CN107533044B - 十二指肠液试样的保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于，提供一种制备用于稳定地保存十二指肠液试样中的蛋白质标志物的保存用试样的方法、和用于制备该保存用试样的试剂盒。本发明的十二指肠液试样的保存方法具有如下步骤：(a)使用稀释用溶液将从受试者采集的十二指肠液试样稀释成10倍体积以上的步骤，以及，(b)将前述步骤(a)中制备的稀释后的十二指肠液试样以液体的状态进行保存的步骤，前述稀释用溶液为含有0.02质量％以上的蛋白质的水溶液。

Description

十二指肠液试样的保存方法

技术领域

本发明涉及制备用于稳定地保存十二指肠液试样中的蛋白质标志物的保存用试样的方法、和用于制备该保存用试样的试剂盒。

背景技术

十二指肠液为由胰脏排出的胰液、由胆管排出的胆汁、和十二指肠所分泌的粘液的混合体液。十二指肠液的采集仅通过将内窥镜插入十二指肠后在该位置进行抽吸即可进行，与经由胰管进行的胰液采集相比侵袭性低且能通过更简单的技能来实施。因此，可以通过十二指肠液中的胰腺病标志物的检测来检查胰腺病。

另一方面，十二指肠液中含有较多的来自胰液、肠液的蛋白酶以及来自胆汁、肠液的细菌，在这些的作用下，十二指肠液中所含的蛋白质等各种生物分子容易被分解。因此，在将十二指肠液作为生物试样、对该生物试样中的蛋白质标志物进行定量检测时，担心该生物试样中的蛋白质标志物受到蛋白酶、细菌的影响而不能准确地进行测定。因此，将十二指肠液试样中的蛋白质标志物稳定地保存至供于检查为止这一点很重要。

作为抑制所采集的十二指肠液试样中的蛋白质标志物的分解并进行保存的有效方法，可以列举在采集十二指肠液后将其迅速冻结并冷冻保存至蛋白质标志物的检查为止的方法。但是，十二指肠液通常是在内窥镜检查时采集，而内窥镜检查室通常没有冷冻设备、液氮等用于使生物试样迅速冻结的设备，该方法难以实施。

作为以来自胰液的生物成分的分解受到抑制的状态保存所采集的十二指肠液的方法，公开了以将十二指肠液试样的pH调节为2～5而成的保存用试样形式来保存的方法(例如，参照专利文献1)。通过将pH调节为2～5，能够抑制十二指肠液试样中的蛋白酶的活性。此外，作为抑制该生物试样中的蛋白酶的活性以稳定地保存生物试样中的蛋白质的方法，还公开了使血清等生物试样中含有脲、盐酸胍等变性剂、SDS等阴离子系表面活性剂的方法(例如，参照专利文献2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特开2012-230073号公报

专利文献2:日本特开2004-329214号公报

专利文献3:日本特开2006-308576号公报

专利文献4:日本特开2011-5009号公报公报

非专利文献

非专利文献1:Pancreas,1994,vol.9,No.6,p741-747

非专利文献2:Pancreas,2002,vol.24,No.54,p344-347

发明内容

发明要解决的问题

专利文献1和2的方法都是目的在于抑制生物试样中的蛋白酶活性的方法。但是，仅单纯地抑制蛋白酶活性对于确保十二指肠液试样中的蛋白质标志物的测定精度而言并不充分。尤其是，在内窥镜检查时，为了进行胃粘膜的观察而事先经口给予用于排除胃的粘膜的强效蛋白酶，因此内窥镜检查时所采集的十二指肠液中含有非常多的强效蛋白酶，存在蛋白质标志物更容易被分解的问题。即，本发明的目的在于，提供制备用于稳定地保存十二指肠液试样中的蛋白质标志物的保存用试样的方法、和用于制备该保存用试样的试剂盒。

