CN115014908A - 染色剂、心脏切片制备方法及微血管灌注染色评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种染色剂、心脏切片制备方法及微血管灌注染色评价方法，该混合染色剂用于微血管灌注染色，所述混合染色剂包括DiIC12与DiIC18，所述混合染色剂中，DiIC12与DiIC18的浓度配置比例为90～60:10～40，实验表明一定比例的混合染色剂可以有效地解决DiIC18在冠脉微循环灌注染色中溶解性差、染色不均匀的问题，不影响心肌细胞及微血管的生物形态和结构。
Description
技术领域
本发明涉及微血管观察技术领域，特别是涉及一种染色剂、心脏切片制备方法及微血管灌注染色评价方法。
背景技术
长期以来，冠状动脉主干狭窄所致的心肌供血不足被认为是冠心病的主要病因，而忽视了冠状动脉微血管(也称微循环)功能障碍(Coronary MicrovascularDysfunction，CMD)临床重要性。最新临床研究发现CMD是缺血性心脏病潜在的病理因素并且发现约20％-30％胸痛患者并无明显的冠状动脉主干和主要分支狭窄或闭塞的情况，而是由于CMD所引起。因此，冠脉微血管病理性改变及治疗也引起的生命科学工作者的重视。但由于心脏是致密的实体组织，而微血管系统垂直于心脏表面，与心肌纤维相互平行，导致难以观察冠脉微血管的形态结构。所以迫切需要一种更佳对冠脉微血管的形态结构的染色和观察方法，有助于对冠状动脉微血管功能障的进一步研究。
目前为止已有多种对冠脉微血管标记或染色的方法，例如内皮细胞特异性标志物和墨汁灌注法等，但都存在一定的缺陷，主要有操作步骤复杂，信号强度较弱，不能完整的对冠脉微血管进行可视化，并且存在破坏微血管形态结构，荧光信号衰减过快等问题，无法准确的观察到微血管的形态结构。
发明内容
鉴于上述状况，有必要针对现有的微血管染色技术中无法准确的观察到微血管形态结构，提供一种微血管灌注染色及评价方法。
一种用于微血管灌注染色的混合染色剂，所述混合染色剂包括DiIC12和DiIC18。
进一步的，上述混合染色剂，其中，DiIC12与DiIC18的浓度比为90～60:10～40。
进一步的，上述混合染色剂，其中，DiIC12与DiIC18的浓度比为80:20。
本发明还公开了一种心脏切片制备方法，包括：
将PBS溶液注入活体的心脏心室，并夹闭主动脉，灌注染色剂至心脏心室，之后注入甲醛溶液，所述染色剂采用权利要求1或2所述的混合染色剂；
取出心脏组织，并置于甲醛溶液中进行固定；
对固定后的心脏组织进行脱水；
将脱水处理后的心脏组织进行包埋处理后冰冻切片。
进一步的，上述心脏切片制备方法，其中，所述心脏组织置于甲醛含量为10％的甲醛溶液中固定24h，且，所述心脏组织在蔗糖含量为30％的蔗糖溶液中脱水12h。
本发明还公开了一种微血管灌注染色评价方法，包括：
制备不同浓度梯度的DiIC12和DiIC18的混合染色剂；
将制得的混合染色剂注入活体的心脏心室中，并制备心脏切片，以得到多个样本组，其中，每个所述样本组采用同一种浓度梯度的混合染色剂，且每个所述样本组包括多个心脏切片；
获取各个所述心脏切片的Z-stack图像，并进行三维图像构建，得到三维图像；
分别对各个所述心脏切片的三维图像进行检测，以获取每个所述心脏切片中的各个评价指标的测量值，并标准化处理；
根据标准化处理后的测量值计算每个所述评价指标下每个所述样本组所占的比重，以及计算各个所述评价指标的权重系数；
根据每个所述评价指标下每个所述心脏切片所占的比重，以及各个所述评价指标的权重系数，计算每个所述样本组的综合评分。
进一步的，上述微血管灌注染色评价方法，其中，所述评价指标包括：
高亮荧光斑点百分比、弱荧光面积百分比、荧光微血管总长度、微血管荧光衰减速率和荧光微血管空隙度。
进一步的，上述微血管灌注染色评价方法，其中，所述根据标准化处理后的测量值计算每个所述评价指标下每个所述样本组所占的比重的步骤包括：
所述根据各个所述心脏切片的评价指标的测量值计算每个所述评价指标下每个所述切片所占的比重，得到每个所述心脏切片对应的比重值，其中，所述心脏切片对应的比重值的计算公式为：
