KR20160128358A - 소변 시료 분석 방법 및 소변 시료 분석용 시약 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 소변 중 유형 성분으로서 적어도 정자 및 효모상 진균을 검출하기 위한 소변 시료 분석 방법 및 소변 시료 분석용 시약 키트에 관한 것이다.

Description

소변 시료 분석 방법 및 소변 시료 분석용 시약 키트{URINE SAMPLE ANALYSIS METHOD AND REAGENT KIT FOR URINE SAMPLE ANALYSIS}
본 발명은 소변 중 유형 성분으로서 적어도 정자 및 효모상 진균을 검출하기 위한 소변 시료 분석 방법 및 소변 시료 분석용 시약 키트에 관한 것이다.
신장·요로계에서의 감염증, 염증성 병변, 변성 병변, 결석증, 종양 등의 질환에서는 각각의 질환에 따라 소변 중에 여러 가지 유형 성분이 출현한다. 유형 성분으로서는 적혈구, 원주, 백혈구, 상피 세포, 효모상 진균, 정자 등을 들 수 있다. 소변 중의 이들 성분을 분석하는 것은 신장·요로계의 질환이나 이상 부위의 추정을 하는데 있어서 중요하다.
예를 들면, 소변 중의 적혈구, 정자 및 효모상 진균을 검출하기 위한 시약으로서는 특허문헌 1에 기재된 시약이 알려져 있다. 특허문헌 1에는 적혈구를 손상시키지 않고, 효모상 진균을 손상시키는 물질과, 적혈구, 효모상 진균 및 정자를 변별 가능하게 염색하기 위한 색소를 포함하는 시약을 이용해 소변 시료를 처리해 측정 시료를 조제하고, 이것을 플로우 사이토미터로 측정하며, 얻어진 광학적 정보에 근거해 적혈구, 효모상 진균 및 정자를 변별하여 분석하는 것이 기재되어 있다. 또, 소변 시료의 분석용 시약에서는 일반적으로 시약을 안정하게 보존하기 위해서, 방부제가 시약에 첨가된다.
일본 특개 2007-255954호 공보
본 발명은 방부제를 포함하는 시약을 이용할 수 있고, 또한 정자 및 효모상 진균을 변별하여 정밀도 양호하게 검출하는 것을 가능하게 하는 소변 시료 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또, 본 발명은 그 방법에 적합하게 이용되는 소변 시료 분석용 시약 키트를 제공하는 것도 목적으로 한다.
본 발명자는 예의 검토의 결과, 정자 및 효모상 진균의 변별에 영향을 미치지 않는 방부제로서 아세트산 및 그 염을 알아내어 본 발명을 완성했다.
따라서, 본 발명은 소변 시료와, 핵산을 염색 가능한 형광 색소를 포함하는 제1 시약과, 방부제로서 아세트산 및/또는 그 염을 포함하는 제2 시약을 혼합해 측정 시료를 조제하는 공정과, 조제 공정에서 얻어진 측정 시료에 포함되는 소변 중 유형 성분에 광을 조사하여 광학적 정보를 취득하는 공정과, 취득 공정에서 얻어진 광학적 정보에 근거하여 소변 중 유형 성분으로서 적어도 정자 및 효모상 진균을 검출하는 공정을 포함하는 소변 시료 분석 방법을 제공한다.
또, 본 발명은 핵산을 염색 가능한 형광 색소를 포함하는 제1 시약과, 방부제로서 아세트산 및/또는 그 염, 및 적혈구를 용혈시키고, 핵산을 가지는 소변 중 유형 성분에 상기 형광 색소를 투과할 수 있는 정도의 손상을 부여하기 위한 계면활성제를 포함하는 제2 시약을 포함하는 소변 시료 중의 정자와 효모상 진균을 구별하여 검출하기 위한 소변 시료 분석용 시약 키트를 제공한다.
본 발명에 의하면, 방부제에 의해 시약의 보존 안정성을 유지할 수 있고, 소변 시료 중의 정자 및 효모상 진균을 변별하여 정밀도 양호하게 검출하는 것을 가능하게 한다.
도 1a는 피리딘계의 방부제를 첨가한 희석용 시약을 이용해 조제한 정자 또는 효모상 진균을 포함하는 측정 시료를 측정했을 때의 형광 강도의 히스토그램이다.
도 1b는 방부제로서 아세트산을 첨가한 희석용 시약을 이용해 조제한 정자 또는 효모상 진균을 포함하는 측정 시료를 측정했을 때의 형광 강도의 히스토그램이다.
도 1c는 트리아진계의 방부제를 첨가한 희석용 시약을 이용해 조제한 정자 또는 효모상 진균을 포함하는 측정 시료를 측정했을 때의 형광 강도의 히스토그램이다.
도 1d는 이소티아졸린계의 방부제를 첨가한 희석용 시약을 이용해 조제한 정자 또는 효모상 진균을 포함하는 측정 시료를 측정했을 때의 형광 강도의 히스토그램이다.
도 2는 방부제로서 아세트산을 첨가한 희석용 시약을 조제한 정자 및 효모상 진균을 포함하는 측정 시료를 측정했을 때의 스캐터그램이다.
도 3은 방부제로서 아세트산을 첨가한 희석용 시약을 조제한 백혈구를 포함하는 측정 시료를 측정했을 때의 스캐터그램이다.
도 4는 방부제로서 아세트산을 첨가한 희석용 시약을 조제한 상피 세포를 포함하는 측정 시료를 측정했을 때의 스캐터그램이다.
도 5는 방부제로서 아세트산을 첨가한 희석용 시약을 조제한 이형(異型) 세포를 포함하는 측정 시료를 측정했을 때의 스캐터그램이다.
도 6은 방부제로서 아세트산을 첨가한 희석용 시약을 조제한 트리코모나스를 포함하는 측정 시료를 측정했을 때의 스캐터그램이다.
도 7은 방부제로서 아세트산을 첨가한 희석용 시약을 조제한 세균을 포함하는 측정 시료를 측정했을 때의 스캐터그램이다.
도 8은 정자, 트리코모나스, 및 효모상 진균의 분포를 나타내는 스캐터그램의 모식도이다.
도 9는 백혈구, 이형 세포, 및 상피 세포의 분포를 나타내는 스캐터그램의 모식도이다.
도 10은 세균의 분포를 나타내는 스캐터그램의 모식도이다.
도 11은 소변 시료 분석용 시약 키트의 일례를 나타내는 도이다.
