CN104561264A - 华支睾吸虫实时荧光pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种华支睾吸虫的实时荧光PCR检测试剂盒，包括PCR特异性引物和荧光探针；其中，PCR特异性引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的华支睾吸虫核糖体18S上游引物和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的华支睾吸虫核糖体18S下游引物；所述荧光探针具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列，且所述荧光探针5’端标记荧光报告基团、3’端标记荧光淬灭基团。采用本发明的华支睾吸虫的实时荧光PCR检测方法相比现有的检测方法，是实时反映靶基因扩增的过程，并根据内参或外参直接反映出靶基因的拷贝数；具有灵敏度高、特异性强、周期短、高通量等优点，同时通过光学系统检测荧光信号而省去了凝胶电泳的繁琐操作，既减少了假阳性的发生率和对人、环境的潜在危害，同时缩短了检测时间。

Description

华支睾吸虫实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于分子生物检测技术领域，具体涉及一种华支睾吸虫实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。
背景技术
从深圳近几年寄生虫门诊的食源性寄生虫病的监测结果以及食品污染物监测网络中食源性寄生虫项目的监测结果中，水产品的华支睾吸虫感染率呈逐渐升高的趋势，所以我们有必要对市面上流通的水产品进行华支睾吸虫等食源性寄生虫的检测。现有的传统检测方法主要通过形态学鉴定技术，操作繁琐，比较耗时，检出率低。
发明内容
本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种光学系统检测荧光信号减少了假阳性、缩短了检测时间的异尖线虫的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
一种华支睾吸虫的实时荧光PCR检测试剂盒，包括PCR特异性引物和荧光探针；其中，
所述PCR特异性引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的华支睾吸虫核糖体18S上游引物和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的华支睾吸虫核糖体18S下游引物；
所述荧光探针具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列，且所述荧光探针5’端标记荧光报告基团、3’端标记荧光淬灭基团。。
采用本发明的华支睾吸虫的实时荧光PCR检测方法相比现有的检测方法，是实时反映靶基因扩增的过程，并根据内参或外参直接反映出靶基因的拷贝数；具有灵敏度高、特异性强、周期短、高通量等优点，同时通过光学系统检测荧光信号而省去了凝胶电泳的繁琐操作，既减少了假阳性的发生率和对人、环境的潜在危害，同时缩短了检测时间。
本发明进一步还提出一种华支睾吸虫的实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤：
提取待测样本DNA；
以提取的待测样本DNA为模板进行实时荧光PCR；其中，所述实时荧光PCR过程中采用的引物为具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的华支睾吸虫核糖体18S上游引物和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的华支睾吸虫核糖体18S下游引物；所述实时荧光PCR过程中采用的荧光探针为具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列的荧光探针，且所述荧光探针5’端标记荧光报告基团、3’端标记荧光淬灭基团；
检测PCR过程中的荧光信号。
本发明的检测方法，通过特异性设计的灵敏性引物和探针，对从待测标样提取的DNA进行PCR扩增，检测扩增过程中的荧光变化，即可实现异尖线虫的检测；检测精度高、结果准确，且过程快速简便。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1为本发明以华支睾吸虫、卫氏并殖吸虫、弓形体、日本血吸虫、广州管圆线虫、异尖线虫为待测标样进行检测的荧光变化图；
图2为本发明的以华支睾吸虫、卫氏并殖吸虫、弓形体、日本血吸虫、广州管圆线虫、异尖线虫为待测标样扩增产物的电泳结果图；
图3为灵敏性实验分析验证本发明方法的灵敏性过程中的荧光变化图；
图4为灵敏性实验分析验证本发明方法的灵敏性结果的线性曲线；
图5为灵敏性实验分析验证本发明方法的灵敏性结果的数据表。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种华支睾吸虫的实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤：
