ES2965647T3 - Procedimientos y sistemas para la evaluación de infiltrado de células inmunitarias en cáncer colorrectal en estadio III - Google Patents
Procedimientos y sistemas para la evaluación de infiltrado de células inmunitarias en cáncer colorrectal en estadio III Download PDFInfo
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Abstract
Las puntuaciones del contexto inmunológico se calculan para muestras de tejido de tumor colorrectal en estadio III utilizando funciones de puntuación continua. Las métricas de características para al menos un marcador de células inmunitarias se calculan para una región o regiones de interés, incluyendo las métricas de características al menos una densidad de células CD3+ humanas en una región de interés que incluye un margen invasivo. Luego se aplica una función de puntuación continua a un vector de características, cuyo resultado es una puntuación del contexto inmunológico. La puntuación del contexto inmunológico puede luego representarse como una función de una métrica de diagnóstico o tratamiento, tal como una métrica de pronóstico (por ejemplo, supervivencia general, supervivencia específica de la enfermedad, supervivencia libre de progresión) o una métrica predictiva (por ejemplo, probabilidad de respuesta a una enfermedad particular). curso de tratamiento). La puntuación del contexto inmunológico puede luego incorporarse en las decisiones de diagnóstico y/o tratamiento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimientos y sistemas para la evaluación de infiltrado de células inmunitarias en cáncer colorrectal en estadio III
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La invención se refiere a la detección, caracterización y enumeración de poblaciones discretas de células inmunitarias en muestras tumorales para su uso en el pronóstico y tratamiento de enfermedades proliferativas, tales como cánceres colorrectales.
Descripción de la técnica relacionada
Se sabe que la presencia o ausencia de una respuesta inflamatoria es un factor pronóstico en una serie de diferentes tipos de cáncer, incluyendo cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, linfoma no hodgkiniano, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de esófago y carcinoma urotelial, entre otros. Véase Pagéset al.(2010). En cáncer colorrectal, por ejemplo, la cantidad relativa de infiltrado de células inmunitarias se ha considerado un factor pronóstico independiente para cánceres colorrectales desde al menos 1986. Véase Jass (1986). Desde entonces, muchos grupos han evaluado procedimientos analíticos y estadísticos para comprender la interacción entre el pronóstico tumoral y su contexto inmunológico. Véase Meiet al.(2014) (que realiza un metanálisis de numerosos estudios previos sobre cánceres colorrectales).
En tumores colorrectales, han predominado tres procedimientos de puntuar el contexto inmunológico:
(1) la puntuación de Jass, en la que el tumor se clasifica de acuerdo con si existe infiltrado de linfocitos peritumoral extenso o pequeño/ausente (véaseJass(1987));
(2) grado de Klintrup-Makinen, en el que la reacción celular inflamatoria global se puntúa en portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina (HyE) en el margen invasivo (MI) en una escala de 3 puntos (0 = sin incremento de células inflamatorias en MI; 1 = incremento leve e irregular de células inflamatorias en el MI sin destrucción de islotes de células cancerosas invasoras; 2 = un infiltrado en forma de banda en el MI con cierta destrucción de los islotes de células cancerosas; y 3 = reacción inflamatoria muy prominente, formando una zona en forma de copa en el margen invasivo y destrucción de islotes de células cancerosas); o una escala de 2 puntos (inflamación de bajo grado (puntuaciones 0-1 como se describe anteriormente) o inflamación de alto grado (puntuaciones 2-3 como se describe anteriormente), véanse Galonet al.(2014); y
(3) Galon IMMUNOSCORE, en el que los portaobjetos se tiñen inmunohistoquímicamente para al menos dos poblaciones de linfocitos (CD3/CD45R<o>, CD3/CD8 o CD8/CD45RO), y las densidades celulares se puntúan por separado en el núcleo tumoral (NT) y en el MI en una escala de 2 puntos (0 = bajo; 1 = alto), puntuaciones que a continuación se integran en una puntuación compuesta de 0 (por ejemplo, CD3 NT bajo, CD3 MI bajo, CD8 NT bajo, CD8 MI bajo) a 4 (por ejemplo, CD3 NT alto, CD3 MI alto,<c>D8 N<t>alto, CD8 MI alto) (véanse Galonet al(2014); Galon (2016a); Galon (2016b); patente de EE. UU. n.° 8.481.271).
Estos enfoques no son cuantitativos, sino que usan sistemas de puntuación binarios en base a observaciones burdas de cantidades relativas.
Se han realizado algunos intentos de automatizar dicha puntuación de contexto inmunológico.
Por ejemplo, IMMUNOSCORE de HalioDx se implementa en una plataforma de patología digital automatizada de Definiens. Las regiones de NT y MI se anotan por separado en una imagen HyE, que se registra en imágenes de cortes seriados teñidos inmunohistoquímicamente para CD3 y CD8. El programa informático superpone un mosaico de 0,8 mm en cada región, calcula una densidad celular para cada mosaico dentro de la región y a continuación informa de la densidad para toda la región como una media de los tres mosaicos más infiltrados de la región. Véase Aniteiet al.(2014). Las puntuaciones "altas" y "bajas" se determinan definiendo un punto de corte en la media de la densidad celular usando un enfoque de valor depmínimo.Id.
El documento US 9.298.968 describe un sistema de análisis celular que: (1) digitaliza cortes tisulares teñidos; (2) extrae rasgos característicos celulares; (3) estratifica el tejido en compartimentos separados que contienen células tumorales u otros tipos celulares pertinentes en base a los rasgos característicos extraídos; (4) detecta y caracteriza células dentro de compartimentos de interés que se tiñen por encima de un nivel umbral definido para un marcador de tipo de célula inflamatoria; (5) deriva una puntuación de estado de sistema inmunitario para el corte tisular en base a los valores o estadísticas de marcadores de tipo de células inflamatorias; y (6) usa la puntuación para estratificar a los pacientes. Aunque la patente '968 contempla la necesidad de una definición de valor de corte y un sistema de puntuación, no parece proporcionar una metodología concreta para definir dicho valor de corte o implementar un sistema de puntuación. Más bien, se mencionan enfoques comunes tales como delimitar entre regiones "positivas" y "negativas" y aplicar grados de puntuación histológica cualitativa en base a la intensidad (tales como 0, 1,2 y 3), sin explicar cómo se podrían integrar dichos sistemas de puntuación en una puntuación de pronóstico útil. Por lo tanto, la patente '968 solo describe, a un nivel aspiracional, un sistema que podría ser útil para automatizar el análisis, pero no describe ningún análisis de pronóstico específico.
Forrestet al.(2014) proponen un procedimiento automatizado para calcular un grado de Klintrup-Makinen usando el programa informático SLIDEPATH Tissue Image Analysis versión 2.0 de Leica Biosystems. El margen invasivo se anota en cortes de HyE y las densidades de células inmunitarias (expresadas como núcleos/mm2) se detectan automáticamente en las regiones anotadas en base a las intensidades de tinción, tamaño celular y tamaño de núcleos. Se someten a prueba tres cortes seriados para cada tumor y la densidad celular se expresa como la media de los tres cortes. A continuación, a las medias de las densidades celulares se les asigna un grado de 0, 1,2 o 3 en base al cuartil en el que cae la media de la densidad, o en una categoría de "débil" (grados 0 y 1) o "fuerte" (grados 2 y 3).
