ES2715018T3 - Ensayo múltiple para puntuar mejor los tejidos tumorales teñidos para PD-L1 - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para puntuar la expresión de PD-L1 en una muestra tumoral, comprendiendo el procedimiento: marcar la muestra de tejido tumoral, comprendiendo el marcado: - poner en contacto la muestra de tejido con un anticuerpo primario anti-PD-L1; y - poner en contacto la misma muestra de tejido con - un anticuerpo primario dirigido a un marcador específico de células tumorales y un anticuerpo dirigido a un marcador específico de células inmunitarias; y - visualizar cada uno de los anticuerpos en la muestra de tejido con un reactivo que genera una señal detectable correspondiente a cada uno de los anticuerpos primarios, en el que el anticuerpo anti-PD-L1 tiene una primera señal detectable, el anticuerpo dirigido al marcador específico de células tumorales tiene una segunda señal detectable distinguible de la primera señal detectable, y el anticuerpo dirigido a un marcador específico de células inmunitarias tiene una tercera señal detectable distinguible de la primera señal detectable y de la segunda señal detectable; en el que la primera, segunda y tercera señales detectables son generadas por cromógenos; y puntuar la expresión de PD-L1 en células tumorales, células inmunitarias, o ambas, en el que la localización conjunta de la primera y segunda señales detectables indica la presencia de células tumorales positivas para PD-L1 y la localización conjunta de la primera y tercera señales detectables indica la presencia de células inmunitarias positivas para PD-L1.

Description

DESCRIPCIÓN
Ensayo múltiple para puntuar mejor los tejidos tumorales teñidos para PD-L1
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere a procedimientos para puntuar histoquímicamente la expresión de PD-L1 en tejidos tumorales.
Descripción de la técnica relacionada
El receptor muerte programada 1 (PD-1, por sus siglas en inglés) es miembro de la familia de receptores CD28, que incluye CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 y BTLA. Se han identificado dos ligandos glucoproteicos de la superficie celular para PD-1, PD-L1 y PD-L2, y se ha demostrado que regulan a la baja la activación de linfocitos T y la secreción de citocinas tras su unión a p D-1 (Freeman et al., J Exp Med 192:1027-34 [2000]; Latchman et al., Nat Immunol 2:261-8 [2001]; Carter et al., Eur J Immunol 32:634-43 [2002]; Ohigashi et al., Clin Cancer Res 11:2947-53 [2005]). Tanto PD-L1 (B7-H1) como PD-L2 (B7-DC) son homólogos de B7 que se unen a PD-1, pero no se unen a otros miembros de la familia CD28.
La vía PD-L1-PD1 está involucrada en la regulación negativa de algunas respuestas inmunitarias y puede desempeñar un papel importante en la regulación de la tolerancia periférica. La interacción de PD-L1 con PD-1 da como resultado la inhibición de la proliferación mediada por RLT y la producción de citocinas. Se ha sugerido que PD-L1 desempeña un papel en la inmunidad tumoral al aumentar la apoptosis de los clones de linfocitos T específicos de antígeno (Dong et al. Nat Med 8:793-800 [2002]). De hecho, se ha encontrado expresión de PD-L1 en varios cánceres murinos y humanos, incluyendo carcinoma de pulmón, ovario y colon y en varios mielomas humanos (Iwai et al. PNAS 99:12293-7 [2002]; Ohigashi et al. Clin Cancer Res 11:2947-53 [2005]). Por lo tanto, la medición de la cantidad de proteína PD-L1 en muestras biológicas puede ayudar en la detección temprana de patologías cancerosas y puede ayudar a evaluar la eficacia y durabilidad de los fármacos en fase de investigación clínica que inhiben la unión de la proteína PD-L1.
Ghebeh et al. (Neoplasia. 2006 Mar; 8[3]:190-8) divulgan ensayos de inmunohistoquímica (IHQ) cromógena en los que unas muestras de tejido de cáncer de mama fijadas con acetona y ultracongeladas se tiñen dos veces en ensayos separados para B7-H1 (PD-L1) y una para FoxP3, CD3, CD4, CD8 y pancitoqueratina.
Ghebeh et al. (BMC Cancer. 2008 Feb 23;8:57) también se ocupan de los ensayos de doble tinción IHQ cromógena que usan, entre otros, los anticuerpos anti-B7-H1 (PD-L1) y anti-FoxP3, y los anticuerpos anti-B7-H1 y anti-CD8. Afanasiev et al. (Clin Cancer Res. 2013 Oct 1 ;19(19):5351-60) divulgan el análisis de la expresión de la proteína PD-L1 en muestras de carcinoma de células de Merkel (CCM). Las muestras de CCM incluidas en parafina y fijadas con formol se analizan en un ensayo de IHQ cromógena de marcador único utilizando un anticuerpo anti-PD-L1.
Powderly et al. (http://carolinabiooncology.org/wp-content/uploads/ASCO-2013-Presentation-Anti-PD-L-1 Biomarkers.pdf) también presentan datos de expresión de PD-L1 que se obtuvieron en ensayos de IHQ cromógena de marcador único.
Iwai et al. (Int Immunol. 2005 Feb;17(2):133-44) divulgan datos de ensayos de IHQ de fluorescencia con criosecciones de tejido hepático con doble tinción para PD-L1 y CD11b. También se describen ensayos de fluorescencia que muestran tinción de PD-L1 y, además, núcleos con contratinción.
PerkinElmer (https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/FLY_Opal-Multiplex-Staining.pdf) se ocupa de ensayos múltiples de fluorescencia basados en TSA y presenta una microfotografía de una micromatriz de tejido de cáncer de mama con señales de fluorescencia diferentes para HER2, ER, PR, Ki-67 y núcleos, y otra microfotografía de una sección de tejido de cáncer de mama que muestra señales de fluorescencia diferentes para CD8, CD4, CD20, citoqueratina y núcleos.
Lyford-Pike et al. (Cancer Res. 2013 Mar 15;73[6]) divulgan el análisis de la expresión de las proteínas de PD-L1 y CD4 en muestras de tejido incluidas en parafina y fijadas con formol de carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello asociados a papilomavirus humano (HPV-HNSCC). En particular, las muestras se analizan en ensayos separados de IHQ cromógena de un solo marcador que utilizan un anticuerpo anti-PD-L1 o anticuerpos contra diversos marcadores específicos de células inmunitarias, tales como CD3, CD4, CD68 o CD1a.
Lloyd et al. (www.poster-submission.com/cdrom/download_poster/37/27814/1062P) analizan la formación de imágenes multiespectrales y la separación lineal de señales en un ensayo múltiple de IHQ cromógena con una micromatriz de tejido teñida para CD3, FoxP3 y CD69. No se muestra tinción de PD-L1. En cambio, el marcador se menciona como un ejemplo de IHQ de fluorescencia.
Sin embargo, el uso de la expresión de la proteína PD-L1 como un factor pronóstico exacto para el cáncer y/o la eficacia de los tratamientos dirigidos anti-PD-1 y anti-PD-L1 sigue siendo un desafío. Por ejemplo, muchas muestras tumorales presentan tinción de PD-L1 tanto en células tumorales como en células inmunitarias. La diferenciación de estos dos tipos de células puede ser difícil para los anatomopatólogos, especialmente cuando ambos están presentes en la misma muestra.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención ofrece ensayos múltiples para una puntuación mejorada de los tejidos tumorales teñidos con PD-L1. Los ensayos presentan la tinción de PD-L1 en un primer color más la tinción de un marcador diferenciador específico para células tumorales o células inmunitarias, en un segundo color y, opcionalmente, un segundo marcador diferenciador específico para células tumorales o células inmunitarias, en un tercer color. Los ensayos de la presente invención ayudan a diferenciar entre las células tumorales positivas para PD-L1 y las células inmunitarias positivas para PD-L1. Esto puede mejorar la capacidad para puntuar las muestras de forma más rápida, con exactitud y con mayor grado de reproducibilidad en comparación con la puntuación de muestras teñidas con PD-L1 solo.