计算每个评价指标下同一所述切片组中的各个所述切片对应的比重值的均值，得到每个评价指标下所述样本组所占的比重。
进一步的，上述微血管灌注染色评价方法，其中，所述计算各个所述评价指标的权重系数的步骤包括：
根据每个所述评价指标下每个所述样本组所占的比重计算各个指标的熵值，熵值ej的计算公式为
根据各个所述评价指标的熵值计算各个所述评价指标的有效信息值，有效信息值gi的计算公式为
根据各个所述评价指标的有效信息值计算各个评价指标的权重系数，权重系数Wj的计算公式为
进一步的，上述微血管灌注染色评价方法，其中，计算每个所述样本组的综合评分Si的公式为：
进一步的，上述微血管灌注染色评价方法，其中，当获取到每个所述心脏切片中的各个评价指标的测量值后，还包括：
将获取到的测量值进行空值和异常值剔除处理。
本发明的有益效果主要体现在：本发明主要是确定染色剂DiIC12和DiIC18的比例范围，实验表明一定比例的混合染色剂可以有效地解决DiIC18在冠脉微循环灌注染色中溶解性差、染色不均匀的问题，不影响心肌细胞及微血管的生物形态和结构，可对冠脉微循环的形态和结构进行完整的可视化，同时能精准地测量微血管数量和密度等相关指标，该方法对有助于对冠状动脉微血管功能障的进一步研究。
附图说明
图1为DiIC12/DiIC18的比例对大鼠冠脉微循环染色效果的影响(激光共聚焦显微镜，400x)；
图2a为不同DiIC12/DiIC18的比例对大鼠冠脉微血管环染色中的指标高亮荧光斑点百分比的影响；
图2b为不同DiIC12/DiIC18的比例对大鼠冠脉微血管环染色中的指标弱荧光面积百分比的影响；
图2c为不同DiIC12/DiIC18的比例对大鼠冠脉微血管环染色中的荧光微血管总长度的影响；
图2d为不同DiIC12/DiIC18的比例对大鼠冠脉微血管环染色中的微血管荧光衰减速率的影响；
图2e为不同DiIC12/DiIC18的比例对大鼠冠脉微血管环染色中的荧光微血管空隙度的影响；
图3a为高亮荧光斑点百分比指标下DiIC12和DiIC18百分比的Pearson相关性及线性回归分析；
图3b为弱荧光面积百分比指标下DiIC12和DiIC18百分比的Pearson相关性及线性回归分析；
图3c为荧光微血管总长度指标下DiIC12和DiIC18百分比的Pearson相关性及线性回归分析；
图3d为微血管荧光衰减速率指标下DiIC12和DiIC18百分比的Pearson相关性及线性回归分析；
图3e为荧光微血管空隙度指标下DiIC12和DiIC18百分比的Pearson相关性及线性回归分析；
需要说明的是，为了书写简便，附图中C12和C18分别表示为DiIC12和DiIC18。
具体实施方式
为使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。实施例中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
本发明实施例提供了一种用于微血管灌注染色的混合染色剂，该微血管灌注染色采用的染色剂为DiIC18和DiIC12的混合染色剂。采用心脏灌流法进行微血管染色，并进行3D图像重构后进行微血管结构观察。
DiIC18全称为1,1'-二-十八烷基-3,3,3',3'-四-甲基氨基碳菁高氯酸盐，是一种亲脂性染料已被广泛用于标记细胞膜和在活体和固定组织中追踪神经元连接。在细胞膜中，DiI分子的两条18烷基链可以埋在与磷脂酰链平行的脂质双分子层中，而染色质团位于双分子层的表面。通过心脏灌注，DiI迅速进入细胞膜，即内皮细胞膜内衬血管，可迅速标记微血管，可被激发很强的荧光信号。但在实验中发现，由于DiI C18烷基链较长，疏水性较强，灌注过程中容易发生聚团，且聚团速度与环境温度密切相关，温度越低聚集越快，导致微血管堵塞。血管堵塞后由于压力作用导致血管破裂，使得心肌细胞被染色，影响微血管的观察(见图1中DiIC18和DiIC12的比例为100:0对应的图片)，使得重复性较差。