Kwaket al.(2016), Oncotarget 7(4):81778 enseñan una inmunopuntuación que engloba las densidades de linfocitos T CD3+ y CD8+ en metástasis a distancia como marcador pronóstico de cáncer colorrectal avanzado; Hermitte (2016), J ImmonuTher Cancer 4:57 enseña un Immunoscore® Colon. Wart-Hartstongeet al.(2017) Cancer Immunol Immunother 66:515 informan de la mejora de una inmunopuntuación de cáncer colorrectal por la inclusión de linfocitos T reguladores efectores BLIMP+; y el documento WO 2017/194556 A1 enseña procedimientos para clasificar pacientes con un cáncer sólido.
Cada uno de los procedimientos anteriores, ya sea automatizado o manual, se basa en un sistema de puntuación binario en el que se agrupan una amplia variedad de recuentos celulares potenciales y se consideran eficazmente iguales. Aunque dicho enfoque puede facilitar relativamente el análisis manual y el cálculo de puntuación, lo hace a expensas de la exactitud del pronóstico. Por tanto, cada procedimiento podría dar como resultado un pronóstico erróneo y/o la pérdida de oportunidades para seleccionar un tratamiento eficaz para muchos pacientes.
Breve sumario de la invención
La presente invención se refiere a un procedimientoin vitrode acuerdo con la reivindicación 1, es decir, un procedimientoin vitroque comprende: (a) anotar un margen invasivo (MI) o una región de interés (RDI) peritumoral (PT) en una imagen digital de una muestra de prueba de un tumor colorrectal en estadio III; (b) detectar células CD3+ en al menos una porción de la RDI; (c) obtener una densidad de células CD3+ dentro de la RDI; (d) aplicar una función de puntuación continua a un vector de rasgo característico que comprende la densidad de células CD3+ para obtener una puntuación de contexto inmunológico (ICS) para el tumor, en el que aplicar una función de puntuación continua es aplicar una fórmula matemática en la que se introduce la magnitud real de la densidad de células CD3+ obtenida en la etapa (c) o un valor normalizado de la misma.
La presente invención también se refiere a un procedimientoin vitrode acuerdo con la reivindicación 12, es decir, un procedimientoin vitropara pronosticar un paciente con cáncer colorrectal en estadio III, comprendiendo el procedimiento: calcular una puntuación de contexto inmunológico (ICS) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y pronosticar el paciente en base a la ICS.
La presente invención también se refiere a un sistema de acuerdo con la reivindicación 13, es decir, un sistema para puntuar un contexto inmunológico de una muestra de tejido, comprendiendo el sistema: un procesador; y una memoria acoplada al procesador, la memoria para almacenar instrucciones ejecutables por ordenador que, cuando se ejecutan por el procesador, hacen que el procesador realice operaciones que comprenden el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
La presente invención también se refiere a un procedimientoin vitrode acuerdo con la reivindicación 14, es decir, un procedimientoin vitropara seleccionar un tratamiento para un sujeto que tiene un cáncer colorrectal en estadio III, comprendiendo dicho procedimiento: (a) obtener una puntuación de contexto inmunológico (ICS) para el tumor colorrectal del sujeto de acuerdo con un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; (b) opcionalmente, obtener un estado de la vía reparadora (VR) o un estado de la inestabilidad microsatelial (IMS) del tumor colorrectal; y (c) seleccionar un tratamiento para el sujeto en base a la ICS y opcionalmente en base además al estado de la vía reparadora.
Divulgación adicional
En una divulgación, se proporciona un procedimiento que comprende: (a) anotar una región de interés (RDI) en una imagen digital de un corte de tejido tumoral; (b) calcular un vector de rasgo característico que incluye un parámetro de rasgo característico que comprende una medida cuantitativa de células CD3+ en la<r>DI; y (c) aplicar una función de puntuación continua al vector de rasgo característico para calcular una puntuación de contexto inmunológico para el corte tisular. En una divulgación, uno o más tipos de células inmunitarias se detectan morfológicamente (tal como en una imagen de una muestra teñida con hematoxilina y eosina) y/o en base a la expresión celular de uno o más marcadores de células inmunitarias. En una divulgación, la función de puntuación continua es una función de tiempo hasta el evento no lineal, tal como una función derivada de un modelo de riesgos proporcionales de Cox. En un modo de realización ejemplar, el "tiempo hasta el evento" se selecciona del grupo que consiste en supervivencia sin enfermedad, supervivencia sin progresión y supervivencia global.
En una divulgación, se proporciona un procedimiento implementado por ordenador que comprende hacer que un procesador de ordenador ejecute un conjunto de funciones ejecutables por ordenador almacenadas en una memoria, comprendiendo el conjunto de funciones ejecutables por ordenador: (A) obtener una imagen digital de un corte tisular de un tumor colorrectal en estadio III, en el que el corte tisular se tiñe histoquímicamente para al menos CD3 humano; (B) anotar una o más regiones de interés (RDI) en la imagen digital, comprendiendo la RDI un margen invasivo (MI) del tumor; y (C) aplicar una función de puntuación a la RDI, en el que la función de puntuación comprende: (C1) calcular un vector de rasgo característico que comprende una densidad de células CD3+ en el MI; y (C2) aplicar una función de puntuación continua al vector de rasgo característico para obtener una puntuación de contexto inmunológico para el corte tisular. En una divulgación, la función de puntuación continua se aplica a un vector de rasgo característico que consiste en una densidad de células CD3+ en el margen invasivo del corte tisular. En otras divulgaciones, la densidad CD3+ se obtiene como un parámetro total. En otras divulgaciones, la densidad CD3+ se obtiene como una media o mediana de una pluralidad de regiones de control de la RDI. En algunas divulgaciones, la densidad CD3+ se normaliza aplicando un factor de normalización a la densidad CD3+, siendo el factor de normalización igual a un límite superior predeterminado o límite inferior del parámetro de rasgo característico. En una divulgación, el factor de normalización se obtiene evaluando una distribución de densidades CD3+ en una población representativa de muestras, identificando un sesgo en la distribución de valores de parámetro de rasgo característico e identificando un valor en el que un número predeterminado de muestras cae más allá, en el que el valor se selecciona como factor de normalización.
En otra divulgación, se proporciona un procedimiento que comprende: (a) anotar una o más regiones de interés (RDI) en una imagen digital de un corte tisular tumoral, en el que al menos una de las RDI incluye al menos una porción de una región de margen invasivo (MI); (b) detectar y cuantificar células que expresan c D3 humano en la RDI; (c) detectar y cuantificar células que expresan CD8 humano en la RDI; (d) calcular una densidad de células CD3+ dentro de la RDI y, opcionalmente, normalizar la densidad de células CD3+ o la densidad de linfocitos; y (e) aplicar una función de puntuación continua al vector de rasgo característico para obtener una puntuación de contexto inmunológico (ICS) para el tumor. En una divulgación, la al menos una RDI que incluye una porción de una región MI es una RDI MI o una RDI peritumoral (PT). En una divulgación, las densidades son densidades celulares de área o densidades celulares lineales.
También se divulgan en el presente documento sistemas para puntuar un contexto inmunológico de una muestra de tejido tumoral, incluyendo los sistemas al menos un procesador de ordenador y una memoria, en los que la memoria almacena un conjunto de instrucciones ejecutables por ordenador para ejecutarse por el procesador de ordenador, incluyendo el conjunto de instrucciones ejecutables por ordenador cualquiera de los procesos y procedimientos descritos en el presente documento. En algunas divulgaciones, los sistemas incluyen teñidores de portaobjetos automatizados para marcar histoquímicamente cortes de la muestra de tejido tumoral y/o medios para generar imágenes digitales de los cortes teñidos histoquímicamente, tales como microscopios conectados de forma funcional a cámaras digitales o sistemas de escáner. En otra divulgación, los sistemas pueden incluir además un sistema de información de laboratorio (LIS) para rastrear y/o controlar los procesos que se van a realizar en las muestras, cortes e imágenes digitales.
