では、セリンプロテアーゼ阻害剤を用いた反応によって、ＦＶＩＩａを修飾することが可能である。ある実施形態では、前記プロテアーゼ阻害剤は、有機リン化合物、スルファニルフルオリド、ペプチドハロメチルケトン、又はアザペプチドである。ある実施形態では、前記プロテアーゼ阻害剤は、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ＦＦＲ−ｃｍｋ）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン（Ｄ−ＦＦＲ−ｃｍｋ）、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ＦＰＲ−ｃｍｋ）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン（Ｄ−ＦＰＲ−ｃｍｋ）、Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ＥＧＲ−ｃｍｋ）、及びＤ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン（Ｄ−ＥＧＲ−ｃｍｋ）、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、及びダンシル−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトンから選択されるペプチドハロメチルケトンである。ある実施形態では、前記プロテアーゼ阻害剤は、ダンシル−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン及びＬ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン及びＤ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトンから選択されるペプチドハロメチルケトンである。ある実施形態において、前記プロテアーゼ阻害剤は、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ＦＦＲ−ＦＶＩＩａ）である。

上記のように、アミノ酸を表す略号の直前に「Ｄ」という表記が先行している場合、そのアミノ酸は、天然に存在しないｄ−鏡像異性体であることを理解しなければならない。

さらなる実施形態では、第ＶＩＩａ因子の触媒活性は、アミノ酸を置換、挿入、又は欠失させることによって阻害される。一連の実施形態では、第ＶＩＩ因子の触媒性三連構造（本明細書においては、第ＶＩＩａ触媒部位に寄与するアミノ酸を含有する領域と定義される）のアミノ酸配列中に、１つ以上のアミノ酸置換が行われる。触媒性三連構造中の置換、挿入、又は欠失は、触媒部位を形成するアミノ酸又はその隣接部位に行われるのが一般的である。ヒト及びウシの第ＶＩＩ因子タンパク質では、触媒性「三連構造」を形成するアミノ酸はＳｅｒ３４４、Ａｓｐ２４２、及びＨｉｓ１９３（数字は、ヒト野生型第ＶＩＩ因子中での位置を表している）である。他の哺乳類種から得られる第ＶＩＩ因子中の触媒部位は、とりわけ、タンパク質の単離及びアミノ酸配列分析などの現時点で利用可能な技術を用いて決定することができる。他のセリンプロテアーゼ、特に、活性部位が既に決定されているキモトリプシン（Sigler et al., J. Mol. Biol., 35: 143-164 (1968)、参照により本明細書に援用される）の配列とともに当該配列を並列させ、そのアラインメントから類似の活性部位の残基を決定することにより、触媒部位を決定してもよい。

アミノ酸の置換、挿入、又は欠失は、第ＶＩＩａ因子による第Ｘ因子及び／又は第ＩＸ因子の活性化を抑制あるいは阻害するように行われる。但し、このような修飾が施された第ＶＩＩ因子も、凝固カスケード中の組織因子への結合に関して、真正な第ＶＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩａ因子と競合する能力は保持していなければならない。このような競合は、例えば本明細書に記載されているように、ヒト膀胱カルシノーマ細胞株Ｊ８２（Sakai et al. J. Biol. Chem. 264: 9980-9988 (1989)）などの細胞表面組織因子を有する細胞株を用いた凝固アッセイ又は競合結合アッセイによって容易に測定することができる。

本発明では、単一のアミノ酸のみを変化させることにより、分子の抗原性が増加する可能性又は組織因子を結合する能力を阻害する可能性を最小限に抑えることが好ましい。しかしながら、２以上のアミノ酸を変化（置換、付加、又は欠失）させてもよいし、置換、付加、及び欠失の組み合わせを用いてもよい。ヒト及びウシの第ＶＩＩ因子中のＳｅｒ３４４、Ａｓｐ２４２、Ｈｉｓ１９３など、第ＶＩＩ因子の触媒部位を形成しているアミノ酸は、置換してもよいし、欠失させてもよい。ヒト及びウシの第ＶＩＩ因子に関して好ましい実施形態では、Ｓｅｒ３４４はＡｌａによって置換するのが好ましいが、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、又はその他のアミノ酸を置換することも可能である。ＡｓｐはＧｌｕに置換し、ＨｉｓはＬｙｓ又はＡｒｇに置換することが好ましい。一般的には、タンパク質の三次構造の崩壊ができる限り最小限になるような置換を選択する。他のアミノ酸置換を選択する際には、Ｄａｙｈｏｆｆらのモデル（Atlas of Protein Structure 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D. C., 本明細書に参照により援用）をガイドとして使用することができるであろう。ヒト、ウシ、その他の種の適切な第ＶＩＩ因子配列の触媒部位中に上述した残基の改変を導入し、本明細書中に上記したように、得られたタンパク質が所望のレベルの触媒活性の阻害とそれによる抗凝固活性の阻害を示すか調べてもよい。

ヒト及びウシ第ＶＩＩ因子の好ましい実施形態では、活性部位の残基Ｓｅｒ３４４が修飾され、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒによって置換され、さらに好ましくはＡｌａによって置換される。このような置換は、別個に行うこともできるし、Ｈｉｓ１９３とＡｓｐ２４２を含む触媒性三連構造中の他の部位の置換と組み合わせて行うこともできる。

野生型第ＶＩＩ因子に比べて実質的に減少した生物活性を有する修飾第ＶＩＩ因子の例としては、Ｒ１５２Ｅ−ＦＶＩＩａ（Wildgoose et al., Biochem 29: 3413-3420, 1990）、Ｓ３４４Ａ−ＦＶＩＩａ（Kazama et al., J. Biol. Chem. 270: 66-72, 1995）、ＦＦＲ−ＦＶＩＩａ（Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15: 515-520, 1998）、Ｇｌａドメインを欠く第ＶＩＩａ因子（Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317: 245-249, 1993）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。非限定的な例としては、３４１位のリシン残基が別のアミノ酸残基で置換されたヒトＦＶＩＩａ、３４４位のセリン残基が別のアミノ酸残基で置換されたヒトＦＶＩＩａ、２４２位のアスパラギン酸残基が別のアミノ酸残基で置換されたヒトＦＶＩＩａ、１９３位のヒスチジン残基が別のアミノ酸残基で置換されたヒトＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩ−（Ｋ３４１Ａ）、ＦＶＩＩ−（Ｓ３４４Ａ）、ＦＶＩＩ−（Ｄ２４２Ａ）、ＦＶＩＩ−（Ｈ１９３Ａ）、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＦＶＩＩ（ＦＦＲ−ＦＶＩＩ）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＦＶＩＩ（Ｄ−ＦＦＲ−ＦＶＩＩ）、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＦＶＩＩ（ＦＰＲ−ＦＶＩＩ）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＦＶＩＩ（Ｄ−ＦＰＲ−ＦＶＩＩ）、Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＦＶＩＩ（ＥＧＲ−ＦＶＩＩ）、及びＤ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＦＶＩＩ（Ｄ−ＥＧＲ−ＦＶＩＩ）、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＦＶＩＩ、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＦＶＩＩ、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＦＶＩＩ、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＦＶＩＩ、ダンシル−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＦＶＩＩ、及びダンシル−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＦＶＩＩも挙げられる。化学的に修飾された第ＶＩＩ因子ポリペプチド及び配列バリアントの非限定的な例は、例えば、米国特許第５，９９７，８６４号中に記載されている。

さらに、「修飾第ＶＩＩ因子」という用語は、ヒトなどの動物から得られ、又は組換え及び／又は合成手段によって作製された修飾第ＶＩＩ因子分子を意味する。

ある実施形態において、前記修飾第ＶＩＩ因子分子は、第ＶＩＩａ因子、好ましくは、プロテアーゼ阻害剤Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトンによって修飾されたウシ又はヒトの第ＶＩＩ因子である。

ある実施形態において、前記修飾第ＶＩＩ因子分子は、プロテアーゼ阻害剤Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトンによって修飾されたヒト野生型第ＶＩＩａ因子である。本実施形態では、この修飾第ＶＩＩ因子分子はＦＦＲ−ＦＶＩＩａと略記される。

本明細書において使用する場合、ＦＦＲ−ＦＶＩＩａ濃度は、適宜ｍｇ／ｍｌ又はＵ／ｍｌとして表記され、１ｍｇ／ｍｇは約２０Ｕ／ｍｌに相当する。

前記修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、約０．５ないし約８．０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ないし約５．０ｍｇ／ｍｌ、又は約１．０ｍｇ／ｍｌないし約５．０ｍｇ／ｍｌなど、約０．１ｍｇ／ｍｌないし約１０．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在することができる。

本明細書で使用する「安定化させる」という用語には、凝集物（不溶性及び／又は可溶性）及び／又は化学的な分解物の形成を最小化させること、並びに、生物活性やタンパク質の安定性が実質的に維持されるように、組成物の保存又は製造中にタンパク質のｐＨと適切なコンフォメーションを維持させることが包含される。さらに、安定化させるという用語には、フリーズドライ条件で組成物を製造中に前記タンパク質の凍結乾燥保護や凍結保護を行うことも包含される。

「構造的な安定化」又は「構造的な安定性」という用語には、優れた特性と見かけ（例えば、崩壊せず且つ使用前にすぐ溶ける）を有する凍結乾燥栓子（plug）又はケーキ（cake）を形成する能力も包含される。

安定に保存できる生成物とは、５℃ないし５０℃の温度で保存した際に安定化され、所定の期間（多くの場合、数ヶ月）にわたって、予め選択した生成物の仕様の範囲に保たれる生成物をいう。

物理的な安定性は、ダイマー、オリゴマー、ポリマー型の修飾第ＶＩＩ因子の形態で不溶性及び／又は可溶性凝集物が形成される（又はそれが欠如する）こと、並びに当該分子の構造的な変形や変性に関連する。