En un aspecto de la presente divulgación está un procedimiento para puntuar la expresión de PD-L1 en una muestra tumoral, comprendiendo el procedimiento marcar la muestra de tejido tumoral, comprendiendo el marcado poner en contacto la muestra de tejido con un anticuerpo primario anti-PD-L1 y poner en contacto la misma muestra de tejido con un anticuerpo primario dirigido a un marcador específico de células tumorales y un anticuerpo dirigido a un marcador específico de células inmunitarias, y visualizar cada uno de los anticuerpos en la muestra de tejido con un reactivo que genera una señal detectable correspondiente a cada uno de los anticuerpos primarios, en el que el anticuerpo anti-PD-L1 tiene una primera señal detectable, el anticuerpo dirigido al marcador específico de células tumorales tiene una segunda señal detectable distinguible de la primera señal detectable, y el anticuerpo dirigido a un marcador específico de células inmunitarias tiene una tercera señal detectable distinguible de la primera señal detectable y de la segunda señal detectable, en el que la primera, segunda y tercera señales detectables son generadas por cromógenos; y el procedimiento para puntuar la expresión de PD-L1 en una muestra tumoral que comprende además puntuar la expresión de PD-L1 en células tumorales, células inmunitarias o ambas, en el que la localización conjunta de la primera y segunda señales detectables indica la presencia de células tumorales positivas para PD-L1 y la localización conjunta de la primera y tercera señales detectables indica la presencia de células inmunitarias positivas para PD-L1. En algunos modos de realización, el marcador específico de células tumorales se selecciona del grupo que consiste en una citoqueratina, cromogranina, sinaptofisina, CD56, factor tiroideo de transcripción 1 (FTT-1), p53, antígeno leucocitario común (ALC), vimentina y actina de músculo liso, y el marcador específico de células inmunitarias se selecciona del grupo que consiste en CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD11c, CD123, CD56, CD14, CD33, o CD66b. En algunos modos de realización, el marcador específico de células inmunitarias es un marcador de linfocitos T o un marcador de linfocitos B. En algunos modos de realización, el anticuerpo dirigido al marcador específico de células tumorales es un anticuerpo panqueratínico y el anticuerpo dirigido al marcador específico de células inmunitarias es un anticuerpo anti-CD4. En algunos modos de realización, la primera señal detectable se genera al poner en contacto la muestra de tejido con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (PRP) que reconoce el anticuerpo primario anti-PD-L1, haciendo reaccionar la PRP con 3,3'-diaminobencidina (DAB) para producir un color marrón; la segunda señal detectable se genera al poner en contacto la muestra con un anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (FA) que reconoce el anticuerpo primario dirigido a un marcador específico de células tumorales, haciendo reaccionar la FA con un cromógeno Fast Red y naftol para producir un color rojo; y la tercera señal detectable se genera al poner en contacto la muestra con un anticuerpo secundario conjugado con PRP que reconoce el anticuerpo primario dirigido a un marcador específico de células inmunitarias, y haciendo reaccionar la PRP con cromógeno PRP-verde para producir un color verde. En algunos modos de realización, la primera, segunda y/o tercera señal detectable es una señal amplificada, opcionalmente en la que la señal amplificada se genera mediante amplificación de señal con tiramida. En algunos modos de realización, la muestra se pone en contacto simultáneamente con los anticuerpos primarios o la muestra se pone en contacto secuencialmente con los anticuerpos primarios. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además contrateñir la muestra de tejido, produciendo la contratinción una cuarta señal detectable distinguible de la primera, segunda y tercera señales detectables; opcionalmente, la contratinción comprende hematoxilina. En algunos modos de realización, una quinta señal detectable se produce por superposición de la primera señal detectable y la segunda señal detectable. En algunos modos de realización, una sexta señal detectable se produce por superposición de la primera señal detectable y la tercera señal detectable. En algunos modos de realización, se cuantifica el número total de células tumorales positivas para PD-L1 y negativas para PD-L1, y el tumor se puntúa como positivo para PD-L1 si se detecta tinción para PD-L1 en más de aproximadamente un 10 % de las células tumorales, o el tumor se puntúa como positivo para PD-L1 si se detecta tinción para PD-L1 en más de aproximadamente un 50 % de las células tumorales. En algunos modos de realización se cuantifica el número total de células inmunitarias positivas para PD-L1 y negativas para PD-L1, y el tumor se puntúa como positivo para PD-L1 si se detecta tinción para PD-L1 en más de aproximadamente un 10 % de las células inmunitarias, o el tumor se puntúa como positivo para PD-L1 si se detecta la tinción para PD-L1 en más de aproximadamente un 50 % de las células inmunitarias. En algunos modos de realización, las células inmunitarias positivas para PD-L1, las células tumorales positivas para PD-L1 y las células tumorales negativas para PD-L1 se cuantifican para generar un valor de PD-L1, en el que el valor de PD-L1 = células tumorales positivas para PD-L1/(células tumorales negativas para PD-L1 células inmunitarias positivas para PD-L1), en el que las células tumorales positivas para PD-L1 se calculan contando el número de células que se tiñen para la primera y segunda señales detectables o calculando el área de la muestra de tejido en la que la primera señal detectable está asociada con la segunda señal detectable, las células tumorales negativas para PD-L1 se calculan contando el número de células que se tiñen solo para la segunda señal detectable o bien calculando el área de la muestra de tejido en la que la segunda señal detectable no está asociada con la primera señal detectable, y las células inmunitarias positivas para PD-L1 se calculan contando el número de células que se tiñen para la primera y tercera señales detectables o calculando el área de la muestra de tejido en la que la primera señal detectable está asociada con la tercera señal detectable. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además puntuar la intensidad de la tinción de PD-L1 en células tumorales positivas para PD-L1 y calcular una puntuación H, en la que la puntuación H = 1 * (porcentaje de tinción de células tumorales positivas para PD-L1 a una intensidad de 1+) 2 * (porcentaje de tinción de células tumorales positivas para PD-L1 a una intensidad de 2+) 3 * (porcentaje de tinción de células tumorales positivas para PD-L 1 a una intensidad de 3+).
Cualquier característica o combinación de características descritas en el presente documento se incluyen dentro del alcance de la presente invención, siempre que las características incluidas en cualquier combinación de este tipo no sean mutuamente contradictorias como será evidente a partir del contexto, esta especificación y el conocimiento de un experto normal en la técnica. Otras ventajas y aspectos adicionales de la presente invención son evidentes en la siguiente descripción detallada y en las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
En la FIG. 1 se muestra la tinción de una muestra tumoral de CPNM. La tinción de PD-L1 se indica mediante (a) y aparecería marrón en una imagen en color. Las citoqueratinas del anticuerpo panqueratínico están indicadas por (b), y serían rojas en una imagen en color. El CD4 de las células inmunitarias se indica con (c) y sería verde/azul en una imagen en color. La contratinción es hematoxilina diluida.
DESCRIPCIÓN DE MODOS DE REALIZACIÓN PREFERENTES
La presente divulgación se refiere en general a procedimientos histoquímicos o citoquímicos para marcar muestras tumorales para facilitar la puntuación de la expresión de PD-L1 en células tumorales, células inmunitarias o ambas. Brevemente, las células se marcan con entidades de unión específicas para PD-L1 y: (1) al menos un marcador de células tumorales; (2) al menos un marcador de células inmunitarias; o (3) al menos un marcador de células tumorales y al menos un marcador de células inmunitarias. Las entidades de unión se visualizan a continuación en las muestras tumorales generando al menos tres señales detectables distintas: una primera señal detectable que se correlaciona con la localización de la entidad de unión a PD-L1; una segunda señal detectable que se correlaciona con la localización de la entidad de unión específica de células tumorales; y una tercera señal detectable que se correlaciona con la localización del marcador de células inmunitarias. Cada una de las señales detectables son distinguibles entre sí. Opcionalmente, se puede proporcionar una contratinción en una cuarta señal detectable y/o se puede generar una quinta señal detectable a partir de la localización conjunta de dos cualesquiera de las señales detectables primera, segunda y tercera.
Muestras tumorales
Los presentes procedimientos son compatibles con muestras tumorales adecuadas para análisis histoquímico o citoquímico, que incluyen, por ejemplo, muestras frescas congeladas, fijadas en formol e incluidas en parafina (FFIP), frotis citológicos (como frotis cervicouterinos), aislados de células tumorales circulantes, etc. En un aspecto específico, la muestra es una muestra FFIP de tejido tumoral.