Además se divulgan y se proponen en el presente documento programas informáticos que comprenden instrucciones que, cuando el programa se ejecuta por un ordenador o una red informática, hacen que el ordenador o red informática lleve a cabo el procedimiento de acuerdo con la presente invención en uno o más de los modos de realización incluidos en el presente documento cuando el programa se ejecuta en un ordenador o red informática. Específicamente, el programa informático se puede almacenar en un soporte de datos legible por ordenador, por ejemplo, un soporte de datos no volátil. Por tanto, específicamente, una, más de una o incluso todas de las etapas de procedimiento (a) a (d) de la reivindicación 1, las etapas de procedimiento (a) a (c) de la reivindicación 5 o las etapas de procedimiento (a) a (c) de la reivindicación 24 se pueden realizar usando un ordenador o una red informática, preferentemente usando un programa informático.
Se divulga y se propone además en el presente documento un producto de programa informático que tiene medios de código de programa para realizar el procedimiento de acuerdo con la presente invención en uno o más de los modos de realización incluidos en el presente documento cuando el programa se ejecuta en un ordenador o red informática. Específicamente, los medios de código de programa se pueden almacenar en un soporte de datos legible por ordenador.
Se divulga y se propone además en el presente documento un soporte de datos que tiene una estructura de datos almacenada en el mismo, que, después de cargarse en un ordenador o red informática, tal como en una memoria de trabajo o memoria principal del ordenador o red informática, puede ejecutar el procedimiento de acuerdo con uno o más de los modos de realización divulgados en el presente documento.
Se divulga y se propone además en el presente documento un producto de programa informático con medios de código de programa almacenados en un soporte legible por máquina, para realizar el procedimiento de acuerdo con uno o más de los modos de realización divulgados en el presente documento, cuando el programa se ejecuta en un ordenador o red informática. Como se usa en el presente documento, un producto de programa informático se refiere al programa como un producto comercializable. El producto puede existir en general en un formato arbitrario, tal como en un formato impreso, o en un soporte de datos legible por ordenador. Específicamente, el producto de programa informático se puede distribuir sobre una red de datos.
Además se divulga y se propone en el presente documento un aparato de procesamiento de datos que comprende medios para llevar a cabo el procedimiento de acuerdo con uno o más de los modos de realización divulgados en el presente documento. El aparato de procesamiento de datos puede ser o puede comprender al menos un procesador. El término "procesador" como se usa en el presente documento es un término amplio y se le debe dar su significado común y habitual para un experto en la técnica y no se debe limitar a un significado especial o personalizado. El término se puede referir específicamente, sin limitación, a un dispositivo electrónico arbitrario configurado para realizar una o más operaciones, específicamente operaciones lógicas, y/o para ejecutar uno o más algoritmos u operaciones de procesamiento de datos. El procesador específicamente puede ser o puede comprender al menos un circuito electrónico que se configura para realizar operaciones en una o más fuentes de datos externas, tales como una memoria o un flujo de datos. El procesador puede comprender al menos un circuito integrado configurado para realizar operaciones lógicas. El procesador puede comprender además al menos un circuito integrado específico de la aplicación (ASIC) y/o al menos una matriz de puertas programables por campo (FPGA).
Finalmente, se divulga y se propone en el presente documento una señal de datos modulada que contiene instrucciones legibles por un sistema informático o red informática para realizar el procedimiento de acuerdo con uno o más de los modos de realización divulgados en el presente documento.
En referencia a los aspectos implementados por ordenador de la invención, una o más de las etapas de procedimiento o incluso todas las etapas de procedimiento del procedimiento de acuerdo con uno o más de los modos de realización divulgados en el presente documento se pueden realizar usando un ordenador o red informática. Por tanto, en general, se puede realizar cualquiera de las etapas de procedimiento, incluyendo la provisión y/o manipulación de datos usando un ordenador o red informática. En general, estas etapas de procedimiento pueden incluir cualquiera de las etapas de procedimiento, típicamente excepto las etapas de procedimiento que requieren trabajo manual, tales como proporcionar las muestras y/o determinados aspectos de realizar las mediciones reales.
Como se usa en lo que sigue, los términos "tener", "comprender" o "incluir" o cualquier variación gramatical arbitraria de los mismos se usan de forma no excluyente. Por tanto, estos términos se pueden referir tanto a una situación en la que, además del rasgo característico introducido por estos términos, no están presentes otros rasgos característicos en la entidad descrita en este contexto como a una situación en la que están presentes uno o más de otros rasgos característicos. Como ejemplo, las expresiones "A tiene B", "A comprende B" y "A incluye B" se pueden referir tanto a una situación en la que, además de B, no está presente ningún otro elemento en A (es decir, una situación en la que A consiste única y exclusivamente en B) como a una situación en la que, además de B, uno o más de otros elementos están presentes en la entidad A, tales como elemento C, elementos C y D o incluso otros elementos.
Además, se debe destacar que los términos "al menos uno", "uno o más" o expresiones similares que indican que un rasgo característico o elemento puede estar presente una vez o más de una vez, típicamente se usarán solo una vez cuando se introduce el respectivo rasgo característico o elemento. En lo que sigue, en la mayoría de los casos, cuando se hace referencia al rasgo característico o elemento respectivo, las expresiones "al menos uno" o "uno o más" no se repetirán, a pesar de que el rasgo característico o elemento respectivo pueda estar presente una vez o más de una vez.
Además, como se usa en lo que sigue, los términos "preferentemente", "más preferentemente", "en particular", "más en particular", "específicamente", "más específicamente" o términos similares se usan conjuntamente con rasgos característicos opcionales, sin restringir posibilidades alternativas. Por tanto, los rasgos característicos introducidos por estos términos son rasgos característicos opcionales y no pretenden restringir el alcance de las reivindicaciones en modo alguno. La invención, como reconocerá el experto en la técnica, se puede realizar usando rasgos característicos alternativos. De forma similar, los rasgos característicos introducidos por "en un modo de realización de la invención" o expresiones similares pretenden ser rasgos característicos opcionales, sin ninguna restricción con respecto a modos de realización alternativos de la invención, sin ninguna restricción con respecto al alcance de la invención y sin ninguna restricción con respecto a la posibilidad de combinar los rasgos característicos introducidos de dicha forma con otros rasgos característicos opcionales o no opcionales de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La fig. 1 ilustra dos procedimientos diferentes para calcular parámetros de rasgo característico para RDI. La línea discontinua en las imágenes ilustra el límite de una RDI. Las "X" en la imagen indican objetos de interés marcados en la imagen. Los círculos en la imagen son regiones de control que se pueden usar para calcular parámetros globales para la región de control.
La fig. 2 ilustra un sistema de puntuación de contexto inmunológico ejemplar como se divulga en el presente documento.
La fig. 3A ilustra un flujo de trabajo ejemplar implementado en un sistema de análisis de imágenes como se divulga en el presente documento, en el que la función de identificación de objetos se ejecuta en toda la imagen antes de que se ejecute la función de generador de RDI.
La fig. 3B ilustra un flujo de trabajo ejemplar implementado en un sistema de análisis de imágenes como se divulga en el presente documento, en el que la función de identificación de objetos se ejecuta solo en la RDI después de que se ejecute la función de generador de RDI.
La fig. 4 ilustra un sistema informático ejemplar que puede formar parte de un sistema de análisis de imágenes como se divulga en el presente documento.