化学的な安定性は、加速された条件において、溶解された状態又は固体の状態で保存した際に、修飾第ＶＩＩ因子に任意の化学的変化が生じること（又は生じないこと）に関連する。非限定的な例としては、加水分解、脱アミド化、及び酸化が挙げられる。特に、含硫アミノ酸は酸化を受けて、対応するスルホキシドを形成しやすい。

本明細書で使用する「凍結保護物質（cryoprotectant）」という用語には、一般に、凍結によって生じたストレスからタンパク質に対して安定性を与える物質が含まれる。凍結保護物質の例には、例えば、マンニトールなどのポリオール、例えばスクロースなどのサッカリド、例えば、ポリソルベート、ポロキサマー、又はポリエチレングリコールなどの界面活性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。凍結保護物質は、調合物の張度にも寄与する。

本明細書で使用する「凍結乾燥保護物質（lyoprotectant）」という用語には、例えば、タンパク質の適切なコンフォメーションを維持することなどによって、凍結乾燥プロセスの乾燥プロセス中の水分除去時にタンパク質に対して安定性を与える物質が含まれる。凍結乾燥保護物質の例としては、サッカリド、特に二糖又は三糖が挙げられるが、これらに限定されるものではない。凍結保護物質が、同時に凍結乾燥保護効果を有していることもある。

「ｐＨを４ないし７の範囲に維持するのに適した物質」という用語には、４．０ないし７．０の許容される範囲内に溶液のｐＨを維持する物質が包含される。ｐＨを４ないし７の範囲内に維持することができる物質の典型的な例は、クエン酸塩（ナトリウム又はカリウム）、酢酸塩（アンモニウム、ナトリウム又はカルシウム）、ヒスチジン（Ｌ−ヒスチジン）、リンゴ酸塩、リン酸塩（ナトリウム又はカリウム）、酒石酸、コハク酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、イミダゾール、ＴＲＩＳ、乳酸塩、グルタミン酸塩及びグリシルグリシンであるが、これらに限定されるものではない。

本明細書中で用いる「凍結乾燥ケーキ」という用語には、溶解／一部溶解した組成物を冷却して氷らせる少なくとも１つの工程を行った後に少なくとも１つの真空乾燥工程を行う条件下で、溶解又は少なくとも一部溶解した組成物を加工したときに得られる固形組成物が包含される。

「凍結乾燥」及び「フリーズドライする」という用語には、溶解又は一部溶解した溶液を冷却して氷らせる少なくとも１つの工程を行った後に真空乾燥工程を行う条件下で、溶解又は少なくとも一部溶解した組成物から液体を除去するプロセスが包含される。凍結乾燥又はフリーズドライは、固体のタンパク質医薬品を製造するための最も一般的なプロセスである。このプロセスは、タンパク質溶液の凍結と、真空下での凍結した固体の乾燥という２つの主要な工程からなる。乾燥工程は、さらに、一次乾燥と二次乾燥という２つの相に分けられる。一次乾燥では、凍結した水分を除去し（氷の昇華）、二次乾燥では、凍結していない「結合した」水分を除去する（水分の脱離）。各凍結乾燥工程のさらに詳細な分析は、例えば、Wang et al, International Journal of Pharmaceutics 203 (2000): 1-60に記載されている（第４節、１６ページを参照）。

典型的には、バイアル中に充填し、凍結乾燥機の棚上で凍結させた後、真空状態を確立し、棚を加熱して一次乾燥（すなわち氷の昇華）することにより、組成物のフリーズドライを行う。次いで、プロセスが完了するまで（すなわち、組成物の水分（水）含量が十分に少なくなるまで）、さらに高い温度で二次乾燥（又は吸着された水の脱離）を行う。フリーズドライする方法は本分野において公知であり、例えば、Wang et al, International Journal of Pharmaceutics 203 (2000): 1-60を参照されたい。ある組成物について、プロセス時に使用すべき温度、各温度における時間、圧力に関してフリーズドライ条件を最適化することは、当業者の通常の知識の範囲内に属することである。

「水分含量（moisture content）」という用語には、前記生成物に会合した水が包含され、凍結した溶質相中に捕捉又は吸着された未凍結水及び／又は非晶質相に会合し若しくは結晶固体に吸着された未凍結水などの吸着された形態の水が含まれるが、これらに限定されるものではない。「水含量（water content）」という用語は、「水分含量」という用語と互換的に用いられる。所望の残存水分レベル（水分含量）は、二次乾燥工程の持続時間と温度の関数として表される。凍結乾燥中の残存水分含量を測定する方法が、本分野で幾つか知られており、例えば、電子湿度計又は残存気体分析器を使用することができる。フリーズドライされた調合物の水分含量は、例えば、乾燥減量、Karl Fischer滴定、熱的重量分析（ＴＧＡ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、又は近赤外線など、本分野で公知の幾つかの方法によって測定することができる（例えば、Wang et al, International Journal of Pharmaceutics 203 (2000): 1-60を参照）。水含量（水分含量）を測定する方法は、欧州薬局方と米国薬局方にも記載されている。例えば、水含量の測定は、米国薬局方（ＵＳＰ＜９２１，Ｉｃ＞）又は欧州薬局方（ＥＰ＜２．５．３２＞）に記載されているように、Karl Fischer電量滴定によって行うことができる。簡単に述べると、この方法は、以下のとおりである。電荷滴定による水含量の測定：無水溶媒中の二酸化硫黄およびヨウ素と水との定量的反応に基づいた水の電量測定において、Karl Fisher反応を用いる。ヨウ化物の酸化により、反応セル中にヨウ素が電気化学的に生じる。陰極に産生されたヨウ素は、反応セル中に含有された水及び二酸化硫黄と直ちに反応する。物質中に存在する水の量は、滴定の終末点に到達するまで、電気の量と正比例する。セル中の水が全て消費されると、終末点に達し、過剰なヨウ素が発生して、これが電気測定によって検出され、終末点を示す。次いで、前記物質中に存在する水のパーセント含量が計算される。

水分含量は、分析時にバイアル中に存在するサンプルの重量（すなわち、固体プラス水−湿重量ベースと称される）に対して表してもよいし、あるいはサンプル中の測定された水に対して補正を行って表してもよい（すなわち、乾燥重量ベース）。水分含量が低いフリーズドライ製品の場合、２つの測定値（湿重量ベースと乾燥重量ベース）は極めて似通った結果を示す。本明細書で使用する場合、水分含量は、固体プラス水に対して表す（すなわち、湿重量ベース）。

「充填剤」という用語には、一般に、優れた凍結乾燥ケーキ特性を与え、薬学的に洗練された生成物を形成し、凍結乾燥工程に伴う様々なストレス（例えば、剪断／凍結）をタンパク質が乗り越えるのを助け、フリーズドライ工程中とその後の保存中にタンパク質の活性レベルが維持されるように助ける物質が含まれる。充填剤の例には、マンニトール、グリシン、スクロース、ラクトースが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの物質は、調合物の張度（tonicity）に寄与することもある。

「張度調節物質」という用語には、溶液の浸透圧に寄与することが可能な物質であって、これにより、使用時に組成物を溶かしたときに、組成物が血液、腹腔液、又は他の適切な体液の生理的範囲内にある張度を有するように、組成物の張度を調節する任意の物質が含まれる。当然のことながら、張度は、再構成溶液が張度調整物質を含有しているか否かにも依存する。

「界面活性剤」という用語には、一般に、空気／溶液界面によって生じるストレス及び／又は溶液／表面によって生じるストレスからタンパク質を保護する物質が含まれる。例えば、界面活性剤は、タンパク質を凝集から保護することができる。適切な界面活性剤としては、Tween 20、Tween 80などのポリソルベート、又はポロキサマー１８８若しくは４０７などのポロキサマー、他のエチレン／ポリプロピレンブロックポリマー又はＰＥＧ８０００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。好ましい界面活性剤は、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７）、アルキルエーテル（例えば、Cremophor A25、Sympatens ALM/230）、ポリソルベート／Tween（例えば、Polysorbate 20、Polysorbate 80）である。さらに好ましいのは、ポロキサマー（例えば、Poloxamer 188）およびTween（例えば、Tween 20、Tween 80）である。

「理論的含量」という用語は、調製時に組成物に添加される修飾第ＶＩＩ因子の量を意味する。本明細書に記される濃度（ｍｇ／ｍｌ）は、フリーズドライを行う前の修飾第ＶＩＩ因子の溶液中における濃度か、又は％ｗ／ｗ（重量／重量）として表され、次いで、これは凍結乾燥ケーキ中の濃度に関わる。

本明細書で使用する場合、明記された量は±約１０％と理解される。このため、約５０ｍＭという表記は５０ｍＭ±５ｍＭを含み、４％は４％±０．４％を含む。

上述したように、本発明は、修飾第ＶＩＩ因子タンパク質を安定化させることにより、使用者に対するリスクや不便を増加させずに、長期保存を可能にする方法及び組成物を提供する。

本研究者らは、修飾第ＶＩＩ因子を安定化させる際には、数多くの重大なパラメータを調整する必要があることを見出した。第一のパラメータとしては、水分含量（例えば、水）が少なくとも部分的に関係する。水分含量は制限すべきである。さらに不可欠なパラメータとしては、組成物には、ｐＨ４ないし７の範囲内にｐＨを維持するのに適した物質を含めるべきである。

このように、第一の側面において、本発明は、
ｉ）修飾第ＶＩＩ因子と
ii）当該組成物を水に溶かしたときに、当該組成物のｐＨを４ないし７の範囲に維持するのに適した物質と、
iii）最高３％の水分含量と
を備えた組成物に関する。

本発明に従って調合することができる修飾第ＶＩＩ因子は、上述のとおりである。本発明の適切な実施形態では、前記修飾第ＶＩＩ因子は、ダンシル−ＥＧＲ−ＦＶＩＩａ、ダンシル−ＥＧＲ−ＦＶＩＩ、ＦＦＲ−ＦＶＩＩａ、ＦＦＲ−ＦＶＩＩ、ＰＰＡ−ＦＶＩＩａ、ＰＰＡ−ＦＶＩＩ、Ｓｅｒ３４４−ＦＶＩＩａおよびＳｅｒ３４４−ＦＶＩＩからなる群から選択される。好ましくは、前記修飾第ＶＩＩ因子は、ＦＦＲ−ＦＶＩＩａ又はＦＦＲ−ＦＶＩＩである。

