JP2000221190A - 尿中蛋白の安定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫学的測定方法 - Google Patents
尿中蛋白の安定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫学的測定方法Info
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Abstract
ず、長期間に亘って尿中蛋白を安定化させる方法、安定
化剤およびこれを応用した尿中蛋白の免疫学的測定方法
を提供すること。 【解決手段】尿試料中に炭酸水素塩化合物、および必要
に応じてアジ化物および/またはキレート剤を含有させ
ることを特徴とする尿中蛋白の安定化方法、安定化剤お
よびこれを応用した免疫学的測定方法。
Description
白を安定に維持できる尿中蛋白の安定化方法、安定化
剤、およびこの技術を応用した免疫学的測定方法に関す
るものである。
生理状態や病態の診断のために広く行われている。ま
た、尿中蛋白の定量による病態診断は、血中蛋白の定量
と異なり、人体を全く傷つけることなく、肝炎やエイズ
の感染の危険性も低いことから今後とも推奨される診断
方法である。このような診断に用いられる有望蛋白とし
ては、特に癌細胞が産生するいわゆる癌マーカーが数多
く知られている。尿中に出現する癌マーカーには、塩基
性胎児蛋白(以下、BFPと略す)、ビトロネクチン、
およびフィブロネクチン等が見出されている。また、腎
後性の出血マーカーとしてα2マクログロブリンが見出
されている。
施するに際しては、試料中の蛋白の安定性が問題とな
る。一般に、尿中の蛋白では、たとえ尿を採取直後に凍
結したとしても、測定値が大きく低下する検体が存在す
る。特に尿のpHが低い場合には、測定値の低下が著し
いことが知られている。
6.5)で、種々の塩類等過剰な溶質が解け込んでお
り、保護コロイドにより準安定過飽和の状態にある。こ
のため、低温や常温での保存時には、これらの析出が起
こり易く尿中蛋白の不安定要因となっているものと考え
られている(小磯謙吉et al:「検査と技術」Vol.20. N
o.6:38-39 1992増刊号)。この他にも、尿中では、酸化
や酵素などによる分解に伴う失活や塩類の混濁沈降に伴
う共沈等による物理的な減少と相まって尿中蛋白の安定
性が低下する原因となっている。
測定する蛋白によって多様であるが、一般的に血球や細
菌に由来する分解酵素を阻害する物質の添加や細菌類の
増殖抑制のための防腐剤の添加などが施行されてきた。
白を安定化させるには有効ではなく、特に微量に存在す
る蛋白を免疫学的測定方法を用いて正確に測定するには
十分でなかった。
用い、主成分としてアルカリ域にて酵素的反応を行う酵
素含有組成物であって、炭酸水素イオンを放出せしめる
炭酸化合物を有効成分とする緩衝液組成物が提案されて
いる(特開平10−309200号公報)。
成物は、アルカリ域における酵素反応のpHの変動を抑
制することを目的とした緩衝液組成物に止まり、尿中蛋
白の安定性、特に酸性領域における尿中蛋白の安定性に
ついては、全く示唆されていない。
に着目してなされたものであって、特に酸性領域にける
尿中蛋白を安定化させる方法、安定化剤およびこれを応
用した尿中蛋白の免疫学的測定方法を提供することを目
的とする。
を解決すべく鋭意研究した結果、尿試料中に炭酸水素塩
化合物を含有させることにより、特に酸性領域で尿中蛋
白を長期間に亘って安定化できると共に、更に必要に応
じてアジ化物および/またはキレート剤を含有させるこ
とにより、中性付近からアルカリ領域における測定値の
上昇を抑制できることを見出し、本発明に到達した。
素塩化合物を含有させることを特徴とする尿中蛋白の安
定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫学的測定
方法により達成された。
炭酸水素塩化合物、および必要に応じてアジ化物/また
はキレート剤を含有させることを特徴とする尿中蛋白の
安定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫学的測
定方法により達成された。
炭酸水素塩化合物、および必要に応じてアジ化物および
/またはキレート剤を含有させることを特徴とする尿中
蛋白の安定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫
学的測定方法により達成された。
る。
