CN114459982B - 一种基于流式细胞术原理的尿液有形成分分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化学分析技术领域，具体涉及一种基于流式细胞术原理的尿液有形成分分析方法，向反应杯中加入占总体积60％‑80％的稀释液和占总体积1.5％‑2.5％的第一荧光染色剂和占总体积1.5％‑2.5％第二荧光染色剂，搅拌均匀得到检测液；将占总体积10％‑25％的样本加入检测液中进行孵育，得到孵育液；基于流式细胞术原理，使用流式细胞仪对孵育液进行测试，得到测试数据，通过第一荧光染色剂和第二荧光染色剂对对细胞的不同组分进行荧光染色，经过流式细胞仪的激光激发后同时产生两种荧光，解决了现有的分析方法对细胞的同种组分进行染色，使得荧光信号较少，不利于对细胞粒子的形态和结果进行分析的问题。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析技术领域，尤其涉及一种基于流式细胞术原理的尿液有形成分分析方法。
背景技术
当人体的泌尿系统受到感染、功能衰退、癌变或者结石等疾病时，尿液中就会出现一些有形成分，如红细胞、白细胞、结晶、管型、细菌、真菌等，通过分析这些有形成分的种类、数量和形态，对于早期发现泌尿系统的疾病以及推断发生异常的部位有非常重要的作用
目前，现有的美国专利(US9329133)公开了一种基于流式细胞学原理的方法，主要是通过使用两种稀释液，在两个反应池中，分别对尿液中的有行成分进行处理，然后分别进行荧光染色，染色后的粒子在通过鞘流器时被激光照射，产生不同的光信号，相关的检验设备对信号进行采集分析和统计计算，对检测结果进行分析。
采用上述方式，仅能对细胞的同种组分进行染色，使得荧光信号较少，不利于对细胞粒子的形态和结果进行分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于流式细胞术原理的尿液有形成分分析方法，旨在解决现有的分析方法对细胞的同种组分进行染色，使得荧光信号较少，不利于对细胞粒子的形态和结果进行分析的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于流式细胞术原理的尿液有形成分分析方法，包括以下步骤：
向反应杯中加入占总体积60％-80％的稀释液和占总体积1.5％-2.5％的第一荧光染色剂和占总体积1.5％-2.5％第二荧光染色剂，搅拌均匀得到检测液；
将占总体积10％-25％的尿液样本加入所述检测液中进行孵育，得到孵育液；
基于流式细胞术原理，使用流式细胞仪对所述孵育液进行测试，得到测试数据。
其中，所述稀释液包括缓冲剂、渗透压维持剂、络合剂、表面活性剂和抑菌剂；
所述缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷-盐酸、2-吗啉乙磺酸、氢氧化钠、双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷、哌嗪-N,N'-二(2-乙磺酸)、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、3-吗啉丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和3-(羟乙基哌嗪)-2-羟基丙磺酸中的一种或多种；
所述渗透压维持剂为氯化钠、氯化钾和硫酸钠中的任意一种或者两种组合；
所述表面活性剂为吐温20和吐温80中的任意一种；
所述抑菌剂为叠氮钠和ProClin300中的任意一种。
其中，所述流式细胞仪选用单激光器激发的流式细胞仪。
其中，所述第一染色剂为DiI、DiD、DiR和DiOCn(n)中的任意一种；
所述第二染色剂为PI、DAPI、7-氨基放线菌素D和LDS751中的任意一种。
其中，所述流式细胞仪选用双激光器激发的流式细胞仪。
其中，所述第一染色剂为SYBR GreenI、吖啶橙、Hoechst 33342、Hoechst33258、EB和HI中的任意一种；
所述第二染色剂为DIL和DIR中的任意一种。
其中，所述将占总体积10％-25％的尿液样本加入所述检测液中进行孵育，得到孵育液的具体方式为：
所述将占总体积10％-25％的尿液样本加入所述检测液中，在常温下孵育30-40秒，或温度环境为在37℃下孵育20秒，得到孵育液。
本发明的一种基于流式细胞术原理的尿液有形成分分析方法，通过向反应杯中加入占总体积60％-80％的稀释液和占总体积3％-5％的第一荧光染色剂和第二荧光染色剂，搅拌均匀得到检测液；将占总体积10％-25％的尿液样本加入所述检测液中进行孵育，得到孵育液；基于流式细胞术原理，使用流式细胞仪对所述孵育液进行测试，得到测试数据；对所述测试数据进行分析，得到分析结果，通过第一荧光染色剂和第二荧光染色剂对对细胞的不同组分进行荧光染色，经过流式细胞仪的激光激发后同时产生两种荧光，解决了现有的分析方法对细胞的同种组分进行染色，使得荧光信号较少，不利于对细胞粒子的形态和结果进行分析的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的一种基于流式细胞术原理的尿液有形成分分析方法的第一实施例图。