DiIC12全称为1,1′-二-十二烷基-3,3,3′,3′-四-甲基氨基碳菁高氯酸盐是一种DiI碳菁染料家族成员之一，其两条烷基链较短，因此疏水性比DiIC18小，可以保持足够长的溶解时间，以便有效地并入细胞膜，使得血管灌注更加均匀，稳定，便于操作，观察效果好(见图1中DiIC18和DiIC12的比例为0:100对应的图片)。由于DiI C12直接被输送到内皮细胞膜上，因此在细胞膜上达到高浓度，增加信噪比。然而DiI C12染料本身具有强烈的荧光性，当暴露于激发光时会加快荧光信号衰减。
实施例1
一种心脏切片制备方法，包括如下步骤：
活体准备，大鼠，雄性，300-350g，利用20％乌拉坦0.7g/100g进行麻醉；
将活体剪开胸腔，暴露心脏，止血钳夹住降主动脉，自左心室缓慢注入PBS溶液5ml、夹闭主动脉，并灌注比例梯度为100:0的DiIC12与DiIC18的混合染色剂2ml，最后注入5ml 10％甲醛溶液；
取出心脏组织，并置于10％甲醛溶液固定24h(避光)，固定后的心脏取出；
切成4mm厚的组织，经30％蔗糖溶液脱水后，用OCT液包埋，冷冻；
冰冻切片机切成60μm厚切片，得到心脏切片，将制得的心脏切片置于含DAPI的甘油中封片备用。
本实施例中，将DiIC12和DiIC18配制成5μg/ml溶液。心脏灌注开始前，连接好2个三通活栓和3个10ml注射器，其内分别装有PBS、DiI工作液、10％甲醛溶液，并排空注射器内气泡。麻醉大鼠，剪开胸腔，暴露心脏，止血钳夹住降主动脉，自左心室缓慢注入PBS溶液、夹闭主动脉，灌注DiI C12和DiIC18比例梯度100:0的混合染色剂。该混合染色剂的工作稀释液由PBS与5％蔗糖溶液按照1：4比例配置。再往心脏左心室注入10％甲醛溶液，取出心脏置于10％甲醛溶液固定。固定后的心脏取出，切成4mm厚的组织。利用30％蔗糖溶液脱水后，用OCT包埋，冷冻备用。
需说明的是，比例梯度为100:0的DiIC12与DiIC18的混合染色剂表示取质量份数100的DiIC12和0份的DiIC18。
实施例2
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：
心室中灌注比例梯度为90:10的DiIC12与DiIC18的混合染色剂。
实施例3
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：
心室中灌注比例梯度为80:20的DiIC12与DiIC18的混合染色剂。
实施例4
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：
心室中灌注比例梯度为60:40的DiIC12与DiIC18的混合染色剂。
实施例5
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：
心室中灌注比例梯度为40:60的DiIC12与DiIC18的混合染色剂。
实施例6
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：
心室中灌注比例梯度为20:80的DiIC12与DiIC18的混合染色剂。
实施例7
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：
心室中灌注比例梯度为0:100的DiIC12与DiIC18的混合染色剂。
将实施例1至实施例7中制备的心脏切片在激光共聚焦显微镜下进行观察。激光共聚焦显微镜选择Z-stack模式40x目镜，利用570nm光激发样品，并采集570-590信号范围，生成像素分辨率为1024*1024的图片，再选择0.63μm层扫一次，用LAS为Z-stack图像进行3D构建，即利用激光共聚焦显微镜的LAS功能对Z-stack图像进行3D图像构建，得到三维图像。
分别对各个心脏切片的三维图像进行检测，得到评价指标的测量值。具体的，测量DiIC12与DiIC18的比例梯度染液对微血管灌注效果的评价指标：高亮荧光斑点百分比、弱荧光面积百分比、荧光微血管总长度、微血管荧光衰减速率、荧光微血管空隙度。