用于解决问题的方案

本发明人们为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，通过将从受试者采集的十二指肠液试样以用含有较多惰性蛋白的水溶液进行稀释的状态来保存，从而即使不进行冷冻保存也能够更稳定地保存十二指肠液试样中的蛋白质标志物，并完成了本发明。

即，本发明的十二指肠液试样的保存方法和试剂盒为下述[1]～[14]。

[1]一种十二指肠液试样的保存方法，其具有如下步骤：

(a)制备使用稀释用溶液将从受试者采集的十二指肠液试样稀释成10倍体积以上的保存用试样的步骤，以及，

(b)将前述步骤(a)中制备的保存用试样以液体的状态进行保存的步骤，

前述稀释用溶液为含有0.02质量％以上的蛋白质的水溶液。

[2]根据前述[1]的十二指肠液试样的保存方法，其中，前述稀释用溶液进一步含有蛋白酶抑制剂。

[3]根据前述[1]的十二指肠液试样的保存方法，其中，在前述步骤(a)中，将使从受试者采集的十二指肠液试样和蛋白酶抑制剂混合后、使用前述稀释用溶液稀释成10倍体积以上的液体作为保存用试样。

[4]根据前述[3]的十二指肠液试样的保存方法，其中，前述蛋白酶抑制剂为固体，或者，前述从受试者采集的十二指肠液试样与前述蛋白酶抑制剂的混合物的体积为前述从受试者采集的十二指肠液试样的2倍体积以下。

[5]根据前述[3]或[4]的十二指肠液试样的保存方法，其中，在使前述从受试者采集的十二指肠液试样和前述蛋白酶抑制剂混合后，经过1～30分钟后添加前述稀释用溶液进行稀释。

[6]根据前述[1]～[5]中任一项的十二指肠液试样的保存方法，其中，前述保存用试样为供于蛋白质标志物的检测的试样，

前述蛋白质相对于前述蛋白质标志物的检测反应的反应体系为惰性。

[7]根据前述[6]的十二指肠液试样的保存方法，其中，前述蛋白质标志物为胰腺病标志物。

[8]根据前述[6]或[7]的十二指肠液试样的保存方法，其中，前述稀释用溶液为前述蛋白质标志物的检测反应的反应用溶液。

[9]根据前述[1]～[8]中任一项的十二指肠液试样的保存方法，其中，前述稀释用溶液含有表面活性剂。

[10]根据前述[1]～[9]中任一项的十二指肠液试样的保存方法，其中，在前述步骤(b)中，保存期为6小时～14天。

[11]一种试剂盒，其具备：回收从受试者采集的十二指肠液试样的回收用容器和稀释用溶液，

前述稀释用溶液为含有0.02质量％以上的蛋白质的水溶液，

所述试剂盒用于在回收到前述回收用容器的十二指肠液试样中混合前述稀释用溶液、从而制备保存用试样。

[12]根据前述[11]的试剂盒，其中，前述回收用容器内容纳有蛋白酶抑制剂。

[13]根据前述[11]的试剂盒，其中，前述稀释用溶液进一步含有蛋白酶抑制剂。

[14]根据前述[11]的试剂盒，其进一步具备用于从前述受试者采集十二指肠液的采集工具。

发明的效果

根据本发明的十二指肠液试样的保存方法，能够以液体的状态稳定地保存十二指肠液试样，并且充分地抑制该试样中所含的蛋白质标志物的分解、变性。

此外，通过使用本发明的用于由十二指肠液试样制备保存用试样的试剂盒，能够更简单地利用从受试者采集的十二指肠液制备能更稳定地保存蛋白质标志物的保存用试样。

具体实施方式

＜十二指肠液试样的保存方法＞

本发明的十二指肠液试样的保存方法(以下有时称为“本发明的保存方法”)是用于稳定地保存从受试者采集的十二指肠液中原本含有的蛋白质的方法。因此，该保存方法作为十二指肠液试样的保存方法来使用，其中，所述十二指肠液试样是供于用于测定十二指肠液中含有的蛋白质的检查的。

