JP2000221190A

JP2000221190A - 尿中蛋白の安定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫学的測定方法

Info

Publication number: JP2000221190A
Application number: JP11023492A
Authority: JP
Inventors: Kazufumi Sakabe; 一史阪部; Nobuyuki Kubota; 信幸窪田
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1999-02-01
Filing date: 1999-02-01
Publication date: 2000-08-11

Abstract

(57)【要約】【課題】酸性領域、中性領域、アルカリ性領域を問わ
ず、長期間に亘って尿中蛋白を安定化させる方法、安定
化剤およびこれを応用した尿中蛋白の免疫学的測定方法
を提供すること。【解決手段】尿試料中に炭酸水素塩化合物、および必要
に応じてアジ化物および／またはキレート剤を含有させ
ることを特徴とする尿中蛋白の安定化方法、安定化剤お
よびこれを応用した免疫学的測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、長期間に亘って尿中蛋
白を安定に維持できる尿中蛋白の安定化方法、安定化
剤、およびこの技術を応用した免疫学的測定方法に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、尿中の特定蛋白の定量は、人体の
生理状態や病態の診断のために広く行われている。ま
た、尿中蛋白の定量による病態診断は、血中蛋白の定量
と異なり、人体を全く傷つけることなく、肝炎やエイズ
の感染の危険性も低いことから今後とも推奨される診断
方法である。このような診断に用いられる有望蛋白とし
ては、特に癌細胞が産生するいわゆる癌マーカーが数多
く知られている。尿中に出現する癌マーカーには、塩基
性胎児蛋白（以下、ＢＦＰと略す）、ビトロネクチン、
およびフィブロネクチン等が見出されている。また、腎
後性の出血マーカーとしてα_２マクログロブリンが見出
されている。

【０００３】しかしながら、この尿試料の測定方法を実
施するに際しては、試料中の蛋白の安定性が問題とな
る。一般に、尿中の蛋白では、たとえ尿を採取直後に凍
結したとしても、測定値が大きく低下する検体が存在す
る。特に尿のｐＨが低い場合には、測定値の低下が著し
いことが知られている。

【０００４】一般的に尿は、ｐＨが弱酸性（ｐＨ５〜
６．５）で、種々の塩類等過剰な溶質が解け込んでお
り、保護コロイドにより準安定過飽和の状態にある。こ
のため、低温や常温での保存時には、これらの析出が起
こり易く尿中蛋白の不安定要因となっているものと考え
られている（小磯謙吉et al:「検査と技術」Vol.20. N
o.6:38-39 1992増刊号）。この他にも、尿中では、酸化
や酵素などによる分解に伴う失活や塩類の混濁沈降に伴
う共沈等による物理的な減少と相まって尿中蛋白の安定
性が低下する原因となっている。

【０００５】このため、尿サンプルの取り扱い方法は、
測定する蛋白によって多様であるが、一般的に血球や細
菌に由来する分解酵素を阻害する物質の添加や細菌類の
増殖抑制のための防腐剤の添加などが施行されてきた。

【０００６】しかしながら、これらの方法は、尿中の蛋
白を安定化させるには有効ではなく、特に微量に存在す
る蛋白を免疫学的測定方法を用いて正確に測定するには
十分でなかった。

【０００７】一方、ｐＨ８〜１１のアルカリ域緩衝液を
用い、主成分としてアルカリ域にて酵素的反応を行う酵
素含有組成物であって、炭酸水素イオンを放出せしめる
炭酸化合物を有効成分とする緩衝液組成物が提案されて
いる（特開平１０−３０９２００号公報）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この組
成物は、アルカリ域における酵素反応のｐＨの変動を抑
制することを目的とした緩衝液組成物に止まり、尿中蛋
白の安定性、特に酸性領域における尿中蛋白の安定性に
ついては、全く示唆されていない。

【０００９】従って、本発明は、このような従来の課題
に着目してなされたものであって、特に酸性領域にける
尿中蛋白を安定化させる方法、安定化剤およびこれを応
用した尿中蛋白の免疫学的測定方法を提供することを目
的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究した結果、尿試料中に炭酸水素塩
化合物を含有させることにより、特に酸性領域で尿中蛋
白を長期間に亘って安定化できると共に、更に必要に応
じてアジ化物および／またはキレート剤を含有させるこ
とにより、中性付近からアルカリ領域における測定値の
上昇を抑制できることを見出し、本発明に到達した。