对三维图像的各个评价指标的测量可采用常规的图像处理软件，如Image J和Angio Tool。
其中，高亮荧光斑点百分比的测量步骤：打开软件Image J，再打开三维图片，使用魔棒工具自动选取分析“Analyze”，并测量(Measure)，得到Area(面积)，选择指标A中荧光阈值10-255内的Vessels area(血管面积)，指标值等于Area/Vessels area。该计算步骤中，高亮荧光斑点的荧光强度要大于或等于20，且直径大于微血管的面积与总荧光面积的比值，再乘于100％。
弱荧光面积百分比的测量步骤：打开软件Angio Tool，再打开三维图片，荧光阈值选择0-10，开启降噪与填补空洞功能，Run analysis(运行分析)，再次打开图片，荧光阈值选择10-255，开启降噪与填补空洞功能，Run analysis，将选择两次的Vessels area面积做比值，得到弱荧光面积百分比。其中，该弱荧光斑点的荧光强度要小于200，且直径小于微血管的面积与总荧光面积的比值，再乘于100％。
荧光微血管总长度的测量步骤：打开软件Angio Tool，再打开三维图片，选择荧光阈值10-255，打开降噪与填补空洞，Run Analysis，选择Total Vessels Length(总血管长度)。
微血管荧光衰减速率通过软件Image J计算，测量微血管的荧光在30min内猝灭的强度，即指标＝(MeanT0-MeanT30)/30min，MeanT0和MeanT30分别为时间为T0和T0加30min时的荧光强度。
荧光微血管空隙度测量步骤；使用软件Angio Tool——打开三维图片，选择荧光阈值10-255，开启降噪与填补空洞功能，Run Analysis，Mean E Lacunarity(空隙度)。
实验结果：
DiIC12/DiIC18的比例梯度染液对大鼠冠脉微血管灌注染色效果的影响参见图1。DiIC12和DiIC18的比例梯度染液对大鼠冠脉微血管灌注染染色各项指标的影响参见图2。各项指标与DiIC12和DiIC18比例的Pearson相关性及线性回归分析参见图3。
结果表明，当DiIC12/DiIC18比例为80:20时，微血管染色均匀，荧光强度适中，较少有出现高亮度红色斑，且荧光猝灭速率较慢，其次染色效果由好到差依次为90:10，60:40，100:0，40:60，20:80及0:100梯度比的DiIC12/DiIC18混合染色剂。SD大鼠冠脉微血管染色中高亮荧光斑点百分比与DiIC12/DiIC18中DiIC12的比值呈负相关(DiIC18反之)，Pearson(皮尔逊)系数为-0.71468；弱荧光面积百分比与DiIC12/DiIC18中DiIC12的比值呈负相关(DiIC18反之)，Pearson系数为-0.59795；荧光微血管总长度与DiIC12/DiIC18中DiIC12的比值呈正相关(DiIC18反之)，Pearson系数为-0.74265；微血管荧光衰减速率与DiIC12/DiIC18中DiIC12的比值呈负相关(DiIC18反之)，Pearson系数为0.63833；荧光微血管空隙度与DiIC12/DiIC18中DiIC12的比值呈正相关(DiIC18反之)，Pearson系数为0.67964。通常情况下Pearson系数绝对值在0.8-1.0为极强相关，0.6-0.8为强相关，0.4-0.6为中等程度相关，0.2-0.4为弱相关，0.0-0.2为极弱相关或无相关。因此，SD大鼠冠脉微血管DiI染色中DiIC12/DiIC18中DiIC12的比值与高亮荧光斑点百分比、荧光微血管总长度、微血管荧光衰减速率和荧光微血管空隙度之间为强相关，与弱荧光面积百分比与之间为中等程度相关。
本发明另一实施例还提供了一种微血管灌注染色评价方法，包括如下步骤：
S1，制备不同浓度梯度的DiIC12和DiIC18的混合染色剂；
S2，将制得的混合染色剂注入活体的心脏心室中，并制备心脏切片，以得到多个样本组，其中，每个所述样本组采用同一种浓度梯度的混合染色剂，且每个所述样本组包括多个心脏切片；