以下，有时将在通过该保存方法保存后的十二指肠液试样所进行的检查中成为测定对象的蛋白质称为“目标蛋白质”。

本发明中，“目标蛋白质”优选为蛋白质标志物。

通过将供于用于检测蛋白质标志物的检查的十二指肠液试样用本发明的保存方法进行保存，从而能够有效地抑制保存期内蛋白质的分解、变性，能够期待可靠性更高的检查结果。

需要说明的是，在本发明和本申请说明书中，蛋白质标志物是指体液中的其浓度成为某种疾病的存在、进展程度的指标的蛋白质。具体是指：与疾病非罹患者相比，从罹患疾病的患者采集的生物试样中的浓度显著升高或降低的蛋白质。需要说明的是，疾病非罹患者可以没有罹患该疾病，不限于健康者，也可以包括该疾病以外的疾病的罹患者。

十二指肠液试样适合作为胰腺病的检查试样。因此，本发明的保存方法特别优选将胰腺病标志物作为目标蛋白质。作为该胰腺病标志物，优选例如胰腺癌、IPMN(胰管内乳头粘液性肿瘤)、MCN(粘液性嚢胞肿瘤)、SCN(浆液性嚢胞肿瘤)、NET(胰腺内分泌肿瘤)、慢性胰腺炎(CP)、急性胰腺炎等的蛋白质标志物。作为胰腺病标志物，具体可以列举S100蛋白(S100P)、NGAL、MIC-1、CEA、CA19-9(例如，参照非专利文献1)、MUC-1(KL-6)(例如，参照专利文献3等)、MMP2(Matrix Metalloproteinase-2，基质金属蛋白酶2)(例如，参照非专利文献2)、MMP7(Matrix Metalloproteinase-7,基质金属蛋白酶7)等。

本发明的十二指肠液试样的保存方法，其特征在于，将从受试者采集的十二指肠液试样以存在较多的惰性蛋白且被稀释的状态进行保存。就蛋白质而言，在水溶液中浓度低时容易变得不稳定，因此，在保存蛋白质溶液时通常以通过超滤膜处理等浓缩后的状态来保存。但是，就十二指肠液试样而言，与将采集的液体直接保存时相比，以稀释成10倍体积以上的状态进行保存时，十二指肠液试样中的蛋白质的保存稳定性良好。其原因不明，我们推测其原因在于，在进行稀释的基础上，通过使较多的惰性蛋白共存，减少了与蛋白酶、细菌接触的机会，结果蛋白质不易由于蛋白酶、细菌而分解、变性。关于与本发明的保存方法不同的、仅单纯地添加蛋白酶抑制剂并保存的方法中十二指肠液试样的保存稳定性不充分的理由，我们认为仅蛋白酶抑制剂的情况下，不能抑制细菌所致的蛋白质分解、变性。首先，通过稀释，来自十二指肠液的细菌与同样来自十二指肠液试样的目标蛋白质的接触机会减少，并且来自十二指肠液的细菌不作用于目标蛋白质、而是作用于其周围存在的较多的惰性蛋白，结果可防止目标蛋白质分解、变性。

具体而言，本发明的十二指肠液试样的保存方法具有下述的步骤(a)和(b)。

(a)制备使用稀释用溶液将从受试者采集的十二指肠液试样稀释成10倍体积以上的保存用试样的步骤。

(b)将前述步骤(a)中制备的保存用试样以液体的状态进行保存的步骤。

本发明中使用的稀释用溶液是含有0.02质量％以上的蛋白质的水溶液。通过使十二指肠液试样中含有0.02质量％以上的高浓度的蛋白质，该蛋白质成为物理性屏障，十二指肠液试样中原本含有的蛋白质不易接触到十二指肠液试样中同样原本含有的蛋白酶、细菌，结果目标蛋白质的保存稳定性提高。虽然有该稀释用溶液的蛋白质含量越多则十二指肠液试样中的蛋白质的保存稳定性越提高的倾向，但蛋白质浓度过高时，有溶解性变差之虞。因此，作为本发明中使用的稀释用溶液的蛋白质浓度，优选为0.02～10质量％，更优选为0.1～10质量％，进一步优选为0.5～10质量％，更进一步优选为1～10质量％。