Descripción detallada de la invención
I. Definiciones
A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica. Véanse, por ejemplo, Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier (4.a ed. 2007); Sambrooket al,MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989). Se pretende que el término "un" o "una" quiera decir "uno/a o más". Se pretende que los términos "comprender", "comprende" y "que comprende", cuando preceden a la mención de una etapa o un elemento, quieren decir que la adición de otras etapas o elementos es opcional y no se excluye.
Anticuerpo:el término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.
Fragmento de anticuerpo:un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
Biomarcador:como se usa en el presente documento, el término "biomarcador" se referirá a cualquier molécula o grupo de moléculas halladas en una muestra biológica que se pueden usar para caracterizar la muestra biológica o un sujeto del que se obtiene la muestra biológica. Por ejemplo, un biomarcador puede ser una molécula o grupo de moléculas con una presencia, ausencia o abundancia relativa que es:
<*>característica de un estado o tipo celular o tisular particular;
<*>característica de un estado o afección patológica particular; o
* indicativa de la gravedad de una afección patológica, la probabilidad de progresión o regresión de la afección patológica, y/o la probabilidad de que la afección patológica responda a un tratamiento particular.
Como otro ejemplo, el biomarcador puede ser un tipo celular o un microorganismo (tal como una bacteria, micobacteria, hongos, virus y similares), o una molécula o grupo de moléculas sustituyente del mismo.
Reactivo específico de biomarcador:un reactivo de detección específico que se puede unir específicamente directamente a uno o más biomarcadores en la muestra celular, tal como un anticuerpo primario.
Muestra celular:como se usa en el presente documento, el término "muestra celular" se refiere a cualquier muestra que contiene células intactas, tales como cultivos celulares, muestras de líquido corporal o piezas quirúrgicas tomadas para interpretación patológica, histológica o citológica.
Función de puntuación continua:una "función de puntuación continua" es una fórmula matemática en la que se introduce la magnitud real de una o más variables (opcionalmente sujeta a límites superiores y/o inferiores sobre el valor y/o aplicación de un factor de normalización). En algunos ejemplos, el valor introducido en la función de puntuación continua es la magnitud real de la variable. En otros ejemplos, el valor introducido en la función de puntuación continua es el valor absoluto de la variable hasta (por arriba y/o hasta por debajo, como sea apropiado) un valor de corte predeterminado, en el que a todos los valores absolutos más allá del valor de corte se les asigna el valor de corte. En otros ejemplos, el valor introducido en la función de puntuación continua es un valor normalizado de la variable. A modo de contraste, en una "función de puntuación no continua" (también denominada en el presente documento "función de puntuación binaria"), cada variable se asigna a un "grupo" predeterminado (por ejemplo, "alto", "medio" o "bajo"), y se introduce el mismo valor en la función matemática para todos los miembros del mismo grupo. Por ejemplo, se supone que la variable que se está evaluando es la densidad de linfocitos T CD3+. En una función de puntuación continua, el valor introducido en la función es la densidad de linfocitos T CD3+ (opcionalmente sujeta a determinados límites superiores y/o inferiores y/o normalización). En una función de puntuación binaria o no continua, el valor de densidad se analiza en primer lugar para determinar si cae en un grupo de "alta densidad" o un grupo de "baja densidad", y el valor que se introduce en la función de puntuación no continua es cualquier valor arbitrario que se asigna a los miembros de ese grupo (por ejemplo, 0 para bajo, 1 para alto). Por tanto, se consideran dos muestras, una primera que tiene una densidad de 500 células CD8+/mm2 y una segunda que tiene una densidad de 700 células CD8+/mm2. Los valores introducidos en una función de puntuación continua serían 500 y 700, respectivamente (o se modificarían en base a los valores de corte máximos o mínimos y/o factor(es) de normalización). Los valores introducidos en una función de puntuación no continua dependerán del grupo en el que caigan. Si el "grupo alto" engloba tanto 500 como 700 células/mm2, a continuación se introduciría un valor de 1 en la función de puntuación no continua para cada muestra. Si el valor de corte entre los grupos "alto" y "bajo" cae en algún punto entre 500 y 700 células/mm2, a continuación se introduciría un valor de 0 en una función de puntuación no continua para la primera muestra, y se introduciría un valor de 1 en una función de puntuación no continua para la segunda muestra. Si el "grupo bajo" engloba tanto 500 como 700 células/mm2, a continuación se introduciría un valor de 0 en la función de puntuación no continua para cada muestra. Cabe destacar que estos valores pretenden ilustrar la diferencia entre una función de puntuación continua y una función de puntuación no continua, y no se debe interpretar de ninguna manera que limiten el alcance de la divulgación a menos que se mencione en una reivindicación.
Modelo de riesgos proporcionales de Cox:un modelo de fórmula 1:
Fórmula 1
K0
en la queho(t)es la proporción entre el riesgo esperado en el tiempot (h(t))y un riesgo básico(ho(t))ybi, b2...bPson constantes extrapoladas para cada una de las variables independientes. Como se usa en todo el documento,m
la proporción (í) " se denominará "puntuación de contexto inmunológico de Cox" o "ICScox."
Reactivo de detección:un "reactivo de detección" es cualquier reactivo que se usa para depositar una tinción cerca de un reactivo específico de biomarcador en una muestra celular. Los ejemplos no limitantes incluyen reactivos específicos de biomarcador (tales como anticuerpos primarios), reactivos de detección secundarios (tales como anticuerpos secundarios que se pueden unir a un anticuerpo primario), reactivos de detección terciarios (tales como anticuerpos terciarios que se pueden unir a anticuerpos secundarios), enzimas asociadas directa o indirectamente con el reactivo específico de biomarcador, productos químicos que reaccionan con dichas enzimas para efectuar el depósito de una tinción fluorescente o cromógena, reactivos de lavado usados entre las etapas de tinción, y similares.
Resto detectable:una molécula o material que puede producir una señal detectable (tal como visualmente, electrónicamente o de otro modo) que indica la presencia (es decir, análisis cualitativo) y/o concentración (es decir, análisis cuantitativo) del resto detectable depositado en una muestra. Una señal detectable se puede generar por cualquier mecanismo conocido o aún por descubrir, incluyendo absorción, emisión y/o dispersión de un fotón (incluyendo fotones de radiofrecuencia, frecuencia de microondas, frecuencia infrarroja, frecuencia visible y frecuencia ultravioleta). El término "resto detectable" incluye moléculas y materiales cromógenos, fluorescentes, fosforescentes y luminiscentes, catalizadores (tales como enzimas) que convierten una sustancia en otra sustancia para proporcionar una diferencia detectable (tal como convirtiendo una sustancia incolora en una sustancia coloreada o viceversa, o produciendo un precipitado o incrementando la turbidez de la muestra). En algunos ejemplos, el resto detectable es un fluoróforo, que pertenece a varias clases químicas comunes incluyendo cumarinas, fluoresceínas (o derivados y análogos de fluoresceína), rodaminas, resorufinas, luminóforos y cianinas. Los ejemplos adicionales de moléculas fluorescentes se pueden encontrar en Molecular Probes Handbook — A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Molecular Probes, Eugene, OR, ThermoFisher Scientific, 11.a edición. En otros modos de realización, el resto detectable es un resto detectable por medio de microscopía de campo claro, tal como tintes incluyendo diaminobencidina (DAB), 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL), tetrametilrrodamina (DISCOVERY Purple), N,N'-biscarboxipentil-5,5'-disulfonato-indo-dicarbocianina (Cy5) y rodamina 110 (rodamina).