Marcadores de células tumorales y marcadores de células inmunitarias
Se puede usar cualquier marcador capaz de distinguir células tumorales de células no tumorales. Los ejemplos de biomarcadores específicos de células tumorales pueden incluir, entre otros: citoqueratinas detectables con el anticuerpo panqueratínico (por ejemplo, citoqueratinas básicas, muchas de las citoqueratinas ácidas), otras citoqueratinas como la citoqueratina 7 (CK7) y citoqueratina 20 (CK20), cromogranina, sinaptofisina, CD56, factor tiroideo de transcripción 1 (FTT-1), p53, antígeno leucocitario común (ALC), vimentina, actina de músculo liso o similares (por ejemplo, ver Capelozzi, V., J Bras Pneumol. 2009; 35[4]:375-382).
Se puede usar cualquier marcador capaz de distinguir células inmunitarias de células no inmunitarias. Los ejemplos de biomarcadores específicos de células inmunitarias pueden incluir, entre otros, los siguientes: CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD11c, CD123, CD56, CD14, CD33, o CD66b. En un ejemplo, se usa un marcador específico de linfocitos. Por ejemplo, se puede usar un marcador específico de linfocitos T, como CD3, CD4 o CD8, o un marcador específico de linfocitos B, como CD19 o CD20.
En un modo de realización específico, el marcador de células inmunitarias es CD4 y el marcador de células tumorales es una citoqueratina detectable por un anticuerpo pancitoqueratínico.
Entidades de unión
La histoquímica y la citoquímica son técnicas que se utilizan a menudo para identificar biomarcadores en el contexto de células intactas al marcar las muestras con moléculas que se unen específicamente al biomarcador de un modo que se puede visualizar en un microscopio. La inmunohistoquímica (IHQ) y la inmunocitoquímica (ICQ) son tipos de histoquímica y citoquímica que utilizan anticuerpos para marcar los biomarcadores. La hibridación in situ (HIS) es un tipo de histoquímica o citoquímica que utiliza sondas de ácido nucleico para marcar secuencias específicas de nucleótidos en la muestra tisular o celular. Al identificar el biomarcador en el contexto de un entorno tisular o celular, se pueden dilucidar las relaciones espaciales entre los biomarcadores y otras características morfológicas o moleculares de la muestra tisular o celular, lo que puede revelar información que no es evidente a partir de otras técnicas moleculares o celulares.
Como se usa en el presente documento, el término “entidad de unión” se referirá a cualquier compuesto o composición que sea capaz de unirse específicamente a una estructura molecular específica en una muestra tumoral adecuada para su análisis histoquímico o citoquímico. Los ejemplos incluyen anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, así como estructuras de unión específicas genomanipuladas, incluyendo las ADNECTIN (matriz basada en la 10.a fibronectina FN3; Bristol-Myers-Squibb Co.), AFFIBODY (matriz basada en el dominio Z de la proteína A de S. aureus; Affibody AB, Solna, Suecia), AVIMER (matriz basada en el dominio A/receptor de LDL; Amgen, Thousand Oaks, CA), dAbs (matriz basada en el dominio de anticuerpos VH o VL; GlaxoSmithKline PEC, Cambridge, Reino Unido), DARP (matriz basada en proteínas de repetición de anquirina; Molecular Partners AG, Zürich, CH), ANTICALIN (matriz basada en lipocalinas; Pieris AG, Freising, DE), NANOBODY (matriz basado en VHH (Ig de camélidos); Ablynx N/V, Gante, BE), TRANS-BODY (matriz basada en transferrina; Pfizer Inc., New York, NY), SMIP (Emergent Biosolutions, Inc., Rockville, MD) y TETRANECTINS (matriz basada en el dominio de lectina tipo C [DLTC], tetranectina; Borean Pharma A/S, Aarhus, DK). Las descripciones de dichas estructuras de unión específicas genomanipuladas se revisan en Wurch et al., Development of Novel Protein Scaffolds as Alternatives to Whole Antibodies for Imaging and Therapy: Status on Discovery Research and Clinical Validation, Current Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 9, pp. 502-509 (2008).
En un ejemplo, las entidades de unión son anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a cualquier forma de anticuerpo que exhibe la actividad biológica o de unión deseada. Por lo tanto, se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente, pero no se limita a, anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanizados, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos quiméricos y anticuerpos camelizados de un solo dominio.
Como se usa en el presente documento, a menos que se indique de otro modo, “fragmento de anticuerpo” o “fragmento de unión a antígeno” se refiere a fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno, es decir, fragmentos de anticuerpos que conservan la capacidad de unirse específicamente al antígeno al que se une el anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, fragmentos que conservan una o más regiones RDC. Los ejemplos de fragmentos de unión de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenario, por ejemplo, sc-Fv, nanocuerpos y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
Los ejemplos de anticuerpos anti-PD-L1 incluyen SP263 (descrito completamente en la solicitud de patente provisional de EE. UU. número de serie 62/004572, número de expediente 32151 US y presentada el 29 de mayo de 2014), SP142 (n.° de catálogo M4420, Spring Biosciences, Inc., Pleasanton, CA) y p D-L1 (E1F3N®) AcM de conejo XP® (n.° de catálogo 13684; Cell Signaling Technologies, Inc., Danvers, MA). Por ejemplo, la entidad de unión a PD-L1 es SP263 o SP142, la entidad de unión específica a células tumorales es un anticuerpo panqueratínico y la entidad de unión específica a células inmunitarias es un anticuerpo anti-CD4. En otro ejemplo, la entidad de unión a PD-L1 es SP142, la entidad de unión específica a células tumorales es un anticuerpo panqueratínico y la entidad de unión específica a células inmunitarias es un anticuerpo anti-CD4.
Visualización de entidades de unión específicas
Como se describe previamente, los ensayos de la presente invención muestran la tinción de PD-L1 así como la tinción de uno o más de marcadores de células tumorales e inmunitarias para generar una señal detectable que se correlaciona con la localización en la que una entidad de unión exógena se ha unido a la muestra. Los procedimientos histoquímicos y citoquímicos para generar señales detectables a partir de entidades de unión exógenas en muestras son bien conocidos por los expertos normales en la técnica y típicamente implican la aplicación de uno o más marcadores. Los ejemplos de marcadores incluyen marcadores cromógenos, marcadores fluorescentes, marcadores luminiscentes, marcadores radiométricos, etc., que se usan para el reconocimiento de los marcadores o dianas (por ejemplo, PD-L1, marcador específico de células tumorales, marcador específico de células inmunitarias, etc.). Los marcadores son bien conocidas por los expertos normales en la técnica y no están limitados a los marcadores descritos en el presente documento. En un modo de realización específico, las señales detectables se generan mediante el uso de cromógenos.
En un modo de realización, el marcador se aplica mediante el uso de un anticuerpo secundario. Por ejemplo, la entidad de unión puede ser un anticuerpo primario específico para el PD-L1, el marcador de células inmunitarias o el marcador de células tumorales. Si se usan anticuerpos derivados de diferentes especies animales como anticuerpo primario, se puede usar un anticuerpo secundario específico para esa especie de anticuerpo para aplicar el marcador. En otro ejemplo, el anticuerpo primario puede modificarse para que contenga un resto separado al que puede unirse una entidad de unión específica. Un ejemplo de dicho anticuerpo primario es un anticuerpo haptenizado (es decir, un anticuerpo modificado para que contenga un hapteno específico). Son conocidos muchos haptenos diferentes, por lo que cada uno de los anticuerpos primarios puede modificarse para que contenga un hapteno diferente, y se pueden usar diferentes anticuerpos contra haptenos para marcar específicamente los diferentes anticuerpos primarios.
En otro modo de realización, la señal detectable puede amplificarse. Como se usa en el presente documento, una señal se “amplifica” cuando se deposita más marcador por anticuerpo primario que usando una disposición convencional de anticuerpo primario-secundario. Un procedimiento de amplificación frecuentemente utilizado es la amplificación de señal con tiramida, que se describe en Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J. y Litt, G. J. (1989) J. Immunol. Methods 125, 279-285. En un ejemplo de modo de realización se usa una forma modificada de amplificación de señal con tiramida como se describe en el documento WO 2013148498.