S10，获取待测样本，并提取待测样本DNA；
S20，以提取的待测样本DNA为模板进行实时荧光PCR；
S30，检测PCR过程中的荧光信号。
本发明上述过程通过对待测的DNA样本进行扩增，并通过扩增过程中荧光探针产生的荧光信号变化，从而便可以得知待测样本是否含有目标病原体；
其中，在步骤S20的实时荧光PCR中采用的特异性引物和荧光探针如下：
上表中，本发明的特异性引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的华支睾吸虫核糖体18S上游引物和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的华支睾吸虫核糖体18S下游引物。而荧光探针序列具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列，其5’端标记荧光报告基团、3’端标记荧光淬灭基团，PCR过程中聚合酶在引物的引导下，逐步顺着DNA模板从5’往3’的方向延伸，遇到探针与模板链杂交的部位会逐步切除探针的碱基，那么在切除的过程中，碱基上的荧光报告基团随着5’端的碱基切除的同时游离出来，所以产生的荧光不再能被3’的淬灭集团抑制，因此便能检测到荧光信号的增加。
因此当采用只能识别目的基因的引物特异性匹配结合DNA模板链进行PCR过程中，通过荧光信号的变化情况便可以实现对待测标样的定性检测。
本发明引物和探针的设计，根据华支睾吸虫18S rRNA基因，从基因库中获得华支睾吸虫的18S rRNA基因序列，设计了特异性引物和探针，将筛选出来的引物和探针在基因库中进行BLAST比较,检测其特异性。选取特异性良好的作为最终的引物和探针，其具有信息如下：
采用本发明的华支睾吸虫的实时荧光PCR检测方法相比现有的检测方法，是实时反映靶基因扩增的过程，并根据内参或外参直接反映出靶基因的拷贝数；具有灵敏度高、特异性强、周期短、高通量等优点，同时通过光学系统检测荧光信号而省去了凝胶电泳的繁琐操作，既减少了假阳性的发生率和对人、环境的潜在危害，又缩短了检测时间；并且扩增曲线良好，融解曲线峰形单一，电泳结果为特异性的目的片段；可以最终实现用于Real Time PCR定量。
为使本发明的上述方法过程更加易于理解，以及使本领域技术人员能明确本方法实施的细节，并且能更加突出检测结果的灵敏性、以及操作的便捷性，以下通过实施例进行举例说明：
实施例1
S10，取深圳市疾病预防控制中心寄生虫实验室保存的华支睾吸虫、卫氏并殖吸虫、弓形体、日本血吸虫、广州管圆线虫、异尖线虫各200mg预处理的待检样本，用商品化的组织基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行；
S20，分别以步骤S10中提取的待测样本DNA作为模板DNA进行PCR，其中PCR体系如下：
其中，上述PCR反应试剂均购自TaKaRa，并且PCR过程中采用ABI-7500荧光PCR仪进行；
反应过程：
其中为了凸显各组病原菌体的扩增的对比，上述华支睾吸虫这一阳性组，做两个重复对照；同时在上述个待测组中，以RNase free dH2O作为阴性对照。
S30，在S20反应过程中检测FAM荧光信号。
在该实施例中，PCR过程中检测的FAM荧光信号结果参见图1所示；并还进一步将上述各待测样本DNA进行PCR扩增之后的DNA产物进行凝胶电泳，电泳结果图2所示。其中电泳条带中按照从左向右的顺序中，条带1和条带2均为为华支睾吸虫标样的扩增产物条带；条带3为卫氏并殖吸虫的扩增产物条带；条带4为弓形体进行PCR的产物条带；条带5为日本血吸虫的PCR产物条带；条带6为广州管圆线虫进行PCR的产物条带；条带7为异尖线虫PCR产物条带；条带8为阴性对照；M条带为100bp DNA Laddar Marker的参考带。
从图1的扩增过程中荧光量的变化中，可以看出有2条标本曲线Ct(PCR循环数)≤32，有明显指数期增长，而其他的样本曲线，由于引物和探针不能匹配，那么基本条带是不扩增的，标本检测结果Ct>35或无Ct值。
从图2的电泳条带中，可以看出能通过特异性引物扩增出产物的也只有华支睾吸虫标样的扩增产物，结果中可以看出本发明中的引物的特异性非常良好。
当然，本发明的上述举例中扩增的各病原体待测的样品采用的均是明确寄生病原体的扩增，而在实际水产品寄生病原体中可能会出现其他的疑似阳性的情形，即检测结果可能出现标本检测结果32<Ct≤35的这一阶段，有明显指数增长期。当出现这一情形时，可以将标本重新进行PCR检测，如果重复检测结果增长期Ct≤35，则判定为阳性，若重测结果Ct>35或无Ct值，则判定为阴性。
同时，进一步为了验证本发明方法中采用引物和探针进行检测的灵敏度，采用下述灵敏性实验分析验证：
将华支睾吸虫标样的扩增产物与质粒进行重组，并将重组质粒稀释至10^7copies/μl作为阳性样本，对阳性样本以10倍梯度进行稀释，最大稀释倍数为100万倍，然后以各稀释液为模板按照上述方法进行实时PCR检测，检测过程中的荧光信号变化其结果可以参见图3-5；从图3-5中可以看出，显示所建立的荧光定量PCR方法最低检测限度为10个DNA拷贝/反应，本发明的方法检测具有灵敏度高，精确性高的优点。