【００１１】本発明の上記の課題は、尿試料中に炭酸水
素塩化合物を含有させることを特徴とする尿中蛋白の安
定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫学的測定
方法により達成された。

【００１２】また、本発明の上記の課題は、尿試料中に
炭酸水素塩化合物、および必要に応じてアジ化物／また
はキレート剤を含有させることを特徴とする尿中蛋白の
安定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫学的測
定方法により達成された。

【００１３】更に、本発明の上記の課題は、尿試料中に
炭酸水素塩化合物、および必要に応じてアジ化物および
／またはキレート剤を含有させることを特徴とする尿中
蛋白の安定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫
学的測定方法により達成された。

【００１４】以下、本発明について更に詳細に説明す
る。

【００１５】本発明に使用する炭酸水素塩化合物は、公
知のものの中から適宜選択して使用することができる。
その具体例としては、例えば炭酸水素ナトリウム、炭酸
水素カリウム、炭酸水素カルシウムおよび炭酸水素アン
モニウムから成る群から選択される少なくとも１種が挙
げられる。

【００１６】本発明の尿中蛋白の安定化方法は、尿試料
に炭酸水素ナトリウムを含有させるとアルカリ性とな
り、炭酸水素アンモニウムを含有させると中性となるた
め、アルカリ性である必要は全くない。

【００１７】本発明においては、尿試料中に炭酸水素塩
化合物を５０〜１０００mM、好ましくは１００〜２００
mM、より好ましくは１００mMとなるように含有させる。
炭酸水素塩化合物の含有量が５０mM未満になると、酸性
領域で十分な安定化効果が得られず、逆に１０００mMを
超えても、これ以上の安定化効果は得られないばかりで
なく、炭酸水素塩化合物の溶解性にも劣る。

【００１８】また、本発明においては、炭酸水素塩化合
物に加えてアジ化物を添加することにより、特に尿沈査
に起因した中性付近の尿中蛋白の安定化効果を向上させ
ることができる。アジ化物の具体例としては、例えば、
アジ化ナトリウム、アジ化カリウムおよびアジ化アンモ
ニウムから成る群から選択される少なくとも１種が挙げ
られる。

【００１９】このアジ化物は、尿試料中に０．１〜１％
（ｗ/v)、好ましくは０．１〜０．３％（w/v)、より好
ましくは０．１％（ｗ/v)となるように含有させる。ア
ジ化物の含有量が０．１％（ｗ/v)未満となると、安定
化効果が不十分となり、逆に０．３％（ｗ/v)を超える
と免疫反応が阻害され、却って測定値が低下する。

【００２０】尿試料中では、一般に中性付近で沈殿を生
ずることがあり、これに伴って測定値が上昇する。この
沈殿は、尿中に含まれている塩類の種類や濃度、または
ｐＨ等の要因によって生成すると考えられている。本発
明においては、この沈殿は、尿試料中にキレート剤を含
有させることによって防止することができ、これに伴っ
て尿中蛋白の安定化効果をより一層向上させることがで
きる。

【００２１】キレート剤は、尿試料中に０．５〜１５０
mM、好ましくは１〜１００mM、より好ましくは１００mM
となるように含有させる。キレート剤の含有量が０．５
mM未満になると、尿試料中におこる沈殿を効果的に防止
できないため、安定化効果が不十分となり、逆に１５０
mMを超えると、免疫反応が阻害され、却って測定値が低
下する。

【００２２】本発明に使用する沈殿防止作用を有するキ
レート剤は、公知のものの中から適宜選択して使用する
ことができる。このようなキレート剤としては、例えば
エチレンジアミン４酢酸（EDTA)、２−シクロヘキサン
ジアミン４酢酸、メチレンジアミン４酢酸、イミノ２酢
酸などが挙げられるが、特にEDTAまたはその塩が好まし
い。