Refiriéndonos ahora a la FIG. 1, la presente invención presenta ensayos múltiples para una puntuación mejorada de los tejidos tumorales teñidos con PD-L1. Los ensayos incluyen etapas para teñir PD-L1 en un primer color (PD-L1 se muestra en marrón en la FIG. 1), así como etapas para teñir un marcador específico de células tumorales y/o un marcador específico de células inmunitarias con un segundo y/o tercer color diferenciador. Por ejemplo, en la FIG. 1 se muestra PD-L1 teñido de marrón (como se indica en [a]), citoqueratinas destinatarias de anticuerpos panqueratínicos (citoqueratinas específicas para las células cancerosas epiteliales) teñidas de rojo/rosa (como se indica en [b]) y CD4 (de células inmunitarias) teñido de verde/azul (como se indica en [c]). Los colores diferenciadores (rojo/rosa y verde/azul) permiten determinar si el PD-L1 que se detecta está presente en células tumorales o en células inmunitarias. Por tanto, los ensayos de la presente invención ayudan a diferenciar entre las células tumorales positivas para PD-L1 y las células inmunitarias positivas para PD-L1. Esto puede mejorar la capacidad de puntuar las muestras (de forma manual/visual, a máquina/análisis de imágenes) más rápidamente, con exactitud y con mayor grado de reproducibilidad en comparación con la puntuación de muestras marcadas con PD-L1 solo.
La tabla 1 ilustra el uso de marcadores/colores diferenciadores para diferenciar entre las células tumorales positivas para PD-L1 y las células inmunitarias positivas para PD-L1. El PD-L1 se puede detectar usando el anticuerpo anti-PD-L1, y el PD-L1 es visible como un primer color (por ejemplo, marrón en el ejemplo que se muestra en la FIG. 1). Las células tumorales con PD-L1 mostrarán el primer color (PD-L1), como lo indica el signo “+” en la columna 4 de la tabla 1 (téngase en cuenta que las células tumorales sin PD-L1 no tienen el primer color, como lo indica el signo “-” en la columna 4 de la tabla 1). Las células inmunitarias también presentan expresión de PD-L1 y pueden mostrarse como el primer color (PD-L1), como lo indica el signo “+” en la columna 1 de la tabla 1. Para diferenciar entre los dos tipos de células positivas para PD-L1, la muestra se tiñe para un marcador específico del tumor (por ejemplo, citoqueratinas detectadas por el anticuerpo panqueratínico), que es visible como un segundo color (un color diferente del primer color). La muestra también se puede teñir para un marcador específico de células inmunitarias (por ejemplo, CD4 u otro marcador), que es visible como un tercer color (un color diferente del primer y segundo colores).
TABLA 1 (véase resumen a continuación)
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Resumen de la tabla 1: Las células que tienen tanto el primer color (PD-L1) como el segundo (marcador diferenciador específico de células tumorales) pero no el tercero (marcador diferenciador específico de células inmunitarias) son células tumorales positivas para PD-L1 (columna 3); las células que tienen tanto el primer color (PD-L1) como el tercero (marcador diferenciador específico de células inmunitarias) pero no el segundo son células inmunitarias positivas para PD-L1 (columna 1); y las células que tienen el segundo color (marcador diferenciador específico de células tumorales) pero no el primero (PD-L1) ni el tercero (marcador diferenciador específico de células inmunitarias) son células tumorales negativas para PD-L1 (columna 4). Las células que tienen el tercer color pero no el primero y el segundo son células inmunitarias negativas para PD-L1 (columna 2). La presente invención no se limita a la tinción en ningún orden determinado. Por ejemplo, el ejemplo 1 describe la tinción primero para PD-L1, a continuación la tinción para el marcador específico de células tumorales, a continuación la tinción para el marcador específico de células inmunitarias y, finalmente, el uso de una contratinción. Sin embargo, en algunos modos de realización, el orden de la tinción es diferente. Por ejemplo, en algunos modos de realización, el marcador específico de células inmunitarias se tiñe antes de teñir el marcador específico de células tumorales, etc.
Como se describe previamente, los ensayos de la presente invención muestran la tinción de PD-L1 así como la tinción de uno o más marcadores diferenciadores. Los procedimientos de tinción pueden incluir la inmunohistoquímica (IHQ). Las técnicas de tinción se pueden aplicar a diversas muestras biológicas, tales como tejido (por ejemplo, muestras frescas congeladas, fijadas en formol e incluidas en parafina [FFIP]) y muestras citológicas. Los marcadores cromógenos se utilizan para el reconocimiento de los marcadores o dianas (por ejemplo, PD-L1, marcador específico de células tumorales, marcador específico de células inmunitarias, etc.). Los marcadores son bien conocidas por los expertos normales en la técnica y no están limitados a los marcadores descritos en el presente documento.
Un ejemplo no limitativo de un protocolo detallado se describe en el ejemplo 1 a continuación. Brevemente, las muestras de interés se tiñen para PD-L1. La muestra se incuba primero con un anticuerpo primario anti-PD-L1. El anticuerpo primario anti-PD-L1 se detecta con un primer color. En el ejemplo 1, la muestra se incuba con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (PRP) contra el anticuerpo primario anti-PD-L1 y se le añade un sustrato (3,3'-diaminobencidina (DAB]), produciendo el primer color (por ejemplo, marrón). Se describen a continuación enzimas y sustratos alternativos (y los colores resultantes).
La muestra se tiñe a continuación para un primer marcador diferenciador, por ejemplo, un marcador que es específico de células tumorales. Los ejemplos de biomarcadores específicos de células tumorales pueden incluir, entre otros: citoqueratinas detectables con el anticuerpo panqueratínico (por ejemplo, citoqueratinas básicas, muchas de las citoqueratinas ácidas), otras citoqueratinas como la citoqueratina 7 (CK7) y citoqueratina 20 (CK20), cromogranina, sinaptofisina, CD56, factor tiroideo de transcripción 1 (FTT-1), p53, antígeno leucocitario común (ALC), vimentina, actina de músculo liso o similares (por ejemplo, véase Capelozzi, V., J Bras Pneumol. 2009; 35[4]:375-382). Un experto normal en la técnica puede sustituir las citoqueratinas por otro biomarcador específico de células tumorales adecuado como se describe en el ejemplo 1. La muestra se incuba primero con un anticuerpo primario (por ejemplo, anticuerpo antipanqueratínico) contra el primer marcador diferenciador (marcador específico de células tumorales). El anticuerpo primario del marcador antidiferenciador se detecta con un segundo color. En el ejemplo 1, la muestra se incuba con un anticuerpo haptenizado contra el anticuerpo primario del marcador antidiferenciador, y a continuación la muestra se incuba con un anticuerpo antihaptánico conjugado con fosfatasa alcalina (FA). El sustrato cromógeno Fast Red produce el segundo color (por ejemplo, rojo).
La muestra puede teñirse a continuación para un marcador específico de células inmunitarias. Los ejemplos no limitantes de biomarcadores específicos de células inmunitarias incluyen CD4 o cualquier otro marcador de CD. Los biomarcadores específicos de células inmunitarias son bien conocidos para un experto normal en la técnica. Un experto normal en la técnica podría sustituir CD4 por otro biomarcador específico de células inmunitarias adecuado como se describe en el ejemplo 1. La muestra se incuba primero con un anticuerpo primario (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD4) contra el segundo marcador diferenciador (marcador específico de células inmunitarias). El anticuerpo primario del marcador antidiferenciador se detecta con un tercer color. En el ejemplo 1, la muestra se incuba con un anticuerpo secundario conjugado con PRP contra el anticuerpo primario del marcador antidiferenciador y se le añade el sustrato cromógeno HRP-Green, que produce el tercer color (por ejemplo, verde/azul).
En algunos modos de realización, las muestras se contratiñen a continuación, produciendo un cuarto color (cuarto color que es diferente del primer, segundo y tercer colores). En algunos modos de realización, la contratinción comprende hematoxilina; sin embargo, la contratinción no se limita a la hematoxilina. Las contratinciones alternativas son bien conocidas para un experto normal en la técnica. Por ejemplo, la contratinción puede comprender azul de metileno, rojo nuclear, azul de toluidina, eosina, verde de metilo o similares. La contratinción concreta se selecciona, en general, para producir contraste para mejorar la visibilidad.