知のものの中から適宜選択して使用することができる。
その具体例としては、例えば炭酸水素ナトリウム、炭酸
水素カリウム、炭酸水素カルシウムおよび炭酸水素アン
モニウムから成る群から選択される少なくとも1種が挙
げられる。
に炭酸水素ナトリウムを含有させるとアルカリ性とな
り、炭酸水素アンモニウムを含有させると中性となるた
め、アルカリ性である必要は全くない。
化合物を50〜1000mM、好ましくは100〜200
mM、より好ましくは100mMとなるように含有させる。
炭酸水素塩化合物の含有量が50mM未満になると、酸性
領域で十分な安定化効果が得られず、逆に1000mMを
超えても、これ以上の安定化効果は得られないばかりで
なく、炭酸水素塩化合物の溶解性にも劣る。
物に加えてアジ化物を添加することにより、特に尿沈査
に起因した中性付近の尿中蛋白の安定化効果を向上させ
ることができる。アジ化物の具体例としては、例えば、
アジ化ナトリウム、アジ化カリウムおよびアジ化アンモ
ニウムから成る群から選択される少なくとも1種が挙げ
られる。
(w/v)、好ましくは0.1〜0.3%(w/v)、より好
ましくは0.1%(w/v)となるように含有させる。ア
ジ化物の含有量が0.1%(w/v)未満となると、安定
化効果が不十分となり、逆に0.3%(w/v)を超える
と免疫反応が阻害され、却って測定値が低下する。
ずることがあり、これに伴って測定値が上昇する。この
沈殿は、尿中に含まれている塩類の種類や濃度、または
pH等の要因によって生成すると考えられている。本発
明においては、この沈殿は、尿試料中にキレート剤を含
有させることによって防止することができ、これに伴っ
て尿中蛋白の安定化効果をより一層向上させることがで
きる。
mM、好ましくは1〜100mM、より好ましくは100mM
となるように含有させる。キレート剤の含有量が0.5
mM未満になると、尿試料中におこる沈殿を効果的に防止
できないため、安定化効果が不十分となり、逆に150
mMを超えると、免疫反応が阻害され、却って測定値が低
下する。
レート剤は、公知のものの中から適宜選択して使用する
ことができる。このようなキレート剤としては、例えば
エチレンジアミン4酢酸(EDTA)、2−シクロヘキサン
ジアミン4酢酸、メチレンジアミン4酢酸、イミノ2酢
酸などが挙げられるが、特にEDTAまたはその塩が好まし
い。
アジ化物およびキレート剤を含有させることにより、酸
性領域、中性領域、アルカリ領域を問わず、尿中蛋白を
略完全に安定に維持することができる。本発明の安定化
方法により安定化できる尿中蛋白としては、公知の尿中
蛋白の中から適宜選択してして使用することができる。
その具体例としては尿中に存在する癌マーカー、例えば
BFP、ビトロネクチン、およびフィブロネクチン、腎
後性の出血マーカーとしてα2マクログロブリンなどが
挙げられる。
が、公知の蛋白質保護剤を必要に応じて加えることによ
って尿中蛋白の安定化効果をより高めることができる。
このような蛋白保護剤としては、アルブミンやゼラチン
に代表される不活性蛋白質等を挙げることができる。
ができるが、特に動物の血清や卵白に由来するアルブミ
ンが好ましい。その具体例としては、ウシ、ウマ、ヤ
ギ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、並びにこれらの動物の幼
獣、または胎児の血液に由来するアルブミンが挙げられ
る。このアルブミンには、上記したもの以外にその酵素
分解物も知られているが、本発明におけるアルブミンに
は、このようなアルブミンから誘導される蛋白質をも含
めることができる。
定化因子として作用する炭酸水素塩化合物を含有させた
尿中蛋白の安定化剤を提供することができる。この場
合、添加する炭酸水素塩化合物としては、炭酸水素ナト
リウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウムおよび
炭酸水素アンモニウムから成る群から選ばれる少なくと
も1種から適宜選択して使用することができる。
てアジ化物および/またはキレート剤を含有させること
ができる。アジ化物およびキレート剤は、上記したもの
の中から適宜選択して使用することができる。この安定
化剤の形態としては、特に制限されず、液状品、凍結乾
燥品、錠剤等が挙げられる。
料は、そのまま公知の免疫学的測定方法に基づく尿中蛋
白濃度測定用試料となる。測定方法の具体例としては、
ラテックス凝集反応法などの免疫学的粒子凝集反応法お
よび免疫比濁法、サンドイッチ法、競合法の原理に基づ
