JPH09329596A - 尿中の有形成分分析方法および試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 フローサイトメトリによる尿中の有形成分の
分析において、互いに弁別の困難な成分の分析方法を提
供する。 【解決手段】 尿試料と、蛍光染料、緩衝剤及び浸透圧
補償剤とを含む染色液、および細胞膜損傷剤を混合した
のち、フローサイトメトリにより分折する尿中有形成分
の分析方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、フローサイトメト
リを応用した尿中の有形成分の分折方法および分析試薬
に関する。

【０００２】

【従来の技術】腎・尿路系の感染症、炎症性病変、変性
病変、結石症、腫瘍などの疾患では、それぞれの疾患に
応じて、尿中に種々の有形成分が出現する。有形成分と
しては、赤血球、白血球、上皮細胞、円柱、細菌、真
菌、結晶などが挙げられる。尿中のこれらの成分を分析
することは、腎・尿路系の疾患の早期発見や異常部位の
推定をする上で特に重要である。例えば、赤血球の測定
は、腎臓の糸球体から尿道に至る経路における出血の有
無を判定する上で重要であり、白血球の出現は、腎孟腎
炎などの腎疾患や尿路系の細菌汚染の疑いが考えられ、
炎症、感染症を早期発見することができる。また、円柱
や赤血球形態を調べることにより、その由来部位を推定
できる。

【０００３】従来より尿中の有形成分の分析は、顕微鏡
による目視検査が広く行われている。まず、尿を遠心分
離して濃縮し、その沈渣物を顕微鏡スライド上に滴下
し、染色後顕微鏡下で分類・計数を行うものである。

【０００４】また近年では、フラットシースフローと画
像処理技術とを組み合わせた自動測定装置が開発されて
いる。これは、シース液を外層とし、極めて偏平な流れ
にされた尿試料液をビデオカメラで撮像し、この静止画
像を面像処理することにより、試料液中の有形成分の像
を切り出して表示するものである。その表示を検査技師
が見ながら有形成分を判別し、分類処理が行われる。

【０００５】一方、細胞を分析する方法としては、フロ
ーサイトメータによる分析が知られている。これは、試
料中の細胞を染色液で染色し、フローセル中に一個ずつ
流して励起光を照射し、染色された細胞から発せられる
蛍光強度や散乱光強度を測定するもので、短時間に多く
の細胞を処理することができる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ところで尿検体は、採
取後時間が経過するとともに有形成分の変性、細菌数の
増加などの変化が起きるため、採取後なるべく早いうち
に検査することが望まれる。

【０００７】顕微鏡による目視検査では、尿検体の遠
心、濃縮等の前処理に手間や時間がかかる上、鏡検作業
は検査技師にとって大きな負担になる。また、観察細胞
数が少ないため検査精度が低い。一方、画像処理技術を
利用した自動測定装置においては、鏡検作業に比べれば
負担が軽減される点では有利であるものの、有形成分の
判別は検査技師が行わなければならず、処理速度も遅い
ため検体数の多い場合には必ずしも満足できるものでは
ない。また、目視検査においても画像処理による自動測
定装置においても、有形成分の判別には熟練を要する。

【０００８】フローサイトメトリーを尿分折に応用した
方法では、迅速に測定が行える点で有利であるが、白血
球と小型上皮細胞（例えば尿細管上皮細胞等）が同時に
出現するような検体では、それらの蛍光強度や散乱光強
度が互いに類似しているため、これらのパラメータのみ
では弁別が困難である。白血球の出現は、主に腎・尿路
系の感染症を反映し、―方小型上皮細胞の出現は、腎・
尿路系の結石や悪性腫瘍等を示唆し臨床的意義は全く異
なる。従って、これらを弁別することは臨床上重要であ
る。

【０００９】また、尿中にシュウ酸カルシウム結晶が出
現すると赤血球との弁別が困難になる。例えば、通常尿
中に出現する結晶成分は、酸、アルカリやキレート剤等
の添加や加熱処理等によって溶解させることができる
が、シュウ酸カルシウム結晶のうち大きなものは、これ
らの処理によっては短時間では溶解しない。このような
場合、蛍光色素で染色しフローサイトメータで測定する
と、赤血球の出現領域とオーバラップしてしまう場合が
あり、明瞭に区別することは困難になる。

