JP3898947B2 - ヘムタンパク質の安定化方法およびこれに用いる保存溶液 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヘムタンパク質の安定化方法に関し、特に糞便、尿、血液検体中のヘムタンパク質検査におけるヘムタンパク質の安定化方法に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
近年、大腸癌などの消化器系の疾患を検査する方法として、消化器官からの出血に起因する糞便中のヒトヘモグロビン（便潜血）の検出が広く行われている。このヒトヘモグロビンの検出方法は、従来の化学的な発色反応に基づく試験紙法に代わり、ヒトヘモグロビンに特異的な抗体を利用した免疫学的手法であり、食事制限を必要としない手軽な検査方法として定着している。
【０００３】
ヒトヘモグロビンの免疫学的検出法としては、例えば寒天平板内で抗ヒトヘモグロビン抗体と被検試料中のヒトヘモグロビンとの沈降線を利用する一次元免疫拡散法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作したラテックス粒子を用いるラテックス凝集法、酵素や放射性元素で標識した抗ヒトヘモグロビン抗体を用いる酵素免疫法や放射性免疫法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作した金コロイド粒子を用いる金コロイド凝集比色法等が挙げられる。
【０００４】
しかしながら、ヒトヘモグロビンは、保存温度等の保存条件によって変性が促進されたり、検体中の細菌や酵素によって分解されてしまうことも多い。このような変性・分解の結果、ヒトヘモグロビンの立体構造が破壊されて抗原性の低下を招くことになる。このため、免疫学的なヒトヘモグロビンの測定方法においては、ヘモグロビンの変性・分解は誤った診断結果を生ずる原因となる。
【０００５】
一方、便潜血検査においては、被験者自身が自宅などで糞便を採取し、便溶解液を含む密閉容器に溶解して検査に供する場合が多い。この場合、糞便中のヒトヘモグロビンは、溶液中で数日間放置され、郵便等の輸送手段を利用することによって高温下に置かれることも多い。また、検査機関で採便する場合においても、他項目の検査を実施しているため、便潜血の検査までに多くの時間を要することもある。このような状況下では、前述したように、ヒトヘモグロビンの変性・分解が生じるため、精度良く測定する際の妨げとなっていた。
【０００６】
このような溶液中でのヒトヘモグロビンの変性・分解を防止するため、例えばチメロサールやクロルヘキシジン等一般的抗菌剤を添加する方法（特開昭６３−２７１１６０号公報）の他に、糖類を添加する方法（特開昭６３−２４３７５６号公報）、ヒト以外の動物ヘモグロビンの添加（特開平２−２９６１４９号公報）、ヒト以外の動物血清の添加（特開平４−１４５３６６号公報）、溶菌酵素の添加（特公平５−６９４６６号公報）、鉄プロトポルフィリンの添加（特開平５−２８１２２７号公報）等が提案されている。
しかしながら、これらの公報に記載されたヒトヘモグロビン安定化技術では、糞便を含む被検液中のヒトヘモグロビンの変性・分解を十分に抑制することができない。
【０００７】
この他にも、エチレンジアミン４酢酸（以下、ＥＤＴＡと省略する）を用いたヘモグロビン安定化方法が提案されている（特開平５−９９９２３号公報）。
しかしながら、本発明者らによる追試の結果、ＥＤＴＡ単独では糞便中のヘモグロビンに対して十分な安定化効果を期待できないことが確認された。
このため、本出願人は、ＥＤＴＡ単独よりも安定化効果の高い水溶性遷移金属錯体を添加する方法を提案している（特開平７−２２９９０２号公報）。更に、本出願人は、フェロシアン化合物と共存させたヘモグロビンの安定化方法（特開平１１−１１８８０６号公報）、ヘモグロビンの酵素分解産物を共存させたヘモグロビンの安定化方法（特開平１１−２１８５３３号公報）、遷移金属類を共存させたヘムタンパク質の安定化方法（特開２００１−２４９１３２号公報）、およびリンゴ酸等を共存させたヘムタンパク質の安定化方法（特願２００１−１９９２２４号）を既に提案している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第一の課題は、ヘモグロビンに代表されるヘムタンパク質の変性・分解作用に対して有効な、新規なヘムタンパク質の安定化方法を提供することにある。特に変性・分解作用の強い糞便成分と共存するヘモグロビンを効果的に安定化する技術の提供を目的とする。
本発明の第二の課題は、新規なヘムタンパク質の安定化剤を利用したヘムタンパク質の保存溶液を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の課題は、ヘムタンパク質を含有する検体中に、脱脂したアルブミン（以下、脱脂アルブミンという）またはその修飾物を共存させることを特徴とする検体中のヘムタンパク質の安定化方法により達成された。
また、本発明の第二の課題は、脱脂アルブミンまたはその修飾物を含有することを特徴とするヘムタンパク質の保存溶液により達成された。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