S3，获取各个所述心脏切片的Z-stack图像，并进行三维图像构建，得到三维图像；
S4，分别对各个所述心脏切片的三维图像进行检测，以获取每个所述心脏切片中的各个评价指标的测量值，并标准化处理；
S5，根据标准化处理后的测量值计算每个所述评价指标下每个所述样本组所占的比重，以及计算各个所述评价指标的权重系数；
S6，根据每个所述评价指标下每个所述心脏切片所占的比重，以及各个所述评价指标的权重系数，计算每个所述样本组的综合评分。
本实施例中，配置100:0，60:40，90:10，80:20，40:60，20:80和0:100的DiIC12与DiIC18梯度比例的混合染色剂。将梯度比例的DiIC12和DiIC18染色剂注入心脏左心室，10％甲醛溶液中固定24h，30％蔗糖溶液中脱水12h，OCT包埋，冰冻切片后进行3D重构后观察，测量评价指标，Pearson相关性分析，熵权法对冠脉微血管灌注染色效果进行综合评价。
具体实施，每种梯度比例的混合染色剂备置一个样本组，即有7个样本组，每个样本组需要三只活体的心脏，每个活体的心脏制备5个心脏切片，即一个样本组有15个心脏切片。针对每个心脏切片进行3D重构，生成三维图像，针对三维图像采集五个评价指标的值，五个评价指标分别为：高亮荧光斑点百分比、弱荧光面积百分比、荧光微血管总长度、微血管荧光衰减速率、荧光微血管空隙度。
对采集的五个评价指标的值进行标准化处理，数据标准化是指异质指标同质化，对于正向指标：荧光微血管总长度经以下公式(1)处理进行标准化，对于逆向指标：高亮荧光斑点百分比、弱荧光面积百分比、微血管荧光衰减速率、荧光微血管空隙度经以下公式(2)处理进行标准化。
其中，Zij为第i个心脏切片的第j个评价指标的测量值标准化处理后的值，xij，为第i个心脏切片的第j个评价指标的测量值，max(xj)为第j个评价指标下各个心脏切片的测量值的最大值，min(xj)为第j个评价指标下各个心脏切片的测量值的最小值。
通过以下公式(3)计算每个指标下每个样本占该指标的比重pij，
其中，m为心脏切片的总数，每个样本组中有15个心脏切片，因此本实施例中m为90，n为评价指标的总数，本实施例中为5。计算每个评价指标下同一样本组中的15个心脏切片对应的比重值的均值，得到每个评价指标下样本组所占的比重，计算结果例如表1中所示。
表1第j个指标中第i个样本组占该指标的比重Pij(
样本组中心脏切片数为15)
通过以下公式(4)计算第各项指标的熵值ej，结果参见表2，其中，M为样本组的数量，n为评价指标的数量，k>0，ln为自然对数，ej>0。式中常数k与样本组数M有关，一般k＝1/ln(M)，则0≦e≦1；
通过以下公式(5)计算第各项指标的信息效用值gj，结果参见表2，
通过以下公式(6)计算各项指标的权重系数Wj，结果参见表2，
表2评价DiIC12/DiIC18比例对微血管DiI灌注效果指标的信息熵值ej、信息效用值gj和权重系数wj(
样本组中心脏切片数为15)
通过以下公式(7)计算DiIC12与DiIC18梯度比例100:0、90:10、80:20、60:40、40:60、20:80和0:100的综合得分Si，结果参见表3；
表3DiIC12/DiIC18比例对微血管灌注染色效果综合评分Si和排序结果(
样本组中心脏切片数为15)
本实施例中，熵权法评价DiIC12/DiIC18比例对微血管DiI灌注效果指标的信息熵值ej、信息效用值gj和权重系数wj结果分表明，各指标的权重系数由大到小依次为：荧光微血管空隙度0.2878±0.0548，高亮荧光斑点百分比(％)0.2758±0.0704，弱荧光面积百分比(％)0.2540±0.0700，微血管荧光衰减速率(ΔIntDen/Time)0.2410±0.0657及荧光微血管总长度×104(μm)0.0377±0.0156；DiIC12/DiIC18比例对冠脉微血管DiI灌注效果综合评分Si最佳的一组为浓度比为80:20的DiIC12/DiIC18混合染色剂，Si＝0.7602±0.1081，其次由好到差依次是浓度比60:40，90:10，100:0，40:60，20:80及0:100的DiIC12/DiIC18混合染色剂。