稀释用溶液中所含的蛋白质使用的是相对于十二指肠液试样中原本含有的目标蛋白质为惰性、且相对于该目标蛋白质的检测反应的反应体系为惰性的蛋白质。作为这样的惰性蛋白，可以列举：血清白蛋白、蛋清白蛋白等白蛋白，球蛋白，脱脂乳等。在本发明中，从对反应体系的影响更小且通用、容易处理的角度出发，优选牛血清白蛋白(BSA)。

“相对于蛋白质为惰性”是指不使该蛋白质分解、变性并且也不影响该蛋白质的活性。作为惰性蛋白，可以是在十二指肠液试样中的各种蛋白酶、细菌作用下分解、变性的蛋白。此外，“相对于反应体系为惰性”是指存在于该反应体系中时不影响目标反应。

本发明中使用的稀释用溶液可以是将惰性蛋白溶解于水而成的溶液，也可以是将惰性蛋白溶解于缓冲液而成的溶液。pH会影响细菌的活性、蛋白酶的活性，因此为了减小试样间的差异，优选将在缓冲液中溶解惰性蛋白而成的溶液作为稀释用溶液。作为该缓冲液，可以使用磷酸生理盐水(PBS)、HEPES缓冲液等之类的用于制备蛋白质、核酸的检测用反应液的缓冲液。

本发明中使用的稀释用溶液只要不妨碍目标蛋白质的保存稳定性、且不妨碍保存后所进行的目标蛋白质的检查等，也可以含有惰性蛋白以外的其它成分。作为该其它成分，可以列举例如蛋白酶抑制剂、表面活性剂、盐类等。

作为该蛋白酶抑制剂，可以列举亮抑酶肽、抑肽酶、甲磺酸卡莫司他(Foipan)、甲磺酸加贝酯(FOY)、TLCK(N-a-甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮)、TPCK(N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮)、PMSF(苯甲基磺酰氟)、AEBSF(4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟))、p-APMSF(对脒基苯基甲磺酰氟盐酸盐)、4-(氟磺酰基)苯甲酸(CAS号：455-26-5)、3-(氟磺酰基)苯甲酸(CAS号：454-95-5)、2-氨基苯磺酰氟(CAS号：392-86-9)、3-氨基苯磺酰氟(CAS号：368-50-3)、4-氨基苯磺酰氟(CAS号：98-62-4)、2-硝基苯磺酰氟(CAS号：433-98-7)、3-硝基苯磺酰氟(CAS号：349-78-0)、4-硝基苯磺酰氟(CAS号：349-96-2)等。本发明中使用的稀释用溶液所含的蛋白酶抑制剂可以为一种，也可以为两种以上。

作为该表面活性剂，可以是非离子性表面活性剂，可以是阴离子性表面活性剂，可以是阳离子性表面活性剂，还可以是两性表面活性剂。作为非离子性表面活性剂，可以列举例如皂素、毛地黄皂苷、Tween(吐温)80(聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯)、Tween(吐温)20(聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯)、Triton X-100(聚氧乙烯(10)辛基苯基醚)、NonidetP-40(聚氧乙烯(9)辛基苯基醚)等。作为阴离子性表面活性剂，可以列举例如以SDS(十二烷基硫酸钠)为代表的烷基硫酸钠、胆酸钠、N-月桂基肌氨酸等。作为阳离子性表面活性剂，可以列举例如以CDAB为代表的烷基季铵等。作为两性表面活性剂，可以列举例如CHAPS(3-[3-胆酰胺丙基二甲氨基]-1-丙磺酸盐)等。本发明中使用的稀释用溶液所含的表面活性剂可以为一种，也可以为两种以上。