Siguiendo el procedimiento de tinción, las muestras se interpretan y puntúan a continuación (la puntuación se describe a continuación). En algunos modos de realización, los resultados de la tinción pueden interpretarse como se describe en la tabla 1. En el caso de un ensayo en el que se tiñe para PD-L1, un marcador específico de células tumorales (por ejemplo, citoqueratinas) y un marcador específico de células inmunitarias, las células que puntúan para el primer y tercer colores pero no para el segundo son células inmunitarias positivas para PD-L1, las células que puntúan tanto para el primer color como para el segundo (pero no para el tercero) son células cancerosas positivas para PD-L1, y las células que puntúan para el segundo color pero no para el primero ni el tercero son células cancerosas negativas para PD-L1. En algunos modos de realización, el primer color y el segundo se superponen (u otros se superponen), produciendo un quinto color (diferente). Este color de superposición puede ayudar a puntuar.
En algunos modos de realización, la tinción (por ejemplo, PD-L1 y el marcador diferenciador) se produce secuencialmente. En algunos modos de realización, la tinción se produce simultáneamente.
La presente invención no se limita a la tinción en ningún orden determinado. Por ejemplo, el ejemplo 1 describe la tinción primero para PD-L1, a continuación la tinción para el marcador específico de células tumorales, a continuación la tinción para el marcador específico de células inmunitarias y, finalmente, el uso de una contratinción. Sin embargo, en algunos ejemplos, el marcador específico de células tumorales (o marcador específico de células inmunitarias) se tiñe primero, seguido de la tinción PD-L1, etc.
CONJUGADOS DE SEÑALIZACIÓN (SUSTRATOS CROMÓGENOS DE IHQ/HIS)
La presente invención no se limita a los conjugados de señalización (por ejemplo, enzimas y sustratos cromógenos) utilizados en el ejemplo 1 ni a los demás conjugados de señalización descritos en el presente documento. Los expertos normales en la técnica conocen bien los pares alternativos de sustrato cromógeno-enzima para los procedimientos de detección (por ejemplo, inmunohistoquímica, etc.).
Tradicionalmente, los sustratos cromógenos precipitan cuando son activados por la enzima apropiada. Es decir, la sustancia cromógena tradicional se convierte de un reactivo soluble en un precipitado coloreado insoluble tras ponerse en contacto con la enzima. Los sustratos cromógenos utilizados para la presente invención pueden ser compatibles con instrumentos y procesos automatizados de tinción de portaobjetos y/o instrumentos y programas informáticos de detección y análisis automatizados. Esto puede permitir una alta sensibilidad de detección y capacidad de multiplexación.
Por ejemplo, la enzima del anticuerpo secundario comprende PRP, fosfatasa alcalina (FA), glucosa oxidasa, betagalactosidasa, similares y/u otras descritas en la solicitud de patente WO n.° 20131484498. En algunos ejemplos, el sustrato comprende DAB, Fast Red y Fast Blue, Fast Red y Black (plateado), cloruro de azul de nitrotetrazolio (NBT), 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfatasa (BCIP), x-gal, 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), 5-bromo-4-cloro-3-indoil-beta-D-galactopiranósido (BCIG), paranitrofenilfosfato (pNPP), ácido 2,2'-azinobis [3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico] (ABTS), 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), cromógeno HRP-Green, similares y/u otros descritos en la solicitud de patente WO n.° 20131484498. El ejemplo 2 (a continuación) describen además conjugados de señalización alternativos.
La presente invención tampoco está limitada a ningún color o combinación de colores determinados. Por ejemplo, en algunos modos de realización, el primer color (PD-L1) es marrón; sin embargo, en algunos ejemplos, el primer color (PD-L1) puede ser cualquier otro color adecuado, por ejemplo, rojo, azul, amarillo, verde, etc., en función de la combinación de enzima y sustrato. En algunos modos de realización, el segundo color (por ejemplo, citoqueratinas, otros marcadores) puede ser rojo/rosa; sin embargo, en algunos ejemplos, el segundo color (por ejemplo, citoqueratinas, otros marcadores) puede ser de cualquier otro color adecuado, por ejemplo, marrón, azul, amarillo, verde, etc., dependiendo de la combinación de enzima y sustrato. En algunos modos de realización, el tercer color (por ejemplo, CD4, otros marcadores) puede ser verde/azul; sin embargo, en algunos ejemplos, el tercer color (por ejemplo, CD4, otros marcadores) puede ser cualquier otro color adecuado, por ejemplo, marrón, rojo/rosa, amarillo, etc., dependiendo de la combinación de enzima y sustrato. En algunos ejemplos, el cuarto color (contratinción) puede ser azul; sin embargo, el cuarto color (contratinción) puede ser cualquier otro color adecuado, por ejemplo, rojo, verde, etc. En algunos ejemplos, el quinto color (superposición de los dos colores) puede ser morado (por ejemplo, si los dos colores son rojo y azul), verde (por ejemplo, si los dos colores son amarillo y azul), naranja (por ejemplo, si los dos colores son rojo y amarillo), etc., dependiendo de la combinación de los dos colores.
PUNTUACIÓN
Las muestras se puntúan a continuación. El segundo color (y el tercer color) dirige la puntuación de PD-L1 en las células tumorales o en las células inmunitarias. El uso del tercer color puede mejorar la puntuación. Por ejemplo, el uso del tercer color puede ayudar a aclarar qué tipo de célula (tumoral frente a inmunitaria) es positiva para PD-L1. Esto puede mejorar la exactitud del cálculo del número de células inmunitarias positivas para PD-L1, células tumorales negativas para PD-L1 y células tumorales positivas para PD-L1.
Un resultado positivo (por ejemplo, un “resultado positivo para PD-L1”) se puede calcular de varias formas y no se limita a los ejemplos descritos en el presente documento.
En algunos ejemplos, el número de células tumorales positivas para PD-L1 o el área de PD-L1 que está asociada con células tumorales (por ejemplo, el área del portaobjetos cubierta de PD-L1 debido a células tumorales) o el porcentaje de células tumorales positivas para PD-L1 pueden calcularse y a continuación introducirse en una ecuación para calcular la puntuación H. Por ejemplo, si la puntuación H está por encima de un umbral de positividad para PD-L1, entonces la muestra es positiva para PD-L1, y si la puntuación H está por debajo del umbral de positividad para PD-L1, entonces la muestra es negativa para PD-L1.
En el ejemplo 3 se presentan ejemplos no limitantes de cálculos de puntuación. Algunos ejemplos se describen brevemente a continuación:
En algunos ejemplos se determina un resultado positivo calculando el porcentaje de células tumorales positivas para PD-L1 y determinando si ese porcentaje está por encima del umbral de positividad o de un valor de corte predeterminado. Por ejemplo, en algunos modos de realización, el porcentaje mínimo de células PD-L1 que confiere positividad para PD-L1, por ejemplo, un 5 % o más de células tumorales positivas para PD-L1 confieren positividad para PD-L1, un 10 % o más células tumorales positivas para PD-L1 confieren positividad para PD-L1, un 25 % o más células tumorales positivas para PD-L1 confieren positividad para PD-L1, un 50 % o más células tumorales positivas para PD-L1 confieren positividad para PD-L1, etc.
En algunos ejemplos, se determina un resultado positivo calculando el número de células tumorales positivas para PD-L1 dividido entre el número total de células (por ejemplo, número de células tumorales más inmunitarias) y determinando si ese valor está por encima del umbral de positividad (por ejemplo, valor mayor que 0,15, valor mayor que 0,25, valor mayor que 0,5, etc.).
En algunos ejemplos se determina un resultado positivo calculando la suma del porcentaje de células tumorales positivas para PD-L1 y células inmunitarias positivas para PD-L1 y determinando si ese valor está por encima del umbral de positividad (por ejemplo, valor mayor que 40, valor mayor que 50, valor mayor que 60, etc.).
En algunos ejemplos se determina un resultado positivo calculando el número de células tumorales positivas para PD-L1 dividido entre el número de células tumorales negativas para PD-L1 y determinando si ese valor está por encima del umbral de positividad (por ejemplo, valor mayor que 1,5, valor mayor que 1,8, valor mayor que 2, etc.). En algunos ejemplos se determina un resultado positivo calculando el número de células tumorales positivas para PD-L1 dividido entre la suma del número de células tumorales negativas para PD-L1 y el número de células inmunitarias negativas para PD-L1 y determinando si ese valor está por encima del umbral de positividad (por ejemplo, mayor que 1,1, mayor que 1,3, etc.).
En algunos ejemplos se determina un resultado positivo calculando el número de células tumorales positivas para PD-L1 dividido entre la suma del número de células tumorales negativas para PD-L1 y el número de células inmunitarias positivas para PD-L1 y determinando si ese valor está por encima del umbral de positividad (por ejemplo, mayor que 1,1, mayor que 1,3, etc.).