上述したように、ｐＨは、水に溶かしたときに４ないし７のｐＨ範囲内に維持しなければならない。同時に、このｐＨ範囲は所望の生理的範囲に属するようにして、それにより、非経口手段により組成物を投与したときにユーザに害を与えないようにすることが有利である。好ましくは、前記溶液のｐＨは、５．０ないし７．０、５．５ないし７．０又は５．８ないし６．８（６．０及び６．５のｐＨに近くなるように）である。

ｐＨを所望の範囲内に維持するのに適した物質の中には、所望のｐＨを達成するために限られた量を添加しなければならないものがある。例えば、本物質がグリシルグリシンである場合には、その含量を調整する必要がある。

このため、さらに別の興味深い実施形態においては、前記組成物のｐＨを４ないし７の範囲に維持するのに適した前記物質はグリシルグリシンであり、グリシルグリシンは最大７ｍｇ／ｍｌの量で存在する。従って、その適切な実施形態において、ｐＨを４ないし７の範囲に維持するのに適した前記物質は、クエン酸塩、ヒスチジン、リンゴ酸塩、リン酸塩、酒石酸、コハク酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、イミダゾール、ＴＲＩＳ、乳酸塩、グルタミン酸塩、及びグリシルグリシンからなる群から選択されるが、前記物質がグリシルグリシンである場合には、最大７ｍｇ／ｍｌの量で存在する。

これに関連するさらに別の実施形態では、グリシルグリシンの量が最大約４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは最大約３ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは最大約２ｍｇ／ｍｌなどとなるように、グリシルグリシンの量はさらに制限される。

さらに、ｐＨを４ないし７の範囲に維持するのに適した前記物質は、列記されている物質のうち少なくとも２つの混合物であってもよく、ここで、前記混合物が特定範囲内のｐＨ値を与えることができる。

前記適切な物質の濃度は、約１ｍＭないし１００ｍＭ、１ｍＭないし約５０ｍＭ、約１ｍＭないし約２５ｍＭ、約２ｍＭないし約２０ｍＭの範囲内にあるか、又は約１０ｍＭである。

上述したように、水分含量は制限しなければならない。このため、本発明の好適な実施形態では、前記水分含量は最大２％ｗ／ｗ、最も好ましくは最大約１％ｗ／ｗである。

典型的には、修飾第ＶＩＩ因子タンパク質は、大量に与える場合、液体の形態をとる。このため、組成物を製造するために、タンパク質原末をさらに加工するには、適切な賦形剤を添加し、前記原末（bulk）から液体を除去する工程が必要であり、前記賦形剤の添加は、液体を除去する前に行ってもよいし、液体を除去した後に行ってもよい。タンパク質から液体を除去するための１つの手段としては、フリーズドライがある。従って、本発明の好ましい実施形態において、前記組成物は凍結乾燥ケーキの形態をとる。

このように、本発明の好適な実施形態において、前記組成物は、凍結保護物質、凍結乾燥保護物質、及び／又は充填剤をさらに含む。この実施形態の１つでは、前記組成物は、マンニトール、ソルビトール、キシリトールからなる群から選択される糖アルコールをさらに含む。別の実施形態では、前記組成物は、スクロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、シクロデキストリン、マルトデキストリン、デキストランからなる群から選択されるサッカリドをさらに含む。

典型的には、凍結保護物質、凍結乾燥保護物質、及び充填剤の含量は、凍結乾燥中及び凍結乾燥終了後及び様々な条件での保存時における修飾第ＶＩＩ因子タンパク質の安定性に貢献するように、適切に調整する必要がある。

本研究者らは、前記糖アルコールが約３０％ｗ／ｗないし９５％ｗ／ｗの範囲の量とすべきことを見出した。好ましくは、前記糖アルコールの量は、約３５％ｗ／ｗないし９５％ｗ／ｗ、より好ましくは約４０％ｗ／ｗないし９０％ｗ／ｗ、最も好ましくは約４５％ｗ／ｗないし９０％ｗ／ｗの範囲内とすべきである。

実施例３を見れば明らかなように、本発明者らは、４０ｍｇ／ｍｌ（フリーズドライ前の濃度）に相当する適切な含量のマンニトールを加えることにより、フリーズドライプロセスを終了した時点で（フリーズドライプロセス終了後２４時間未満）、分解産物の含量が少ない組成物を提供した。このように、本発明の組成物は、保存を行う前に、酸化型及び凝集物の初期含量が少ないことを特徴とする。

典型的には、前記組成物は、凍結乾燥が終了すると、４％ｗ／ｗ未満の修飾第ＶＩＩ因子が酸化型に転換され、１％未満がダイマー又はそれ以上のポリマー型として回収され、慣用的な分析法（例えば、本明細書の実施例２に記載されている方法など）を用いて検出されないように安定化される。

さらに、有利には、本発明の組成物は安定に保存でき、例えば、２５℃で暗所に１２時間保存した際に、５％ｗ／ｗ未満（４％、３％、又は２．５％など）の修飾第ＶＩＩ因子が酸化型に転換され、５％ｗ／ｗ未満（４％、３％、又は２．５％など）がダイマー型に転換される。

本研究者らは、外界条件下で保存した際に、修飾第ＶＩＩ因子のさらなる分解が最小限となることを示すデータを本明細書に記載している。実施例４から明らかなように、フリーズドライを終了した際の酸化型の初期含量に加え、２％ ｗ／ｗ未満の修飾第ＶＩＩ因子（約１％ｗ／ｗなど）が酸化型の修飾第ＶＩＩ因子として回収されるように増加する。さらに、２％ｗ／ｗ未満（約１％ｗ／ｗなど）の修飾第ＶＩＩ因子が、２５℃で１２ヶ月保存した際に、ダイマー型として回収される。極めて重要なことは、２５℃で１２ヶ月保存する間に、ポリマー型の含量の増加が全くモニターされなかったことである。

先述したように、修飾第ＶＩＩ因子の分解は、酸化と凝集をもたらすことがある。しかし、酸化型の修飾第ＶＩＩ因子が安定性の指標パラメータとして有用であることから、酸化経路の方が保存に対して感受性が高いことが明らかとなった。

このため、幾つかの実施形態において、本発明は、２５℃で１２ヶ月保存した際に安定な組成物であって、酸化型の前記修飾第ＶＩＩ因子が、前記修飾第ＶＩＩ因子の初期理論含量に比して最大約４％ｗ／ｗの量であるような組成物に関する。前記修飾第ＶＩＩ因子の初期理論含量とは、フリーズドライ工程に先立って、前記組成物を調製する際に、前記組成物に加える量をいう。凍結保護物質、凍結乾燥保護物質、及び／又は充填剤の含量を適切に最適化することにより、酸化型の前記修飾第ＶＩＩ因子は、最大約３．５％ｗ／ｗ、さらに好ましくは最大約３．０％ｗ／ｗの量である。さらに適切な実施形態では、酸化型の前記修飾第ＶＩＩ因子の量は、前記修飾第ＶＩＩ因子の初期理論含量に対して最大約２．５％の量である。

先述したように、本発明は、修飾第ＶＩＩ因子の固形組成物を製造する時点から（例えば、フリーズドライを終了してから使用するときまで、例えば、組成物が患者によって投与されるべきときまで）修飾第ＶＩＩ因子の分解を抑えることにも関する。従って、本発明によれば、適切な組成物は、外界条件で長期間保存した際の酸化型の含量の増加が限定されている。さらなる実施形態において、組成物を２５℃で１２ヶ月保存した際に、初期含量との比較において酸化型の前記修飾第ＶＩＩ因子が、前記修飾第ＶＩＩ因子の初期理論含量に比べて最大約２．０％増加するにすぎないように、前記組成物は安定である。さらに好適な実施形態において、酸化型の含量の増加は、最大約１．５％ ｗ／ｗ、最大約１．０％ ｗ／ｗ、又は好ましくは最大約０．５％ ｗ／ｗである。酸化型の含量の増加とは、保存時に酸化型として回収された修飾第ＶＩＩ因子の量を表している。

本発明の組成物は２５℃での長期保存にも適しており、さらに高温（例えば、４５℃）にした場合のような分解を加速させる条件で適切な安定性を有する場合もある。

さらなる実施形態において、組成物を２５℃で１８ヶ月保存した際に、酸化型の前記修飾第ＶＩＩ因子が、前記修飾第ＶＩＩ因子の初期理論含量に比べて最大約４．５％ ｗ／ｗの量となるように、前記組成物は安定である。好ましくは、前記酸化型の量は、最大約４．０％ ｗ／ｗ、より好ましくは最大約３．５％ ｗ／ｗ、さらに好ましくは最大約３．０％ ｗ／ｗ、最も好ましくは最大約３．５％ ｗ／ｗである。

さらに言えば、組成物を２５℃で１８ヶ月保存した後に、初期含量との比較において酸化型の前記修飾第ＶＩＩ因子が、前記修飾第ＶＩＩ因子の初期理論含量に比べて最大約２．８％増加するにすぎないように、前記組成物は安定である。さらなる実施形態において、前記増加は、最大約２．５％ ｗ／ｗの量の酸化型含量の増加に相当し、さらに好ましい実施形態では、最大約２．０％ ｗ／ｗである。さらなる実施形態において、酸化型含量の増加は最大約１．５％ ｗ／ｗ、最も好ましくは最大約１．０％ ｗ／ｗ（最大約０．５％ ｗ／ｗなど）である。

本発明のさらなる実施形態は、組成物を２５℃で３２ヶ月保存した際に、酸化型の前記修飾第ＶＩＩ因子が、前記修飾第ＶＩＩ因子の初期理論含量に比べて最大約９．０％ ｗ／ｗの量、好ましくは最大約８．０％ ｗ／ｗの量、より好ましくは最大約７．０％ ｗ／ｗの量、さらに好ましくは最大約６％ ｗ／ｗの量（約５％ ｗ／ｗ、好ましくは最大約４％ ｗ／ｗ、最も好ましくは最大約３％ ｗ／ｗの量など）であるような安定な組成物に関する。