通过本发明的保存方法进行保存的十二指肠液试样为按照使从受试者采集的十二指肠液达到至少10倍体积以上的方式稀释的保存用试样。因此，带入到用于检测目标蛋白质的反应体系的保存用试样的体积与此前的未经稀释而保存的十二指肠液试样相比也变多。因此，本发明中使用的稀释用溶液含有可能影响用于目标蛋白质检测的反应体系的成分时，优选将稀释用溶液的该成分浓度抑制为即使将该稀释用溶液较多地带入到反应体系中也不妨碍检测反应的程度。例如，反应体系的表面活性剂的浓度大多会影响蛋白质的检测反应。因此，稀释用溶液含有表面活性剂时，带入到检测反应的反应体系中的量需要适当调节，以抑制为不妨碍检测反应的浓度。

作为本发明中使用的稀释用溶液，优选为目标蛋白质的检测反应的反应用溶液，即优选为与反应用溶液相同的组成。这是由于，如果稀释用溶液为与反应用溶液相同的组成，则带入到反应体系中的稀释用溶液的量的多寡不影响检测反应。例如，在通过ELISA法进行目标蛋白质的检测时，作为稀释用溶液，可以使用市售的ELISA用缓冲液。

步骤(a)中，供于本发明的保存方法的十二指肠液试样可以为从受试者采集的十二指肠液本身，也可以为在所采集的十二指肠液中添加了各种添加剂的液体。作为添加剂，可以列举表面活性剂、蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、pH调节剂等用于抑制十二指肠液试样中的成分的分解、变性的试剂等。

十二指肠液可以通过常规方法从受试者采集。例如，可以通过连接到内窥镜导管的注射器、真空泵等抽吸手段来采集十二指肠液。具体而言，将内窥镜从口腔插入到十二指肠，使用贯穿钳子通道而插入的导管抽吸、采集存在于十二指肠的第二段、第三段的十二指肠液。例如，也可以在进行作为所谓胃镜的胃/十二指肠的内窥镜检查(上部内窥镜检查)时顺便采集积存在十二指肠的肠管内的十二指肠液。

为了使蛋白酶抑制剂高效地抑制蛋白酶，需要存在充分量的蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂的浓度是重要的。因此，代替使稀释用溶液含有蛋白酶抑制剂的方式，还优选将使从受试者采集的十二指肠液试样和蛋白酶抑制剂混合后、使用稀释用溶液稀释成10倍体积以上的液体作为保存用试样。通过在使用稀释用溶液稀释前的十二指肠液试样中混合蛋白酶抑制剂，从而可以以更少量的蛋白酶抑制剂得到充分的抑制效果。

在稀释前的十二指肠液试样中添加蛋白酶抑制剂的情况下，在添加等量的蛋白酶抑制剂时，添加后的总体积不大的方式可以进一步提高十二指肠液试样中的蛋白酶抑制剂浓度，因此优选。因此，本发明中，添加到稀释前的十二指肠液试样中的蛋白酶抑制剂优选为固体。此外，在蛋白酶抑制剂为液体时，从受试者采集的十二指肠液试样与蛋白酶抑制剂的混合物的体积优选抑制为混合蛋白酶抑制剂之前的十二指肠液试样的2倍体积以下。

在稀释前的十二指肠液试样中添加蛋白酶抑制剂时，优选在将十二指肠液试样和蛋白酶抑制剂混合后，在添加稀释用溶液前对所得到的混合物静置或培养一定时间。由此，蛋白酶抑制剂可以充分抑制十二指肠液试样中的蛋白酶。静置或培养的时间没有特别限定，例如，可以在十二指肠液试样中混合蛋白酶抑制剂后，经过1～30分钟后添加稀释用溶液进行稀释。

在使用稀释用溶液稀释前将核酸酶抑制剂等蛋白酶抑制剂以外的添加剂添加到从受试者采集的十二指肠液本身的情况下，从受试者采集的十二指肠液试样与添加剂的混合物的体积也同样优选抑制为混合蛋白酶抑制剂前的十二指肠液试样的2倍体积以下，该混合物优选根据需要静置或培养一定时间。