图2是DiOCn(n)系列化合物的结构通式图。
图3是细胞检测示例中的试验1通过第二实施例的得出的测试结果的散点示意图。
图4是细胞检测示例中的试验1通过第三实施例的得出的测试结果的散点示意图。
图5是细胞检测示例中的试验2通过第二实施例的得出的测试结果的散点示意图。
图6是细胞检测示例中的试验3通过第二实施例的得出的测试结果的散点示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
请参阅图1至图6，本发明提供一种基于流式细胞术原理的尿液有形成分分析方法，包括以下步骤：
S101向反应杯中加入占总体积60％-80％的稀释液和占总体积1.5％-2.5％的第一荧光染色剂和占总体积1.5％-2.5％第二荧光染色剂，搅拌均匀得到检测液；
具体的，所述稀释液包括缓冲剂、渗透压维持剂、络合剂、表面活性剂和抑菌剂；
所述缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷-盐酸、2-吗啉乙磺酸、氢氧化钠、双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷、哌嗪-N,N'-二(2-乙磺酸)、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、3-吗啉丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和3-(羟乙基哌嗪)-2-羟基丙磺酸中的一种或多种；其中，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)是优选的。
所述渗透压维持剂为氯化钠、氯化钾和硫酸钠中的任意一种或两种组合；
所述表面活性剂为吐温20和吐温80中的任意一种；
所述抑菌剂为叠氮钠和ProClin300中的任意一种。
所述缓冲剂浓度为10至400mM，优选60至150mM，用于将尿液的所述尿液样本的pH值调节至pH6.0至7.5的范围内，以防止红细胞溶血，稳定所述尿液样本的荧光强度，所述渗透压维维持剂用于保证细胞的渗透压在合理的范围内，通常为150-500oSMO/kg，所述络合剂用于将尿液中含有的结晶成分中，特别是无定形盐以及一些其他的金属离子溶解，所述表面活性剂用于促进所述第一荧光染色剂和所述第二荧光染色剂与细胞的结构组分进行结合，所述抑菌剂用于抑制细菌的滋生，避免滋生的细菌影响检测结果。
S102将占总体积10％-25％的尿液样本加入所述检测液中进行孵育，得到孵育液；
具体的，所述将占总体积10％-25％的尿液样本加入所述检测液中，在常温下孵育30-40秒，或温度环境为在37℃下孵育20秒，得到孵育液
S103基于流式细胞术原理，使用流式细胞仪对所述孵育液进行测试，得到测试数据。
具体的，在所述流式细胞仪的分析软件上可以通过设门不断的优化细胞的识别和分类，最终根据细胞的特性得到各种类的数量。
实施例2：
实施例2和实施例1的区别仅在于：
在步骤S103中，所述流式细胞仪选用单激光器激发的流式细胞仪。
在步骤S101中，所述第一染色剂为染色细胞膜部分的吲哚菁染料，具体为DiI(1,1'-二十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚菁高氯酸盐)、DiD(1,1'-双十八烷基-3,3,3'，3'-tetramethylindodicarbocyanine)、DiR(1,1'-二十八烷基四甲基吲哚菁碘化物)和DiOCn(n)系列化合物中的任意一种，优选的所述第一染色剂是DiOC18(3)3,3-二丙基氧杂羰基菁碘化物，DiOCn(n)系列化合物的结构通式请参阅图2，图中R为直链烷烃基团，根据碳原子的数量来确定n值的大小，其中n为2-18；
所述第二染色剂为主染细胞核酸部分的染色剂，要求发射波长大于第一种染色剂，且两者之间尽可能少的重合，具体为PI、DAPI、7-氨基放线菌素D和LDS751中的任意一种。
实施例3：
实施例3和实施例1的区别仅在于：
在步骤S103中，所述流式细胞仪选用双激光器激发的流式细胞仪。
在步骤S101中，所述第一染色剂为染色细胞核酸的荧光染料，具体为SYBRGreenI、吖啶橙、Hoechst 33342、Hoechst 33258、EB和HI中的任意一种，优选Hoechst33342；
