CN103224975A - 利用实时荧光pcr技术检测胆囊胆汁中华支睾吸虫dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用实时荧光PCR技术检测胆囊胆汁中华支睾吸虫DNA的方法，其包括以下步骤：1)胆囊胆汁预处理；2)提取胆囊胆汁中的DNA；3)设计并合成特异性引物及探针；4)实时荧光PCR反应。本发明提供的方法能够高效提取胆囊胆汁中华支睾吸虫的DNA，并且无需电泳，可以节省检测时间，灵敏度高，并有效避免有毒物质的污染，为研究华支睾吸虫卵与胆囊胆汁形成机制的关系提供了新的研究角度和方向。

Description

利用实时荧光PCR技术检测胆囊胆汁中华支睾吸虫DNA的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种检测胆囊胆汁中华支睾吸虫DNA的方法。

背景技术

胆囊结石病是目前全世界范围内最常见的消化系统疾病之一，随着发病率的日趋增加，严重影响人民的健康和生活质量。近年来胆囊结石成因的研究有了较大进展，如乔铁等报道了华支睾吸虫与胆囊结石有密切相关性，但目前对胆囊结石的形成机制仍不十分明了，尚未对华支睾吸虫与胆囊结石形成机制之间的关系进行DNA水平上的研究，但也可通过研究胆囊胆汁DNA来进行研究。

发明内容

针对以上要解决的技术问题，本发明的目的在于提供一种利用实时荧光PCR技术检测胆囊胆汁中华支睾吸虫DNA的方法，从而为探讨华支睾吸虫卵与胆囊胆汁形成机制的关系提供新的角度和方向。

为了达到上述技术目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明所述的利用实时荧光PCR技术检测胆囊胆汁中华支睾吸虫DNA的方法，其具体步骤包括：

1)胆囊胆汁预处理；

2)提取胆囊胆汁中的DNA；

3)设计并合成特异性引物及探针：根据华支睾吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因序列，设计并合成如下特异性的引物及探针：

正向引物序列：5′-GGTTTGGTATGATTAGTCACATTTG-3′；

反向引物序列：5′-ACCACCCTACCCAGACAAAC-3′；

探针序列：5′-(JOE)-AGCAAACATAGCCAACACCAAGCCC-(BHQ-1)-3′；

将以上引物及探针配制成浓度为10μM的储存液，-20℃保存；

4)实时荧光PCR反应。

根据本发明提供的检测方法，所述步骤1)中，胆囊胆汁预处理的具体步骤如下：

A)取胆囊胆汁500μl置于2.0ml Ep管中，12000rpm离心10分钟，向沉渣中加入1ml生理盐水，混匀后12000rpm离心10分钟，弃上清；

B)向胆囊胆汁沉渣中加入1ml 80v/v％乙醇，混匀后静置5分钟，12000rpm离心10分钟弃上清；

C)重复步骤B)；

D)向步骤C)所得的胆囊胆汁中加入1ml生理盐水，12000rpm离心10分钟，弃上清，保留沉渣。

根据本发明提供的检测方法，所述步骤2)中提取胆囊胆汁中的DNA的具体步骤为：使用DNeasy Blood &Tissue Kit提取胆汁DNA，再用100μl AE溶液溶解所提取的DNA，-20℃保存。

根据本发明提供的检测方法，所述步骤4)中实时荧光PCR反应的具体步骤如下：

a)在冰上配制PCR反应体系，依次加入以下试剂：Premix Ex Taq^TM25μl、正向引物溶液1μl、反向引物溶液1μl、探针溶液1μl、ROX液1μl、胆汁DNA 2μl，然后再加蒸馏水至总体积为50μl；

b)设置PCR反应条件：第一步95℃预变性30秒，第二步95℃变性15秒，60℃退火延伸31秒，共计45个循环。

与现有技术相比，本发明通过实时荧光PCR技术，能够高效地提取胆囊胆汁中华支睾吸虫的DNA，并且无需电泳，可以节省检测时间，灵敏度高，并有效避免有毒物质(如EB)的污染，为探讨华支睾吸虫卵与胆囊胆汁形成机制的关系提供了新的研究角度和方向。

附图说明

图1是对华支睾吸虫、弓形虫、日本血吸虫、广州管圆线虫、蛔虫的DNA及阴性对照的实时荧光PCR特异性分析结果比较。

图2是本发明实时荧光PCR灵敏度检测结果。

图3是Ct值与华支睾吸虫DNAi0倍浓度梯度稀释的相关性分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1胆囊胆汁的获取

喉罩全身麻醉，迷你腹腔镜直视右肋缘下小切口抓取胆囊，胆囊底部微小切口(＜6mm)，用无菌脑室引流管引流胆汁至连接的无菌注射器中，再转移至无菌试管中。

实施例2胆囊胆汁DNA的提取

将以上手术获得的胆囊胆汁500μl置于2.0ml Ep管中，12000rpm离心10分钟，向沉渣中加入1ml生理盐水，混匀后12000rpm离心10分钟，弃上清。然后加1ml80％乙醇，混匀后静置5分钟，12000rpm离心10分钟弃上清，重复一次。最后再加1ml生理盐水，12000rpm离心10分钟，弃上清，保留沉渣。按照DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN)说明书操作步骤提取胆汁DNA。最后用100μl AE溶液(QIAGEN)溶解DNA，-20℃保存。