【００２３】本発明においては、上記炭酸水素化合物、
アジ化物およびキレート剤を含有させることにより、酸
性領域、中性領域、アルカリ領域を問わず、尿中蛋白を
略完全に安定に維持することができる。本発明の安定化
方法により安定化できる尿中蛋白としては、公知の尿中
蛋白の中から適宜選択してして使用することができる。
その具体例としては尿中に存在する癌マーカー、例えば
ＢＦＰ、ビトロネクチン、およびフィブロネクチン、腎
後性の出血マーカーとしてα_２マクログロブリンなどが
挙げられる。

【００２４】本発明においては、特に必要とされない
が、公知の蛋白質保護剤を必要に応じて加えることによ
って尿中蛋白の安定化効果をより高めることができる。
このような蛋白保護剤としては、アルブミンやゼラチン
に代表される不活性蛋白質等を挙げることができる。

【００２５】アルブミンは、任意のものを使用すること
ができるが、特に動物の血清や卵白に由来するアルブミ
ンが好ましい。その具体例としては、ウシ、ウマ、ヤ
ギ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、並びにこれらの動物の幼
獣、または胎児の血液に由来するアルブミンが挙げられ
る。このアルブミンには、上記したもの以外にその酵素
分解物も知られているが、本発明におけるアルブミンに
は、このようなアルブミンから誘導される蛋白質をも含
めることができる。

【００２６】本発明においては、尿中ミオグロビンの安
定化因子として作用する炭酸水素塩化合物を含有させた
尿中蛋白の安定化剤を提供することができる。この場
合、添加する炭酸水素塩化合物としては、炭酸水素ナト
リウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウムおよび
炭酸水素アンモニウムから成る群から選ばれる少なくと
も１種から適宜選択して使用することができる。

【００２７】更に、本発明の安定化剤には、必要に応じ
てアジ化物および／またはキレート剤を含有させること
ができる。アジ化物およびキレート剤は、上記したもの
の中から適宜選択して使用することができる。この安定
化剤の形態としては、特に制限されず、液状品、凍結乾
燥品、錠剤等が挙げられる。

【００２８】本発明によって尿中蛋白を安定化した尿試
料は、そのまま公知の免疫学的測定方法に基づく尿中蛋
白濃度測定用試料となる。測定方法の具体例としては、
ラテックス凝集反応法などの免疫学的粒子凝集反応法お
よび免疫比濁法、サンドイッチ法、競合法の原理に基づ
くＲＩＡ法やＥＬＩＳＡ法から成る群から選択されるも
のが挙げられる。

【００２９】尿試料は、用いる試薬の測定可能範囲に応
じて適宜希釈して測定用のサンプルとすることが好まし
い。希釈には、免疫学的な反応に好適なｐＨや塩濃度を
与える希釈溶液を用いても良い。

【００３０】

【発明の効果】本発明は、尿中蛋白、特に尿中に存在す
る癌マーカーや出血マーカー等の免疫学的測定値を長期
間に亘って安定に維持することができる。従って本発明
に係る免疫学的測定方法によれば、癌疾患等を高い精度
で診断することができる。

【００３１】

【実施例】以下、実施例によって本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれによって限定されるものではな
い。

【００３２】実施例１．炭酸水素ナトリウム単独による
安定化効果ｐＨ４．０〜１０．０の尿試料に、０、１、１０、１０
０、５００、１０００mMの炭酸水素ナトリウムを加えて
４℃に、それぞれ１、２、３、５、７、１０日間保存し
てＢＦＰの免疫学的な測定値に与える影響を調べた。

【００３３】尿試料２０μＬを最初のサイクルで分注
し、次のサイクルで希釈液２２５μＬ、および抗ＢＦＰ
抗体感作ラテックス（粒径：０．２μｍ）試薬７５μＬ
を連続分注し、試料中のＢＦＰ濃度に応じて凝集塊を形
成するこの凝集反応を一定時間の吸光度変化量として測
定した。既知濃度の標準物質の吸光度変化量から検量線
を求め、ＢＦＰ緩衝液で保存した尿中ＢＦＰ濃度を求
め、その残存活性を測定した。尚、このラテックス免疫
比濁法は免疫自動分析装置ＬＸ−２２００｛アロカ
（株）製の商品名｝を用いた。