[소변 시료 분석 방법]
본 실시 형태의 소변 시료 분석 방법(이하, 단순히 「방법」이라고도 함)은 핵산을 가지는 소변 중 유형 성분을 분석 대상으로 하고, 그와 같은 소변 중 유형 성분 중 정자 및 효모상 진균의 분석에 특히 적합하다. 또한 효모상 진균으로서는, 예를 들면 칸디다속의 진균 등을 들 수 있다. 또, 핵산을 가지는 소변 중 유형 성분으로서는 정자 및 효모상 진균 이외에, 백혈구, 상피 세포, 이형 세포, 세균, 진균, 트리코모나스 등을 들 수 있다.
본 실시 형태의 방법에서는 우선 소변 시료와, 핵산을 염색 가능한 형광 색소를 포함하는 제1 시약과, 방부제로서 아세트산 및/또는 그 염을 포함하는 제2 시약을 혼합해 측정 시료를 조제하는 공정이 실시된다.
본 실시 형태에서는 소변 시료는 소변 중 유형 성분을 포함하는 액체 시료이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 피험자로부터 채취한 소변이다. 또한 피험자로부터 채취한 소변을 시료로서 이용하는 경우, 시간 경과에 의해 소변 중 유형 성분이 열화될 우려가 있으므로, 채취 후 24시간 이내, 특히 3~12시간 이내에 소변 시료를 본 실시 형태의 방법에 이용하는 것이 바람직하다.
본 실시 형태의 방법에 이용되는 제1 시약은 적어도 정자 및 효모상 진균을 포함하는 소변 중 유형 성분을 염색하기 위한 시약이며, 제2 시약은 소변 시료를 희석하기 위한 시약이다. 본 실시 형태에서는 소변 시료와, 제1 시약과, 제2 시약을 혼합하는 순서는 특별히 한정되지 않고, 이들을 동시에 혼합할 수도 있다. 제2 시약에 후술하는 계면활성제 및/또는 킬레이트제가 포함되어 있는 경우에는 소변 시료와 제2 시약을 먼저 혼합하고, 여기에 제1 시약을 추가로 혼합하는 것이 바람직하다. 혹은 제1 시약과 제2 시약을 먼저 혼합하고, 여기에 소변 시료를 추가로 혼합해도 된다.
본 실시 형태에서, 소변 시료와, 제1 시약과, 제2 시약의 혼합 비율은 특별히 한정되지 않고, 각 시약에 포함되는 성분 농도에 따라 적절히 결정하면 된다. 예를 들면, 소변 시료와 제1 시약의 혼합 비율은 체적비로 1:0.01~1의 범위로부터 결정할 수 있다. 또, 소변 시료와 제2 시약의 혼합 비율은 체적비로 1:0.5~10의 범위로부터 결정할 수 있다. 또한 소변 시료의 양은 제1 시약과 제2 시약에 따라 적절히 결정하면 된다. 소변 시료의 양은 측정 시간이 너무 길어지지 않게 하는 관점에서 1000μL 이하가 바람직하다. 소변 시료의 양은 10~1000μL 정도로 측정에 충분하다.
조제 공정에서의 온도 조건은 10~60℃, 바람직하게는 37~44℃이다. 각 시약을 미리 이들 온도가 되도록 가온하고 있어도 된다. 또, 소변 시료와, 제1 시약 및/또는 제2 시약을 혼합한 후, 1~5분간, 바람직하게는 3~60초간 인큐베이션해도 된다.
이하에, 본 실시 형태의 방법의 조제 공정에 이용되는 제1 시약 및 제2 시약에 대해 설명한다.
제1 시약은 핵산을 염색 가능한 형광 색소를 포함한다. 본 실시 형태에서, 형광 색소는 핵산을 염색할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 여기광의 파장에 따라 상기 기술에서 공지된 형광 색소 중에서 선택할 수 있다. 그와 같은 형광 색소로서는, 예를 들면 핵산을 특이적으로 염색할 수 있는 인터컬레이터, 및 DNA의 부구(副溝)(minor groove)에 결합하는 색소 등을 들 수 있다. 인터컬레이터로서는, 예를 들면 시아닌계 색소, 아크리딘계 색소, 페난트리디움계 색소 등을 들 수 있다.
보다 구체적으로는 인터컬레이터로서 SYBR Green I, 티아졸 오렌지, 아크리딘 오렌지, 프로피디움아이오다이드, 에티디움브로마이드, 에티디움-아크리딘헤테로다이머, 에티디움디아지드, 에티디움호모다이머-1, 에티디움호모다이머-2, 에티디움모노아지드, 트리메틸렌비스[[3-[[4-[[(3-메틸벤조티아졸-3-이움)-2-일]메틸렌]-1,4-디히드로퀴놀린]-1-일]프로필]디메틸아미니움]·테트라요오도(TOTO-1), 4-[(3-메틸벤조티아졸-2(3H)-일리덴)메틸]-1-[3-(트리메틸아미니오)프로필]퀴놀리늄·디요오드(TO-PRO-1), N,N,N',N'-테트라메틸-N,N'-비스[3-[4-[3-[(3-메틸벤조티아졸-3-이움)-2-일]-2-프로페닐리덴]-1,4-디히드로퀴놀린-1-일]프로필]-1,3-프로판디아미니움·테트라요오도(TOTO-3), 또는 2-[3-[[1-[3-(트리메틸아미니오)프로필]-1,4-디히드로퀴놀린]-4-일리덴]-1-프로페닐]-3-메틸벤조티아졸-3-이움·디요오드(TO-PRO-3) 등을 들 수 있다. 혹은 하기의 식(1)~(3)의 어느 하나로 나타내는 형광 색소를 이용해도 된다.
[화 1]
Figure pct00001
(식 중, A1은 -O-, -S-, -Se- 또는 -C(CH3)2-이며, R1은 저급 알킬기, X는 할로겐 또는 과염소산, Y는 -CH= 또는 -NH-, m은 1 또는 2, n은 0 또는 1, B는 하기 식
[화 2]
Figure pct00002
(식 중, A2는 -O-, -S- 또는 -C(CH3)2-이며, R2는 저급 알킬기 또는 2개의 저급 알콕시기 혹은 1개의 디-저급 알킬아미노기(이 저급 알킬은 시아노기로 치환되어 있어도 된다)로 치환된 페닐기이다))
상기의 식(1)~(3)에서, A1와 A2는 동일해도 되고, 상이해도 된다. 또, R1과 R2는 동일해도 되고, 상이해도 된다.