【００１０】さらには、赤血球と酵母様真菌が同時に出
現するような検体においては、変形赤血球と酵母様真菌
の出現領域がオーバラップすることがあり、それらを互
いに弁別するのが困難な場合がある。

【００１１】本発明は、上記の問題点に鑑みなされたも
ので、フローサイトメトリによる尿中の有形成分の分析
において、互いに弁別の困難な成分の分析方法、ならび
にこのような分析に使用する分析試薬を提供することを
目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、尿試料を染色
してフローサイトメータを用いて分析するにあたり、尿
試料と、 １）蛍光染料、緩衝剤及び浸透圧補償剤とを含む染色
液、および ２）細胞膜損傷剤とを混合したのち、分析することを特
徴とする。

【００１３】細胞膜損傷剤としては、酸、アルカリ、水
溶性界面活性剤、水溶性有機溶剤、１００ｍＯｓｍ／ｋ
ｇ以下の低浸透圧水溶液などが挙げられるが、好適には
水溶性界面活性剤が用いられる。例えば、カチオン性界
面活性剤、ノニオン性界面活性剤、両性界面活性剤が用
いられる。

【００１４】カチオン性界面活性剤としては、四級アン
モニウム塩型またはピリジニウム塩型のもので、以下の
構造を有するものが好適に用いられる。

【００１５】

【化１】 （式中Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は同一又は異なって、Ｈ原子、
Ｃ_1-8のアルキル基又はＣ_6-8のアラルキル基；Ｒ₄はＣ
_8-18のアルキル基、Ｃ_8-18のアルケニル基又はＣ_{6- 18}の
アラルキル基；Ｒ₅はＣ_8-18のアルキル基；Ｘはアニオ
ン） このうち、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃におけるＣ_1-8のアルキル
基又はＣ_6-8のアラルキル基としては、オクチル、ヘプ
チル、ヘキシル、ベンジルなどを挙げることができる
が、メチル、エチルなどのＣ_1-3のアルキル基が好まし
い。また、Ｒ₄におけるＣ_8-18のアルキル基、Ｃ_8-18の
アルケニル基又はＣ_6-18のアラルキル基としては、オク
チル、ベンジルなどを挙げることができるが、例えば、
デシル、ドデシル、テトラデシルなどのＣ_10-18の直鎖
のアルキル基が好ましい。また、Ｒ₅におけるＣ_8-18の
アルキル基としては、デシル、ドデシル、テトラデシル
などのＣ_10-18の直鎖のアルキル基が好ましい。これら
カチオン性界面活性剤の具体例としては、例えば、ラウ
リルトリメチルアンモニウムクロライド、ミリスチルト
リメチルアンモニウムクロライド、セチルトリメチルア
ンモニウムクロライド、セチルピリジニウムクロライ
ド、セチルジメチルエチルアンモニウムクロライド、ベ
ンジルジメチルセチルアンモニウムクロライドなどが挙
げられる。

【００１６】ノニオン性界面活性剤としては、以下の構
造を有するポリオキシエチレングリコール系のものが好
適に用いられる。

【００１７】

【化２】 具体的には、ポリオキシエチレングリコールノニルフェ
ニルエーテル２０モル付加物、ポリオキシエチレングリ
コールオレイルエーテル２０モル付加物などが挙げられ
る。

【００１８】両性界面活性剤としては、以下の構造を有
するアルキルベタイン系のものが好適に用いられる。

【００１９】

【化３】 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₄は上記の定義と同じ；ｎは１
又は２） 両性界面活性剤の具体例には、例えば、ラウリルジメチ
ルアミノ酢酸ベタイン、ステアリルジメチルアミノ酢酸
ベタインなどが挙げられる。

【００２０】水溶性界面活性剤の濃度は、尿中白血球の
蛍光強度を変化させるのに十分な、または尿中赤血球中
のヘモグロビンが流出するのに十分な濃度であり、希釈
した尿試料中で約５０〜５０００ｍｇ／ｌ、好ましくは
約１００〜２５００ｍｇ／１、より好ましくは約１７０
〜１６００ｍｇ／１で用いられる。濃度が高すぎると、
白血球が完全に破壊され計数できなくなるので好ましく
ない。