En algunos ejemplos se determina un resultado positivo calculando el número de células tumorales positivas para PD-L1 dividido entre el número de células inmunitarias positivas para PD-L1 y determinando si ese valor está por encima del umbral de positividad. En algunos modos de realización se determina un resultado positivo calculando el número de células tumorales positivas para PD-L1 dividido entre el número de células inmunitarias negativas para PD-L1 y determinando si ese valor está por encima del umbral de positividad.
Como se analiza anteriormente, la positividad para PD-L1 puede determinarse calculando el porcentaje de células tumorales positivas para PD-L1. Por ejemplo, la tinción en más de aproximadamente un 1 % de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1. En otro ejemplo, la tinción en más de aproximadamente un 5 % de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1. En algunos modos de realización, la tinción en más de aproximadamente un 10 % de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1. En algunos ejemplos, la tinción en más de aproximadamente un 15 % de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1. En algunos ejemplos, la tinción en más de aproximadamente un 20 % de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1. En algunos ejemplos, la tinción en más de aproximadamente un 25 % de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1. En algunos ejemplos, la tinción en más de aproximadamente un 30 % de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1. En algunos ejemplos, la tinción en más de aproximadamente un 35 % de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1. En algunos ejemplos, la tinción en más de aproximadamente un 40% de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1. En algunos ejemplos, la tinción en más de aproximadamente un 45 % de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1. En algunos modos de realización, la tinción en más de aproximadamente un 50 % de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1. En algunos ejemplos, la tinción en más de aproximadamente un 55 % de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1. En algunos ejemplos, la tinción en más de aproximadamente un 60% de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1. En algunos ejemplos, la tinción en más de aproximadamente un 65 % de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1. En algunos ejemplos, la tinción en más de aproximadamente un 70 % de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1. En algunos ejemplos, la tinción en más de aproximadamente un 75 % de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1. En algunos ejemplos, la tinción en más de aproximadamente un 80 % de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1. En algunos ejemplos, la tinción en más de aproximadamente un 90 % de las células (por ejemplo, células tumorales) se puntúa como positiva para PD-L1.
El número o porcentaje de células inmunitarias positivas para PD-L1 puede ser relevante para la determinación de la positividad para PD-L1. Por ejemplo, la tinción en más de aproximadamente un 5 % de las células inmunitarias se asocia con una puntuación positiva para PD-L1. En algunos modos de realización, la tinción en más de aproximadamente un 10 % de las células inmunitarias se asocia con una puntuación positiva para PD-L1. En algunos ejemplos, la tinción en más de aproximadamente un 15 % de las células inmunitarias se asocia con una puntuación positiva para PD-L1. En algunos ejemplos, la tinción en más de aproximadamente un 25 % de las células inmunitarias se asocia con una puntuación positiva para PD-L1. En algunos modos de realización, la tinción en más de aproximadamente un 50 % de las células inmunitarias se asocia con una puntuación positiva para PD-L1.
La positividad de la muestra también puede determinarse por el grado o la intensidad de la tinción (por ejemplo, la tinción intensa puede ser positiva y la tinción ligera puede ser negativa). En algunos modos de realización, los procedimientos de puntuación pueden presentar la puntuación de las muestras en una escala de intensidad, por ejemplo, de 0 a 3, para la expresión de PD-L1 (véase, por ejemplo, la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/875.334 (procedimiento de puntuación para la expresión de la proteína mesotelina). En algunos modos de realización, las muestras se puntúan en base a la intensidad y los porcentajes de tinción de las células. Por ejemplo, como se describe en la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/875334, las puntuaciones H se calculan como: 1 * (porcentaje de tinción de células tumorales a una intensidad de 1+) 2 * (porcentaje de tinción de células tumorales a una intensidad de 2+) 3 * (porcentaje de tinción de células a una intensidad de 3+) = puntuación H (valor entre 0 y 300). Se han descrito otros procedimientos de puntuación y son bien conocidos por los expertos normales en la técnica.
EJEMPLO 1: PROTOCOLO PARA ENSAYO MÚLTIPLE
En el ejemplo 1 se describe un ejemplo no limitante de un ensayo IHQ múltiple de la presente invención. Se prepara un portaobjetos con muestra de CPNM de acuerdo con los protocolos convencionales.
1. Aplicar 1 gota de anticuerpo PD-L1 SP142 (Ventana Medical System, Tucson, Arizona) al portaobjetos e incubar durante 16 minutos. Enjuagar el portaobjetos con amortiguador de reacción.
2. Aplicar 1 gota de OptiView HQ Universal Linker (número de catálogo 760-700, Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona) e incubar durante 8 minutos. Enjuagar el portaobjetos con amortiguador de reacción.
3. Aplicar 1 gota de OptiView PRP Multimer (número de catálogo 760-700, Ventana Medical System, Tucson, Arizona) e incubar durante 8 minutos. Enjuagar el portaobjetos con amortiguador de reacción.
4. Aplicar 1 gota de cada uno de OptiView Amplifier H2O2 y OptiView Amplifier (número de catálogo 760-700, Ventana Medical System, Tucson, Arizona) e incubar durante 8 minutos. Enjuagar el portaobjetos con amortiguador de reacción.
5. Aplicar 1 gota de OptiView Amplifier Multimer (número de catálogo 760-700, Ventana Medical System, Tucson, Arizona) e incubar durante 8 minutos. Enjuagar el portaobjetos con amortiguador de reacción.
6. Aplicar 1 gota de OptiView H2O2 y 1 gota de OptiView DAB (número de catálogo 760-700, Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona) e incubar durante 8 minutos. Enjuagar el portaobjetos con amortiguador de reacción. 7. Aplicar 1 gota de OptiView Copper (número de catálogo 760-700, Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona) e incubar durante 4 minutos. Enjuagar el portaobjetos con amortiguador de reacción.
8. Aplicar 1 gota de anticuerpo primario panqueratínico (AE1/AE3/PCK26; número de catálogo 760-2595, Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona). Incubar durante 8 minutos. Enjuagar el portaobjetos con amortiguador de reacción.
9. Aplicar 1 gota de anticuerpo antimurino haptenizado e incubar durante 8 minutos. Enjuagar el portaobjetos con amortiguador de reacción.
10. Aplicar 1 gota de anticuerpo antihapténico conjugado con FA e incubar durante 8 minutos. Enjuagar el portaobjetos con amortiguador de reacción.
11. Aplicar cromógeno Fast Red e incubar durante 8 minutos. Enjuagar con amortiguador de reacción.
12. Aplicar 1 gota de anticuerpo primario monoclonal de conejo anti-CD4 (SP35; número de catálogo 790-4423, Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona) e incubar durante 16 minutos. Enjuagar el portaobjetos con amortiguador de reacción.
13. Aplicar 1 gota de anticuerpo anticunicular conjugado con PRP e incubar durante 16 minutos. Enjuagar el portaobjetos con amortiguador de reacción.
14. Aplicar 2 gotas de HRP-Green Chromogen Detection 1 e incubar durante 4 minutos.
15. Aplicar 2 gotas de HRP-Green Chromogen Detection 2 e incubar durante 12 minutos. Enjuagar el portaobjetos con amortiguador de reacción.
16. Aplicar 1 gota de hematoxilina de Mayer (1:5) e incubar durante 4 minutos. Enjuagar el portaobjetos con amortiguador de reacción.
EJEMPLO 2: CONJUGADOS DE SEÑALIZACIÓN
En el siguiente ejemplo se describen conjugados de señalización alternativos descritos en la solicitud de patente WO n.22013148498.
En algunos modos de realización, los procedimientos para detectar una diana en una muestra biológica incluyen poner en contacto la muestra biológica con una sonda de detección, poner en contacto la muestra biológica con un conjugado marcador y poner en contacto la muestra biológica con un conjugado de señalización. El conjugado marcador incluye una enzima. El conjugado de señalización incluye un resto reactivo latente y un resto cromógeno. La enzima cataliza la conversión del resto reactivo latente en un resto reactivo que se une covalentemente a la muestra biológica de forma proximal a la diana o directamente sobre ella. El procedimiento incluye además iluminar la muestra biológica con luz y detectar la diana a través de la absorbancia de la luz por el resto cromógeno del conjugado de señalización. En un modo de realización, el resto reactivo reacciona con un residuo de tirosina de la muestra biológica, el conjugado enzimático, la sonda de detección o combinaciones de los mismos.