상기의 저급 알킬기로서는 탄소수 1~6의 알킬기를 의미하고, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸, 헥실 등을 들 수 있다. X의 할로겐 원자로서는 불소, 염소, 브롬, 요오드를 들 수 있다. B에서의 2개의 저급 알콕시기로 치환된 페닐기란, 2개의 탄소수 1~3의 알콕시기, 바람직하게는 탄소수 1 또는 2의 알콕시기, 예를 들면 메톡시기, 에톡시기로 치환된 페닐기를 말한다. 구체적으로는 2,6-디메톡시페닐기, 2,6-디에톡시페닐기를 들 수 있다. 또, B에서의 디-저급 알킬아미노기(상기 저급 알킬기는 시아노기로 치환되어 있어도 된다)로 치환된 페닐기란, 탄소수 1~3의 알킬아미노기, 바람직하게는 탄소수 1 또는 2의 알킬아미노기로 치환된 페닐기를 말한다. 여기서 말하는 알킬기는 시아노기로 치환되어 있어도 되고, 예를 들면 메틸, 에틸, 시아노메틸, 시아노에틸 등을 포함한다. 바람직한 디-저급 알킬아미노기(상기 저급 알킬은 시아노기로 치환되어 있어도 된다)로 치환된 페닐기로서는, 4-디메틸아미노페닐기, 4-디에틸아미노페닐기, 4-(시아노에틸메틸아미노)페닐기 등을 들 수 있다.
DNA의 부구에 결합하는 색소로서는, 예를 들면 Hoechst33342, Hoechst33258 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌·디히드로클로라이드(DAPI)를 들 수 있다.
제1 시약 중의 형광 색소는 1 종류여도 되고, 2 종류 이상이어도 된다. 제1 시약 중의 형광 색소의 농도는 상기와 같이 하여 조제한 측정 시료 중에서, 적어도 정자 및 효모상 진균을 적절히 염색할 수 있는 최종 농도로 상기 형광 색소가 포함되도록 설정하는 것이 바람직하다. 측정 시료 중의 최종 농도는 상기의 형광 색소의 종류에 따라 적절히 설정된다. 예를 들면, 형광 색소로서 티아졸 오렌지를 이용하는 경우, 측정 시료 중의 최종 농도는 0.1μg/mL 이상 200μg/mL 이하, 바람직하게는 0.5μg/mL 이상 50μg/mL 이하이다.
제1 시약은 상기의 형광 색소를 적절한 용매에 용해시킴으로써 얻을 수 있다. 용매는 상기의 형광 색소를 용해시킬 수 있는 수성 용매이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 물, 수용성 유기 용매, 및 이들 혼합물을 들 수 있다. 이들 중에서도, 수용성 유기 용매가 특히 바람직하다. 수용성 유기 용매로서는, 예를 들면 탄소수 1~3의 저급 알코올, 에틸렌글리콜, 디메틸설폭사이드(DMSO) 등을 들 수 있다.
제2 시약은 방부제로서의 아세트산 및/또는 그 염을 적절한 용매에 용해시킴으로써 얻을 수 있다. 소변 시료의 분석용 시약에서는 일반적으로 시약을 안정하게 보존하기 위해서, 방부제가 시약에 첨가된다. 본 발명자는 분석용 시약에 첨가하는 방부제로서 아세트산 및/또는 그 염을 이용함으로써, 효모상 진균의 형태에 변화가 생겨 상기 효모상 진균의 염색성이 바뀌는 것을 억제하고, 정자 및 효모상 진균을 보다 정확하게 검출할 수 있는 것을 알아냈다. 제2 시약의 조제에 이용하는 아세트산은 용액이어도 되고, 고체(빙초산)이어도 된다. 용매가 물이거나 또는 물을 포함하는 경우에는 아세트산을 대신하여, 무수 아세트산을 이용해 제2 시약을 조제해도 된다.
본 실시 형태에서, 아세트산염의 종류는 세균이나 곰팡이 등의 진균에 대한 정균 작용을 가지는 한 특별히 한정되지 않지만, 알칼리 금속 또는 알칼리 토류 금속의 염이 바람직하다. 예를 들면, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 아세트산칼슘, 아세트산마그네슘 등을 들 수 있고, 이들 중에서도 아세트산나트륨이 특히 바람직하다. 또, 아세트산과 아세트산나트륨을 1:1로 혼합해 얻어지는 2아세트산나트륨(CAS No. 126-96-5)을 방부제로서 이용해도 된다. 제2 시약에 포함되는 아세트산염은 1 종류여도 되고, 2 종류 이상이어도 된다.
제2 시약 중의 아세트산 또는 아세트산염의 농도는 방부제로서의 효과가 얻어지는 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 아세트산을 이용하는 경우, 시약 중의 농도는 통상 100ppm 이상 3000ppm 이하, 바람직하게는 200ppm 이상 1000ppm 이하이다. 또한 시약 중의 아세트산 농도는 조제에 이용하는 아세트산의 순도에 근거해 산출할 수 있다.
제2 시약에 이용되는 용매는 아세트산 및/또는 그 염을 용해시킬 수 있으면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 물, 수용성 유기 용매, 및 이들 혼합물을 들 수 있다. 수용성 유기 용매로서는, 예를 들면 탄소수 1~3의 저급 알코올, 에틸렌글리콜, DMSO 등을 들 수 있다. 본 실시 형태에서는 물이 특히 바람직하다.
본 실시 형태에서, 제2 시약은 적혈구를 용혈시키고, 핵산을 가지는 소변 중 유형 성분에 상기 형광 색소를 투과할 수 있는 정도의 손상을 부여하기 위한 계면활성제를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 그와 같은 계면활성제로서는 상기 기술에서 공지된 양이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제로부터 선택할 수 있다. 제2 시약에 포함되는 계면활성제는 1 종류여도 되고, 2 종류 이상이어도 된다. 2 종류 이상의 계면활성제를 포함하는 경우, 그 조합은 양이온성 계면활성제 및/또는 비이온성 계면활성제로부터 임의로 선택할 수 있다.
본 실시 형태에서는 양이온성 계면활성제로서 제4급 암모늄염형 계면활성제 및 피리디늄염형 계면활성제로부터 선택되는 적어도 1종을 이용할 수 있다. 제4급 암모늄염형 계면활성제로서는, 예를 들면 이하의 식(I)로 나타내는 전체 탄소수가 9~30인 계면활성제를 들 수 있다.
[화 3]
Figure pct00003
상기의 식(I) 중, R1은 탄소수 6~18의 알킬기 또는 알케닐기이며; R2 및 R3은 서로 동일 또는 상이하고, 탄소수 1~4의 알킬기 또는 알케닐기이며; R4는 탄소수 1~4의 알킬기 혹은 알케닐기, 또는 벤질기이며; X-는 할로겐 이온이다.
상기의 식(I) 중, R1로서는 탄소수가 6, 8, 10, 12 및 14인 알킬기 또는 알케닐기가 바람직하고, 특히 직쇄의 알킬기가 바람직하다. 보다 구체적인 R1로서는 옥틸기, 데실기 및 도데실기를 들 수 있다. R2 및 R3로서는 메틸기, 에틸기 및 프로필기가 바람직하다. R4로서는 메틸기, 에틸기 및 프로필기가 바람직하다.