さらなる実施形態では、組成物を２５℃で３２ヶ月保存した際に、初期含量との比較において前記修飾第ＶＩＩ因子の酸化型の含量が、前記修飾第ＶＩＩ因子の初期理論含量に比べて最大約７．０％ ｗ／ｗ、好ましくは最大約６．０％ ｗ／ｗの量、より好ましくは最大約５．０％の量（最大約４％ ｗ／ｗおよび３％ ｗ／ｗ、さらに好ましくは最大約２．０％ ｗ／ｗ、最も好ましくは最大約１．０％ ｗ／ｗなど）で増加するように、前記組成物は安定である。

加速された条件でも、前記組成物は、なお優れた安定性を有する。このため、他の実施形態において、本発明は、組成物を４５℃で８週間保存した際に、酸化型の前記修飾第ＶＩＩ因子が、前記修飾第ＶＩＩ因子の初期理論含量に比べて最大約４％ ｗ／ｗの量、好ましくは最大約３．５％ ｗ／ｗの量、より好ましくは最大約３．０％ ｗ／ｗの量、最も好ましくは最大約２．５％ ｗ／ｗの量などであるように、安定な組成物に関する。

さらに、フリーズドライプロセスを終結した後の酸化型の増加も限られている。このため、さらに別の実施形態において、組成物を４５℃で８週間保存した際に、初期含量との比較において前記修飾第ＶＩＩ因子の酸化型の含量が、前記修飾第ＶＩＩ因子の初期理論含量に比べて最大約２．０％ ｗ／ｗ、好ましくは最大約１．５％ ｗ／ｗ、より好ましくは最大約１．０％ ｗ／ｗ、さらの好ましくは最大約０．８％ ｗ／ｗ、最も好ましくは酸化型の最大約０．５％増加するにすぎないように、前記組成物は安定である。

より冷たい条件（５℃など）で保存すれば、さらに安定性が向上する。この温度では、修飾第ＶＩＩ因子の分解が不適切になる前に、さらに長い期間にわたって前記組成物を保存することができる。実施例４から明らかなように、３２ヶ月の保存時に分解する修飾第ＶＩＩ因子は、約１．５％ ｗ／ｗ未満である。

このように、本発明の別の実施形態は、組成物を５℃で３２ヶ月保存した際に、酸化型の前記修飾第ＶＩＩ因子が、前記修飾第ＶＩＩ因子の初期理論含量に比べて最大約５．０％ ｗ／ｗの量、好ましくは最大約４．５％ ｗ／ｗの量、より好ましくは最大４．０％ ｗ／ｗの量、さらに好ましくは最大約３．５％ ｗ／ｗの量、最も好ましくは最大約３．０％ ｗ／ｗの量（約２．５％ ｗ／ｗの量など）であるような安定な組成物に関する。

さらに、別の実施形態では、組成物を５℃で３２ヶ月保存した際に、初期含量との比較において前記修飾第ＶＩＩ因子の酸化型の含量が、前記修飾第ＶＩＩ因子の初期理論含量に比べて最大約２．５％ ｗ／ｗ、好ましくは最大約２．０％ ｗ／ｗの量、より好ましくは最大約１．５％ ｗ／ｗの量、さらに好ましくは最大約１．０％ ｗ／ｗの量、最も好ましくは最大約０．５％ ｗ／ｗの量であるように、前記組成物は安定である。

上述したように、安定性の向上は、一部には、適切な凍結保護物質、凍結乾燥保護物質、充填剤の選択とそれらの含量の調節に関連する。先述したように、このような賦形剤の群のうち少なくとも１つは、適切な安定性を達成するために、本発明の組成物中に存在させるべきである。但し、本研究者らによって明らかにされたところによれば、上記特性を有する賦形剤を混合すると、安定性がさらに好ましくなる。従って、本発明の好適な実施形態は、サッカリドをさらに含む組成物に関する。このサッカリドは二糖や三糖、さらには幾つかの多糖であり、スクロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、シクロデキストリン、マルトデキストリン、デキストランからなる群から選択することができる。

本研究者らは、好ましい安定性を達成するために、糖アルコール及びサッカリドの適切な組み合わせ、さらには、少なくとも部分的には、それらの含量を明らかにした。

このように、本発明の幾つかの実施形態では、前記サッカリドは、約１％ ｗ／ｗないし４５％ ｗ／ｗの範囲の量で前記組成物中に存在する。さらに興味深い実施形態では、前記量は、約５％ ｗ／ｗないし４０％ ｗ／ｗ、より興味深くは約５％ ｗ／ｗないし３５％ ｗ／ｗ、最も好適には約１０％ないし３０％ ｗ／ｗの範囲にある。

重要なことに、糖アルコールとサッカリドとの比は、適切に調節する必要がある。本発明の幾つかの実施形態では、前記糖アルコールは、前記サッカリドに対する重量比が約１００：１ないし１：２０の範囲にある。別の実施形態では、前記重量比は、約５０：１ないし１：１０、より好ましくは約２０：１ないし１：５である。別の実施形態では、前記重量比は、約１０：１ないし１：２、及び約４：１ないし１：２の範囲である。しかし、本研究者らが見出したところによれば（実施例５参照）、さらに大量のサッカリドを含ませると、凍結乾燥ケーキは崩壊した。このため、幾つかの実施形態は、前記糖アルコールの前記サッカリドに対する重量比が約３：１ないし１：１の範囲、例えば、約３：１ないし３：２の範囲である。

さらに、好ましい安定性は、少なくとも部分的には、前記修飾第ＶＩＩ因子の含量に対する前記糖アルコールと前記サッカリドの含量に関連する。従って、本発明のさらなる実施形態において、修飾第ＶＩＩ因子を含む前記組成物は、前記糖アルコールと前記サッカリドの合計に対する修飾第ＶＩＩの重量比は、約１：２００ないし１：５の範囲にある。好ましくは、重量比は約１：１００ないし１：８、より好ましくは約１：７５ないし１：１０の範囲にある。別の実施形態では、前記重量比は、約１：６０ないし１：１５、例えば約１：５０ないし１：２０の範囲にある。

本発明の幾つかの実施形態では、前記糖アルコールはマンニトールであり、さらに別の実施形態では、前記サッカリドはスクロースである。

このように、これらの実施形態では、マンニトールとスクロースの比は、スクロースに対するマンニトールの重量比が約１０：１ないし１：１０の範囲である。さらに興味深くは、前記比は約１０：１ないし１：５、さらに興味深くは約５：１ないし１：２の範囲である。しかし、前記組成物が凍結乾燥ケーキとして得られる場合、極めて適切な実施形態では、前記サッカリドに対する前記マンニトールの重量比が約５：１ないし１：１、最も好ましくは約４：１ないし５：４、例えば約３：１ないし３：２の範囲にある。

本発明のさらなる実施形態では、マンニトールとスクロースの合計に対する前記修飾第ＶＩＩ因子の重量比は、約１：１００ないし１：５、好ましくは約１：７５ないし１：１０、より好ましくは約１：６０ないし１：１５、最も好ましくは約１：５０ないし１：２０の範囲にある。

理解可能であるかもしれないが、本発明の前記安定化された組成物は固体の形態である。すなわち、前記組成物にはフリーズドライが行われる。しかし、このことは、前記組成物は、元来、フリーズドライが行われるべき液体として得られることを示唆している。少なくとも部分的には、水分を除去する前に液体組成物を安定化させる目的で、及び保存時に固体組成物を安定化させる目的で、前記組成物は、分解を防ぐために、ｐＨを最適なレベルに維持することができる物質を含む。極めて重要なことであるが、４−７というこのｐＨ範囲は、前記組成物を非経口投与するときの生理的な範囲内にもある。

必要に応じて、前記組成物には抗酸化剤を含めてもよい。抗酸化剤という用語には、修飾第ＶＩＩ因子の化学的酸化を抑える任意の物質が包含される。このため、本発明の幾つかの好ましい実施形態において、前記組成物は抗酸化剤をさらに含む。適切な抗酸化剤の例には、アスコルビン酸、システイン、ホモシステイン、シスチン、シスタチオニン、メチオニン、グルタチオン、並びにシステイン、ホモシステイン、シスチン、シスタチオニン、メチオニン、及びグルタチオンのうち何れか１つを含有するペプチド、とりわけ、２ないし５個のアミノ酸残基を含有するペプチドであって、少なくとも１つの残基がシステイン、ホモシステイン、シスチン、シスタチオニン、メチオニン又はグルタチオン残基であるペプチドが含まれるが、これらに限定されるものではない。このうち幾つかの実施形態では、前記抗酸化剤はメチオニン、特にＬ−メチオニンである。前記抗酸化剤は、約０．０１ないし約５．０ｍｇ／ｍｌ、例えば、約０．１ないし約５．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ないし約４．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ないし約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ないし約２．０ｍｇ／ｍｌなど、又は約０．５ないし約３．０ｍｇ／ｍｌ、約１．０ないし約２．７ｍｇ／ｍｌ、例えば、約２／５ｍｇ／ｍｌなどの濃度で含まれる。

前記抗酸化剤は、少なくとも部分的には、最大３％の水分含量を有する組成物を準備する時から保存中に、例えば、フリーズドライプロセスの終了時から使用まで、組成物を安定化するのに寄与する。実施例４から明らかなように、２５℃で３２ヶ月間、メチオニンを含む組成物を保存した際に、酸化型の増加が０．９％ ｗ／ｗである。

さらに、非経口投与、特に静脈内投与が可能な組成物を得るために、前記組成物は、他の薬学的に許容される賦形剤を取り込ませることによって調合することもできる。非経口投与用の組成物を調製する方法は、当業者に公知又は自明であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1995)にさらに詳述されている。「賦形剤（excipient）」という用語には、生物活性とタンパク質の安定性が実質的に保持されるように、優れた凍結乾燥ケーキ特性を与える薬学的に許容される試薬（充填剤）の他、タンパク質の凍結乾燥保護や凍結保護を与える試薬、ｐＨを維持する試薬、許容される張度を維持する試薬、保存時にタンパク質の適切なコンフォメーションを維持する試薬が含まれる。