实施例3设计并合成实时荧光PCR引物、探针

根据华支睾吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基1基因序列(Genebank：FJ965388.1)，应用Beacon Designer-v7.51软件设计特异性的引物及TaqMan探针，将筛选出的引物探针组合提交NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)与其他物种基因序列进行Blast比对，保证引物、探针的高度特异性，最终确认选取的探针5’端标记荧光报告基团JOE，3’端标记荧光淬灭基团BHQ-1。正反向引物以及探针的碱基序列如下：

正向引物序列：5′-GGTTTGGTATGATTAGTCACATTTG-3′

反向引物序列：5′-ACCACCCTACCCAGACAAAC-3′

探针序列：5′-(JOE)-AGCAAACATAGCCAACACCAAGCCC-(BHQ-1)-3′

将合成的引物、探针配制成浓度为10μM的储存液，-20℃保存。

实施例4实时荧光PCR反应体系及条件的建立

实时荧光PCR反应体系如下：在生物安全柜内，冰上配置PCR反应体系。向PCR反应管中依次加入以下试剂：Premix Ex Taq^TM(Takara)25μl、正向引物1μl(10μM)、反向引物1μl(10μM)、探针1μl(10μM)、ROX液(Takara)1μl、胆汁DNA 2μl，然后再加灭菌超纯水至总体积为50μl。同时以华支睾吸虫成虫DNA做阳性对照，以蒸馏水做阴性对照。

实时荧光PCR反应条件如下：第一步95℃预变性30秒；第二步95℃变性15秒，60℃退火延伸31秒，共计45个循环。实时荧光PCR仪优选为ABI7300实时荧光PCR仪(USA)。

实施例5实时荧光PCR检测体系的灵敏度及特异性分析

1.特异性分析

分别对华支睾吸虫、弓形虫、日本血吸虫、广州管圆线虫和蛔虫的成虫DNA用本实验建立的实时荧光PCR检测方法在相同反应条件下进行PCR扩增，以确定其检测特异性。

结果显示，应用该实验所设计的华支睾吸虫特异性引物、TaqMan探针，建立的华支睾吸虫实时荧光PCR检测方法，能特异性地检测到华支睾吸虫DNA，而对弓形虫、日本血吸虫、广州管圆线虫、蛔虫的DNA及阴性对照均未有特异性扩增出现。结果如图1所示。图中，曲线1：华支睾吸虫，曲线2：弓形虫，曲线3：日本血吸虫，曲线4：广州管圆线虫，曲线5：蛔虫，曲线6：蒸馏水(即阴性对照)。

2.灵敏度分析

应用本发明所建立的华支睾吸虫实时荧光PCR检测方法，分别对不同浓度梯度的华支睾吸虫成虫DNA在相同条件下进行实时荧光PCR扩增，以确定其检测阈值。

结果显示，本实验建立的华支睾吸虫实时荧光PCR检测方法，对华支睾吸虫DNA的最低检测阈值可达到0.1pg，检测灵敏度高，并且荧光信号强度与华支睾吸虫DNA浓度成线性相关(R²＞0.99)，如图2、3所示。图2中，曲线1：10ng、曲线2：1ng、曲线3：100pg、曲线4：10pg、曲线5：1pg、曲线6：0.1pg、曲线7：蒸馏水(阴性对照)。图3为Ct值与华支睾吸虫DNA10倍浓度梯度稀释的相关性分析，其中X轴为DNA浓度的负对数，Y轴为Ct值。

Claims (4)

1.一种利用实时荧光PCR技术检测胆囊胆汁中华支睾吸虫DNA的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)胆囊胆汁预处理；

2)提取胆囊胆汁中的DNA；

3)设计并合成特异性引物及探针：根据华支睾吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因序列，设计并合成如下特异性的引物及探针：

正向引物序列：5′-GGTTTGGTATGATTAGTCACATTTG-3′；

反向引物序列：5′-ACCACCCTACCCAGACAAAC-3′；

探针序列：5′-(JOE)-AGCAAACATAGCCAACACCAAGCCC-(BHQ-1)-3′；

将以上引物及探针配制成浓度为10μM的储存液，-20℃保存；

4)实时荧光PCR反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，胆囊胆汁预处理的具体步骤如下：

A)取胆囊胆汁500μl置于2.0ml Ep管中，12000rpm离心10分钟，向沉渣中加入1ml生理盐水，混匀后12000rpm离心10分钟，弃上清；

B)向胆囊胆汁沉渣中加入1ml 80v/v％乙醇，混匀后静置5分钟，12000rpm离心10分钟弃上清；

C)重复步骤B)；

D)向步骤C)所得的胆囊胆汁中加入1ml生理盐水，12000rpm离心10分钟，弃上清，保留沉渣。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)中提取胆囊胆汁中的DNA的具体步骤为：使用DNeasy Blood &Tissue Kit提取胆汁DNA，再用100μl AE溶液溶解所提取的DNA，-20℃保存。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中实时荧光PCR反应的具体步骤如下：

a)在冰上配制PCR反应体系，依次加入以下试剂：Premix Ex Taq^TM25μl、正向引物溶液1μl、反向引物溶液1μl、探针溶液1μl、ROX液1μl、胆汁DNA 2μl，然后再加蒸馏水至总体积为50μl；

b)设置PCR反应条件：第一步95℃预变性30秒，第二步95℃变性15秒，60℃退火延伸31秒，共计45个循环。

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