Parámetro de rasgo característico:un valor indicativo de un nivel de expresión de un biomarcador en una muestra. Los ejemplos incluyen: intensidad de expresión (por ejemplo, en una escala de 0+, 1+, 2+, 3+), número de células positivas para biomarcador, densidad celular (por ejemplo, número de células positivas para biomarcador en un área de una RDI, número de células positivas para biomarcador en una distancia lineal de un borde que define una RDI, y similares), densidad de píxeles (es decir, número de píxeles positivos para biomarcador en un área de una RDI, número de píxeles positivos para biomarcador en una distancia lineal de un borde que define una RDI, etc.), etc. un parámetro de rasgo característico puede ser un parámetro total o un parámetro global.
Detección histoquímica:un procedimiento que implica marcar biomarcadores u otras estructuras en una muestra tisular con reactivos específicos de biomarcador y reactivos de detección de manera que permite la detección microscópica del biomarcador u otras estructuras en el contexto de la relación transversal entre las estructuras de la muestra tisular. Los ejemplos incluyen inmunohistoquímica (IHQ), hibridaciónin situcromogénica (CISH), hibridaciónin situcon fluorescencia (FISH), hibridaciónin situcon plata (SISH) y tinción con hematoxilina y eosina (HyE) de cortes histológicos fijados con formol e incluidos en parafina.
Tratamiento dirigido a punto de control inmunitario:cualquier tratamiento que inhibe la activación de una molécula de punto de control inmunitario.
Molécula de punto de control inmunitario:una proteína expresada por una célula inmunitaria con una activación que regulación por disminución una respuesta de linfocitos T citotóxicos. Los ejemplos incluyen PD-1, TIM-3, LAG-4 y CTLA-4.
Biomarcador de escape inmunitario:un biomarcador expresado por una célula tumoral que ayuda al tumor a evitar una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T. Los ejemplos de biomarcadores de escape inmunitario incluyen PD-L1, PD-L2 e IDO.
Margen invasivo (MI):la interfaz entre tejido neoplásico invasivo y tejido normal. Cuando se usa en el contexto de una RDI, "MI" se refiere a una RDI restringida a una región de un tumor identificada por un lector experto como un margen invasivo.
Anticuerpo monoclonal:un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes dichas variantes en general en cantidades pequeñas. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, o una combinación de los mismos.
Función de puntuación continua no lineal:una función de puntuación continua que tiene la estructura general de cualquiera distinta de f(x) = a bx, en la que x es una variable y a y b son constantes. Por tanto, por ejemplo, la "función de puntuación continua no lineal" incluye funciones algebraicas no lineales (tales como funciones polinómicas no constantes y no lineales; funciones racionales; y funciones de raíces enésimas) y funciones trascendentes (tales como funciones exponenciales, funciones hiperbólicas, funciones logarítmicas y funciones de potencia).
Normalizar:ajustar un parámetro de rasgo característico por un factor fijo de modo que diferentes parámetros de rasgo característico se expresan en la misma escala.
Factor de normalización:un factor fijo aplicado a un parámetro de rasgo característico para obtener un parámetro de rasgo característico normalizado.
Parámetro de rasgo característico normalizado:un parámetro de rasgo característico , con un valor que se ha ajustado por un factor de normalización.
Región peritumoral (PT):la región de un tumor en las inmediaciones del margen invasivo, que también puede incluir una porción del tejido extratumoral y una porción del núcleo tumoral.
RDI peritumoral (PT):una RDI que incluye al menos una porción de la región MI y, opcionalmente, tejido extratumoral en las inmediaciones de la región MI y/o una porción de la región de núcleo tumoral en las inmediaciones de la MI. Por ejemplo, "RDI PT" puede englobar todos los píxeles dentro de una distancia definida de cualquier punto en la interfaz entre células tumorales y células no tumorales, o puede englobar una RDI de un ancho definido centrado en la interfaz entre células tumorales y no tumorales, o puede englobar una pluralidad de conformaciones definidas centrada cada una en un punto de la interfaz entre células tumorales y células no tumorales (tal como una pluralidad de círculos superpuestos, centrado cada uno en un punto discreto de la interfaz entre células tumorales y células no tumorales).
Muestra:como se usa en el presente documento, el término "muestra" se referirá a cualquier material obtenido de un sujeto que se puede someter a prueba para determinar la presencia o ausencia de un biomarcador.
Reactivo de detección secundario:un reactivo de detección específico que se puede unir específicamente a un reactivo específico de biomarcador.
Corte: cuando se usa como nombre, un corte fino de una muestra tisular adecuado para análisis microscópico, típicamente cortado usando un micrótomo. Cuando se usa como verbo, el proceso de generar un corte.
Corte seriado:como se usa en el presente documento, el término "corte seriado" se referirá a uno cualquiera de una serie de cortes cortados en secuencia por un micrótomo a partir de una muestra tisular. Para que dos cortes se consideren "cortes seriados" entre sí, no necesitan necesariamente ser cortes consecutivos del tejido, sino que en general deben contener las estructuras tisulares suficientemente similares en la misma relación espacial, de modo que las estructuras pueden coincidir entre sí después de la tinción histológica.
Reactivo de detección específico:cualquier composición de materia que se puede unir específicamente a una estructura química diana en el contexto de una muestra celular. Como se usa en el presente documento, la frase "unión específica", "se une específicamente a" o "específico para" u otras iteraciones similares se refiere a interacciones medibles y reproducibles entre una diana y un reactivo de detección específico, lo que es determinante de la presencia de la diana en presencia de una población heterogénea de moléculas incluyendo moléculas biológicas. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a una diana es un anticuerpo que se une a esta diana con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de la que se une a otras dianas. En un modo de realización, el grado de unión de un reactivo de detección específico a una diana no relacionada es menor de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a la diana como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados modos de realización, un reactivo específico de biomarcador que se une específicamente a una diana tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |j M, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM o < 0,1 nM. En otro modo de realización, la unión específica puede incluir, pero no requiere, una unión exclusiva. Los reactivos de detección específicos ejemplares incluyen sondas de ácido nucleico específicas para secuencias de nucleótidos; anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y composiciones de unión específicas genomanipuladas, incluyendo las ADNECTIN (matriz basada en la 10.a fibronectina FN3; Bristol-Myers-Squibb Co.), a Ff IBODY (matriz basada en el dominio Z de la proteína A de S.aureus;Affibody AB, Solna, Suecia), AVIMER (matriz basada en el dominio A/receptor de LDL; Amgen, Thousand Oaks, CA), dAb (matriz basada en el dominio de anticuerpos VH o VL; GlaxoSmithKline PLC, Cambridge, Reino Unido), DARP (matriz basada en proteínas de repetición de anquirina; Molecular Partners AG, Zürich, CH), ANTICALIN (matriz basada en lipocalinas; Pieris AG, Freising, DE), NANOBODY (matriz basado en VHH (Ig de camélidos); Ablynx N/V, Gante, BE), TRANS-BODY (matriz basada en transferrina; Pfizer Inc., New York, NY), SMIP (Emergent Biosolutions, Inc., Rockville, MD) y TETRANECTINS (matriz basada en el dominio de lectina tipo C (DLTC), tetranectina; Borean Pharma A/S, Aarhus, DK). Las descripciones de dichas estructuras de unión específica genomanipuladas se revisan por Wurchet al.,Development of Novel Protein Scaffolds as Alternatives to Whole Antibodies for Imaging and Therapy: Status on Discovery Research and Clinical Validation, Current Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 9, pp. 502-509 (2008).
Tinte:cuando se usa como sustantivo, el término "tinte" se refiere a cualquier sustancia que se puede usar para visualizar moléculas o estructuras específicas en una muestra celular para análisis microscópico, incluyendo la microscopía de campo claro, microscopía fluorescente, microscopía electrónica y similares. Cuando se usa como verbo, el término "teñir" se refiere a cualquier proceso que da como resultado el depósito de un tinte en una muestra celular.