くRIA法やELISA法から成る群から選択されるも
のが挙げられる。
じて適宜希釈して測定用のサンプルとすることが好まし
い。希釈には、免疫学的な反応に好適なpHや塩濃度を
与える希釈溶液を用いても良い。
る癌マーカーや出血マーカー等の免疫学的測定値を長期
間に亘って安定に維持することができる。従って本発明
に係る免疫学的測定方法によれば、癌疾患等を高い精度
で診断することができる。
明するが、本発明はこれによって限定されるものではな
い。
安定化効果 pH4.0〜10.0の尿試料に、0、1、10、10
0、500、1000mMの炭酸水素ナトリウムを加えて
4℃に、それぞれ1、2、3、5、7、10日間保存し
てBFPの免疫学的な測定値に与える影響を調べた。
し、次のサイクルで希釈液225μL、および抗BFP
抗体感作ラテックス(粒径:0.2μm)試薬75μL
を連続分注し、試料中のBFP濃度に応じて凝集塊を形
成するこの凝集反応を一定時間の吸光度変化量として測
定した。既知濃度の標準物質の吸光度変化量から検量線
を求め、BFP緩衝液で保存した尿中BFP濃度を求
め、その残存活性を測定した。尚、このラテックス免疫
比濁法は免疫自動分析装置LX−2200{アロカ
(株)製の商品名}を用いた。
トリウムを添加した場合(表2〜表6参照)には、無添
加の場合(表1参照)と比較して酸性条件下(pH4.
0〜5.0)でBFPの安定性が向上したことが判る。
特に100〜1000mMの範囲で著しく安定性が向上
したことが確認された。
化ナトリウムの組み合わせによるBFPの安定化効果 100mMの炭酸水素ナトリウムおよび0.01%(w/
v)、0.03%(w/v)、0.1%(w/v)、0.3%(w/
v)、1.0%(w/v)のアジ化ナトリウムを添加した以外
は、実施例1と全く同様にしてBFPの安定化効果を調
べた。その結果を表7〜表12に示す。表7に示すよう
に、炭酸水素ナトリウム単独の場合には、pH5.0〜
pH8.0の範囲で測定値の上昇が認められるが、0.
1〜0.3%(w/v)のアジ化ナトリウム(表10、表1
1参照)でこの測定値の上昇を抑制できたことが判る。
TA・2Naの組み合わせによるBFPの安定化効果 100mMの炭酸水素ナトリウムおよび1mM、5m
M、20mM、100mM、300mMのEDTA・2
Naを添加した以外は、実施例1と全く同様にしてBF
Pの安定化効果を調べた。その結果を表13〜表18に
示す。表13に示すように、炭酸水素ナトリウム単独の
場合には、pH5.0〜pH10.0の範囲で測定値の
上昇が認められるが、1〜100mMのEDTA・2N
a(表14〜表17参照)を添加することでこの測定値
の上昇を抑制できたことが判る。
トリウムおよびEDTA・2Naの組み合わせによるB
FPの安定化効果 100mMの炭酸水素ナトリウム、0.1%(w/v)のア
ジ化ナトリウムおよび5mMのEDTA・2Naを添加
した以外は、実施例1と全く同様にしてBFPの安定化
効果を調べた。その結果を表20に示す。表20に示す
ように、無添加の場合(表19参照)と比較してpH
4.0〜pH9.0の範囲で測定値が略一定に維持され
ることが判る。
トリウムおよびEDTA・2Naの組み合わせによるα
2マクログロブリンの安定化効果 100mMの炭酸水素ナトリウム、0.1%(w/v)のア
ジ化ナトリウムおよび5mMのEDTA・2Naを添加
した以外は、実施例1と全く同様にしてα2マクログロ
ブリンの安定化効果を調べた。その結果を表22に示
す。表22に示すように、無添加の場合(表21参照)
と比較してpH4.0〜pH9.0の範囲で測定値が略
一定に維持されることが判る。
Claims (22)
- 【請求項1】尿試料中に炭酸水素塩化合物を含有させる
ことを特徴とする尿中蛋白(但し、ミオグロビンを除
く。以下同様である。)の安定化方法。 - 【請求項2】炭酸水素塩化合物の含有量が10〜100
0mMの範囲である請求項1記載の尿中蛋白の安定化方
法。 - 【請求項3】炭酸水素塩化合物が炭酸水素ナトリウム、
炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウムおよび炭酸水素
アンモニウムから成る群から選択される少なくとも1種
である請求項1または2記載の尿中蛋白の安定化方法。 - 【請求項4】アジ化物を含有させる請求項1乃至3記載
の尿中蛋白の安定化方法。 - 【請求項5】アジ化物の含有量が0.01〜1w/v%の範
囲である請求項4記載の尿中蛋白の安定化方法。 - 【請求項6】アジ化物がアジ化ナトリウム、アジ化カリ
ウムおよびアジ化アンモニウムから成る群から選択され