【００１０】
本発明で使用する脱脂アルブミンは、常法により脱脂したものであれば、特に制限されず、公知のものの中から適宜選択すれば良い。
本発明に使用しうる脱脂処理を施すアルブミンとしては、任意のものを使用することができるが、特に動物の血清や卵に由来するアルブミンが好ましい。その具体例としては、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、並びにこれらの動物の幼獣、または胎児の血液に由来するアルブミンが挙げられる。
【００１１】
また、アルブミンの修飾物としては、アルブミンの酵素処理物やポリアルキレングリコール等と化学的に結合させたものも知られているが、本発明におけるアルブミン修飾物には、このようなアルブミンから誘導される蛋白質をも含めることができる。
また、これらの生物由来のアルブミンの他に、アルブミンをコードする遺伝子を組換えて発現させた組換え体アルブミンやアミノ酸配列の置換・挿入・欠損等の変異による変異体アルブミンも、本発明の安定化方法に有効なアルブミンとして挙げられる。
【００１２】
脱脂アルブミンまたはその修飾物１グラムあたりの脂肪酸の結合量は１００μEq以下が好ましく、完全に脱脂した０μEqのものが最も好ましい。脂肪酸の結合量が１００μEqを超えると、ヘムタンパク質の安定化効果が著しく低下する。
アルブミンは、一般に６〜７分子の脂肪酸を含有し、脂肪酸と結合することにより安定になっている。従って、通常アルブミンと言えば脂肪酸が含有されている。脱脂アルブミンは、脂肪酸が抜けた分ヘムタンパク質との反応性が強くなり、ヘムの安定化に寄与するものと推定される。
【００１３】
本発明においては、ヘムタンパク質を含有する検体中に、脱脂アルブミンまたはその修飾物を０．０１〜１０％、好ましくは０．１〜５％、より好ましくは０．５％となるように共存させる。これらの物質の濃度が０．０１％未満になると、安定化効果が不十分になり、逆に１０％を超えると、溶解しにくくなると共に免疫反応も阻害される。
【００１４】
また、本発明においては、上記物質に加えて有機酸類を添加することにより、検体中のヘムタンパク質をより一層安定化させることができる。この有機酸の具体例としては、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、グリコール酸、２−ケトグルタル酸、イソクエン酸、乳酸、ピルビン酸、およびオキサル酢酸から成る群から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類が挙げられる。
【００１５】
これらの有機酸は０．１ｍＭ〜２０００ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜１０００ｍＭ、より好ましくは１０００ｍＭとなるように共存させる。これらの物質の濃度が０．１ｍＭ未満になると、安定化効果を向上させることができず、逆に２０００ｍＭを超えると、溶解しにくくなり、免疫反応も阻害される。
【００１６】
さらに、本発明においては、上記有機酸に加えてアジ化物を添加することにより、検体中のヘムタンパク質を更に一層安定化させることができる。アジ化物の具体例としては、例えば、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム、アジ化アンモニウムおよびアジ化リチウムから成る群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００１７】
このアジ化物は、ヘムタンパク質含有検体中に０．０１〜０.２w/v%、好ましくは０．１w/v%となるように含有させる。アジ化物の濃度が０．０１w/v%未満となると、安定化効果を向上させることができない。その一方でアジ化物のうち、アジ化ナトリウムは、劇毒物指定品（政令台405号：毒物および劇物指定令の一部を改正する政令）となっているため、０．２w/v%を超えて使用することは好ましくない。
【００１８】
本発明においては、特に必要とされないが、公知のタンパク質保護剤を必要に応じて加えることによってヘムタンパク質の安定化効果をより高めることができる。このようなタンパク質保護剤としては、ゼラチンなどに代表される不活性タンパク質等を挙げることができる。
【００１９】
上記タンパク保護剤の他に、例えば微生物の不必要な繁殖を防ぐための抗菌剤やヘムタンパク質の保存に有利なｐＨを与える緩衝剤などこれまでに知られている多くのヘムタンパク質保護成分の添加も有効である。
抗菌剤としては、溶菌酵素、安息香酸エチル、ペニシリン、ファンギソン、ストレプトマイシン、あるいはセファマイシン他非ペニシリン系の一連の抗生物質等が挙げられる。 また、トリプシンインヒビターやα２マクログロブリンのようなプロテアーゼ抑制物質もヘムタンパク質を安定化することも知られている。
【００２０】
保存溶液のｐＨは、ヘムタンパク質を安定に保持できる範囲に設定する。極端な酸性やアルカリ性条件下ではヘムタンパク質の安定性を損なう恐れがあり、中性域のｐＨが望ましい。具体的には５〜１０、好ましくは６〜８程度のｐＨとする。