このように、本発明によれば、前記組成物には、さらに張度調節物質が含まれる。張度調節物質としては、アミノ酸、小ペプチド（例えば、２ないし５個のアミノ酸残基を有する）、中性塩、単糖又は二糖、多糖、糖アルコール、又はこれらの調節物質のうち少なくとも２つの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。張度調節物質の例には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム、スクロース、グルコース、グリシルグリシン、マンニトールが含まれるが、これらに限定されるものではない。通常、前記調節物質は、他の含有成分に応じて、約１ないし約５００ｍＭ、約１ないし約３００ｍＭ、約１０ないし約２００ｍＭ、又は約２０ないし約１５０ｍＭの濃度で存在する。例えば、塩化ナトリウム又は塩化カリウムのような中性塩を使用してもよい。「中性塩」という用語は、水溶液中に溶かしたときに、酸にも塩基にもならない塩を意味する。

１つの実施形態において、前記張度調節物質は、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムからなる群から選択される。使用前に組成物を等張にするのであれば（例えば、原末組成物は生理的範囲の等張とする必要はない）、ずっと高濃度の張度調節物質を組成物に含めてもよいことに留意しなければならない。注射又は注入により投与すべき組成物は、使用前に血清に対して等張（すなわち、約３００±５０ milliosmol／kg）とすることが好ましい。

界面活性剤を添加することにより、フリーズドライされたタンパク質をさらに安定化することができる。このため、本発明の幾つかの実施形態では、前記組成物はさらに界面活性剤を含み、該界面活性剤は、ポリソルベート、例えばポリソルベート２０又は８０のようなTween（登録商標）；ポロキサマー１８８（例えば、Pluronic（登録商標））又はポロキサマー４０７（例えば、Lutrol（登録商標））のようなポリオキシエチレンアルキルエーテル又はポロキサマー、及びＰＥＧ８０００のようなその他のエチレン／ポリプロピレンブロックポリマー又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選択される。前記界面活性剤は、約０．００５ないし約５ｍｇ／ｍｌ、例えば、約０．０１ないし約５．０ｍｇ／ｍｌ、約０．００５ないし約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ないし約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ないし約２．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ないし約１．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ないし約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．０５ないし約０．５ｍｇ／ｍｌ、又は約０．０５ないし約０．２５ｍｇ／ｍｌのような量を加えるのが通例である。好ましい量は、０．０１ないし３ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．０１ないし約２．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ないし約１．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ないし約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．０５ないし約０．５ｍｇ／ｍｌ又は約０．０５ないし約０．２５ｍｇ／ｍｌであり、Tween 20及び／又はTween 80については約０．１ｍｇ／ｍｌなど、Poloxamer 188については、約０．０５ないし３．０ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．０５ないし約２．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０５ないし約１．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０５ないし約０．５ｍｇ／ｍｌ、又は約０．０５ないし約０．２５ｍｇ／ｍｌなどである。

本発明の幾つかの実施形態では、前記組成物は、例えば充填剤として作用する他の薬学的な賦形剤をさらに含む。すなわち、マンニトール以外の充填剤を前記組成物中に含めてもよい。特に、フリーズドライによって調製された組成物中には、充填剤が含められる。

１つの実施形態において、前記組成物は、修飾第ＶＩＩ因子、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、グリシルグリシン、マンニトール、Tween 80を含有し、最大３％の水分含量を有し、組成物を水に溶かしたときに４．０ないし７．０の範囲のｐＨを有する。

別の実施形態では、前記組成物は、修飾第ＶＩＩ因子、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、グリシルグリシン、マンニトール、スクロース、メチオニン、及びTween 80を含有し、最大３％の水分含量を有し、組成物を水に溶かしたときに４．０ないし７．０の範囲のｐＨを有する。

さらなる実施形態において、前記組成物は、

を含有する。

別の実施形態において、前記組成物は、

を含有する。

上述したように、本研究者らは、薬学的に許容される特定の賦形剤を含む固形組成物中に修飾第ＶＩＩ因子タンパク質を与えることによって修飾第ＶＩＩ因子タンパク質を安定化する方法を提供した。この場合、ｐＨを４ないし７の範囲に保つことができる物質を含ませることが重要である。

従って、本発明のさらなる側面は、安定な修飾第ＶＩＩ因子を調製する方法に関する。該方法は、
ｉ）ｐＨが４ないし７の範囲にある溶液中に前記修飾第ＶＩＩ因子を与える工程と、
ii）前記溶液を加工して、水分含量が最大３％ ｗ／ｗである固形組成物を得る工程と、
を備える。

前記方法のさらなる実施形態において、前記溶液はマンニトール、ソルビトール、キシリトールからなる群から選択される糖アルコールをさらに含む。さらに別の興味深い実施形態において、前記溶液は、スクロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、シクロデキストリン、マルトデキストリン、及びデキストランからなる群から選択されるサッカリドをさらに含む。好ましい実施形態では、前記糖アルコールはマンニトールであり、前記サッカリドはスクロースである。

好ましくは、前記溶液中に存在する前記糖アルコールの含量及び必要に応じて加えられる前記サッカリドの含量は、ｉ）特に安定化された修飾第ＶＩＩ因子タンパク質が得られるように調節すべきである。本発明によれば、前記糖アルコールは、約１ｍｇ／ｍｌないし６０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌないし５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１５ｍｇ／ｍｌないし４５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２０ｍｇ／ｍｌないし４０ｍｇ／ｍｌの範囲の量とすべきである。前記サッカリドが存在する場合、前記サッカリドは、約１ｍｇ／ｍｌないし５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約２ｍｇ／ｍｌないし３５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約５ｍｇ／ｍｌないし２５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌないし２０ｍｇ／ｍｌの範囲の量とすべきである。

さらに、前記糖アルコールと前記サッカリドの比を調節すべきである。適切な実施形態では、前記サッカリドに対する前記糖アルコールの重量比は、約１００：１ないし１：１０、好ましくは約５０：１ないし１：５、より好ましくは約２０：１ないし１：３、さらに好ましくは約１０：１ないし１：２、さらに好ましくは約４：１ないし１：２、さらに好ましくは、約３：１ないし１：１、最も好ましくは約３：１ないし３：２の範囲である。

好ましい実施形態において、安定な修飾第ＶＩＩ因子を調製する方法では、フリーズドライを行う。フリーズドライとは、前記修飾第ＶＩＩ因子を含む溶液を凍結乾燥バイアル中などに充填するプロセスである。フリーズドライを開始する前に、前記修飾第ＶＩＩ因子には、必要に応じて、滅菌ろ過を行ってもよい。凍結乾燥機の棚を冷却して、バイアルと溶液を臨界生成物温度以下に凍結させる。真空を導入して水を除去し、凍結乾燥機のアイスコンデンサ上で水蒸気を凝結させる。生成物が乾燥した時点（通常は、（例えば、上述したKarl Fischer電量滴定によって測定された）残余水分含量が１％未満となった時点）で、バイアルを閉めて、封をする。製造が終了し、この時点で、前記組成物は凍結乾燥ケーキの形態となる。

このような組成物は、注射可能な手段で患者に投与するときには、使用前に、適切な液体中に再構成させる必要がある。他の目的、例えば、他の薬学的組成物に再調合する目的で組成物を再構成することもある。しかしながら、本発明は、前記組成物を固形状のまま患者に投与することを除外するものではない。

前記組成物は、許容可能な（好ましくは無菌の）希釈剤又は担体、好ましくは水性担体を用いて再構成される。様々な水性担体、例えば、水（例えば、Water For Injection／ＷＦＩ）、緩衝化された水、生理的食塩水（例えば、０．４%生理的食塩水）、グリシン（例えば、０．３％グリシン）などを使用することができる。再構成希釈液は、カルシウム塩（例えば、ＣａＣｌ２）又はナトリウム塩とカルシウム塩の組み合わせ（例えば、ＮａＣｌとＣａＣｌ２）のように１以上の塩を含有することもできる。

このように、無菌リンゲル溶液中に本発明の組成物を再構成させることにより、静脈内注入用の典型的な薬学的組成物ができる。

前記再構成された組成物は、予防及び／又は治療的処置のために非経口投与することが意図されている。前記薬学的組成物は、非経口投与、すなわち、静脈内、皮下、又は筋肉内投与するのが好ましく、あるいは連続的又は間歇的な注入によって投与される。

従って、本発明のさらなる側面は、血液凝固の抑制又は組織因子媒介反応の抑制のような治療的処置を行うための医薬を調製するための前記安定化された固形組成物の使用に関する。

すなわち、本発明の１つの側面は、血液凝固及び／又は組織因子媒介反応を抑制するための医薬を調製するための修飾第ＶＩＩ因子の使用に関し、前記医薬は、
ｉ）修飾第ＶＩＩ因子と、
ii）当該組成物を水に溶かしたときに、４ないし７の範囲に当該組成物のｐＨを維持するのに適した物質と、
iii）最大３％の水分含量と、
を備えた組成物を含む。

さらに、別の側面において、本発明は、血液凝固を防止し及び／又は組織因子媒介反応を抑制するために、前記安定化された修飾第ＶＩＩ因子を患者に投与することに関する。このように、本発明は、血液凝固を防止し及び／又は組織因子媒介反応を防止する方法であって、これを必要としている患者に有効量の組成物を投与することを備え、該組成物が、
ｉ）修飾第ＶＩＩ因子と、
ii）前記組成物を水に溶かしたときに、前記組成物のｐＨを４ないし７の範囲に維持するのに適した物質と、
iii）最高３％の水分含量と、
を備える、方法に関する。

別の実施形態において、血液凝固には、血管形成、深部静脈血栓、肺塞栓、発作、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、グラム陰性内毒血症を伴う肺および腎臓内へのフィブリン沈着、並びに心筋梗塞からなる群から選択される症状が伴う。