步骤(a)中，将十二指肠液试样使用稀释用溶液稀释的稀释倍率只要为10倍体积以上则没有特别限制，优选为50倍以上。此外，稀释倍率过大时，有目标蛋白质的检测变困难之虞，因此该稀释倍率优选为500倍体积以下，更优选为300倍体积以下，进一步优选为200倍体积以下。

步骤(b)中，对于步骤(a)中制备的保存用试样不进行冻结、而是以液体的状态进行保存。保存温度只要为该保存用试样不凝固的温度则没有特别限定，不需要进行温度控制的特别环境。例如，保存用试样可以冷藏保存，也可以常温(15～25℃)保存，还可以室温(1～30℃)保存。此外，还可以在使用恒温装置等将温度控制在0～35℃中的一定范围内的环境中保存。

步骤(b)中，对保存用试样进行保存的保存期没有特别限制。本发明中，作为该保存期，优选6小时～14天，更优选6小时～7天，进一步优选6小时～3天。例如，将步骤(a)中制备的保存用试样运输到进行目标蛋白质的检查的设施等的情况下，可以将该运输期设为步骤(b)中的保存期。

通过本发明的保存方法进行保存的保存用试样可以与通过现有方法制备的十二指肠液试样同样地供于各种检查。作为检测保存用试样中的目标蛋白质的方法，可以列举例如：ELISA、免疫色谱、化学发光免疫测定法等免疫学测定法，二维电泳，蛋白质印迹、质谱法等。这些方法可以按照常规方法来进行。

＜用于由十二指肠液试样制备保存用试样的试剂盒＞

本发明的试剂盒是用于实施本发明的保存方法的步骤(a)的试剂盒。即，本发明的试剂盒具备：回收从受试者采集的十二指肠液试样的回收用容器和前述稀释用溶液，所述试剂盒用于在回收到该回收用容器的十二指肠液试样中混合稀释用溶液、从而制备保存用试样。通过使用该试剂盒，可以更简单地实施前述步骤(a)。

作为本发明的试剂盒，可以具备稀释用溶液本身，也可以将惰性蛋白质和通过添加该蛋白质而形成稀释用溶液的溶液容纳在独立的容器中。在彼此分开地包含惰性蛋白质和稀释用溶液的情况下，该蛋白质可以是溶解于水、缓冲液而成的溶液，从试剂盒的长期保存稳定性的角度出发，优选为粉末等固体。

作为本发明的试剂盒，可以具备含有蛋白酶抑制剂的稀释用溶液，也可以是如下构成：具备装在与稀释用溶液独立的容器中的状态的蛋白酶抑制剂，在即将添加到十二指肠液试样之前将蛋白酶抑制剂混合到稀释用溶液中。

作为本发明的试剂盒，也可以在回收用容器内容纳有蛋白酶抑制剂。从受试者采集的十二指肠液被容纳到回收用容器中，因此通过在回收用容器内容纳蛋白酶抑制剂，可使离开受试者身体的十二指肠液在回收用容器内迅速地与蛋白酶抑制剂混合。回收用容器内容纳的蛋白酶抑制剂可以是溶解于水、缓冲液的溶液，从试剂盒的长期保存稳定性的角度出发，优选为粉末等固体。

本发明的试剂盒此外还可以具备：用于装入回收到回收用容器的十二指肠液试样和稀释用溶液、从而制备保存用试样的容器，记载有将核酸酶抑制剂等各种添加剂、稀释用溶液添加到回收到回收用容器的十二指肠液试样中的步骤等的试剂盒使用方法的说明书等。