피리디늄염형 계면활성제로서는, 예를 들면 이하의 식(Ⅱ)로 나타내는 계면활성제를 들 수 있다.
[화 4]
Figure pct00004
상기의 식(Ⅱ) 중, R1은 탄소수 6~18의 알킬기 또는 알케닐기이며; X-는 할로겐 이온이다.
상기의 식(Ⅱ) 중, R1로서는 탄소수가 6, 8, 10, 12 및 14인 알킬기 또는 알케닐기가 바람직하고, 특히 직쇄의 알킬기가 바람직하다. 보다 구체적인 R1로서는 옥틸기, 데실기 및 도데실기를 들 수 있다.
상기의 양이온성 계면활성제의 구체예로서는 도데실트리메틸암모늄브로마이드, 데실트리메틸암모늄브로마이드, 도데실트리메틸암모늄클로라이드, 옥틸트리메틸암모늄브로마이드, 옥틸트리메틸암모늄클로라이드, 미리스틸트리메틸암모늄브로마이드, 미리스틸트리메틸암모늄클로라이드, 도데실피리디늄클로라이드 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 도데실트리메틸암모늄브로마이드(DTAB)가 특히 바람직하다.
본 실시 형태에서는 비이온성 계면활성제로서 이하의 식(Ⅲ)으로 나타내는 폴리옥시에틸렌계 비이온 계면활성제가 적합하게 이용된다.
[화 5]
Figure pct00005
상기의 식(Ⅲ) 중, R1은 탄소수 8~25의 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기이며; R2는 -O-, -COO- 또는
[화 6]
Figure pct00006
이며; n은 10~50의 정수이다.
상기의 비이온성 계면활성제의 구체예로서는 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌스테롤, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌소르비톨 지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌알킬아민, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르 등을 들 수 있다.
제2 시약 중의 계면활성제의 농도는 상기와 같이 하여 조제한 측정 시료 중에서, 적혈구를 용혈시키고, 핵산을 가지는 소변 중 유형 성분(적어도 정자 및 효모상 진균)에 상기의 형광 색소를 투과할 수 있는 정도의 손상을 부여할 수 있는 최종 농도로 상기 계면활성제가 포함되도록 설정하는 것이 바람직하다. 측정 시료 중의 계면활성제의 최종 농도는 상기의 계면활성제의 종류에 따라 적절히 설정된다. 예를 들면, 계면활성제로서 DTAB를 이용하는 경우, 측정 시료 중의 최종 농도는 100ppm 이상 2500ppm 이하, 바람직하게는 500ppm 이상 2000ppm 이하이다.
본 실시 형태에서는 소변 시료 중의 적혈구를 용혈시키기 쉽게 하기 위해서, 제2 시약의 pH를 3 이상 6 이하, 바람직하게는 5 이상 6 이하로 할 수 있다. 따라서, 제2 시약은 pH를 일정하게 유지하기 위해서 완충제를 포함하고 있어도 된다. 그와 같은 완충제로서는 상기의 pH 범위에서 완충 작용을 가지는 완충제이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 구연산 및 그 염, 및 인산 및 그 염 등의 조합을 들 수 있다. 또한 방부제로서 아세트산과, 아세트산나트륨 혹은 아세트산칼륨과의 조합을 포함하는 경우, 이 조합은 아세트산 완충액으로서 작용하므로, 제2 시약에 완충제를 추가로 첨가할 필요는 특별히 없다.
소변 시료에는 인산암모늄, 인산마그네슘, 탄산칼슘 등의 무정성 염류가 포함되어 있는 경우가 있다. 본 실시 형태에서는 이들 무정성 염류의 영향을 저감시키기 위해서, 제2 시약은 킬레이트제를 포함하고 있어도 된다. 킬레이트제는 무정성 염류를 제거 가능한 킬레이트제이면 특별히 한정되지 않고, 상기 기술에 대해 공지된 탈칼슘제, 탈마그네슘제 등에서 적절히 선택할 수 있다. 구체적으로는 에틸렌디아민4아세트산염(EDTA염), CyDTA, DHEG, DPTA-OH, EDDA, EDDP, GEDTA, HDTA, HIDA, Methyl-EDTA, NTA, NTP, NTPO, EDDPO 등을 들 수 있고, 이들 중에서도 EDTA염이 특히 바람직하다.
제2 시약 중의 킬레이트제의 농도는 상기와 같이 하여 조제한 측정 시료 중에서, 무정성 염류의 영향을 저감할 수 있는 최종 농도로 상기 킬레이트제가 포함되도록 설정하는 것이 바람직하다. 측정 시료 중의 최종 농도는 상기의 킬레이트제의 종류에 따라 적절히 설정된다. 예를 들면, 킬레이트제로서 EDTA2 칼륨(EDTA-2K)을 이용하는 경우, 측정 시료 중의 최종 농도는 100mM 이상 300mM 이하, 바람직하게는 150mM 이상 250mM 이하이다.
소변의 침투압은 50~1300mOsm/kg와 광범위하게 분포하고 있는 것이 알려져 있지만, 측정 시료에서 침투압이 너무 낮거나 또는 너무 높은 경우, 백혈구 등의 세포가 손상될 우려가 있다. 측정 시료에서의 적절한 침투압은 100mOsm/kg 이상 600mOsm/kg 이하, 바람직하게는 150mOsm/kg 이상 500mOsm/kg 이하이다. 소변의 침투압이 너무 높은 경우에는 물 또는 제2 시약으로 희석함으로써 침투압을 적절히 조절할 수 있다. 반대로, 소변의 침투압이 너무 낮은 경우에는 제2 시약은 침투압 보상제를 포함하고 있어도 된다. 그와 같은 침투압 보상제로서는 무기 염류, 유기 염류, 당류 등을 들 수 있다. 무기 염류로서는 염화나트륨, 브롬화나트륨 등을 들 수 있다. 유기 염류로서는 프로피온산나트륨, 프로피온산칼륨, 프로피온산암모늄옥살산염 등을 들 수 있다. 당류로서는 소르비톨, 글루코오스, 만니톨 등을 들 수 있다.
본 실시 형태의 방법에서는 상기의 조제 공정에서 얻어진 측정 시료에 포함되는 소변 중 유형 성분에 광을 조사하여 광학적 정보를 취득하는 공정이 실시된다.
이 취득 공정은 플로우 사이토미터에 의해 실시되는 것이 바람직하다. 플로우 사이토미터에 의한 측정에서는 염색된 소변 중 유형 성분이 플로우 셀을 통과할 때에 상기 유형 성분에 광을 조사함으로써, 상기 유형 성분으로부터 발생되는 시그널로서 광학적 정보를 얻을 수 있다. 그와 같은 광학적 정보로서는 산란광 정보 및 형광 정보가 바람직하다.