Sujeto:como se usa en el presente documento, el término "sujeto" o "individuo" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados modos de realización, el individuo o sujeto es un ser humano.
Muestra de prueba:una muestra tumoral obtenida de un sujeto que tiene un resultado desconocido en el momento en que se obtiene la muestra.
Modelo de tiempo hasta el evento:un modelo matemático en el que las variables se modelan en función de su capacidad para predecir la probabilidad de que se produzca un acontecimiento definido en un tiempot.
Muestra tisular:como se usa en el presente documento, el término "muestra tisular" se referirá a una muestra celular que conserva la relación espacial transversal entre las células como existían dentro del sujeto del que se obtuvo la muestra.
Núcleo tumoral (NT):la región de una lesión neoplásica invasiva que no es el margen invasivo. En el contexto de una RDI, "NT" se refiere a una porción de una región tumoral completa que no es MI ni se excluye de la RDI como artefacto.
Muestra tumoral:una muestra tisular obtenida de un tumor.
Región tumoral completa (WT):una porción de un corte tisular caracterizada por una o más regiones contiguas compuestas sustancialmente en su totalidad por células neoplásicas invasivas, incluyendo tanto regiones NT como MI.
RDI tumoral completa:una RDI limitada a una región tumoral completa.
II. Descripciones de biomarcadores
CD3:CD3 es un complejo receptor de superficie celular que se usa con frecuencia como biomarcador definitorio para células que tienen un linaje de linfocitos T. El complejo CD3 se compone de 4 cadenas polipeptídicas distintas: cadena gamma CD3, cadena delta CD3, cadena épsilon CD3 y cadena zeta CD3. CD3-gamma y CD3-delta forman cada una heterodímeros con CD3-épsilon (homodímero sy y heterodímero s5), mientras que CD3-zeta forma un homodímero (homodímero ZZ). Funcionalmente, el homodímero<sy>, heterodímero<s>5 y homodímero ZZ forman un complejo de señalización con complejos de receptores de linfocitos T. Las secuencias ejemplares para (e isoformas y variantes de) la cadena gamma CD3, cadena delta CD3, cadena épsilon CD3 y cadena zeta CD3 humanas se pueden encontrar en los n.os de acceso de Uniprot P09693 (secuencia de aminoácidos canónica que se divulga en el presente documento en SEQ ID NO: 1), P04234 (secuencia de aminoácidos canónica que se divulga en el presente documento en SEQ ID NO: 2), P07766 (secuencia de aminoácidos canónica que se divulga en el presente documento en SEQ ID NO: 3), y P20963 (secuencia de aminoácidos canónica que se divulga en el presente documento en SEQ ID NO: 4), respectivamente. Como se usa en el presente documento, el término "biomarcador de proteína CD3 humana" engloba cualquier polipéptido de cadena gamma CD3, cadena delta CD3, cadena épsilon CD3 y cadena zeta CD3 que tiene una secuencia humana canónica y variantes naturales del mismo que mantienen la función de la secuencia canónica; homodímeros<sy>, heterodímeros<s>5 y homodímeros ZZ que incluyen uno o más polipéptidos de cadena gamma CD3, cadena delta CD3, cadena épsilon CD3 y cadena zeta CD3 que tienen una secuencia humana canónica y variantes naturales de los mismos que mantienen la función de la secuencia canónica; y cualquier complejo de señalización que incluye uno o más de los homodímeros o heterodímeros de CD3 anteriores. En algunos modos de realización, un agente específico de biomarcador de proteína CD3 humana engloba cualquier agente específico de biomarcador que se une específicamente a una estructura (tal como un epítopo) dentro del polipéptido de cadena gamma<c>D3 (tal como el polipéptido en SEQ ID NO: 1), polipéptido de cadena delta CD3 (tal como el polipéptido en SEQ ID NO: 2), polipéptido de cadena épsilon CD3 (tal como el polipéptido en SEQ ID NO: 3), o polipéptido de cadena zeta CD3 (tal como el polipéptido en SEQ ID NO: 4), o que se une a una estructura (tal como un epítopo) localizada dentro del homodímero<sy>, heterodímero<s>5 o homodímeroZZ-
CD8:CD8 es una glucoproteína transmembranaria heterodimérica, enlazada por disulfuro, hallada en el subconjunto de linfocitos T supresores citotóxicos, en timocitos, en determinados linfocitos citolíticos naturales y en una subpoblación de células de la médula ósea. Las secuencias ejemplares para (e isoformas y variantes de) la cadena alfa y beta humanas del receptor CD8 se pueden encontrar en los números de acceso de Uniprot P01732 (secuencia de aminoácidos canónica que se divulga en el presente documento en SEQ ID NO: 5) y P10966 (secuencia de aminoácidos canónica que se divulga en el presente documento en SEQ ID NO: 6), respectivamente. Como se usa en el presente documento, el término "biomarcador de proteína CD8 humana" engloba cualquier polipéptido de cadena alfa CD8 que tiene una secuencia humana canónica y variantes naturales del mismo que mantienen la función de la secuencia canónica; cualquier polipéptido de cadena beta CD8 que tiene una secuencia humana canónica y variantes naturales del mismo que mantienen la función de la secuencia canónica; cualquier dímero que incluye un polipéptido de cadena alfa CD8 que tiene una secuencia humana canónica y variantes naturales del mismo que mantienen la función de la secuencia canónica y/o un polipéptido de cadena beta CD8 que tiene una secuencia humana canónica y variantes naturales del mismo que mantienen la función de la secuencia canónica. En algunos modos de realización, un agente específico de biomarcador de proteína CD8 humana engloba cualquier agente específico de biomarcador que se une específicamente a una estructura (tal como un epítopo) dentro del polipéptido de cadena alfa CD8 (tal como el polipéptido en SEQ ID NO: 6), polipéptido de cadena beta CD8 (tal como el polipéptido en SEQ ID NO: 7), o que se une a una estructura (tal como un epítopo) localizada dentro de un dímero c D8.
CTLA-4:CTLA-4 (también conocida como CD152), es una proteína de punto de control inmunitario expresada por el genCTLA4en el cromosoma 2 de seres humanos. Se pueden encontrar secuencias ejemplares para (e isoformas y variantes de) la proteína CTLA-4 humana en el número de acceso de Uniprot P16410 (secuencia de aminoácidos canónica que se divulga en el presente documento en SEQ ID NO: 7).
FoxP3:la proteína forkhead box P3 (FoxP3) es un regulador transcripcional que está implicado en el desarrollo y la función inhibidora de linfocitos T reguladores (Treg) que se codifica por el genFOXP3del cromosoma X. Se pueden encontrar secuencias ejemplares para (e isoformas y variantes de) la proteína FOXP3 humana en el número de acceso de Uniprot Q9BZS1 (secuencia de aminoácidos canónica que se divulga en el presente documento en SEQ ID NO: 8). En algunos modos de realización, un agente específico de biomarcador de proteína FoxP3 humana engloba cualquier agente específico de biomarcador que se une específicamente a una estructura (tal como un epítopo) dentro de un polipéptido FoxP3 humano (tal como el polipéptido en SEQ ID NO: 8).
PD-1:el receptor muerte programada-1 (PD-1) es un miembro de la familia de receptores CD28 codificada por el genPDCD1en el cromosoma 2. Se pueden encontrar secuencias ejemplares para (e isoformas y variantes de) la proteína PD-1 humana en el número de acceso de Uniprot Q15116 (secuencia de aminoácidos canónica que se divulga en el presente documento en SEQ ID NO: 9). En algunos modos de realización, un agente específico de biomarcador de proteína PD-1 humana engloba cualquier agente específico de biomarcador que se une específicamente a una estructura (tal como un epítopo) dentro de un polipéptido PD-1 humano (tal como el polipéptido en SEQ ID NO: 9).