ｐＨの維持のためには適当な緩衝剤を利用する。たとえば、ヒドロキシエチルピペラジン−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳと省略する）やピペラジン−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳと省略する）等のグッド緩衝剤は、ヘムタンパク質の構造を最も安定化すると思われるｐＨ（６〜８）を与えると同時に、免疫反応によってヘムタンパク質を検出する時の反応用緩衝液としても利用されているものであり、特に好ましい緩衝剤として挙げられる。この他、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等を利用することもできる。
【００２１】
本発明のヘムタンパク質の安定化方法は、糞便、尿、血液検体中のヘムタンパク質の検出に利用することができる。ヘムタンパク質としては、ヘムを構成成分とするタンパク質の中から適宜選択でき、例えばヘモグロビン、ミオグロビン、ペルオキシダーゼ、またはカタラーゼが挙げられる。特に抗原構造の保護が要求される免疫学的な分析対象としてのヘムタンパク質について、その抗原性の維持に有用である。
【００２２】
本発明においては、ヘムタンパク質の安定化因子として作用する脱脂アルブミンまたはその修飾物を含有させたヘムタンパク質の保存溶液を提供することができる。
脱脂アルブミンまたはその修飾物は、１グラムあたりの脂肪酸の結合量が１００μEq以下、特に完全に脱脂した０μEqのものが最も好ましい。
【００２３】
更に、本発明の保存溶液には、必要に応じて有機酸、アジ化物、タンパク質保護剤および緩衝剤を含有させることができる。有機酸、アジ化物、タンパク質保護剤および緩衝剤としては、上記したものの中から適宜選択して使用することができる。
【００２４】
本発明は、前記ヘムタンパク質の安定化技術を応用したヘムタンパク質の免疫学的測定方法を提供することができる。免疫学的な測定方法としては、例えばラテックス凝集反応法、金コロイド凝集反応法、イムノクロマトグラフ法、またはＥＬＩＳＡ法等を挙げることができる。いずれの測定方法においても、ヘムタンパク質含有検体中に、脱脂アルブミンまたはその修飾物を共存させることによって、保存中の抗原活性は保護され測定値の低下が抑制される。
【００２５】
本発明のヘムタンパク質の安定化方法は、検体中に存在する分析対象としてのヘムタンパク質を安定化するために有用である。特にヘムタンパク質を認識する抗体を用いた免疫学的手法によるヘムタンパク質の測定方法において、測定対象となるヘムタンパク質の抗原性を高度に安定化する。ヘムタンパク質を検出すべき検体としては、糞便、尿、血液が知られている。特に糞便中のヘモグロビンは消化器における出血の指標となり、尿中のヘモグロビンは、尿路における出血の指標となる。
【００２６】
【発明の実施の態様】
本発明の安定化方法を、糞便検体中に存在するヘモグロビンに応用する場合には、糞便を懸濁させる保存溶液に脱脂アルブミンまたはその修飾物を添加しておくと良い。通常、糞便中のヘモグロビンの検出にあたっては、糞便を適当な保存液に懸濁させ必要に応じてろ過して免疫学的な分析用試料とする。
【００２７】
【発明の効果】
本発明のヘムタンパク質の安定化方法では、ヘムタンパク質に対して強い変性・分解作用を持つ生体成分、特に糞便成分との共存下においても保護作用を得ることができる。したがって、生体成分の分析、例えば糞便潜血の検出を目的とする検体に含まれるヘモグロビンの安定化に有用である。特に抗原構造の保護が要求される免疫学的な分析対象としてのヘムタンパク質について、その抗原性の維持に貢献する。本発明によって糞便検体中のヘモグロビンが効果的に安定化され、ヘモグロビンの変性・分解による偽陰性結果の防止を期待することができる。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００２９】
実施例１．脱脂ＢＳＡによるヘモグロビンの安定化効果
脱脂ＢＳＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製、商品名：fraction５, fatty acid free）と比較対照として脱脂されていないＢＳＡとをそれぞれ０．５％含有する緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０、０．９％のＮａＣｌ、０．１％のＮａＮ_３）２ｍｌに、正常便検体（Ａ〜Ｃ）１０ｍｇとヒト溶血液とを添加し、添加直後のヘモグロビン測定値と３７℃で１７時間保存したときのヘモグロビン測定値を比較した。測定は、ＯＣセンサーneo（栄研化学製）を用いてラテックス凝集反応を測定原理とする専用試薬（ＯＣヘモディア・オートIII:栄研化学製）で行った。
その結果を表１〜３に示す。表に示すように、対照である脱脂していないＢＳＡを添加したものに比べて、脱脂ＢＳＡを添加したものは、３７℃で１７時間保存後のヘモグロビンの安定化効果が著しく高いことが確認された。
【００３０】
【表１】