【００２１】これらの水溶性界面活性剤は、血液中の赤
血球の溶解剤として公知であるが、尿中に出現する細胞
への作用については知られていない。通常、溶解剤を用
いて細胞を前処理する場合、溶解剤の細胞への作用は、
共存する物質（タンパクや糖等）の影響を受けるが、血
液と尿では、細胞一個当たりの共存物質量は尿の方が多
い。また、ｐＨや浸透圧も血液とは一般には異なる。従
って、同じ白血球に対してであっても、血液中と尿中で
は細胞膜損傷剤の作用も異なってくる。

【００２２】本発明で使用される細胞膜損傷剤は、染色
前あるいは染色後に使用される。好ましくは、染色前に
使用される。または、染色液の一成分として予め存在さ
せておいてもよい。白血球と小型上皮細胞とを弁別する
場合、または赤血球と酵母様真菌とを弁別する場合に
は、染色液の一成分として予め存在させておいてもよ
い。赤血球とシュウ酸カルシウム結晶と弁別する場合に
は、細胞膜損傷剤と染色液とは別の試薬とするのが好ま
しい。

【００２３】本発明で使用される染色液は、蛍光染料、
ｐＨ緩衝剤、および浸透圧補償剤を含み、その例として
は、特開平４―３３７４５９号に記載の試薬、又は特願
平７―２６７４５４号に記載されたような試薬、つまり
（i）ｐＨ５．０〜９．０に保つための緩衝剤、（ii）
浸透圧を１００ｍ０ｓｍ／ｋｇ〜６００ｍ０ｓｍ／ｋｇ
に保つための浸透圧補償剤、（iii）細胞膜を染色しう
る染料、（iv）損傷を受けた細胞を染色しうる染料及び
（v）キレート剤を含む試薬が挙げられる。または、（i
ii）及び（iv）の染料のかわりに赤色波長で励起可能な
染料を用いることもできる。

【００２４】染色液に含まれる緩衝剤は測定試料のｐＨ
を一定に保つために用いられる。緩衝剤としては公知の
ものを使用することができ、例えばトリス、ＭＥＳ、Ｈ
ＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅなどのグッド緩衝剤を挙げる
ことができる。ＨＥＰＥＳが好ましい。濃度は、用いる
緩衝剤の緩衝能に応じて、尿検体を希釈したときにｐＨ
が一定範囲内（ｐＨ５．０〜９．０）になる濃度で用い
られる。通常は２０〜５００ｍＭ、好ましくは５０〜２
００ｍＭである。

【００２５】蛍光染料としては、上述したように細胞膜
を染色しうる染料と、損傷を受けた細胞を染色しうる染
料とを組み合わせて使用することが好ましく、このよう
な場合には励起光源として青色波長を有する光を用いる
ことができる。

【００２６】細胞膜を染色する染料としては、例えば、
縮合ベンゼン誘導体、特にオキサカルボシアニン系色素
であるＤｉＯＣｎ（３）（ｎ＝１〜６）を用いることが
好ましく、ＤｉＯＣ６（３）がより好ましい。これらの
染料は例えばＮＫ−シリーズとして日本感光色素研究所
（株）より入手できる。その他の好ましい縮合ベンゼン
誘導体には、ＮＫ−９１、ＮＫ−５２８、ＮＫ−９７、
Ｂａｓｉｃ Ｙｅｌｌｏｗ １１、Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ
１４を含む。細胞膜を染色する染料の濃度は、最終濃
度（測定試料中の濃度）が１〜３０ｐｐｍとなる範囲で
用いられ、５〜２０ｐｐｍが好適である。

【００２７】また、損傷を受けた細胞を染色しうる染料
としては、例えば、ＥＢ（エチジウムブロマイド）また
はＰＩ（プロピジウムアイオダイド）を用いることがで
きる。濃度は、最終濃度が１〜１００ｐｐｍとなる範囲
で用いられ、３０〜６０ｐｐｍが好適である。