En algunos modos de realización, la sonda de detección es una sonda de anticuerpo. En algunos modos de realización, el conjugado marcador incluye un anticuerpo acoplado a la enzima. Las enzimas pueden incluir oxidorreductasas, peroxidasas o hidrolasas. Un anticuerpo para el conjugado marcador sería un anticuerpo antiespecie o antihapténico. La sonda de detección puede incluir un hapteno seleccionado del grupo que consiste en un hapteno oxazólico, hapteno pirazólico, hapteno tiazólico, hapteno nitroarílico, hapteno benzofuránico, hapteno triterpénico, hapteno ureico, hapteno tioureico, hapteno rotenóidico, hapteno cumarínico, hapteno ciclolignánico, hapteno dinitrofenílico, hapteno biotínico, hapteno digoxigenínico, hapteno fluoresceínico y hapteno rodamínico. En otros ejemplos, la sonda de detección es un anticuerpo monoclonal derivado de una segunda especie tal como cabra, conejo, ratón o similar. El conjugado marcador se configura, mediante su inclusión de un anticuerpo antiespecie o antihaptánico, para unirse selectivamente a la sonda de detección.
Los conjugados cromógenos utilizados para la presente invención se pueden configurar para absorber la luz de manera más selectiva que los cromógenos disponibles tradicionalmente. La detección se lleva a cabo mediante la absorbancia de la luz por el conjugado de señalización; por ejemplo, la absorbancia de al menos aproximadamente un 5 % de la luz incidente facilitaría la detección de la diana. En otras manchas más oscuras, se absorbería al menos aproximadamente un 20 % de la luz incidente. La absorbancia no uniforme de la luz dentro de los espectros visibles da como resultado que el resto cromóforo aparezca coloreado. Los conjugados de señalización divulgados en el presente documento pueden aparecer coloreados debido a su absorbancia; los conjugados de señalización pueden proporcionar cualquier color cuando se usan en el ensayo, y ciertos colores determinados incluyen rojo, naranja, amarillo, verde, añil o violeta dependiendo de la absorbancia espectral asociada con el resto cromóforo. De acuerdo con otro aspecto, los restos cromóforos pueden tener absorbancias espectrales más estrechas que las absorbancias de los cromógenos usados tradicionalmente (por ejemplo, DAB, Fast Red, Fast Blue). En modos de realización ilustrativos, la absorbancia espectral asociada con el primer resto cromóforo del primer conjugado de señalización tiene una anchura a media altura (AMA) de entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 250 nm, entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 150 nm, entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 100 nm o entre aproximadamente 20 nm y aproximadamente 60 nm.
Las absorbancias espectrales estrechas permiten que el resto cromóforo del conjugado de señalización se analice de forma diferente que los cromógenos tradicionales. Si bien tiene características mejoradas en comparación con los cromógenos tradicionales, la detección de los conjugados de señalización sigue siendo sencilla. En modos de realización ilustrativos, la detección comprende usar un microscopio de campo claro o un escáner digital equivalente. Las absorbancias espectrales estrechas permiten la multiplexación cromogénica a un nivel que va más allá de la capacidad de los cromógenos tradicionales. Por ejemplo, los cromógenos tradicionales se duplican de forma en cierto modo rutinaria (por ejemplo, Fast Red y Fast Blue, Fast Red y Black [plateado], Fast Red y DAB).
Sin embargo, las aplicaciones triplicadas o tricolores, o de más colores, son atípicas, ya que se hace difícil distinguir un cromóforo de otro. En modos de realización ilustrativos de la tecnología actualmente divulgada, el procedimiento incluye detectar de dos hasta al menos aproximadamente seis dianas diferentes utilizando diferentes conjugados de señalización o combinaciones de los mismos, iluminar la muestra biológica con luz que comprende iluminar la muestra biológica con una fuente de luz espectralmente estrecha, la cual fuente de luz espectralmente estrecha tiene una emisión espectral con una segunda anchura a media altura (AMA) de entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 250 nm, entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 150 nm, entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 100 nm o entre aproximadamente 20 nm y aproximadamente 60 nm. En otro modo de realización, iluminar la muestra biológica con luz incluye iluminar la muestra biológica con una fuente de luz LED. En otro modo de realización, iluminar la muestra biológica con luz incluye iluminar la muestra biológica con una fuente de luz filtrada.
En modos de realización ilustrativos, la detección de dianas en la muestra incluye poner en contacto la muestra biológica con un primer conjugado de amplificación que se deposita covalentemente de forma proximal al primer conjugado marcador o directamente sobre el mismo. El primer conjugado de amplificación se puede seguir poniendo en contacto la muestra biológica con un conjugado marcador secundario. De manera ilustrativa, la amplificación de señal que usa conjugados de amplificación potencia el depósito del conjugado de señalización. El depósito potenciado del conjugado de señalización permite una identificación visual más fácil de la señal cromógena, es decir, la amplificación vuelve el color más oscuro y más fácil de ver. Para dianas de baja expresión, esta amplificación puede hacer que la señal se vuelva lo suficientemente oscura para ser visible, mientras que, sin amplificación, la diana no sería apreciable. En un modo de realización, el conjugado de señalización se deposita covalentemente de forma proximal a la diana a una concentración superior a aproximadamente 1 x 1011 moléculas por cm2<cm hasta aproximadamente 1 x 1016 moléculas por cm^gm de la muestra biológica. En un modo de realización, la primera diana y la segunda diana son ácidos nucleicos genéticos. La detección de la primera diana a través de la absorbancia de la luz por el primer conjugado de señalización incluye la detección de una primera señal coloreada seleccionada entre rojo, naranja, amarillo, verde, añil o violeta, y la primera señal coloreada está asociada con la absorbancia espectral asociada con el primer resto cromógeno del primer conjugado de señalización. La detección de la segunda diana a través de la absorbancia de la luz por el segundo conjugado de señalización incluye la detección de una segunda señal coloreada seleccionada entre rojo, naranja, amarillo, verde, añil o violeta, y la segunda señal coloreada está asociada con la absorbancia espectral asociada con el segundo resto cromógeno del segundo conjugado de señalización. Detectar una superposición en proximidad a través de la absorbancia de la luz por el primer conjugado de señalización que se superpone en proximidad con el segundo conjugado de señalización, de modo que una tercera señal coloreada se asocie con la absorbancia espectral superpuesta de la primera absorbancia espectral y la segunda absorbancia espectral. De acuerdo con un ejemplo, este tercer color indica una disposición genética normal y el primer y el segundo color indican una reordenación o genética.
EJEMPLO 3: PUNTUACIÓN
En el siguiente ejemplo se describen varios cálculos (3A-3E) para determinar la positividad para PD-L1.
Ejemplo 3A
Ecuación: valor de PD-L1 = porcentaje de células tumorales positivas para PD-L1.
Umbral de positividad: valor de PD-L1 >40 % es positivo para PD-L1.
Un anatomopatólogo examina la muestra 3A y calcula el porcentaje de células tumorales positivas para PD-L1 en un 48 %. Basándose en el umbral de positividad, la muestra 3A se marca como positiva para PD-L1.
Ejemplo 3B
Ecuación: valor de PD-L1 = n.° de células tumorales positivas para PD-L1/n.° total de células.
Umbral de positividad: valor de PD-L1 >0,25 es positivo para PD-L1.
Un anatomopatólogo examina la muestra 3B. El número de células tumorales positivas para PD-L1 es de 68 y el número total de células es de 460. El valor de PD-L1 basado en el cálculo anterior es de 68/460 = 0,147. Basándose en el umbral de positividad, la muestra 3B se marca como negativa para PD-L1.
Ejemplo 3C
Ecuación: valor de PD-L1 = % de células tumorales positivas para PD-L1 % de células inmunitarias positivas para PD-L1.
Umbral de positividad: valor de PD-L1 >60 es positivo para PD-L1.
Un anatomopatólogo examina la muestra 3C. El porcentaje de células tumorales positivas para PD-L1 es de 50 y el porcentaje de células inmunitarias positivas para PD-L1 es de 20. El valor de PD-L1 basado en el cálculo anterior es de 50 20 = 70. Basándose en el umbral de positividad, la muestra 3C se marca como positiva para PD-L1.