さらに別の実施形態では、前記組織因子媒介反応には、ＳＩＲＳ、ＡＲＤＳ、ＭＯＦ、ＨＵＳ、及びＴＴＰからなる群から選択される症状が伴う。

先述したように、前記組成物は固形状である。従って、適切な実施形態において、医薬を非経口投与できるようにするため、前記医薬は溶解するのに適していなければならない。このため、前記組成物を患者に投与する場合には、投与工程の前に、前記組成物を適切な液体中に溶解させる工程を備える。

略語
ＦＶＩＩ
一本鎖形態の凝固第ＶＩＩ因子
ＦＶＩＩａ
切断され活性化された二本鎖形態の凝固第ＶＩＩ因子
ｒＦＶＩＩ（ｒＦＶＩＩａ）
組換え第ＶＩＩ因子（組換え第ＶＩＩａ因子）
ＦＶＩＩａｉ
修飾第ＶＩＩ因子−触媒中心に少なくとも１つの修飾を有する凝固第ＶＩＩ因子であって、その修飾によって、修飾第ＶＩＩ因子が血漿第Ｘ因子又は第ＩＸ因子を活性化する能力が実質的に阻害されている
ＲＦＶｉｉａｉ
組換え修飾第ＶＩＩａ因子（組換えＦＶＩＩａｉ）
ダンシル−ＥＧＲ−ＦＶＩＩａ（ダンシル−ＥＧＲ−ＦＶＩＩ）
ＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩ）をダンシル−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ダンシル−ＥＧＲ−ｃｍｋ）と化学的に反応させることによって触媒中心が不活化されている、凝固因子ＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩ）
ＦＦＲ−ＦＶＩＩａ（ＦＦＲ−ＦＶＩＩ）
ＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩ）をＰｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ＦＦＲ−ｃｍｋ）と化学的に反応させることによって触媒中心が不活化されている凝固因子ＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩ）
ＰＰＡ−ＦＶＩＩａ（ＰＰＡ−ＦＶＩＩ）
Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ＰＰＡ−ｃｍｋ）と反応させたＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩ）
ダンシル−ＥＧＲ−ｃｍｋ
ダンシル−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン
ＦＦＲ−ｃｍｋ
Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ又はＰｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン
ＰＰＡＣＫ
Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ＰＰＡ−ｃｍｋ）
ＤＦＦＲ−ｃｍｋ
ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ又はダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン
Ｓｅｒ３４４−ＦＶＩＩａ（Ｓｅｒ３４４−ＦＶＩＩ）
３４４位に位置する本来のアミノ酸をセリンと置換することによって触媒中心が不活化された凝固因子ＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩ）

アッセイ：
第ＶＩＩ因子の生物活性
血液凝固における第ＶＩＩａ因子の生物活性は、（ｉ）組織因子（ＴＦ）への結合能と（ｉｉ）第ＩＸ因子又は第Ｘ因子をタンパク分解によって切断して、活性化された第ＩＸ因子又は第Ｘ因子（それぞれ、第ＩＸａ因子又は第Ｘａ因子）を生成する触媒能とに由来する。

第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物活性（「第ＶＩＩ因子生物活性」）は、第ＶＩＩ因子を欠損した血漿及びトロンボプラスチンを用いて、ある調製物が血液凝固を促進する能力を測定することによって定量することができる（例えば、米国特許第５，９９７，８６４号に記載されている）。あるいは、（ｉ）脂質膜中に埋め込まれたＴＦと第Ｘ因子とを含む系内で第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩａ関連ポリペプチドが活性化された第Ｘ因子（第Ｘａ因子）を生成する能力を測定すること（Persson et al., J. Biol. Chem. 272: 19919-19924, 1997）、（ｉｉ）水系中で第Ｘ因子の加水分解を測定すること、（ｉｉｉ）第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドのＴＦへの物理的結合を、表面プラズモン共鳴を使用した装置を用いて測定すること（Persson, FEBS Letts. 413: 359-363, 1997）、（ｉｖ）第ＶＩＩａ因子及び／又は第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドによる合成基質の加水分解を測定すること、（ｖ）ＴＦ非依存性のトロンビン生成をインビトロ系で測定すること、によって定量してもよい。

修飾第ＶＩＩ因子の生物活性：
修飾第ＶＩＩ因子の生物活性は、例えば、ＷＯ ９２／１５６８６号に記載されているものと同様の競合凝固アッセイ（実施例３）（アッセイ１）によって、又は以下のアッセイ２ないし７のうち１以上で測定することができる。

ＦＶＩＩａ／リン脂質中に埋没されたＴＦによって触媒されるＦＸの活性化の修飾第ＶＩＩ因子による阻害−ＦＸａ生成アッセイ（アッセイ２）：
以下の実施例において、全ての濃度は最終濃度である。ＨＢＳ／ＢＳＡ（５０ｍＭ ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中の脂質化ＴＦ（１０ｐＭ）、ＦＶＩＩａ（１００ｐＭ）、修飾第ＶＩＩ因子（０−５０ｎＭ）を、ＦＸ（５０ｎＭ）を添加する前に、室温で６０分インキュベートする。さらに１０分経過した後、１／２容量の停止緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加して反応を停止させる。基質Ｓ２７６５（０．６ｍＭ、Chromogenix）を添加し、４０５ｎｍの吸光度を１０分間継続的に測定することによって、生成されたＦＸａの量を測定する。ＦＶＩＩａ／脂質化ＴＦが媒介するＦＸの活性化のＴＦアンタゴニストによる阻害についてＩＣ５０値を算出してもよい。ＦＦＲ−ｒＦＶＩＩａに対するＩＣ５０値は、本アッセイにおいて５１＋／−２６ｐＭである。

細胞表面ＴＦへの１２５Ｉ−ＦＶＩＩａの結合の修飾第ＶＩＩ因子による阻害−ＴＦ結合アッセイ（アッセイ３）：
以下の例において、全ての濃度は最終濃度である。何れもＴＦを構成的に発現しているヒト膀胱カルシノーマ細胞株Ｊ８２（ＡＴＴＣ Ｎｏ．ＨＴＢ−１）又はヒトケラチン産生細胞株（ＣＣＤ１１０２ＫｅｒＴｒ ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲＬ−２３１０）又はＮＨＥＫ Ｐ１６６（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｎｏ．ＣＣ−２５０７）を用いた結合試験を利用する。５ｍＭ ＥＤＴＡを補充した緩衝液Ａ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、及び１１ｍＭ グルコース）で一度、次いで、緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（緩衝液Ａに１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡと５ｍＭ Ｃａ２＋を補充したもの）で一度ずつ、２４ウェルの組織培養プレート中の稠密単層を洗浄する。１００μｌの冷えた緩衝液Ｂとともに、前記単層を２分間プレインキュベートする。様々な濃度の修飾第ＶＩＩ因子と放射性標識したＦＶＩＩａ（０．５ｎＭ １２５Ｉ−ＦＶＩＩａ）とを前記細胞に同時に添加する（最終容量２００μｌ）。このプレートを４℃で２時間インキュベートする。インキュベートが終了した時点で、未結合の物質を除去し、氷冷した緩衝液Ｂで前記細胞を４回洗浄し、３００μｌの溶解緩衝液（２００ｍＭ ＮａＯＨ、１%ＳＤＳ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡ）により溶解させる。ガンマカウンター（Cobra, Packard Instruments）中で放射能を測定する。結合データを分析し、ＧｒａＦｉｔ４（Erithacus Software,Ltd., (U.K.)）を用いてカーブフィッティングを行う。ＦＦＲ−ｒＦＶＩＩａに対するＩＣ５０は、本アッセイでは４ｎＭである。

ＦＶＩＩａ／ｓＴＦアミド分解活性の阻害（アッセイ ４）：
可溶性ヒトＴＦ（１０ｎＭ）、組換えヒトＦＶＩＩａ（１０ｎＭ）、漸増濃度の修飾第ＶＩＩ因子を用いて、修飾第ＶＩＩ因子によるＦＶＩＩａ−ＴＦ触媒性アミド分解活性の阻害を試験する。基質Ｓ２２８８（１．２ｍＭ、Chromogenix）を添加する前に、ＢＳＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中の１０ｎＭ ｓＴＦ及び１０ｎＭ ＦＶＩＩａとともに、様々な濃度の修飾第ＶＩＩ因子を室温で６０分間プレインキュベートする。４０５ｎｍで発色を３０分間継続的に測定する。アミド分解活性は、ｍＯＤ／分として表される。修飾第ＶＩＩ因子によるＦＶＩＩａ／ＴＦアミド分解活性の阻害に対するＩＣ５０値を算出してもよい。

ＦＸａ生成の阻害（アッセイ５）：
ＦＸ（５０ｎＭ）を添加する前に、ＢＳＡ緩衝液（アッセイ４参照）中の脂質化ＴＦ（１０ｐＭ）、ＦＶＩＩａ（１００ｐＭ）、及び修飾第ＶＩＩ因子（０−５０ｎＭ）を室温で６０分インキュベートする。さらに１０分経過した後、１／２容量の停止緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加して反応を停止させる。基質Ｓ２７６５（０．６ｍＭ、Chromogenix）を添加し、４０５ｎｍの吸光度を１０分間継続的に測定することによって、生成されたＦＸａの量を測定する。ＦＶＩＩａ／脂質化ＴＦが媒介するＦＸの活性化の修飾第ＶＩＩ因子による阻害についてＩＣ５０値を算出してもよい。ＦＦＲ−ｒＦＶＩＩａに対するＩＣ５０値を算出してもよい。