所述第二染色剂为染色细胞膜部分的荧光染剂，可以包括花青类染色剂，具体为DIL和DIR中的任意一种，优选DIL，即DiIC18(3)。
以上两种实施例的所述第一染色剂和所述第二染色剂在使用前，需前通过溶剂配置成10-300ppm的溶液后使用，所述溶剂为水、甲醇、乙醇、丙酮、乙二醇、丙二醇和DMSO中的任意一种，优选DMSO。
实验：
(1)所述稀释液：
所述缓冲剂：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，浓度为5-100mM/L和氢氧化钠(NaOH)，浓度为10-60mM/L；
络合剂：EDTA-2Na，浓度为30-80mM/L；
所述渗透压维持剂：氯化钠(NaCl)，浓度为20-80mM/L；
所述表面活性剂：吐温80，浓度为0.01-0.1％；
所述抑菌剂：Proclin 300，浓度为0.005-0.01％；
配置好的所述稀释液的pH值为7.0，渗透压应为150-300mOsm/kg之间。
(2)所述染色液(包括所述第一染色液和所述第二染色液)：
实施例1中：
所述第一染色液：DiOC18(3)，浓度为0.03％，所述溶剂为DMSO；
所述第二染色液：LDS751，浓度为0.008％，所述溶剂为DMSO；
实施例2中：
所述第一染色液：Hoechst 33342，浓度为0.009％，所述溶剂为DMSO；
所述第二染色液：DIL，浓度为0.01％，所述溶剂为DMSO。
(3)细胞检测示例：
有益效果：
1、基于流式细胞术原理，检测的样本量更大，可以实现5-8ul的标本检测量，比常规的图像法检测量2uL更多，检测结果更稳定可靠；
2、采用单所述反应杯反应，无需为了实现检测更多的项目而进行样品分杯检测；
3、同一个细胞有两种荧光特性，更有利于对于尿液中的细胞分类识别。
4、通过两种荧光的检测，对于同一个细胞来说可以获得更多的参数，在所述流式细胞仪上。
以上所揭露的仅为本发明一种基于流式细胞术原理的尿液有形成分分析方法较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。
Claims (3)
1.一种基于流式细胞术原理的尿液有形成分分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
向反应杯中加入占总体积60％-80％的稀释液和占总体积1.5％-2.5％的第一荧光染色剂和占总体积1.5％-2.5％第二荧光染色剂，搅拌均匀得到检测液；
将占总体积10％-25％的尿液样本加入所述检测液中进行孵育，得到孵育液；
基于流式细胞术原理，使用流式细胞仪对所述孵育液进行测试，得到测试数据；
所述流式细胞仪选用单激光器激发的流式细胞仪，所述第一荧光染色剂为染色细胞膜部分的吲哚菁染料，所述第二荧光染色剂为主染细胞核酸部分的染色剂，
所述第一荧光染色剂为DiI、DiD、DiR和DiOCn(n)中的任意一种，
所述第二荧光染色剂为PI、DAPI、7-氨基放线菌素D和LDS751中的任意一种；
所述流式细胞仪选用双激光器激发的流式细胞仪，所述第一荧光染色剂为染色细胞核酸的荧光染料，所述第二荧光染色剂为染色细胞膜部分的荧光染剂，
所述第一荧光染色剂为SYBR GreenI、吖啶橙、Hoechst 33342、Hoechst33258、EB和HI中的任意一种，
所述第二荧光染色剂为DIL和DIR中的任意一种。
2.如权利要求1所述的基于流式细胞术原理的尿液有形成分分析方法，其特征在于，
所述稀释液包括缓冲剂、渗透压维持剂、络合剂、表面活性剂和抑菌剂；
所述缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷-盐酸、2-吗啉乙磺酸、氢氧化钠、双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷、哌嗪-N,N'-二(2-乙磺酸)、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、3-吗啉丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和3-(羟乙基哌嗪)-2-羟基丙磺酸中的一种或多种；
所述渗透压维持剂为氯化钠、氯化钾和硫酸钠中的任意一种或者两种组合；
所述表面活性剂为吐温20和吐温80中的任意一种；
所述抑菌剂为叠氮钠和ProClin300中的任意一种。
3.如权利要求1所述的基于流式细胞术原理的尿液有形成分分析方法，其特征在于，
所述将占总体积10％-25％的尿液样本加入所述检测液中进行孵育，得到孵育液的具体方式为：
所述将占总体积10％-25％的尿液样本加入所述检测液中，在常温下孵育30-40秒，或温度环境为在37℃下孵育20秒，得到孵育液。
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