【００２８】本発明では、上記２種の染料を組み合わせ
て用い、青色波長を有する光で励起する代わりに、赤色
波長で励起可能な染料を用いることもできる。このよう
な染料として、以下の化合物からなる群のうち、１種ま
たは２種以上を組み合わせて用いることができる：ＮＫ
−３２１、ＮＫ−１５９０、ＮＫ−５２９、ＮＫ−２７
８０、ＮＫ−２７８２、Ｏｘａｚｉｎｅ ４、ＮＫ−１
３８、Ｂａｓｉｃ Ｇｒｅｅｎ、Ｃａｐｒｉ Ｂｌｕｅ
ＧＯＮ、Ｂａｓｉｃ Ｇｒｅｅｎ ４、ＮＫ−２７８
３、Ｂａｓｉｃ Ｂｌｕｅ １、ＮＫ−３７５、Ｏｘａ
ｚｉｎｅ ７５０ ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ、ＮＫ−１
９５４、Ｂａｓｉｃ Ｂｌｕｅ ２０、Ｂａｓｉｃ Ｂ
ｌｕｅ ２４、Ｏｘａｚｉｎｅ ７２０、ＮＫ−１８３
６、ＮＫ−１３６、Ｎｉｌｅ Ｂｌｕｅ Ｃｈｌｏｒｉ
ｄｅ、ＮＫ−１５１１、ＮＫ−３７６、ＮＫ−２７１
１、Ｉｏｄｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、ＮＫ−９６、Ｒｈｏｄ
ｎｉｌｅ Ｂｌｕｅ、Ｃａｐｒｉ Ｂｌｕｅ ＢＢ、Ｂ
ａｓｉｃ Ｂｌｕｅ １２４、およびＢａｓｉｃ Ｂｌ
ｕｅ １。赤色波長で励起可能な染料の濃度は、最終濃
度が１〜３００ｐｐｍの範囲で用いられ、５〜１００ｐ
ｐｍが好適である。

【００２９】浸透圧補償剤は、浸透圧を１００〜６００
ｍ０ｓｍ／ｋｇ、より好ましくは１５０〜５００ｍＯｓ
ｍ／ｋｇに保つものを使用することができる。浸透圧補
償剤としては、無機塩類やプロピオン酸塩などの有機塩
類、糖類などが用いられる。無機塩類としては、塩化ナ
トリウム、塩化カリウム、塩化リチウムなど、プロピオ
ン酸塩としては、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン
酸カリウム、プロピオン酸アンモニウムなど、その他の
有機塩類としては、シュウ酸塩、酢酸塩など、糖類とし
ては、ソルビトール、グルコース、マンニトールなどが
挙げられる。

【００３０】染色液は１液構成とすることもできるし、
あるいは染料を含む液と、ｐＨ緩衝剤と浸透圧補償剤を
含む希釈液との２液で構成することもできる。２液構成
とする場合には、染料は水溶液中で不安定なものが多い
ため、染色液として染料を水溶性有機溶媒に溶解させる
ことで保存安定性を高めることができる。さらに、染色
液には安定化剤を加えてもよい。この場合の使用可能な
水溶性有機溶媒としては、低級アルカノール、低級アル
キレングリコールまたは低級アルキレングリコールモノ
低級アルキルエーテルが好ましい。例えば、メタノー
ル、エタノール、ｎ−プロパノール、エチレングリコー
ル、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、
エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリ
コールモノエチルエーテルなどを使用することができ
る。中でもエチレングリコール、ジエチレングリコー
ル、トリエチレングリコールが好ましく、特にエチレン
グリコールが好ましい。

【００３１】本発明の方法によれば、尿試料は測定前に
細胞膜損傷剤で処理され、染色される。このとき、処理
される尿試料の希釈倍率は、分析精度を考慮すると最終
の希釈倍率で２〜２０倍が好ましく、より好ましくは４
〜１０倍である。尿試料の染色及び細胞膜損傷剤による
処理は、室温から４０℃までの範囲で、好ましくは３３
〜３７℃で、５〜１２０秒間、好ましくは１０〜６０秒
間行うことが好ましい。希釈・染色された尿試料をフロ
ーセル中に流して励起光を照射し、染色された細胞から
発せられる蛍光強度や散乱光強度（前方又は側方）を測
定する。励起光の波長は、使用する蛍光染料に応じて決
定すればよいが、特開平４―３３７４５９号に記載の試
薬及び上述の（iii）、（iv）の染料を組み合わせて使
用する場合は青色波長（４８８ｎｍ付近）を、赤色励起
可能な染料を使用する場合は赤色波長（６３０ｎｍ付
近）を使用する。