PD-L1:el ligando de muerte programada 1 (PD-L1) es una proteína transmembranaria de tipo 1 codificada por el genCD274en el cromosoma 9. PD-L1 actúa como ligando para PD-1 y CD80. Se pueden encontrar secuencias ejemplares para (e isoformas y variantes de) la proteína PD-L1 humana en el número de acceso de Uniprot Q9NZQ7 (secuencia de aminoácidos canónica que se divulga en el presente documento en SEQ ID NO: 10). En algunos modos de realización, un agente específico de biomarcador de proteína PD-L1 humana engloba cualquier agente específico de biomarcador que se une específicamente a una estructura (tal como un epítopo) dentro de un polipéptido PD-L1 humano (tal como el polipéptido en SEQ ID NO: 10).
PD-L2:el ligando de muerte programada 2 (PD-L2) es una proteína transmembranaria codificada por el genPDCD1LG2en el cromosoma 9. PD-L2 actúa como ligando de PD-1. Se pueden encontrar secuencias ejemplares para (e isoformas y variantes de) la proteína PD-L2 humana en el número de acceso de Uniprot Q9BQ51 (secuencia de aminoácidos canónica que se divulga en el presente documento en SEQ ID NO: 11). En algunos modos de realización, un agente específico de biomarcador de proteína PD-L2 humana engloba cualquier agente específico de biomarcador que se une específicamente a una estructura (tal como un epítopo) dentro de un polipéptido PD-L2 humano (tal como el polipéptido en SEQ ID NO: 11).
TIM-3:el receptor de mucina de inmunoglobulina de linfocitos T 3, también conocido como TIM-3, es una proteína de punto de control inmunitario codificada por el genHAVCR2localizado en el cromosoma humano 5. Se pueden encontrar secuencias ejemplares para (e isoformas y variantes de) la proteína TIM-3 humana en el número de acceso de Uniprot Q8TDQ0 (secuencia de aminoácidos canónica que se divulga en el presente documento en SEQ ID NO: 12). En algunos modos de realización, un agente específico de biomarcador de proteína TIM-3 humana engloba cualquier agente específico de biomarcador que se une específicamente a una estructura (tal como un epítopo) dentro de un polipéptido TIM-3 humano (tal como el polipéptido en SEQ ID NO: 12).
LAG3:la proteína del gen de activación de linfocitos 3 (LAG3) es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas (Ig) codificada por el genLAG3en el cromosoma humano 12. Se pueden encontrar secuencias ejemplares para (e isoformas y variantes de) la proteína LAG3 humana en el número de acceso de Uniprot P18627 (secuencia de aminoácidos canónica que se divulga en el presente documento en SEQ ID NO: 13). En algunos modos de realización, un agente específico de biomarcador de proteína LAG3 humana engloba cualquier agente específico de biomarcador que se une específicamente a una estructura (tal como un epítopo) dentro de un polipéptido LAG3 humano (tal como el polipéptido en SEQ ID NO: 13).
IDO:la indoleamina 2,3-dioxigenasa 1 (IDO) es una enzima codificada por el genIDO1en el cromosoma humano 8. Se pueden encontrar secuencias ejemplares para (e isoformas y variantes de) la proteína IDO humana en el número de acceso de Uniprot P14902 (secuencia de aminoácidos canónica que se divulga en el presente documento en SEQ ID NO: 14). En algunos modos de realización, un agente específico de biomarcador de proteína IDO humana engloba cualquier agente específico de biomarcador que se une específicamente a una estructura (tal como un epítopo) dentro de un polipéptido IDO humano (tal como el polipéptido en SEQ ID NO: 14).
111. Generación de la función de puntuación
Las funciones de puntuación de los presentes procedimientos y sistemas se derivan de muestras tumorales de una cohorte de pacientes con resultados conocidos de cáncer colorrectal en estadio III. Se selecciona un panel de biomarcadores para someter a prueba, las muestras de la cohorte se tiñen para determinar los biomarcadores y parámetros de rasgo característico para los biomarcadores se calculan a partir de una o más RDI (con parámetros de rasgo característico que opcionalmente se pueden normalizar y/o estar sujetos a límites superiores o inferiores). Los parámetros de rasgo característico para las muestras se modelan frente a los resultados usando uno o más de una variedad de modelos, incluyendo modelos de "tiempo hasta el evento" (tales como los modelos de riesgos proporcionales de Cox para la supervivencia global, la supervivencia sin enfermedad o la supervivencia sin progresión) y modelos de acontecimientos binarios (tales como los modelos de regresión logística). Una vez se identifica una función de puntuación continua candidata, opcionalmente se pueden seleccionar uno o más valores de corte para separar la cohorte en grupos de acuerdo con su ICS (por ejemplo, grupos de "riesgo alto" y "riesgo bajo"), por ejemplo por el uso de curvas ROC, y los valores de corte se someten a prueba usando curvas de Kaplan-Meier que comparan los grupos. A continuación se selecciona la función de puntuación continua candidata y la combinación de valor corte que muestra la separación deseada entre grupos. Esta función se puede usar a continuación en un sistema de puntuación inmunológico y en procedimientos como se describe en el presente documento.
Las presentes funciones de puntuación se basan en una densidad de células CD3+ localizadas dentro de una región de margen invasivo (MI) o una región peritumoral (PT). Se pueden incluir biomarcadores adicionales en la función de puntuación y/o también se pueden incluir densidades CD3+ de diferentes compartimentos tisulares, siempre que no reduzcan significativamente la capacidad de la función de puntuación para pronosticar el sujeto o para predecir la respuesta del sujeto a un determinado ciclo de tratamiento.
III.A. Muestras y preparación de muestras para la generación de la función de puntuación continua
La función de puntuación continua se ejecuta en una imagen digital de un corte tisular obtenida de un tumor colorrectal en estadio III. Las muestras son típicamente muestras tisulares procesadas de manera compatible con la tinción histoquímica, incluyendo, por ejemplo, fijación (tal como con un fijador a base de formol), inclusión en una matriz de cera (tal como parafina) y corte (tal como con un micrótomo). No se requiere ninguna etapa de procesamiento específico por la presente divulgación, siempre que la muestra obtenida sea compatible con la tinción histoquímica de la muestra para los biomarcadores de interés y genere una imagen digital de la muestra teñida. En un modo de realización específico, la muestra es un corte de micrótomo de muestras de tejido fijadas con formol e incluidas en parafina (FFPE) de un tumor de cáncer colorrectal en estadio III.
III.B. Paneles de biomarcadores
En un modo de realización, al menos un corte tisular de la muestra colorrectal en estadio III se marca con un reactivo específico de biomarcador de proteína CD3 humana en combinación con reactivos de detección apropiados, y se evalúa la densidad de células CD3+. Adicionalmente, el tumor se puede clasificar en base al estado de la vía reparadora y/o estabilidad microsatelial.
El estado de la vía reparadora (también denominada "VR") típicamente implica evaluar el estado de expresión y/o de metilación de cuatro genes implicados en la vía reparadora:hPMS2, hMLHI, hMSH2yhMSH6.Las secuencias de proteínas canónicas se divulga en SEQ ID NO: 15-18, respectivamente. Se determina que un tumor que tiene una expresión alterada de uno cualquiera de estos cuatro tiene una alteración de la vía reparadora (denominada "AVR"), mientras que se determina que un tumor que no tiene una expresión alterada de ninguno de estos genes tiene una VR inalterada (denominada "VIR"). El estado de VR se puede determinar, por ejemplo, por un ensayo basado en proteínas (tal como por inmunoensayo, tal como un inmunoensayo enzimático en fase sólida (por ejemplo, ELISA) o ensayo inmunohistoquímico) o un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (tal como un ensayo de PCR con retrotranscriptasa ultrarrápida).