此外，十二指肠液试样通常经内窥镜进行采集。因此，作为本发明的试剂盒的构成品，还可以含有经内窥镜采集十二指肠液试样的采集工具。作为该采集工具，包括例如：在能够插入内窥镜装置的导管上组装有注射器的结构，以及，前端具备能够插入内窥镜装置的吸收体的探头等。作为能够插入内窥镜装置的导管，可以列举例如专利文献4中记载的标本采集管等。回收从受试者采集的十二指肠液试样的回收用容器可以能够拆卸地与采集工具连接，也可以是容纳从采集工具中所设置的积存部回收的十二指肠液的、与采集工具独立的容器。通过对规定的采集工具和回收用容器、稀释用容器进行试剂盒化，从而能够使采集技能和保存方法统一，实施更高精度的检查。

实施例

以下示出实施例等进一步详细地说明本发明，本发明不受以下的实施例限定。

[实施例1]

对于从4名受试者(受试者a～d)采集的十二指肠液试样，以各种条件进行保存，测定保存后的试样中的S100P浓度。将采集后立即冻结并保存在-80℃的试样的S100P浓度作为基准来比较测定结果。

关于来自受试者的十二指肠液试样的采集，使用可拆卸地设置有预先容纳有10mg的粉末蛋白酶抑制剂(AEBSF、PMSF和TLCK的混合物)的保存用容器的采集工具经内窥镜进行。需要说明的是，从所采集的十二指肠液试样与蛋白酶抑制剂的混合时间起到后述的用ELISA缓冲液进行的稀释为止的时间长度为1～3分钟左右。

从采自各受试者的、与蛋白酶抑制剂混合后的十二指肠液试样中，分别取20μL至6个容器，其中的3个样品直接保存，其余3个样品用CircuLex S100P ELISA试剂盒(Cyclex公司制，目录编号：CY-8060)所附带的ELISA缓冲液稀释到100倍体积并保存。不进行稀释而保存的3个样品的保存条件分别设为-80℃下1周、4℃下1天、或室温下1天。进行稀释并保存的3个样品的保存条件分别设为4℃下1天、4℃下1周、或室温下1天。需要说明的是，该ELISA缓冲液含有1～5％的BSA。

使用CircuLex S100P ELISA试剂盒(Cyclex公司制、目录编号：CY-8060)测定了保存后的各样品的总量中的S100P浓度(pg/mL)。

关于各样品的S100P浓度，求出将-80℃下保存1周的样品的S100P浓度设为100％时的相对值(％)，作为S100P残存率(％)。将结果示于表1。结果确认，对于任一受试者的样品而言，在保存温度和保存期相同的情况下，稀释样品的S100P残存率都明显高于未进行稀释的样品，以进行了稀释的状态进行保存时，十二指肠液试样中的蛋白质的保存稳定性高。

[表1]

[实施例2]

对于实施例1的采自受试者a～d的与10mg的粉末蛋白酶抑制剂(AEBSF、PMSF和TLCK的混合物)混合后的十二指肠液试样，调查稀释用溶液的成分差异对S100P残存率(％)的影响。

具体而言，从采自各受试者的与蛋白酶抑制剂混合后的十二指肠液试样中，分别取20μL至12个容器，对于其中的5个样品，在用PBS、含有0.1质量％的BSA的PBS(PBS+BSA0.1％)、含有0.02质量％的BSA的PBS(PBS+BSA0.02％)、含有0.1质量％的BSA和0.05％的tween(吐温)20的PBS(PBS+BSA0.1％+tween 20 0.05％)或实施例1中使用的ELISA缓冲液分别稀释成100倍体积后，在室温下保存1天。其余6个样品不进行稀释而在-80℃下保存1天。

与实施例1同样地测定保存后的各样品的总量中的S100P浓度(pg/mL)。但是，对于不进行稀释而在-80℃下保存1天的5个样品之中的4个样品，在分别用PBS、含有0.1质量％的BSA的PBS、含有0.02质量％的BSA的PBS、含有0.1质量％的BSA和0.05％的tween20的PBS或实施例1中使用的ELISA缓冲液稀释成10倍体积后测定S100P浓度。