ＴＦ依存性凝固アッセイ（アッセイ６）：
本アッセイは、ACL300 Research凝固装置（ILS Laboratories）で行う。５０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＢＳＡ中に修飾第ＶＩＩ因子を希釈したものを、２ないし５の比率で、２５ｍＭ ＣａＣｌ２と混合し、前記凝固装置中のサンプルカップ中に添加する。修飾第ＶＩＩ因子を加えていない試料中での凝固時間が概ね３０秒となるように、前記イミダゾール緩衝液で希釈したヒト、ラット、ウサギ、ヒヒ、又はブタのトロンボプラスチンを試薬リザーバ２の中に入れ、ヒト、ラット、ウサギ、ヒヒ、又はブタの血漿を試薬リザーバ３の中に入れる。分析の間、７０μｌの修飾第ＶＩＩ因子とＣａＣｌ２混合物を２５μｌのトロンボプラスチン試薬に移し、６０μｌの血漿を添加し、凝固時間を測定する前に９００秒プレインキュベートする。最大の凝固時間を４００秒に設定する。修飾ＦＶＩＩを添加しない対照と比較したＴＦ活性に凝固時間を変換するための標準曲線として、トロンボプラスチンの希釈液を使用する。

ＦＶＩＩａ／細胞表面ＴＦによって触媒されるＦＸの活性化の修飾第ＶＩＩ因子による阻害（アッセイ７）：
ヒトＴＦを発現している細胞（例えば、ヒト肺繊維芽細胞ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−７５）、ヒト膀胱カルシノーマ細胞株Ｊ８２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ−１）、ヒトケラチン産生細胞株ＣＣＤ １１０２ＫｅｒＴｒ（ＡＴＣＣ ｎｏ．ＣＲＬ−２３１０）、ヒト膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７、又はヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１）の単層を、ＦＶＩＩａ／ＴＦによって触媒されるＦＸの活性化におけるＴＦ源として使用する。緩衝液Ａ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、及び１１ｍＭ グルコース）中で一度、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａに、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡと５ｍＭ Ｃａ２＋を補充したもの）中で、２４−、４８−、又は９６ウェルプレート中の稠密な細胞単層を一度洗浄する。緩衝液Ｂ中のＦＶＩＩａ（１ｎＭ）、ＦＸ（１３５ｎＭ）、及び様々な濃度の修飾第ＶＩＩ因子を前記細胞に同時に添加する。あるいは、ｒＦＶＩＩａとＦＸを添加する前に、前記細胞を修飾第ＶＩＩ因子とともに１５分プレインキュベートする。３７℃で１５分間、ＦＸａを形成させる。各ウェルから５０μｌの分取試料を採取し、５０μｌの停止緩衝液（緩衝液Ａに１０ｍＭ ＥＤＴＡと１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）を添加したもの。５０μｌの上記混合物をマイクロタイタープレートのウェルに移し、２５μｌのChromozym X（最終濃度０．６ｍＭ）を前記ウェルに添加することによって、生成されたＦＸａの量を測定する。４０５ｎｍの吸光度を継続的に測定し、ＦＸａ標準曲線を用いて、発色の初速をＦＸａ濃度に変換する。

以下の実施例は例示の目的でのみ記載されており、限定を意図するものではない。

［実施例１］
典型的な組成物が示されている。表１には、組成物が液状形態の時点（すなわち、フリーズドライを行う前の組成物又はフリーズドライを行った後に溶液中に再構成した組成物）での活性成分と賦形剤の濃度が示されている。表２には、組成物が固形（すなわち、フリーズドライされた形態）の時点での活性成分と賦形剤の濃度が示されている。

表１ 組成物、溶液中の賦形剤の含量

表２ 組成物、固形中の賦形剤の含量

［実施例２］
安定性を表すパラメータの測定で使用する分析法：
Ａ．逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による酸化型の測定：
ＨＰＬＣカラム：５μｍの粒径と３００Åの孔径を有するブチル結合されたシリカを充填した４．５×２５０ｍｍカラム。カラム温度：７０℃。溶出液Ａ：水９９．９％ ｖ／ｖ及びトリフルオロ酢酸０．１％ ｖ／ｖ。溶出液Ｂ：アセトニトリル８０％ ｖ／ｖ、トリフルオロ酢酸０．０９％ ｖ／ｖ、及び水１９．９１％ ｖ／ｖ。３０分でＸ％ Ｂが（Ｘ＋１３）％ Ｂまで増加する線形グラジエントで、カラムを溶出した。流速：１．０ｍｌ／分。検出：２１４ｎｍ。

酸化型は、ＦＦＲ−ＦＶＩＩａのメチオニンスルホキシドである。２つの主な誘導体は、Ｍｅｔ（Ｏ）２９８−ＦＦＲ−ＦＶＩＩａとＭｅｔ（Ｏ）３０６−ＦＦＲ−ＦＶＩＩａである。

酸化型の含量は、酸化型のＦＦＲ−ＦＶＩＩａとして回収された組成物中のＦＦＲ−ＦＶＩＩａの初期量に対するパーセントとして表される。ＦＦＲ−ＦＶＩＩａの初期量は、フリーズドライ前に組成物を調製する時点でのＦＦＲ−ＦＶＩＩａの量に関する。

Ｂ．高性能ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰ−ＨＰＬＣ）によるＦＦＲ−ＦＶＩＩのポリマー、オリゴマー、又はダイマーの測定
移動相として０．２Ｍ 硫酸アンモニウム ｐＨ７．０を用いて、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｋ ３００ ＳＷカラム、７．５×３００ｍｍ上でＧＰ−ＨＰＬＣを行った。流速：０．５ｍｌ／分、検出：２１５ｎｍ。凝集物の含量は、ダイマー及びポリマー型のＦＦＲ−ＦＶＩＩａとして回収された組成物中のＦＦＲ−ＦＶＩＩａの初期量に対するパーセントとして表されている。ＦＦＲ−ＦＶＩＩａの初期量とは、フリーズドライ前に組成物を調製する時点でのＦＦＲ−ＦＶＩＩａの量である。

［実施例３］
実施例１の組成物について、フリーズドライを終結した後のダイマー、ポリマー及び酸化型のＦＦＲ−ＶＩＩａの含量を報告する。含量は、ダイマー、ポリマー、又は酸化型として回収された修飾第ＶＩＩ因子（ここでは、ＦＦＲ−ＶＩＩａ）の量を表している。

表３ ダイマー、ポリマー、及び酸化型のＦＦＲ−ＶＩＩａの含量

［実施例４］
実施例１の組成物について、５℃で１８ヶ月、２５℃で６、１２、１８、及び３２ヶ月、又は４５℃で８週間保存した際のダイマー、ポリマー、酸化型のＦＦＲ−ＶＩＩａ含量の増加が報告されている。保存時間は、フリーズドライを終結した時点から計算されている。前記組成物は、組成物の製造を終了した時点で、当初から一定量の分解生成物を有していることが通例であるため、含量の増加は、前記保存時にダイマー、ポリマー、又は酸化型として回収されたＦＦＲ−ＶＩＩａの増加量を表している。

表４ ５℃で１８ヶ月保存

表５ ２５℃で６ヶ月保存

表６ ２５℃で１２ヶ月保存

表７ ２５℃で１８ヶ月保存

表８ ２５℃で３２ヶ月保存

表９ ４５℃で８週間保存

［実施例５］
フリーズドライケーキの構造的な安定性が、様々な組成物１−６について示されている。マンニトールとスクロースの含量が、各組成物について報告されている（表１０）。組成物は、１ｍｇ／ｍｌの濃度でＦＦＲ−ＦＶＩＩ又はＦＲＲ−ＩＩａを含み、塩化ナトリウム、塩化カルシウム・２Ｈ_２Ｏ、グリシルグリシン、及びtweenなど他の賦形剤が５．７ｍｇ／ｍｌの量で追加されている。フリーズドライされたケーキの構造的な安定性が表１１に報告されている。

表１０ 様々な量のマンニトールとスクロースを含む組成物

表１１ マンニトールとスクロースの比によるフリーズドライケーキの安定性

Claims (43)