산란광 정보는 일반적으로 시판되는 플로우 사이토미터로 측정할 수 있는 산란광의 정보이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 전방 산란광(예를 들면, 수광 각도 0~20도 부근)이나 측방 산란광(수광 각도 90도 부근) 등의 산란광의 강도 및 파형 정보 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 산란광 정보로서 산란광 강도, 산란광 펄스 폭 및 산란광 적분값 등을 들 수 있다. 상기 기술에서는 측방 산란광은 세포의 핵이나 과립 등의 내부 정보를 반영하고, 전방 산란광은 세포의 크기의 정보를 반영하는 것이 알려져 있다. 본 실시 형태에서는 전방 산란광의 정보를 이용하는 것이 바람직하다.
형광 정보는 적당한 파장의 여기광을 염색된 소변 중 유형 성분에 조사하여, 여기된 형광을 측정해 얻어지는 정보이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 형광의 강도 및 파형 정보를 들 수 있다. 보다 구체적으로는 형광 정보로서 형광 강도, 형광 펄스 폭 및 형광 적분값 등을 들 수 있다. 또한 형광은 제1 시약에 포함되는 형광 색소에 의해서 염색된 유형 성분 내의 핵산 등에서 발생된다. 또, 수광 파장은 제1 시약에 포함되는 형광 색소에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 실시 형태에서는 플로우 사이토미터의 광원은 특별히 한정되지 않고, 형광 색소의 여기에 적합한 파장의 광원을 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면, 적색 반도체 레이저, 청색 반도체 레이저, 아르곤 레이저, He-Ne 레이저, 수은 아크 램프 등이 사용된다. 특히 반도체 레이저는 기체 레이저에 비해 매우 염가이므로 적합하다.
본 실시 형태의 방법에서는 상기의 취득 공정에서 얻어진 광학적 정보에 근거하여 소변 중 유형 성분으로서 적어도 정자 및 효모상 진균을 검출하는 공정이 실시된다. 또한 「검출」에는 측정 시료 중에 소변 중 유형 성분의 존재를 알아내는 것만이 아니라, 소변 중 유형 성분을 분류 및 계수하는 것도 포함된다.
본 실시 형태에서, 소변 중 유형 성분의 검출은 산란광 정보와 형광 정보를 2축으로 하는 스캐터그램을 작성하고, 얻어진 스캐터그램을 적당한 해석 소프트를 이용해 해석함으로써 실시되는 것이 바람직하다. 예를 들면, X축을 형광 강도로 하고, Y축을 전방 산란광 강도로서 스캐터그램을 그린 경우, 각 소변 중 유형 성분의 입자 사이즈 및 염색성(핵산 함유량)에 따라 각각의 집단(클러스터)이 스캐터그램 상에 출현한다. 본 실시 형태의 방법에서는 적어도 정자 및 효모상 진균을, 각각 상이한 영역에 출현하는 2 종류의 집단으로서 검출할 수 있다.
또한 본 실시 형태에서는 정자 및 효모상 진균에 더하여 트리코모나스, 백혈구, 상피 세포, 이형 세포 및 세균을 각각 상이한 영역에 출현하는 집단으로서 검출할 수 있다.
정자, 트리코모나스, 및 효모상 진균은 백혈구, 상피 세포, 및 이형 세포보다도 핵산량이 적고, 백혈구, 상피 세포, 및 이형 세포보다도 염색 색소에 대한 염색성이 낮다. 따라서, 정자, 트리코모나스, 및 효모상 진균과, 백혈구, 상피 세포, 및 이형 세포는 형광 강도에 근거하여 분류할 수 있다. 세균은 정자, 트리코모나스, 효모상 진균, 백혈구, 상피 세포, 및 이형 세포에 비해 매우 사이즈가 작고, 또 핵산량도 적기 때문에, 정자, 트리코모나스, 효모상 진균, 백혈구, 상피 세포, 및 이형 세포보다도 염색 색소에 대한 염색성이 낮다. 따라서, 세균과, 정자, 트리코모나스, 효모상 진균, 백혈구, 상피 세포, 및 이형 세포는 형광 강도에 근거해 분류할 수 있다.
도 8은 정자, 트리코모나스, 및 효모상 진균의 분포를 나타내는 스캐터그램의 모식도이다. 도 8에 나타내는 영역 R41에 포함되는 입자가 정자로서 검출되고, 그 수가 계수된다. 또, 도 8에 나타내는 영역 R42에 포함되는 입자가 효모상 진균으로서 검출되고, 그 수가 계수된다. 추가로, 도 8에 나타내는 영역 R43에 포함되는 입자가 트리코모나스로서 검출되고, 그 수가 계수된다.
정자와 효모상 진균은 형광 강도의 분포 영역이 상이하다. 이것은 정자의 핵산량이 효모상 진균의 핵산량보다도 많기 때문이다. 또, 정자 및 진균과, 트리코모나스는 전방 산란광 강도의 분포 영역이 상이하다. 이것은 트리코모나스가 정자 및 진균보다도 사이즈가 크기 때문이다. 따라서, 정자, 트리코모나스, 및 효모상 진균은 형광 강도 및 전방 산란광 강도에 근거해 분류할 수 있다.
도 9는 백혈구, 이형 세포, 및 상피 세포의 분포를 나타내는 스캐터그램의 모식도이다. 도 9에 나타내는 영역 R31에 포함되는 입자가 이형 세포로서 검출되고, 그 수가 계수된다. 또, 도 9에 나타내는 영역 R32에 포함되는 입자가 백혈구로서 검출되고, 그 수가 계수된다. 추가로, 도 9에 나타내는 영역 R33에 포함되는 입자가 상피 세포로서 검출되고, 그 수가 계수된다.
백혈구 및 상피 세포와, 이형 세포는 형광 강도의 분포 영역이 상이하다. 이것은 백혈구와 상피 세포는 핵산량에 대체로 차이가 없고, 이형 세포 쪽이 백혈구 및 상피 세포보다도 핵산량이 많고, 형광 강도는 핵산량을 반영하고 있기 때문이다. 또, 백혈구와 상피 세포는 전방 산란광 강도의 분포 영역이 상이하다. 이것은 상피 세포는 백혈구보다도 사이즈가 크고, 전방 산란광 강도는 입자의 크기를 반영하고 있기 때문이다. 따라서, 백혈구, 상피 세포, 및 이형 세포는 형광 강도 및 전방 산란광 강도에 근거해 분류할 수 있다.
도 10은 세균의 분포를 나타내는 스캐터그램의 모식도이다. 도 10에 나타내는 영역 R5에 포함되는 입자가 세균으로서 검출되고, 그 수가 계수된다.