因此，从该实施例1的检测结果图4显示出，本发明中TaKaRa设计合成的该基因SYBR Green I嵌合荧光法定量用引物，扩增曲线良好，融解曲线峰形单一，电泳结果为特异性的目的片段。用该引物制作的标准曲线，线性关系良好，R2＝0.993，扩增效率Eff＝97.7％，符合实验要求。以上实验数据说明，该引物反应性能良好，可以用于Real Time PCR定量实验。
本发明应用该荧光PCR检测试剂盒对2014年1月到6月份深圳市食品污染物监测网送检的食源性寄生虫监测的150份水产品按上述检测方法和步骤进行检测，同时用消化法、压片法等形态学的传统检测方法进行比对，结果互相吻合。共检出5份阳性样本，阳性率为3.33％。
从上述实施例1的特异性和灵敏性验证的检测试验还可以看出，采用本发明的上述检测方法，以华支睾吸虫18S rRNA基因为研究对象、设计引物，扩增目的片段并制备阳性质粒标准品，对荧光PCR扩增条件进行优化及特异性、敏感性分析，特异性强、稳定性好，操作简单。
本发明在上述方法的基础上，进一步还提出一种华支睾吸虫的实时荧光PCR检测试剂盒产品，在试剂盒中具有异尖线虫的特异性引物和探针；其中，华支睾吸虫的特异性引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的华支睾吸虫核糖体18S上游引物和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的华支睾吸虫核糖体18S下游引物。荧光探针序列具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列，其5’端标记荧光报告基团、3’端标记荧光淬灭基团。
其中的荧光报告基团可以从FAM、HEX、ROX、TMR中进行选择。
在使用为了更加进一步增加试剂盒的便易性，在试剂盒中还可以添加PCR反应缓冲液、酶液，以及各种碱基原料等。
为便于结果的对比和验证，试剂盒中还可以提供阳性对照和阴性对照，其中，阳性对照为带有华支睾吸虫18S rRNA基因的重组质粒；阴性对照为RNasefree dH2O。通过阳性对照和阴性对照的结果为待测的标样做参考对比，提升检测结果的准确性。
本发明的上述试剂盒，提供实施本发明上述实时荧光PCR检测方法中所要具备的特异性引物和探针，是实时反映靶基因扩增的过程，并根据内参或外参直接反映出靶基因的拷贝数；具有灵敏度高、特异性强、周期短、高通量等优点，同时通过光学系统检测荧光信号而省去了凝胶电泳的繁琐操作，既减少了假阳性的发生率和对人、环境的潜在危害，又缩短了检测时间；并且扩增曲线良好，融解曲线峰形单一，电泳结果为特异性的目的片段；可以最终实现用于Real Time PCR定量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种华支睾吸虫的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括PCR特异性引物和荧光探针；其中，
所述PCR特异性引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的华支睾吸虫核糖体18S上游引物和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的华支睾吸虫核糖体18S下游引物；
所述荧光探针具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列，且所述荧光探针5’端标记荧光报告基团、3’端标记荧光淬灭基团。
2.如权利要求1所述的华支睾吸虫的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM。
3.如权利要求1或2所述的华支睾吸虫的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有阳性对照；所述阳性对照为带有华支睾吸虫18SrRNA基因的重组质粒。
4.如权利要求1或2所述的华支睾吸虫的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有阴性对照；所述阴性对照为RNase free dH2O。
5.一种华支睾吸虫的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取待测样本DNA；
以提取的待测样本DNA为模板进行实时荧光PCR；其中，所述实时荧光PCR过程中采用的引物为具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的华支睾吸虫核糖体18S上游引物和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的华支睾吸虫核糖体18S下游引物；所述实时荧光PCR过程中采用的荧光探针为具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列的荧光探针，且所述荧光探针5’端标记荧光报告基团、3’端标记荧光淬灭基团；
检测PCR过程中的荧光信号。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM。
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