る少なくとも1種である請求項4または5記載の尿中蛋
白の安定化方法。 - 【請求項7】キレート剤を含有させる請求項1乃至3記
載の尿中蛋白の安定化方法。 - 【請求項8】キレート剤の含有量が0.5〜150mMの
範囲である請求項7記載の尿中蛋白の安定化方法。 - 【請求項9】キレート剤がEDTAまたはその塩である請求
項7または8記載の尿中蛋白の安定化方法。 - 【請求項10】アジ化ナトリウムおよびキレート剤を含
有させる請求項1乃至3記載の尿中蛋白の安定化方法。 - 【請求項11】尿中蛋白が塩基性胎児蛋白、α2マクロ
グロブリン、ビトロネクチン、およびフィブロネクチン
から成る群から選択される請求項1乃至10記載の尿中
蛋白の安定化方法。 - 【請求項12】炭酸水素塩化合物を含有することを特徴
とする尿中蛋白の安定化剤。 - 【請求項13】炭酸水素塩化合物が炭酸水素ナトリウ
ム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウムおよび炭酸
水素アンモニウムから成る群から選択される少なくとも
1種である請求項12記載の尿中蛋白の安定化剤。 - 【請求項14】アジ化物を含有する請求項12または1
3記載の尿中蛋白の安定化剤。 - 【請求項15】アジ化物がアジ化ナトリウム、アジ化カ
リウムおよびアジ化アンモニウムから成る群から選択さ
れる少なくとも1種である請求項14記載の尿中蛋白の
安定化剤。 - 【請求項16】キレート剤を含有する請求項12乃至1
3記載の尿中蛋白の安定化剤。 - 【請求項17】キレート剤がEDTAまたはその塩である請
求項16記載の尿中蛋白の安定化剤。 - 【請求項18】アジ化物およびキレート剤を含有する請
求項12乃至13記載の尿中蛋白の安定化剤。 - 【請求項19】炭酸水素塩化合物を含む尿試料中の蛋白
と抗蛋白抗体とを反応させることを特徴とする尿中蛋白
の免疫学的測定方法。 - 【請求項20】アジ化物を含有させる請求項19記載の
尿中蛋白の免疫学的測定方法。 - 【請求項21】キレート剤を含有させる請求項19記載
の尿中蛋白の免疫学的測定方法。 - 【請求項22】アジ化物およびキレート剤を含有させる
請求項19乃至21記載の尿中蛋白の免疫学的測定法。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11023492A JP2000221190A (ja) | 1999-02-01 | 1999-02-01 | 尿中蛋白の安定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫学的測定方法 |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006510890A (ja) * | 2002-12-20 | 2006-03-30 | ゲーエスエフ・フォルシュングスツェントゥルム・フューア・ウムヴェルト・ウント・ゲズントハイト・ゲーエムベーハー | グアニル酸結合タンパク質−1(gbp−1)の検出のためのelisa方法 |
WO2015129870A1 (ja) * | 2014-02-28 | 2015-09-03 | シスメックス株式会社 | 尿試料分析方法及び尿試料分析用試薬キット |
-
1999
- 1999-02-01 JP JP11023492A patent/JP2000221190A/ja active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2006510890A (ja) * | 2002-12-20 | 2006-03-30 | ゲーエスエフ・フォルシュングスツェントゥルム・フューア・ウムヴェルト・ウント・ゲズントハイト・ゲーエムベーハー | グアニル酸結合タンパク質−1(gbp−1)の検出のためのelisa方法 |
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KR20160128358A (ko) * | 2014-02-28 | 2016-11-07 | 시스멕스 가부시키가이샤 | 소변 시료 분석 방법 및 소변 시료 분석용 시약 키트 |
KR101890050B1 (ko) | 2014-02-28 | 2018-08-20 | 시스멕스 가부시키가이샤 | 소변 시료 분석 방법 및 소변 시료 분석용 시약 키트 |
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