또, 해석 소프트에 의해서, 스캐터그램 상에서 각 집단을 둘러싸는 윈도우를 마련하고, 각 윈도우 중의 입자 수를 계수할 수 있다.
[소변 시료 분석용 시약 키트]
본 실시 형태의 소변 시료 분석용 시약 키트(이하, 단순히 「시약 키트」라고도 함)은 소변 시료 중의 정자와 효모상 진균을 구별하여 검출하기 위한 시약 키트이다. 이 시약 키트는 핵산을 염색 가능한 형광 색소를 포함하는 제1 시약과, 방부제로서 아세트산 및/또는 그 염, 및 적혈구를 용혈시키고, 핵산을 가지는 소변 중 유형 성분에 상기 형광 색소를 투과할 수 있는 정도의 손상을 부여하기 위한 계면활성제를 포함하는 제2 시약을 포함한다.
시약 키트에 포함되는 제1 시약에 대해서는 본 실시 형태의 소변 시료 분석 방법에 이용한 제1 시약에 대해 서술한 것과 동일하다.
시약 키트에 포함되는 제2 시약에 대해서는 방부제로서의 아세트산 및/또는 그 염, 및 계면활성제를 포함하는 것을 제외하고, 본 실시 형태의 소변 시료 분석 방법에 이용한 제2 시약에 대해 서술한 것과 동일하다. 또한 시약 키트에 이용되는 방부제로서의 아세트산 및/또는 그 염, 및 계면활성제에 대해서도, 본 실시 형태의 소변 시료 분석 방법의 설명에서 서술한 것과 동일하다.
본 실시 형태에서는 제1 시약과 제2 시약을 다른 용기에 수용하고, 이들을 구비한 2 시약형의 시약 키트로 하는 것이 바람직하다. 도 11에 용기에 수용된 제1 시약(11) 및 용기에 수용된 제2 시약(22)을 포함하는 본 실시 형태의 시약 키트의 일례를 나타낸다.
본 발명의 범위에는 소변 시료 중의 정자와 효모상 진균을 구별하여 검출하기 위한, 핵산을 염색 가능한 형광 색소를 포함하는 제1 시약과, 방부제로서 아세트산 및/또는 그 염, 및 적혈구를 용혈시키고, 핵산을 가지는 소변 중 유형 성분에 상기 형광 색소를 투과할 수 있는 정도의 손상을 부여하기 위한 계면활성제를 포함하는 제2 시약을 포함하는 시약 키트의 사용도 포함된다.
이하에, 본 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
실시예 1에서는 플로우 사이토미터에 의한 정자와 효모상 진균의 변별에 적합한 방부제를 검토하기 위해서, 각종 방부제를 포함하는 분석용 시약을 이용해 변별 성능을 비교했다. 또한 변별 성능은 정자를 포함하는 시료에 대한 평균 측정값과, 효모상 진균을 포함하는 시료에 대한 평균 측정값의 차이에 근거해 평가했다.
(1) 시료
·정자를 포함하는 시료
정상 자원봉사자로부터 채취한 정자(200μL)를 생리식염수(50mL)에 현탁하여 정자를 포함하는 시료를 조제했다.
·효모상 진균을 포함하는 시료
배양한 칸디다·알비칸스(C. albicans: ATCC로부터 입수)를 1.0×106 cells/mL의 농도가 되도록 생리식염수에 현탁하여 효모상 진균을 포함하는 시료를 조제했다.
(2) 시약
·염색용 시약
핵산을 염색 가능한 형광 색소로서 NK-9536(티아졸 오렌지: 하야시바라 생물화학 연구소)를, 0.20 mg/mL의 농도가 되도록 에틸렌글리콜(나카라이테스크 주식회사)에 용해하여 염색용 시약을 조제했다.
·희석용 시약
희석용 시약으로서 하기의 조성의 희석액 A~D를 조제했다. 희석액 A~D는 각각 방부제로서 피리딘계의 머티리얼 TKMA, 아세트산, 트리아진계의 모르논 650 및 이소티아졸린계의 프록셀 GXL를 포함한다. 또한 희석액 A~D에는 역침투막으로 여과한 물을 용매로서 이용했다. 또, 희석액 B의 조제에 이용한 아세트산의 순도는 99%이다.
희석액 A(pH 5.6): DTAB(1250ppm)(도쿄카세이 공업 주식회사), EDTA-2K(25mM)(츄부키레스토 주식회사) 및 머티리얼 TKMA(1000ppm: 에이피아이코포레이션사)
희석액 B(pH 5.6): DTAB(1250ppm), EDTA-2K(25mM) 및 아세트산(1000ppm)(와코준야쿠 공업 주식회사)
희석액 C(pH 5.6): DTAB(1250ppm), EDTA-2K(25mM) 및 모르논 650(1000ppm)(카타야마 화학 주식회사)
희석액 D(pH 5.6): DTAB(1250ppm), EDTA-2K(25mM) 및 프록셀 GXL(1000ppm)(아치·케미컬즈사)
·시스액
시스액으로서 UF-F시스(시스멕스 주식회사)를 이용했다.
(3) 측정 및 결과
시료의 측정은 플로우 사이토미터 UF-1000i(시스멕스 주식회사 제)를 이용해서 실시했다. 이 플로우 사이토미터에 의한 측정의 구체적인 공정은 다음과 같다. 우선 시료(200μL)와, 미리 42℃로 가온한 희석액(580μL)을 혼합하여 42℃에서 7초간 반응시켰다. 그 다음에, 얻어진 혼합액과, 염색용 시약(20μL)을 혼합하여 42℃에서 3초간 반응시켜 측정 시료를 조제했다. 그리고, 얻어진 측정 시료에 광을 조사하여 형광 강도를 취득했다. 또한 플로우 사이토미터의 광원으로서 여기 파장 488nm의 반도체 레이저를 이용했다. 얻어진 결과를 도 1a~d에 나타낸다.
도 1a~d로부터, 정자를 포함하는 시료에 대해서는 어느 방부제를 이용한 경우에도, 형광 강도의 평균값 및 히스토그램에 큰 차이는 확인되지 않았다. 효모상 진균을 포함하는 시료에 대해서는 아세트산 이외의 방부제를 이용한 경우, 형광 강도의 평균값은 정자를 포함하는 시료에 대한 평균값에 가까웠다(도 1a, c 및 d 참조). 한편, 방부제로서 아세트산을 이용한 경우, 다른 방부제를 이용한 경우에 비해, 효모상 진균을 포함하는 시료에 대한 형광 강도의 평균값이 낮았다(도 1b 참조). 따라서, 정자를 포함하는 시료에 대한 평균 측정값과, 효모상 진균을 포함하는 시료에 대한 평균 측정값의 차이는 아세트산을 이용한 경우 쪽이, 아세트산 이외의 방부제를 이용한 경우에 비해 현저하게 큰 것을 알 수 있었다. 이들 결과로부터, 아세트산을 방부제로서 포함하는 희석액을 이용한 경우, 종래 관용되고 있는 시판의 방부제를 포함하는 희석액을 이용한 경우보다도, 정자와 효모상 진균의 변별 성능이 높아지는 것으로 나타났다.