【００３２】本発明の方法を用いる尿試料の測定に好適
に用いられるフローサイトメータの一例を図１に示す。
まず、弁１および２を所定時間開けることにより、廃液
チャンバからの陰圧により吸引ノズル３から試料液が弁
１および２に満たされる。シリンジ４が一定流量で液を
押し出すことにより、試料用ノズル６から試料液が吐出
されると同時に、弁８を開けることによりフローセル５
のチャンバ７にシース液が供給される。これによって試
料は図１に示されるように、チャンバ７の内径にしたが
って細く絞られシースフローを形成し、オリフィス１１
を通過する。オリフィス１１の形状は内径の一辺が１０
０〜３００μｍの角柱形状をし、材質は光学硝子（石英
硝子を含む）でできている。このようにシースフローを
形成することによって粒子を１個ずつオリフィス１１の
中心を一列に整列して流すことができる。オリフィス１
１を通過した試料液とシース液とはチャンバ２５に設け
た回収管１４を通って排出される。

【００３３】電極１３はチャンバ２５の内部に設けられ
た白金製でプラス電極とし、電極１２はチャンバ７の内
部に設けられたステンレス製でマイナス電極としてい
る。この電極１２および１３間の電気抵抗は、シース液
の抵抗率（電気伝導度）、オリフィスの孔寸法（孔断面
積）と孔長、試料液の抵抗率、試料液の流れている時の
径によって決まる。

【００３４】電源１５は直流定電流源で電極１２および
１３間に供給している。電極１２および１３間に定電流
を流すことにより、電極１２および１３間の電気抵抗と
電流値により決まる直流電圧が発生する。粒子がオリフ
ィス１１を通過すると、オリフィス１１の両端の電気抵
抗が変化する。よって、粒子がオリフィス１１を通過し
ている間のみ電極１２および１３間に発生する電圧が大
きくなる。しかも、オリフィス１１を通過する粒子の大
きさに比例して、パルス状の電圧が発生するため、この
分の電圧のみ大きくなり、この電圧が前記直流電圧に重
畳され、電極１２および１３間に洗われる。従って、こ
れをアンプ１６で検出することにより、抵抗信号２９が
出力されることになる。

【００３５】オリフィス１１のほぼ中心のサンプル流２
６へレーザ１７から発振したレーザ光がコンデンサレン
ズ１８で楕円状に絞られて照射される。レーザ光の形状
は試料の流れの方向には血球粒子径と同程度、例えば１
０μｍ前後と狭く、試料の流れ方向および照射光軸方向
と直交する方向の形状は、血球粒子径より十分広く、例
えば１５０〜３００μｍ程度である。サンプル流２６に
照射されたレーザ光で細胞（有形物）に当たらずそのま
まフローセル５を通過した透過光はビームストッパ１９
で遮光される。細胞（有形物）に照射され、狭い角度で
発せられる前方散乱光および前方蛍光はコレクターレン
ズ２０により集光され、遮光板３０のピンホール２１を
通過する。そして、ダイクロイックミラー２２に到達す
る。散乱光より長波長の蛍光はそのまま高率でダイクロ
イックミラー２２を透過し、フィルター２３でさらに散
乱光が除かれた後にフォトマルチプライヤーチューブ
（ＰＭＴ）２４で検出され、電気信号２７に変換されて
出力される。散乱光はダイクロイックミラー２２で反射
され、フォトダイオード３１で受光されて電気信号２８
に変換されて出力される。

【００３６】本発明の方法によると、細胞膜損傷剤によ
リダメージを受けた白血球は強く染色され、蛍光強度が
強くなり、散乱光強度が小さくなる。一方、小型上皮細
胞は、細胞膜損傷剤の影響をほとんど受けず、蛍光強度
及び散乱光強度はあまり変化しない。従って、白血球と
小型上皮細胞とを弁別することができるようになる。