【００３１】
【表２】

【００３２】
【表３】

【００３３】
実施例２．脱脂ＢＳＡおよび有機酸によるヘモグロビンの安定化効果
実施例１で用いた脱脂ＢＳＡおよび有機酸として（３）リンゴ酸２ナトリウム（１Ｍ）、（４）コハク酸２ナトリウム（１Ｍ）、（５）フマル酸２ナトリウム（１Ｍ）と、（２）脱脂ＢＳＡと、（１）比較対照として脱脂されていないＢＳＡとをそれぞれ０．５％含有する緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０、０．９％のＮａＣｌ、０．１％のＮａＮ_３）２ｍｌに、正常便検体（Ｄ〜Ｆ）１０ｍｇとヒト溶血液とを添加し、添加直後のヘモグロビン測定値と３７℃で１７時間保存したときのヘモグロビン測定値を比較した。測定は、ＯＣ−NEO（栄研化学製）を用いてラテックス凝集反応を測定原理とする専用試薬（ＯＣ−オートIII:栄研化学製）で行った。
その結果を表４〜６に示す。表に示すように、（１）対照である脱脂していないＢＳＡを添加したものおよび（２）脱脂ＢＳＡに比べて、（３）〜（５）脱脂ＢＳＡおよび有機酸を添加したものは、３７℃で１７時間保存後のヘモグロビンの安定化効果が更に向上することが確認された。特に、脱脂ＢＳＡとリンゴ酸２ナトリウムとを組み合わせたものは、脱脂していないＢＳＡおよび脱脂ＢＳＡ単独のものと比較して顕著な効果が得られたことが判る。
【００３４】
【表４】

【００３５】
【表５】

【００３６】
【表６】

Claims (16)

1. ヘムタンパク質を含有する検体中に、脱脂したアルブミンまたはその修飾物を共存させることを特徴とする検体中のヘムタンパク質の安定化方法。
2. 脱脂したアルブミンまたはその修飾物1グラムあたりの脂肪酸の結合量が１００μEq以下である請求項１記載の検体中のヘムタンパク質の安定化方法。
3. 脱脂したアルブミンまたはその修飾物の濃度が０．０１〜１０％の範囲である請求項１または２記載の検体中のヘムタンパク質の安定化方法。
4. 有機酸を共存させる請求項１乃至３記載の検体中のヘムタンパク質の安定化方法。
5. 有機酸がリンゴ酸、コハク酸、フマル酸、グリコール酸、２−ケトグルタル酸、イソクエン酸、乳酸、ピルビン酸、およびオキサル酢酸から成る群から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類である請求項４記載の検体中のヘムタンパク質の安定化方法。
6. 有機酸の濃度が０．１〜２０００ｍＭの範囲である請求項４または５記載の検体中のヘムタンパク質の安定化方法。
7. アジ化物を共存させる請求項１乃至６記載の検体中のヘムタンパク質の安定化方法。
8. アジ化物がアジ化ナトリウム、アジ化カリウム、アジ化アンモニウムおよびアジ化リチウムから成る群から選択される少なくとも１種である請求項７記載の検体中のヘムタンパク質の安定化方法。
9. ヘムタンパク質がヘモグロビン、ミオグロビン、ペルオキシダーゼ、またはカタラーゼである請求項１乃至８記載の検体中のヘムタンパク質の安定化方法。
10. ヘムタンパク質を含有する検体が糞便、尿または血液である請求項１記載の検体中のヘムタンパク質の安定化方法。
11. 脱脂したアルブミンまたはその修飾物を含有することを特徴とするヘムタンパク質の保存溶液。
12. 脱脂したアルブミンまたはその修飾物1グラムあたりの脂肪酸の結合量が１００μEq以下である請求項１１記載のヘムタンパク質の保存溶液。
13. 有機酸を共存させる請求項１１または１２記載のヘムタンパク質の保存溶液。
14. 有機酸がリンゴ酸、コハク酸、フマル酸、グリコール酸、２−ケトグルタル酸、イソクエン酸、乳酸、ピルビン酸、およびオキサル酢酸から成る群から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類である請求項１３記載のヘムタンパク質の保存溶液。
15. アジ化物を含有する請求項１１乃至１４記載のヘムタンパク質の保存溶液。
16. アジ化物がアジ化ナトリウム、アジ化カリウム、アジ化アンモニウムおよびアジ化リチウムから成る群から選択される少なくとも１種である請求項１５記載のヘムタンパク質の保存溶液。