실시예 2
실시예 2에서는 염색용 시약과, 방부제로서 아세트산을 포함하는 희석용 시약을 이용하고, 정자 및 효모상 진균을 포함하는 시료를 플로우 사이토미터에 의해 측정해 변별 성능을 평가했다. 또한 변별 성능은 취득한 형광 강도 및 산란광 강도로부터 작성한 스캐터그램에 근거해 평가했다.
(1) 시료
·정자 및 효모상 진균을 포함하는 시료
정상 자원봉사자로부터 채취한 정자(200μL)를 생리식염수(50mL)에 현탁하여 정자를 포함하는 현탁액을 조제했다. 이 현탁액에 배양한 칸디다·알비칸스를 5.0×105 cells/mL의 농도가 되도록 현탁하여 정자 및 효모상 진균을 포함하는 시료를 조제했다.
·백혈구를 포함하는 시료
백혈구를 생리식염수에 현탁하여 백혈구를 포함하는 시료를 조제했다.
·상피 세포를 포함하는 시료
상피 세포를 생리식염수에 현탁하여 상피 세포를 포함하는 시료를 조제했다.
·이형 세포를 포함하는 시료
이형 세포를 생리식염수에 현탁하여 이형 세포를 포함하는 시료를 조제했다.
·트리코모나스를 포함하는 시료
트리코모나스를 생리식염수에 현탁하여 트리코모나스를 포함하는 시료를 조제했다.
·세균을 포함하는 시료
세균을 생리식염수에 현탁하여 세균을 포함하는 시료를 조제했다.
(2) 시약
염색용 시약으로서 실시예 1과 동일한 염색용 시약을 이용했다. 희석용 시약으로서 실시예 1과 동일한 희석액 B를 이용했다. 시스액으로서 실시예 1과 동일한 UF-F시스(시스멕스 주식회사)를 이용했다.
(3) 측정 및 결과
시료의 측정은 플로우 사이토미터 UF-1000i(시스멕스 주식회사 제)를 이용해서 실시했다. 또한 측정 시료는 실시예 1과 동일하게 하여 조제했다. 그리고, 얻어진 측정 시료에 광을 조사하여 형광 강도 및 전방 산란광 강도를 취득했다. 또한 플로우 사이토미터의 광원으로서 여기 파장 488nm의 반도체 레이저를 이용했다. 이들 측정값에 근거해 스캐터그램을 작성했다. 결과를 도 2~7에 나타낸다. 또한 도 2~7에서, X축(가로축)은 형광 강도를 나타내고, Y축(세로축)은 전방 산란광 강도를 나타낸다. 도 2로부터, 방부제로서 아세트산을 포함하는 희석용 시약을 이용함으로써, 형광 강도 및 전방 산란광 강도에 근거하는 스캐터그램에서, 효모상 진균의 영역(R1)과 정자의 영역(R2)으로 분획할 수 있는 것으로 나타났다. 동일하게 도 3~7에 의해, 방부제로서 아세트산을 포함하는 희석용 시약을 이용함으로써, 형광 강도 및 전방 산란광 강도에 근거하는 스캐터그램에서, 백혈구, 상피 세포, 이형 세포, 트리코모나스, 및 세균을 검출할 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 3
본 실시예에서는 여러 가지 세균에 대한 아세트산의 항균력을 평가했다. 또, 컨트롤로서 생리식염수를 이용했다. 또한 항균력은 고형 배지 위의 세균의 콜로니 수에 근거해 평가했다.
(1) 사용한 세균
·대장균(E. coli: ATCC로부터 입수)
·황색 포도상구균(S. aureus: ATCC로부터 입수)
·녹농균(P. aeruginosa: ATCC로부터 입수)
(2) 시약
·아세트산 수용액(1000ppm)
·생리식염수
(3) 항균력의 평가
아세트산 수용액 및 생리식염수 각각에 각종 세균을 1×105 cells/mL의 농도가 되도록 첨가하여 세균 현탁액을 얻었다. 얻어진 세균 현탁액으로부터 100μL씩 취하고, 이들을 배양 0일째의 샘플로 했다. 나머지의 세균 현탁액을 대장균 및 포도상구균은 37℃, 녹농균은 25℃에서 7일간 배양하고, 배양 후의 현탁액으로부터 100μL씩 취하여, 이들을 배양 7일째의 샘플로 했다. 각 샘플 100μL를 하트 인퓨전 한천 배지에 도말하고, 각각의 배양 온도에서 배양했다. 또한 배양 시간은 대장균에 대해서는 20시간, 황색 포도상구균에 대해서는 24시간, 녹농균에 대해서는 48시간이었다. 배양 후, 한천 배지상의 콜로니 수를 카운트하여 균 수(CFU/mL)를 산출했다. 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00007
표 1로부터, 1000ppm의 아세트산 수용액 중에서는 7일간 배양해도, 대장균, 황색 포도상구균 및 녹농균 모두 번식할 수 없는 것으로 나타났다. 따라서, 희석용 시약을 위한 방부제로서 아세트산을 이용함으로써, 이들 세균에 대한 충분한 방부 효과가 얻어지는 것으로 나타났다.
본 출원은 2014년 2월 28일에 출원된 일본 특허 출원 특원 2014-39283호에 관한 것이고, 이들 특허 청구의 범위, 명세서, 도면 및 요약서 모두는 본 명세서 중에 참조로서 포함된다.
11 제1 시약
22 제2 시약

Claims (16)

  1. 소변 시료와, 핵산을 염색 가능한 형광 색소를 포함하는 제1 시약과, 방부제로서 아세트산 및/또는 그 염을 포함하는 제2 시약을 혼합해 측정 시료를 조제하는 공정과,
    조제 공정에서 얻어진 측정 시료에 포함되는 소변 중 유형 성분에 광을 조사하여 광학적 정보를 취득하는 공정과,
    취득 공정에서 얻어진 광학적 정보에 근거하여 소변 중 유형 성분으로서 적어도 정자 및 효모상 진균을 검출하는 공정
    을 포함하는 소변 시료 분석 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 광학적 정보가 산란광 정보 및 형광 정보인 소변 시료 분석 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    제2 시약이 적혈구를 용혈시키고, 핵산을 가지는 소변 중 유형 성분에 상기 형광 색소를 투과할 수 있는 정도의 손상을 부여하기 위한 계면활성제를 추가로 포함하는 소변 시료 분석 방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    계면활성제가 양이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제로부터 선택되는 적어도 1개인 소변 시료 분석 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    양이온성 계면활성제가 4급 암모늄염형 계면활성제 및 피리디늄염형 계면활성제로부터 선택되고, 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면활성제로부터 선택되는 소변 시료 분석 방법.