【００３７】赤血球は、細胞膜損傷剤により溶解する
が、結晶や酵母様真菌は溶解せずに残る。また、細胞膜
損傷剤で処理せずに測定したものも測定しておき、これ
ら２つのスキャッタグラム比較すれば、赤血球と結晶あ
るいは酵母様真菌とを弁別できる。

【００３８】

【発明の効果】本発明によれば、これまで弁別すること
が困難であった細胞を弁別することができる。また、本
発明では尿試料と染色液および細胞膜損傷剤を混合して
短時間で測定できるために、有形成分の変性や細菌数の
増加などの変化が少なく精度よく測定できる。また、フ
ローサイトメトリによる多数の検体の迅速な測定が可能
となる。

【００３９】

【実施例】本発明の尿中の有形成分分析方法を以下の実
施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲は
これに限定されない。

【００４０】以下の処方により細胞膜損傷剤、染色液お
よび希釈液を調製し、これを以下の実施例に用いた。

【００４１】細胞膜損傷剤 界面活性剤 ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 3.14g/ｌ 塩化ナトリウム 1.78g/ｌ 精製水 1ｌ

【００４２】染色液 細胞膜染色染料 1,1-ジヘキシル-2,2-オキサカルボシアニン 400ppm 損傷細胞染色染料 エチジウムブロマイド 1600ppm 上記染料をエチレングリコールに溶解 1ｌ

【００４３】希釈液 緩衝剤 ＨＥＰＥＳ 50mM 水酸化ナトリム pH7.0になる量 浸透圧補償剤 塩化ナトリム 210mOsm/kgになる量 キレート剤 ＥＤＴＡ―３Ｋ 4.0g/ｌ 精製水 1ｌ

【００４４】実施例１ 原尿として、白血球出現検体、小型上皮細胞（尿細管上
皮細胞）出現検体及び両検体を混合したものを用いて測
定を行った。

【００４５】原尿４００μｌに細胞膜損傷剤２６０μｌ
加えて室温で３０秒反応させたのち、希釈液９００μｌ
及び染色液４０μｌを加え（最終希釈倍率４倍）、３５
℃、１０秒間インキュベーションした後、アルゴンレー
ザを光源とするフローサイトメータで前方蛍光強度及び
前方散乱光強度を測定した。

【００４６】また、原尿４００μｌに希釈液１１６０μ
ｌ及び染色液４０μｌを加え、同じ条件でインキュベー
ションしたものを対照とした。

【００４７】得られたスキャッタグラムを図２のＡ〜Ｆ
に示す。

【００４８】図に示したように、細胞膜損傷剤で処理し
ない場合は、白血球と小型上皮細胞はほぼ同じ位置に出
現し両者を弁別することはできない（図２Ａは白血球出
現検体、図２Ｃは小型上皮細胞出現検体、図２Ｅは両者
を混合した場合）。細胞膜損傷剤で処理することによっ
て、白血球の散乱光強度と蛍光強度が変化する（図２
Ｂ）一方、小型上皮細胞は変化しない（図２Ｄ）ので、
両者を弁別することが可能になる（図２Ｆ）。

【００４９】実施例２ 原尿として、赤血球、シュウ酸カルシウム結晶及び白血
球が同時に出現した検体を用いて測定を行った。

【００５０】原尿１ｍｌに対し、細胞膜損傷剤を５０μ
ｌを加え、室温で５０秒間反応させた。反応させた試料
４００μ１に希釈液１１６０μｌ及び染色液４０μｌを
加え、３５℃、１０秒間インキュベーションしたのち、
アルゴンレーザを光源とするフローサイトメータで前方
蛍光強度及び前方散乱光強度を測定した。