【００３４】その結果を表１〜表６に示す。炭酸水素ナ
トリウムを添加した場合（表２〜表６参照）には、無添
加の場合（表１参照）と比較して酸性条件下（ｐＨ４．
０〜５．０）でＢＦＰの安定性が向上したことが判る。
特に１００〜１０００ｍＭの範囲で著しく安定性が向上
したことが確認された。

【００３５】

【表１】炭酸水素ナトリウム無添加

【００３６】

【表２】炭酸水素ナトリウム１ｍＭ添加

【００３７】

【表３】炭酸水素ナトリウム１０ｍＭ添加

【００３８】

【表４】炭酸水素ナトリウム１００ｍＭ添加

【００３９】

【表５】炭酸水素ナトリウム５００ｍＭ添加

【００４０】

【表６】炭酸水素ナトリウム１０００ｍＭ添加

【００４１】実施例２．炭酸水素ナトリウムおよびアジ
化ナトリウムの組み合わせによるＢＦＰの安定化効果１００ｍＭの炭酸水素ナトリウムおよび０．０１％(w/
v)、０．０３％(w/v)、０．１％(w/v)、０．３％(w/
v)、１．０％(w/v)のアジ化ナトリウムを添加した以外
は、実施例１と全く同様にしてＢＦＰの安定化効果を調
べた。その結果を表７〜表１２に示す。表７に示すよう
に、炭酸水素ナトリウム単独の場合には、ｐＨ５．０〜
ｐＨ８．０の範囲で測定値の上昇が認められるが、０．
１〜０．３％(w/v)のアジ化ナトリウム（表１０、表１
１参照）でこの測定値の上昇を抑制できたことが判る。

【表７】アジ化ナトリウム無添加

【００４４】

【表８】アジ化ナトリウム０．０１％(w/v)添加

【００４５】

【表９】アジ化ナトリウム０．０３％(w/v)添加

【００４６】

【表１０】アジ化ナトリウム０．１％(w/v)添加

【００４７】

【表１１】アジ化ナトリウム０．３％添加

【００４８】

【表１２】アジ化ナトリウム１．０％添加

【００４９】実施例３．炭酸水素ナトリウムおよびＥＤ
ＴＡ・２Ｎａの組み合わせによるＢＦＰの安定化効果１００ｍＭの炭酸水素ナトリウムおよび１ｍＭ、５ｍ
Ｍ、２０ｍＭ、１００ｍＭ、３００ｍＭのＥＤＴＡ・２
Ｎａを添加した以外は、実施例１と全く同様にしてＢＦ
Ｐの安定化効果を調べた。その結果を表１３〜表１８に
示す。表１３に示すように、炭酸水素ナトリウム単独の
場合には、ｐＨ５．０〜ｐＨ１０．０の範囲で測定値の
上昇が認められるが、１〜１００ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ（表１４〜表１７参照）を添加することでこの測定値
の上昇を抑制できたことが判る。

【表１３】ＥＤＴＡ・２Ｎａ無添加

【００５０】

【表１４】ＥＤＴＡ・２Ｎａ１ｍＭ添加

【００５１】

【表１５】ＥＤＴＡ・２Ｎａ５ｍＭ添加

【００５２】

【表１６】ＥＤＴＡ・２Ｎａ２０ｍＭ添加

【００５３】

【表１７】ＥＤＴＡ・２Ｎａ１００ｍＭ添加

【００５４】

【表１８】ＥＤＴＡ・２Ｎａ３００ｍＭ添加

【００５５】実施例４．炭酸水素ナトリウム、アジ化ナ
トリウムおよびＥＤＴＡ・２Ｎａの組み合わせによるＢ
ＦＰの安定化効果１００ｍＭの炭酸水素ナトリウム、０．１％(w/v)のア
ジ化ナトリウムおよび５ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａを添加
した以外は、実施例１と全く同様にしてＢＦＰの安定化
効果を調べた。その結果を表２０に示す。表２０に示す
ように、無添加の場合（表１９参照）と比較してｐＨ
４．０〜ｐＨ９．０の範囲で測定値が略一定に維持され
ることが判る。