  6. 청구항 4에 있어서,
    양이온성 계면활성제가 도데실트리메틸암모늄브로마이드인 소변 시료 분석 방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    제2 시약의 pH가 3 이상 6 이하인 소변 시료 분석 방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    제2 시약이 킬레이트제를 추가로 포함하는 소변 시료 분석 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    킬레이트제가 에틸렌디아민4아세트산염(EDTA염)인 소변 시료 분석 방법.
  10. 핵산을 염색 가능한 형광 색소를 포함하는 제1 시약과,
    방부제로서 아세트산 및/또는 그 염, 및 적혈구를 용혈시키고, 핵산을 가지는 소변 중 유형 성분에 상기 형광 색소를 투과할 수 있는 정도의 손상을 부여하기 위한 계면활성제를 포함하는 제2 시약을 포함하는, 소변 시료 중의 정자와 효모상 진균을 구별하여 검출하기 위한 소변 시료 분석용 시약 키트.
  11. 청구항 10에 있어서,
    계면활성제가 양이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제로부터 선택되는 적어도 1개인 소변 시료 분석용 시약 키트.
  12. 청구항 11에 있어서,
    양이온성 계면활성제가 4급 암모늄염형 계면활성제 및 피리디늄염형 계면활성제이며, 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면활성제인 소변 시료 분석용 시약 키트.
  13. 청구항 11에 있어서,
    양이온성 계면활성제가 도데실트리메틸암모늄브로마이드인 소변 시료 분석용 시약 키트.
  14. 청구항 10에 있어서,
    제2 시약의 pH가 3 이상 6 이하인 소변 시료 분석용 시약 키트.
  15. 청구항 10에 있어서,
    제2 시약이 킬레이트제를 추가로 포함하는 소변 시료 분석용 시약 키트.
  16. 청구항 15에 있어서,
    킬레이트제가 에틸렌디아민4아세트산염(EDTA염)인 소변 시료 분석용 시약 키트.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7005176B2 (ja) 2017-05-31 2022-01-21 シスメックス株式会社 試料調製装置、試料調製システム、試料調製方法及び粒子分析装置
US20190316171A1 (en) * 2018-03-22 2019-10-17 Idexx Laboratories, Inc. Methods for measuring bacteria in biological samples
GB2576331B8 (en) * 2018-08-14 2021-04-07 Apacor Ltd Fixative solution and method of preparation of biological sample for examination
CN109612807A (zh) * 2018-12-29 2019-04-12 湖北伽诺美生物科技有限公司 一种尿液有形成分染色液

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08240520A (ja) * 1995-03-06 1996-09-17 Toa Medical Electronics Co Ltd 尿中赤血球の鑑別装置
JPH09329596A (ja) * 1996-05-23 1997-12-22 Toa Medical Electronics Co Ltd 尿中の有形成分分析方法および試薬
JP2000221190A (ja) * 1999-02-01 2000-08-11 Eiken Chem Co Ltd 尿中蛋白の安定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫学的測定方法
JP2001255260A (ja) * 2000-03-07 2001-09-21 Toyobo Co Ltd 尿中有形成分分類装置
JP2006149384A (ja) * 2004-11-05 2006-06-15 Sanei Gen Ffi Inc 加工食品の製造方法
WO2006135854A2 (en) * 2005-06-10 2006-12-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Antiseptic compositions
JP2007255954A (ja) 2006-03-22 2007-10-04 Sysmex Corp 尿試料分析用試薬及び尿試料の分析方法
JP2012132850A (ja) * 2010-12-22 2012-07-12 Sysmex Corp 尿分析装置、尿検体情報処理装置および尿検体情報処理方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1172185B (it) * 1981-12-21 1987-06-18 Serono Ist Farm Composizione particolarmente per la vande vaginali
JP3070968B2 (ja) * 1991-05-14 2000-07-31 シスメックス株式会社 尿中の細胞分析用試薬及び方法
JPH0815256A (ja) * 1994-06-28 1996-01-19 Hitachi Ltd フロ−式粒子画像解析装置
JPH0843385A (ja) * 1994-07-27 1996-02-16 Nissho Corp 液状検査用試薬
JP2007010685A (ja) * 1996-11-05 2007-01-18 Toyobo Co Ltd 有形成分分析装置及び有形成分分析方法
CN2676190Y (zh) * 2004-02-16 2005-02-02 复旦大学附属华山医院 一种尿沉渣染色定量计数装置
JP4918281B2 (ja) * 2006-05-18 2012-04-18 シスメックス株式会社 尿中有形成分分析装置
JP4796443B2 (ja) * 2006-06-08 2011-10-19 シスメックス株式会社 試料分析用試薬、試料分析用試薬キット及び試料分析方法
CN101196513A (zh) * 2007-12-28 2008-06-11 姜傥 尿液综合检测方法
JP5420203B2 (ja) * 2008-06-30 2014-02-19 シスメックス株式会社 試料分析装置、粒子分布図表示方法、及びコンピュータプログラム
JP4907705B2 (ja) * 2009-09-29 2012-04-04 シスメックス株式会社 尿中赤血球分析用試薬
WO2012086426A1 (ja) * 2010-12-22 2012-06-28 シスメックス株式会社 尿分析装置、尿検体情報処理装置および尿検体情報の処理方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08240520A (ja) * 1995-03-06 1996-09-17 Toa Medical Electronics Co Ltd 尿中赤血球の鑑別装置
JPH09329596A (ja) * 1996-05-23 1997-12-22 Toa Medical Electronics Co Ltd 尿中の有形成分分析方法および試薬
JP2000221190A (ja) * 1999-02-01 2000-08-11 Eiken Chem Co Ltd 尿中蛋白の安定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫学的測定方法
JP2001255260A (ja) * 2000-03-07 2001-09-21 Toyobo Co Ltd 尿中有形成分分類装置
JP2006149384A (ja) * 2004-11-05 2006-06-15 Sanei Gen Ffi Inc 加工食品の製造方法
WO2006135854A2 (en) * 2005-06-10 2006-12-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Antiseptic compositions
JP2007255954A (ja) 2006-03-22 2007-10-04 Sysmex Corp 尿試料分析用試薬及び尿試料の分析方法
JP2012132850A (ja) * 2010-12-22 2012-07-12 Sysmex Corp 尿分析装置、尿検体情報処理装置および尿検体情報処理方法

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