【００５１】また、原尿４００μｌに希釈液１１６０μ
ｌ及び染色液４０μｌを加え、同じ条件でインキュベー
ションしたものを対照とした。

【００５２】得られたスキャッタグラムを図３のＡ〜Ｄ
に示す。

【００５３】白血球は、強い蛍光を発するので、細胞膜
損傷剤を加えなくても、赤血球やシュウ酸カルシウム結
晶とは弁別することができる（図３Ａ）。しかし、赤血
球とシュウ酸カルシウム結晶とは、たとえ蛍光強度の感
度を高くしても互いに弁別することは困難である（図３
Ｂ）。細胞膜損傷剤を加えることによって、赤血球は溶
解し、シュウ酸カルシウム結晶のみが残る。この試料を
フローサイトメータで測定すると、スキャッタグラム上
には、赤血球の集団は消失し、シュウ酸カルシウム結晶
の集団のみが残る（図３Ｄ）。細胞膜損傷剤を添加しな
い場合のスキャッタグラムとを比較すれば、赤血球とシ
ュウ酸カルシウム結晶とを区別し、それぞれの正確な計
数をすることができる。

【００５４】実施例３ 原尿として、赤血球と酵母様真菌が同時に出現した検体
を用い、上記実施例２と同様にして測定を行った。

【００５５】得られたスキャッタグラムを図４Ａ〜Ｄに
示す。

【００５６】細胞膜損傷剤未添加の場合は、変形赤血球
と酵母様真菌との区別は困難である（図４Ａ、Ｂ）が、
細胞膜損傷剤を添加することにより、赤血球集団は消失
し、酵母様真菌のみが残る（図４Ｃ、Ｄ）。これら２つ
のスキャッタグラムを比較することにより、変形赤血球
と酵母様真菌とを区別し、それぞれの計数をすることが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法を用いて尿中の有形成分を測定す
る場合に好適に用いられるフローサイトメータを示す概
略模式図である。

【図２】Ａ．白血球出現検体を細胞膜損傷剤で処理せず
に測定したときのスキャッタグラムである。なお、Ａ〜
Ｆの縦軸は前方散乱光を、横軸は蛍光強度を示す。 Ｂ．白血球出現検体を細胞膜損傷剤で処理して測定した
ときのスキャッタグラムである。 Ｃ．小型上皮細胞（尿細管上皮細胞）出現検体を細胞膜
損傷剤で処理せずに測定したときのスキャッタグラムで
ある。 Ｄ．小型上皮細胞（尿細管上皮細胞）出現検体を細胞膜
損傷剤で処理して測定したときのスキャッタグラムであ
る。 Ｅ．白血球出現検体と小型上皮細胞（尿細管上皮細胞）
出現横休とを混合し、細胞膜損傷剤で処理せずに測定し
たときのスキャッタグラムである。 Ｆ．白血球出現検体と小型上皮細胞（尿細管上皮細胞）
出現検体とを混合し、細胞膜損傷剤で処理して測定した
ときスキャッタグラムである。

【図３】Ａ．検体を細胞膜損傷剤で処理せずに測定した
ときのスキャッタグラムである。縦軸は前方散乱光を、
横軸は低感度の蛍光強度を示す。 Ｂ．検体を細胞膜損傷剤で処理せずに測定したときのス
キャッタグラムである。縦軸は前方散乱光を、横軸は高
感度の蛍光強度を示す。 Ｄ．検体を細胞膜損傷剤で処理して測定したときのスキ
ャッタグラムである。縦軸は前方散乱光を、横軸は高感
度の蛍光強度を示す。

【図４】Ａ．検体を細胞膜損傷剤で処理せずに測定した
ときのスキャッタグラムである。縦軸は前方散乱光を、
横軸は低感度の蛍光強度を示す。 Ｂ．検体を細胞膜損傷剤で処理せずに測定したときのス
キャッタグラムである。縦軸は前方散乱光を、横軸は高
感度の蛍光強度を示す。 Ｃ．検体を細胞膜損傷剤で処理して測定したときのスキ
ャッタグラムである。縦軸は前方散乱光を、横軸は低感
度の蛍光強度を示す。 Ｄ．検体を細胞膜損傷剤で処理して測定したときのスキ
ャッタグラムである。縦軸は前方散乱光を、横軸は高感
度の蛍光強度を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成８年８月８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法を用いて尿中の有形成分を測定す
る場合に好適に用いられるフローサイトメータを示す概
略模式図である。