Ejemplo 3D
Ecuación: valor de PD-L1 = n.° de células tumorales positivas para PD-L1/(n.2 de células tumorales negativas para PD-L1 n.° de células inmunitarias positivas para PD-L1).
Umbral de positividad: valor de PD-L1 >0,8 es positivo para PD-L1.
Un anatomopatólogo examina la muestra 3D. El número de células tumorales positivas para PD-L1 es de 68, el número de células tumorales negativas para PD-L1 es de 45 y el número de células inmunitarias positivas para PD-L1 es de 210. El valor de PD-L1 basado en el cálculo anterior es de 68/(45 210) = 0,266. Basándose en el umbral de positividad, la muestra 3D se marca como negativa para PD-L1.
Ejemplo 3E
Ecuación: puntuación H = 1 * (porcentaje de tinción de células tumorales a una intensidad de 1+) 2 * (porcentaje de tinción de células tumorales a una intensidad de 2+) 3 * (porcentaje de tinción de células a una intensidad de 3+).
Umbral de positividad: puntuación H >125 es positiva para PD-L1.
Un anatomopatólogo examina la muestra 3E. El porcentaje de tinción de células tumorales positivas para PD-L1 a una intensidad de 1+ es de un 5 %, el porcentaje de tinción de células tumorales positivas para PD-L1 a una intensidad de 2+ es de un 35 % y el porcentaje de tinción de células tumorales positivas para PD-L1 a una intensidad de 3+ es de un 20 %. La puntuación H es de 5 (1) 2 (35) 3 (20) = 135. Basándose en el umbral de positividad, la muestra 3E se marca como positiva para PD-L1.
Como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” se refiere a más o menos un 10 % del número al que hacen referencia.
Varias modificaciones de la invención, además de las descritas en el presente documento, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Dichas modificaciones también están destinadas a hallarse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Por ejemplo, un “anticuerpo” utilizado de acuerdo con la presente invención puede ser un anticuerpo completo o un fragmento de un anticuerpo que sea eficaz en la unión a un sitio destinatario deseado. Además, cuando corresponda, un “anticuerpo” de la presente invención puede sustituirse con un resto dirigido (por ejemplo, péptido ligando, molécula pequeña, etc.). Por ejemplo, si la célula tumoral o la célula inmunitaria tienen un receptor de superficie celular específico, diferenciador y único, entonces se puede usar un resto dirigido correspondiente de acuerdo con la presente invención para diferenciar células tumorales de células inmunitarias.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para puntuar la expresión de PD-L1 en una muestra tumoral, comprendiendo el procedimiento:
• marcar la muestra de tejido tumoral, comprendiendo el marcado:
o poner en contacto la muestra de tejido con un anticuerpo primario anti-PD-L1; y
o poner en contacto la misma muestra de tejido con
o un anticuerpo primario dirigido a un marcador específico de células tumorales y un anticuerpo dirigido a un marcador específico de células inmunitarias; y
o visualizar cada uno de los anticuerpos en la muestra de tejido con un reactivo que genera una señal detectable correspondiente a cada uno de los anticuerpos primarios, en el que el anticuerpo anti-PD-L1 tiene una primera señal detectable, el anticuerpo dirigido al marcador específico de células tumorales tiene una segunda señal detectable distinguible de la primera señal detectable, y el anticuerpo dirigido a un marcador específico de células inmunitarias tiene una tercera señal detectable distinguible de la primera señal detectable y de la segunda señal detectable;
en el que la primera, segunda y tercera señales detectables son generadas por cromógenos; y
• puntuar la expresión de PD-L1 en células tumorales, células inmunitarias, o ambas, en el que la localización conjunta de la primera y segunda señales detectables indica la presencia de células tumorales positivas para PD-L1 y la localización conjunta de la primera y tercera señales detectables indica la presencia de células inmunitarias positivas para PD-L1.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el marcador específico de células tumorales se selecciona del grupo que consiste en una citoqueratina, cromogranina, sinaptofisina, CD56, factor tiroideo de transcripción 1 (FTT-1), p53, antígeno leucocitario común (ALC), vimentina y actina de músculo liso, y en el que el marcador específico de células inmunitarias se selecciona del grupo que consiste en CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD11c, CD123, CD56, CD14, CD33, o CD66b.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el marcador específico de células inmunitarias es un marcador de linfocitos T o un marcador de linfocitos B.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo dirigido al marcador específico de células tumorales es un anticuerpo panqueratínico y el anticuerpo dirigido al marcador específico de células inmunitarias es un anticuerpo anti-CD4.
5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que:
• la primera señal detectable se genera
o poniendo en contacto la muestra de tejido con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (PRP) que reconoce el anticuerpo primario anti-PD-L1;
o haciendo reaccionar la PRP con 3,3'-diaminobencidina (DAB) para producir un color marrón; • la segunda señal detectable se genera:
o poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (FA) que reconoce el anticuerpo primario dirigido a un marcador específico de células tumorales;
o haciendo reaccionar la FA con un cromógeno Fast Red y naftol para producir un color rojo; y • la tercera señal detectable se genera
o poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo secundario conjugado con PRP que reconoce el anticuerpo primario dirigido a un marcador específico de células inmunitarias;
o haciendo reaccionar la PRP con cromógeno HRP-Green para producir un color verde.
6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la primera, segunda y/o tercera señal detectable es una señal amplificada, opcionalmente en el que la señal amplificada se genera por amplificación de señal con tiramida.
7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que poner en contacto la muestra con los anticuerpos primarios se realiza simultáneamente, o en el que poner en contacto la muestra con los anticuerpos primarios se realiza secuencialmente.
8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además contrateñir la muestra de tejido, produciendo dicha contratinción una cuarta señal detectable que es distinguible de la primera, segunda y tercera señales detectables, opcionalmente en el que la contratinción comprende hematoxilina.
9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que se produce una quinta señal detectable por superposición de la primera señal detectable y la segunda señal detectable.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que se produce una sexta señal detectable por superposición de la primera señal detectable y la tercera señal detectable.
11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que se cuantifica el número total de células tumorales positivas para PD-L1 y negativas para PD-L1, y en el que el tumor se puntúa como positivo para PD-L1 si se detecta tinción para PD-L1 en más de aproximadamente un 10 % de las células tumorales, o el tumor se puntúa como positivo para PD-L1 si se detecta tinción para PD-L1 en más de aproximadamente un 50 % de las células tumorales.
12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que se cuantifica el número total de células inmunitarias positivas para PD-L1 y negativas para PD-L1, y en el que el tumor se puntúa como positivo para PD-L1 si se detecta tinción para PD-L1 en más de aproximadamente un 10 % de las células inmunitarias, o el tumor se puntúa como positivo para PD-L1 si se detecta tinción para PD-L1 en más de aproximadamente un 50 % de las células inmunitarias.
13. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a 10, en el que las células inmunitarias positivas para PD-L1, las células tumorales positivas para PD-L1 y las células tumorales negativas para PD-L1 se cuantifican para generar un valor de PD-L1, en el que:
Valor de PD-L1 = células tumorales positivas para PD-L1/(células tumorales negativas para PD-L1 células inmunitarias positivas para PD-L1),
en el que:
• las células tumorales positivas para PD-L1 se calculan contando el número de células que se tiñen para la primera y la segunda señales detectables o bien calculando el área de la muestra de tejido en la que la primera señal detectable está asociada con la segunda señal detectable;
• las células tumorales negativas para PD-L1 se calculan contando el número de células que se tiñen solo para la segunda señal detectable o bien calculando el área de la muestra de tejido en la que la segunda señal detectable no está asociada con la primera señal detectable; y
• las células inmunitarias positivas para PD-L1 se calculan contando el número de células que se tiñen para la primera y tercera señales detectables o bien calculando el área de la muestra de tejido en la que la primera señal detectable está asociada con la tercera señal detectable.
14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además puntuar la intensidad de la tinción de PD-L1 en células tumorales positivas para PD-L1 y calcular una puntuación H, en la que: puntuación H = 1 * (porcentaje de tinción de células tumorales positivas para PD-L1 a una intensidad de 1) 2 * (porcentaje de tinción de células tumorales positivas para PD-L1 a una intensidad de 2+) 3 * (porcentaje de tinción de células tumorales positivas para PD-L1 a una intensidad de 3+).
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