进一步的，对获取到每个所述心脏切片中的各个评价指标的测量值进行标准化处理之前还包括：
将获取到的测量值进行空值和异常值剔除处理。
其中，空值处理为：指标值如果含有空值，则剔除整条数据；
异常值处理为：分别计算每个指标下数据的均值和标准差，如果数据大于均值+3*标准差或小于均值-3*标准差，则剔除整条数据。
由于本方法中各指标未出现空值，不需要进行空值处理；且每个指标下数据均在均值加减3倍范围内，因此也不需要进行异常值处理。
经试验可知，染色效果综合评分达到0.7以上，其微血管染色均匀，荧光强度适中，较少有出现高亮度红色斑，且荧光猝灭速率较慢，可以较好的观察出微血管的结构。因此，采用DiIC12与DiIC18的浓度配置比例为90～60:10～40的混合染色剂均能得到较好的染色效果。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种用于微血管灌注染色的混合染色剂，其特征在于，所述混合染色剂包括DiIC12和DiIC18。
2.如权利要求1所述的混合染色剂，其特征在于，DiIC12与DiIC18的浓度比为90～60:10～40。
3.如权利要求2所述的混合染色剂，其特征在于，DiIC12与DiIC18的浓度比为80:20。
4.一种心脏切片制备方法，其特征在于，包括：
将PBS溶液注入活体的心脏心室，并夹闭主动脉，灌注染色剂至心脏心室，之后注入甲醛溶液，所述染色剂采用权利要求1或2所述的混合染色剂；
取出心脏组织，并置于甲醛溶液中进行固定；
对固定后的心脏组织进行脱水；
将脱水处理后的心脏组织进行包埋处理后冰冻切片。
5.如权利要求4所述的心脏切片制备方法，其特征在于，所述心脏组织置于甲醛含量为10％的甲醛溶液中固定24h，且，所述心脏组织在蔗糖含量为30％的蔗糖溶液中脱水12h。
6.一种微血管灌注染色评价方法，其特征在于，包括：
制备不同浓度梯度的DiIC12和DiIC18的混合染色剂；
将制得的混合染色剂注入活体的心脏心室中，并制备心脏切片，以得到多个样本组，其中，每个所述样本组采用同一种浓度梯度的混合染色剂，且每个所述样本组包括多个心脏切片；
获取各个所述心脏切片的Z-stack图像，并进行三维图像构建，得到三维图像；
分别对各个所述心脏切片的三维图像进行检测，以获取每个所述心脏切片中的各个评价指标的测量值，并标准化处理；
根据标准化处理后的测量值计算每个所述评价指标下每个所述样本组所占的比重，以及计算各个所述评价指标的权重系数；
根据每个所述评价指标下每个所述心脏切片所占的比重，以及各个所述评价指标的权重系数，计算每个所述样本组的综合评分。
7.如权利要求6所述的微血管灌注染色评价方法，其特征在于，所述评价指标包括：
高亮荧光斑点百分比、弱荧光面积百分比、荧光微血管总长度、微血管荧光衰减速率和荧光微血管空隙度。
8.如权利要求6所述的微血管灌注染色评价方法，其特征在于，所述根据标准化处理后的测量值计算每个所述评价指标下每个所述样本组所占的比重的步骤包括：
所述根据各个所述心脏切片的评价指标的测量值计算每个所述评价指标下每个所述切片所占的比重，得到每个所述心脏切片对应的比重值，其中，所述心脏切片对应的比重值的计算公式为：
计算每个评价指标下同一所述切片组中的各个所述切片对应的比重值的均值，得到每个评价指标下所述样本组所占的比重。
9.如权利要求6所述的微血管灌注染色评价方法，其特征在于，所述计算各个所述评价指标的权重系数的步骤包括：
根据每个所述评价指标下每个所述样本组所占的比重计算各个指标的熵值，熵值ej的计算公式为
根据各个所述评价指标的熵值计算各个所述评价指标的有效信息值，有效信息值gi的计算公式为
根据各个所述评价指标的有效信息值计算各个评价指标的权重系数，权重系数Wj的计算公式为
10.如权利要求6所述的微血管灌注染色评价方法，其特征在于，计算每个所述样本组的综合评分Si的公式为：
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