【表１９】無添加

【００５６】

【表２０】添加

【００５７】実施例５．炭酸水素ナトリウム、アジ化ナ
トリウムおよびＥＤＴＡ・２Ｎａの組み合わせによるα
_２マクログロブリンの安定化効果１００ｍＭの炭酸水素ナトリウム、０．１％(w/v)のア
ジ化ナトリウムおよび５ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａを添加
した以外は、実施例１と全く同様にしてα_２マクログロ
ブリンの安定化効果を調べた。その結果を表２２に示
す。表２２に示すように、無添加の場合（表２１参照）
と比較してｐＨ４．０〜ｐＨ９．０の範囲で測定値が略
一定に維持されることが判る。

【表２１】無添加

【００５８】

【表２２】添加

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】尿試料中に炭酸水素塩化合物を含有させる
ことを特徴とする尿中蛋白（但し、ミオグロビンを除
く。以下同様である。）の安定化方法。
【請求項２】炭酸水素塩化合物の含有量が１０〜１００
０mMの範囲である請求項１記載の尿中蛋白の安定化方
法。
【請求項３】炭酸水素塩化合物が炭酸水素ナトリウム、
炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウムおよび炭酸水素
アンモニウムから成る群から選択される少なくとも１種
である請求項１または２記載の尿中蛋白の安定化方法。
【請求項４】アジ化物を含有させる請求項１乃至３記載
の尿中蛋白の安定化方法。
【請求項５】アジ化物の含有量が０．０１〜１w/v%の範
囲である請求項４記載の尿中蛋白の安定化方法。
【請求項６】アジ化物がアジ化ナトリウム、アジ化カリ
ウムおよびアジ化アンモニウムから成る群から選択され
る少なくとも１種である請求項４または５記載の尿中蛋
白の安定化方法。
【請求項７】キレート剤を含有させる請求項１乃至３記
載の尿中蛋白の安定化方法。
【請求項８】キレート剤の含有量が０．５〜１５０mMの
範囲である請求項７記載の尿中蛋白の安定化方法。
【請求項９】キレート剤がEDTAまたはその塩である請求
項７または８記載の尿中蛋白の安定化方法。
【請求項１０】アジ化ナトリウムおよびキレート剤を含
有させる請求項１乃至３記載の尿中蛋白の安定化方法。
【請求項１１】尿中蛋白が塩基性胎児蛋白、α_２マクロ
グロブリン、ビトロネクチン、およびフィブロネクチン
から成る群から選択される請求項１乃至１０記載の尿中
蛋白の安定化方法。
【請求項１２】炭酸水素塩化合物を含有することを特徴
とする尿中蛋白の安定化剤。
【請求項１３】炭酸水素塩化合物が炭酸水素ナトリウ
ム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウムおよび炭酸
水素アンモニウムから成る群から選択される少なくとも
１種である請求項１２記載の尿中蛋白の安定化剤。
【請求項１４】アジ化物を含有する請求項１２または１
３記載の尿中蛋白の安定化剤。
【請求項１５】アジ化物がアジ化ナトリウム、アジ化カ
リウムおよびアジ化アンモニウムから成る群から選択さ
れる少なくとも１種である請求項１４記載の尿中蛋白の
安定化剤。
【請求項１６】キレート剤を含有する請求項１２乃至１
３記載の尿中蛋白の安定化剤。
【請求項１７】キレート剤がEDTAまたはその塩である請
求項１６記載の尿中蛋白の安定化剤。
【請求項１８】アジ化物およびキレート剤を含有する請
求項１２乃至１３記載の尿中蛋白の安定化剤。
【請求項１９】炭酸水素塩化合物を含む尿試料中の蛋白
と抗蛋白抗体とを反応させることを特徴とする尿中蛋白
の免疫学的測定方法。
【請求項２０】アジ化物を含有させる請求項１９記載の
尿中蛋白の免疫学的測定方法。
【請求項２１】キレート剤を含有させる請求項１９記載
の尿中蛋白の免疫学的測定方法。
【請求項２２】アジ化物およびキレート剤を含有させる
請求項１９乃至２１記載の尿中蛋白の免疫学的測定法。