【図２】Ａ．白血球出現検体を細胞膜損傷剤で処理せず
に測定したときのスキャッタグラムである。なお、Ａ〜
Ｆの縦軸は前方散乱光を、横軸は蛍光強度を示す。 Ｂ．白血球出現検体を細胞膜損傷剤で処理して測定した
ときのスキャッタグラムである。 Ｃ．小型上皮細胞（尿細管上皮細胞）出現検体を細胞膜
損傷剤で処理せずに測定したときのスキャッタグラムで
ある。 Ｄ．小型上皮細胞（尿細管上皮細胞）出現検体を細胞膜
損傷剤で処理して測定したときのスキャッタグラムであ
る。 Ｅ．白血球出現検体と小型上皮細胞（尿細管上皮細胞）
出現横休とを混合し、細胞膜損傷剤で処理せずに測定し
たときのスキャッタグラムである。 Ｆ．白血球出現検体と小型上皮細胞（尿細管上皮細胞）
出現検体とを混合し、細胞膜損傷剤で処理して測定した
ときスキャッタグラムである。

【図３】Ａ．検体を細胞膜損傷剤で処理せずに測定した
ときのスキャッタグラムである。縦軸は前方散乱光を、
横軸は低感度の蛍光強度を示す。 Ｂ．検体を細胞膜損傷剤で処理せずに測定したときのス
キャッタグラムである。縦軸は前方散乱光を、横軸は高
感度の蛍光強度を示す。 Ｃ．検体を細胞膜損傷剤で処理して測定したときのスキ
ャッタグラムである。縦軸は前方散乱光を、横軸は高感
度の蛍光強度を示す。

【図４】Ａ．検体を細胞膜損傷剤で処理せずに測定した
ときのスキャッタグラムである。縦軸は前方散乱光を、
横軸は低感度の蛍光強度を示す。 Ｂ．検体を細胞膜損傷剤で処理せずに測定したときのス
キャッタグラムである。縦軸は前方散乱光を、横軸は高
感度の蛍光強度を示す。 Ｃ．検体を細胞膜損傷剤で処理して測定したときのスキ
ャッタグラムである。縦軸は前方散乱光を、横軸は低感
度の蛍光強度を示す。 Ｄ．検体を細胞膜損傷剤で処理して測定したときのスキ
ャッタグラムである。縦軸は前方散乱光を、横軸は高感
度の蛍光強度を示す。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【手続補正書】

【提出日】平成８年８月９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５２】得られたスキャッタグラムを図３のＡ〜Ｃ
に示す。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５３】白血球は、強い蛍光を発するので、細胞膜
損傷剤を加えなくても、赤血球やシュウ酸カルシウム結
晶とは弁別することができる（図３Ａ）。しかし、赤血
球とシュウ酸カルシウム結晶とは、たとえ蛍光強度の感
度を高くしても互いに弁別することは困難である（図３
Ｂ）。細胞膜損傷剤を加えることによって、赤血球は溶
解し、シュウ酸カルシウム結晶のみが残る。この試料を
フローサイトメータで測定すると、スキャッタグラム上
には、赤血球の集団は消失し、シュウ酸カルシウム結晶
の集団のみが残る（図３Ｃ）。細胞膜損傷剤を添加しな
い場合のスキャッタグラムとを比較すれば、赤血球とシ
ュウ酸カルシウム結晶とを区別し、それぞれの正確な計
数をすることができる。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 尿試料と、 １）蛍光染料、緩衝剤及び浸透圧補償剤とを含む染色
   液、および ２）細胞膜損傷剤とを混合したのち、フローサイトメト
   リにより分折することを特徴とする尿中有形成分の分析
   方法。
2. 【請求項２】 細胞膜損傷剤が界面活性剤である請求項
   １記載の尿中有形成分の分析方法。
3. 【請求項３】 尿中有形成分が、白血球及び小型上皮細
   胞である請求項１又は２記載の尿中有形成分の分析方
   法。
4. 【請求項４】 尿中有形成分が、赤血球、結晶、酵母様
   真菌である請求項１又は２記載の尿中有形成分の分析方
   法。
5. 【請求項５】 以下の成分： １）蛍光染料、 ２）緩衝剤、 ３）浸透圧補償剤、および ４）細胞膜損傷剤、を含むフローサイトメトリ用尿中有
   形成分分析試薬。