1. ｉ）修飾第ＶＩＩ因子と、
   ii）当該組成物を水に溶かしたときに、当該組成物のｐＨを４ないし７の範囲に維持するのに適した物質と、
   iii）最大３％の水分含量と、
   iv）マンニトールと、
   v）スクロースと、
   vi）アスコルビン酸、システイン、ホモシステイン、シスチン、シスタチオニン、メチオニン、グルタチオン、並びにシステイン、ホモシステイン、シスチン、シスタチオニン、メチオニン、及びグルタチオンのうち何れか１つを含有するペプチドからなる群から選択される抗酸化剤
   を含み、
   スクロースに対するマンニトールの重量比（マンニトール：スクロース）が、５：１ないし１：１の範囲にある、組成物。
2. 前記組成物のｐＨを４ないし７の範囲に維持するのに適した前記物質がグリシルグリシンであり、グリシルグリシンが最大７ｍｇ／ｍｌの量で存在する、請求項１に記載の組成物。
3. 前記組成物を水に溶かしたときに、前記組成物のｐＨが５．５ないし７．０の範囲にある、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記スクロースに対する前記マンニトールの重量比が、４：１ないし５：４の範囲にある、請求項１ないし３の何れか１項に記載の組成物。
5. 前記マンニトールと前記スクロースの合計に対する前記修飾第ＶＩＩ因子の重量比が、１：２００ないし１：５の範囲にある、請求項１ないし３の何れか１項に記載の組成物。
6. 前記組成物を４５℃で８週間保存した際に、酸化型の前記修飾第ＶＩＩ因子の量が、組成物の調製時に組成物に添加される前記修飾第ＶＩＩ因子の初期含量に比べて最大４％ ｗ／ｗの量であるように前記組成物が安定である、請求項１〜５の何れか１項に記載の組成物。
7. 前記組成物を２５℃で１２ヶ月保存した際に、酸化型の前記修飾第ＶＩＩ因子の量が、組成物の調製時に組成物に添加される前記修飾第ＶＩＩ因子の初期含量に比べて最大４％ ｗ／ｗの量であるように前記組成物が安定である、請求項１ないし５の何れか１項に記載の組成物。
8. 前記組成物を２５℃で３２ヶ月保存した際に、酸化型の前記修飾第ＶＩＩ因子の量が、組成物の調製時に組成物に添加される前記修飾第ＶＩＩ因子の初期含量に比べて最大９．０％ ｗ／ｗの量であるように前記組成物が安定である、請求項１ないし５の何れか１項に記載の組成物。
9. 前記組成物を５℃で３２ヶ月保存した際に、酸化型の前記修飾第ＶＩＩ因子の量が、組成物の調製時に組成物に添加される前記修飾第ＶＩＩ因子の初期含量に比べて最大５．０％ ｗ／ｗの量であるように前記組成物が安定である、請求項１ないし５の何れか１項に記載の組成物。
10. 前記組成物を４５℃で８週間保存した際に、酸化型の前記修飾第ＶＩＩ因子の含量が、組成物の調製時に組成物に添加される前記修飾第ＶＩＩ因子の初期含量に対して最大２．０％ ｗ／ｗの量で増加するように前記組成物が安定である、請求項１ないし５の何れか１項に記載の組成物。
11. 前記組成物を２５℃で３２ヶ月保存した後に、酸化型の前記修飾第ＶＩＩ因子の含量が、組成物の調製時に組成物に添加される前記修飾第ＶＩＩ因子の初期含量に比べて最大７．０％ ｗ／ｗの量で増加するように前記組成物が安定である、請求項１ないし５の何れか１項に記載の組成物。
12. 前記組成物を５℃で３２ヶ月保存した後に、酸化型の前記修飾第ＶＩＩ因子の含量が、組成物の調製時に組成物に添加される前記修飾第ＶＩＩ因子の初期含量に比べて最大２．５％ ｗ／ｗの量で増加するように前記組成物が安定である、請求項１ないし５の何れか１項に記載の組成物。
13. 前記マンニトールの量が、３０％ ｗ／ｗないし９５％ ｗ／ｗの範囲にある、請求項１ないし１２の何れか１項に記載の組成物。
14. 前記スクロースの量が、１％ ｗ／ｗないし４５％ ｗ／ｗの範囲にある、請求項１ないし１２の何れか１項に記載の組成物。
15. 前記スクロースに対する前記マンニトールの重量比が、３：１ないし３：２の範囲にある、請求項４、１３および１４の何れか１項に記載の組成物。
16. 前記マンニトールと前記スクロースの合計に対する前記修飾第ＶＩＩ因子の重量比が、１：１００ないし１：５の範囲にある、請求項５、１３および１４の何れか１項に記載の組成物。
17. 張度調節物質をさらに含む、請求項１〜１６の何れか１項に記載の組成物。
18. 前記張度調節物質が、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウムからなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
19. 界面活性剤をさらに含む、請求項１〜１８の何れか１項に記載の組成物。
20. 前記界面活性剤が、ポリソルベート（polysorbate）２０若しくは８０であるポリソルベート；ポリオキシエチレンアルキルエーテル；又はポロキサマー（poloxamer）１８８若しくは４０７であるポロキサマーからなる群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記修飾第ＶＩＩ因子が、
    活性部位の残基Ｓｅｒ３４４が修飾され、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＡｌａで置換されたヒト及びウシ第ＶＩＩ因子；
    残基Ｌｙｓ３４１が置換されたヒト第ＶＩＩ因子；
    残基Ａｓｐ２４２が置換されたヒト第ＶＩＩ因子；
    残基Ｈｉｓ１９３が置換されたヒト第ＶＩＩ因子；
    ＦＶＩＩ−（Ｋ３４１Ａ）；
    ＦＶＩＩ−（Ｓ３４４Ａ）；
    ＦＶＩＩ−（Ｄ２４２Ａ）；
    ＦＶＩＩ−（Ｈ１９３Ａ）；
    ペプチドクロロメチルケトン又はペプチジルクロロメタン；アザペプチド；アシル化剤；スルホニルフルオリド；ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）；トシルプロピルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）；トシリシルクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）；ニトロフェニルスルホネート；複素環式プロテアーゼ阻害剤から選択される試薬との反応によって活性部位が修飾された第ＶＩＩ因子ポリペプチド
    から選択される、請求項１ないし２０の何れか１項に記載の組成物。
22. 前記修飾第ＶＩＩ因子が、
    ＦＶＩＩ−（Ｓ３４４Ａ）；
    ＦＶＩＩ−（Ｈ１９３Ａ）；並びに
    Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、及びダンシル−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン．クロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、及びダンシル−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトンから選択される試薬との反応によって活性部位が修飾された第ＶＩＩ因子ポリペプチド
    から選択される、請求項２１に記載の組成物。
23. 前記修飾された第ＶＩＩ因子が、ダンシル−ＥＧＲ−ＦＶＩＩａ、ダンシル−ＥＧＲ−ＦＶＩＩ、ＦＦＲ−ＦＶＩＩａ、ＦＦＲ−ＦＶＩＩ、ＰＰＡ−ＦＶＩＩａ、ＰＰＡ−ＦＶＩＩ、Ｓｅｒ３４４−ＦＶＩＩａ、及びＳｅｒ３４４−ＦＶＩＩからなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
24. 充填剤として作用する他の薬学的賦形剤をさらに含む、請求項１〜２３の何れか１項に記載の組成物。
25. ｐＨを４ないし７の範囲に維持するのに適した物質が、クエン酸塩、ヒスチジン、リンゴ酸塩、リン酸塩、酒石酸、コハク酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、イミダゾール、ＴＲＩＳ、乳酸塩、グルタミン酸塩、及びグリシルグリシンからなる群から選択され、但し、前記物質がグリシルグリシンである場合には、前記物質は最大７ｍｇ／ｍｌの量で存在する、請求項１に記載の組成物。
26. グリシルグリシンの量が、最大４ｍｇ／ｍｌである、請求項２に記載の組成物。
27. 前記水分の含量が、最大２％ ｗ／ｗの水分である、請求項１〜２６の何れか１項に記載の組成物。
28. 前記組成物が凍結乾燥ケーキである、請求項１〜２７の何れか１項に記載の組成物。
29. 前記組成物が、修飾第ＶＩＩ因子、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、グリシルグリシン、マンニトール、スクロース、メチオニンおよびポリソルベート８０を含む、請求項１〜２８の何れか１項に記載の組成物。
30. 前記修飾第ＶＩＩ因子がＦＦＲ−ＦＶＩＩａである、請求項２９に記載の組成物。
31. 前記組成物が、下記の調合物Ｃである、請求項３０に記載の組成物。
    

    
32. 前記組成物が、下記の調合物Ｆである、請求項３１に記載の組成物。
    

    
33. 安定な修飾第ＶＩＩ因子を調製する方法であって、
    ｉ）マンニトールと、
    スクロースと、
    アスコルビン酸、システイン、ホモシステイン、シスチン、シスタチオニン、メチオニン、グルタチオン、並びにシステイン、ホモシステイン、シスチン、シスタチオニン、メチオニン、及びグルタチオンのうち何れか１つを含有するペプチドからなる群から選択される抗酸化剤と
    を含有するｐＨが４ないし７の範囲にある溶液中に、前記修飾第ＶＩＩ因子を供給する工程と、
    ii）前記溶液を処理して、水分含量が最大３％ ｗ／ｗである固形組成物を得る工程と、
    を備え、
    スクロースに対するマンニトールの重量比（マンニトール：スクロース）が、５：１ないし１：１の範囲にある方法。
34. 前記スクロースに対する前記マンニトールの重量比が、４：１ないし５：４の範囲にある、請求項３３に記載の方法。
35. 前記マンニトールが、１ｍｇ／ｍｌないし６０ｍｇ／ｍｌの範囲の量である、請求項３３または３４に記載の方法。
36. 前記スクロースが、１ｍｇ／ｍｌないし５０ｍｇ／ｍｌの範囲の量である、請求項３３または３４に記載の方法。
37. 前記処理がフリーズドライを含む、請求項３３ないし３６の何れか１項に記載の方法。
38. 血液凝固を抑制するための医薬であって、
    ｉ）修飾第ＶＩＩ因子、
    ii）当該組成物を水に溶かしたときに、４ないし７の範囲に当該組成物のｐＨを維持するのに適した物質と、
    iii）最大３％の水分含量と、
    iv）マンニトールと、
    v）スクロースと、
    vi）アスコルビン酸、システイン、ホモシステイン、シスチン、シスタチオニン、メチオニン、グルタチオン、並びにシステイン、ホモシステイン、シスチン、シスタチオニン、メチオニン、及びグルタチオンのうち何れか１つを含有するペプチドからなる群から選択される抗酸化剤
    を含み、
    スクロースに対するマンニトールの重量比（マンニトール：スクロース）が、５：１ないし１：１の範囲にある組成物を備えた医薬を調製するための修飾第ＶＩＩ因子の使用。
39. 前記血液凝固が、血管形成、深部静脈血栓、肺塞栓、発作、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、グラム陰性内毒血症を伴う肺及び腎臓内のフィブリン沈着、並びに心筋梗塞からなる群から選択される症状と関連する、請求項３８に記載の使用。
40. 組織因子媒介反応を抑制するための医薬であって、
    ｉ）修飾第ＶＩＩ因子、
    ii）当該組成物を水に溶かしたときに、４ないし７の範囲に当該組成物のｐＨを維持するのに適した物質と、
    iii）最大３％の水分含量と、
    iv）マンニトールと、
    v）スクロースと、
    vi）アスコルビン酸、システイン、ホモシステイン、シスチン、シスタチオニン、メチオニン、グルタチオン、並びにシステイン、ホモシステイン、シスチン、シスタチオニン、メチオニン、及びグルタチオンのうち何れか１つを含有するペプチドからなる群から選択される抗酸化剤
    を含み、
    スクロースに対するマンニトールの重量比（マンニトール：スクロース）が、５：１ないし１：１の範囲にある組成物を備えた医薬を調製するための修飾第ＶＩＩ因子の使用。
41. 前記組織因子媒介反応が、ＳＩＲＳ、ＡＲＤＳ、ＭＯＦ、ＨＵＳ、及びＴＴＰからなる群から選択される症状と関連する、請求項４０に記載の使用。
42. 前記医薬が溶解に適している、請求項３８ないし４１の何れか１項に記載の使用。
43. 前記組成物が請求項１ないし３２の何れか１項に記載されている組成物である、請求項３８ないし４２の何れか１項に記載の使用。