关于在-80℃下保存后用各稀释用溶液稀释100倍的样品的S100P浓度，求出将-80℃下保存且不进行稀释直接测定S100P浓度的样品的S100P浓度设为100％时的相对值(％)，作为S100P残存率(％)。该S100P残存率表示稀释用溶液对ELISA反应体系的带入影响。将结果示于表2。S100P残存率降低的稀释用溶液表明通过被带入反应体系而抑制了ELISA反应。结果是，用含有0.1质量％的BSA和0.05％的tween 20的PBS稀释的样品的S100P残存率为69％，明显低。推测其原因在于，0.05％的tween20高于适合进行ELISA反应的表面活性剂浓度，因此，ELISA反应受到抑制。使用含有表面活性剂的稀释用溶液时有可能对ELISA反应体系带来负面影响，因此优选预先调查稀释用溶液被带入反应体系时所产生的影响。

[表2]

关于进行稀释并保存的各样品的S100P浓度，求出将-80℃下保存的样品的S100P浓度设为100％时的相对值(％)，作为S100P残存率(％)。将结果示于表3。其结果是，对用PBS进行稀释的样品、用含有0.1质量％的BSA的PBS进行稀释的样品、用含有0.02质量％的BSA的PBS进行稀释的样品和用ELISA缓冲液进行稀释的样品的结果进行比较时存在如下倾向：稀释用溶液的BSA含量越高则S100P残存率越高。但是，用带入ELISA反应体系时有负面影响的含有0.05％的tween 20的稀释用溶液稀释的样品的S100P残存率非常低。

[表3]

[实施例3]

对于实施例1的采自受试者a～d的与10mg的粉末蛋白酶抑制剂(AEBSF、PMSF和TLCK的混合物)混合后的十二指肠液试样，调查稀释倍率对S100P残存率(％)的影响。

具体而言，从采自各受试者的与蛋白酶抑制剂混合后的十二指肠液试样中，分别取20μL至4个容器，对于其中的3个样品，用实施例1中使用的ELISA缓冲液分别稀释成5、20、或100倍体积，然后在室温下保存1天。其余1个样品不进行稀释而在-80℃下保存1天。

关于各样品的S100P浓度，求出将-80℃下保存的样品的S100P浓度设为100％时的相对值(％)，作为S100P残存率(％)。将结果示于表4。其结果是，对于任一受试者而言，都是ELISA缓冲液的稀释倍率越高则S100P残存率越高、S100P的保存稳定性越良好。推测其原因在于，稀释倍率越高则样品中的S100P接触蛋白酶、细菌的频率越低。

[表4]

Claims (7)

1.一种十二指肠液试样的保存方法，其具有如下步骤：

(a)使从受试者采集的十二指肠液试样和蛋白酶抑制剂混合后，经过1～30分钟后使用稀释用溶液稀释成10倍体积以上，从而制备保存用试样的步骤，以及，

(b)将所述步骤(a)中制备的保存用试样以液体的状态进行保存的步骤，

所述稀释用溶液为含有0.02质量％以上的蛋白质的水溶液。

2.根据权利要求1所述的十二指肠液试样的保存方法，其中，所述蛋白酶抑制剂为固体，或者，所述从受试者采集的十二指肠液试样和所述蛋白酶抑制剂的混合物的体积为所述从受试者采集的十二指肠液试样的2倍体积以下。

3.根据权利要求1或2所述的十二指肠液试样的保存方法，其中，所述保存用试样供于蛋白质标志物的检测，

所述蛋白质相对于所述蛋白质标志物的检测反应的反应体系为惰性。

4.根据权利要求3所述的十二指肠液试样的保存方法，其中，所述蛋白质标志物为胰腺病标志物。

5.根据权利要求3所述的十二指肠液试样的保存方法，其中，所述稀释用溶液为所述蛋白质标志物的检测反应的反应用溶液。

6.根据权利要求1所述的十二指肠液试样的保存方法，其中，所述稀释用溶液含有表面活性剂。

7.根据权利要求1所述的十二指肠液试样的保存方法，其中，在所述步骤(b)中，保存期为6小时～14天。