La inestabilidad microsatelial ("IMS") está provocada por una alteración de la VR. Como resultado, comienzan a acumularse alteraciones en la longitud de los locus microsateliales. Los ensayos para evaluar el estado de IMS son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Murphyet al.,J. Mol. Diagn., Vol. 8, Issue 3, pp. 305-11 (Jul.
2006); Esemuedeet al.,Ann. Surg. Oncol., vol. 17, Issue 12, pp. 3370-78 (Dec. 2010);Mukherjeeet al.,Hereditary Cancer in Clinical Practice, Vol. 8, Issue 9 (2010); sistema de análisis de IMS (Promega) (evaluación de siete marcadores para fenotipo alto de IMS, incluyendo cinco marcadores de repetición de mononucleótidos casi monomórficos (BAT-25, BAT-26, MONO-27, NR-21 y NR-24) y dos marcadores de repetición de pentanucleótidos altamente polimórficos (Penta C y Penta D)).
III.C. Tinción histoquímica de muestras
La imagen digital en la que se aplica la función de puntuación continua se puede obtener a partir de un corte tisular teñido histoquímicamente. Los cortes de las muestras se tiñen aplicando uno o más reactivos específicos de biomarcador en combinación con un conjunto de reactivos de detección apropiados para generar un corte teñido con biomarcador. La tinción de biomarcador típicamente se logra poniendo en contacto un corte de la muestra con un reactivo específico de biomarcador en condiciones que facilitan la unión específica entre el biomarcador y el reactivo específico de biomarcador. A continuación, la muestra se pone en contacto con un conjunto de reactivos de detección que interactúan con el reactivo específico de biomarcador para facilitar el depósito de un resto detectable muy cerca del biomarcador, generando de este modo una señal detectable localizada en el biomarcador. Típicamente, las etapas de lavado se realizan entre la aplicación de diferentes reactivos para evitar tinciones inespecíficas no deseadas de tejidos.
El reactivo específico de biomarcador facilita la detección del biomarcador mediando el depósito de un resto detectable en muy cerca del reactivo específico de biomarcador.
En algunos modos de realización, el resto detectable se conjuga directamente al reactivo específico de biomarcador y por tanto se deposita en la muestra tras la unión del reactivo específico de biomarcador a su diana (denominado en general procedimiento de marcaje directo). Los procedimientos de marcaje directo a menudo son cuantificables de forma más directa, pero a menudo adolecen de una falta de sensibilidad. En otros modos de realización, el depósito del resto detectable se efectúa por el uso de un reactivo de detección asociado con el reactivo específico de biomarcador (denominado en general procedimiento de marcaje indirecto). Los procedimientos de marcaje indirecto incrementan el número de restos detectables que se pueden depositar cerca del reactivo específico de biomarcador y por tanto suelen ser más sensibles que los procedimientos de marcaje directo, en particular cuando se usan en combinación con tintes.
En algunos modos de realización, se usa un procedimiento indirecto, en el que el resto detectable se deposita por medio de una reacción enzimática localizada en el reactivo específico de biomarcador. Las enzimas adecuadas para dichas reacciones son bien conocidas e incluyen, pero no se limitan a, oxidorreductasas, hidrolasas y peroxidasas. Las enzimas específicas incluidas explícitamente son peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP), fosfatasa ácida, glucosa oxidasa, p-galactosidasa, p-glucuronidasa y p-lactamasa. La enzima se puede conjugar directamente con el reactivo específico de biomarcador o se puede asociar indirectamente con el reactivo específico de biomarcador por medio de un conjugado de marcaje. Como se usa en el presente documento, un "conjugado de marcaje" comprende:
(a) un reactivo de detección específico; y
(b) una enzima conjugada al reactivo de detección específico, en el que la enzima es reactiva con el sustrato cromógeno, conjugado de señalización o tinte reactivo con enzima en condiciones de reacción apropiadas para efectuar la generaciónin situdel tinte y/o depósito del tinte sobre la muestra de tejido.
En ejemplos no limitantes, el reactivo de detección específico del conjugado de marcado puede ser un reactivo de detección secundario (tal como un anticuerpo secundario específico de especie unido a un anticuerpo primario, un anticuerpo antihapteno unido a un anticuerpo primario conjugado con hapteno, o una proteína de unión a biotina unida a un anticuerpo primario biotinilado), un reactivo de detección terciario (tal como un anticuerpo terciario específico de especie unido a un anticuerpo secundario, un anticuerpo antihapteno unido a un anticuerpo secundario conjugado a hapteno o una proteína de unión a biotina unida a un anticuerpo secundario biotinilado), u otras de dichas disposiciones. Por tanto, una enzima localizada en el reactivo específico de biomarcador unido a muestra se puede usar a continuación en una serie de esquemas para depositar un resto detectable.
En algunos casos, la enzima reacciona con un compuesto/sustrato cromógeno. Los ejemplos no limitantes particulares de compuestos/sustratos cromógenos incluyen fosfato de 4-nitrofenilo (pNPP), Fast Red, fosfato de bromocloroindolilo (BCIP), nitroazul de tetrazolio (N<b>T), BCIP/NBT, Fast Red, Ap Orange, AP Blue, tetrametilbencidina (TMB), 2,2'-acino-di-[3-etilbenzotiazolin-sulfonato] (ABTS), o-dianisidina, 4-cloronaftol (4-CN), nitrofenil-p-D-galactopiranósido (ONPG), o-fenilendiamina (OPD), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-galactopiranósido (X-Gal), metilumbeliferil-p-D-galactopiranósido (MU-Gal), p-nitrofenil-a-D-galactopiranósido (PNP), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glucuronida (X-Gluc), 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), fucsina, yodonitrotetrazolio (INT), azul de tetrazolio o violeta de tetrazolio.
En algunos modos de realización, la enzima se puede usar en un esquema de detección metalográfica. Los procedimientos de detección metalográfica incluyen el uso de una enzima, tal como fosfatasa alcalina, en combinación con un ion metálico soluble en agua y un sustrato inactivo redox de la enzima. En algunos modos de realización, la enzima convierte el sustrato en un agente activo redox, y el agente activo redox reduce el ion metálico, provocando que forme un precipitado detectable (véanse, por ejemplo, la solicitud de patente de EE. UU. n.° 11/015.646, presentada el 20 de diciembre de 2004, publicación Pc T n.° 2005/003777 y publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0265922). Los procedimientos de detección metalográfica incluyen el uso de una enzima oxidorreductasa (tal como la peroxidasa de rábano picante) junto con un ion metálico hidrosoluble, un agente oxidante y un agente reductor, de nuevo para formar un precipitado detectable. (Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.670.113).
En algunos modos de realización, la acción enzimática se produce entre la enzima y el propio tinte, en la que la reacción convierte el tinte de una especie de no unión a una especie depositada en la muestra. Por ejemplo, la reacción de DAB con una peroxidasa (tal como peroxidasa de rábano picante) oxida la DAB, provocando que precipite.
Aún en otros modos de realización, el resto detectable se deposita por medio de un conjugado de señalización que comprende un resto reactivo latente configurado para reaccionar con la enzima para formar una especie reactiva que se puede unir a la muestra o a otros componentes de detección. Estas especies reactivas pueden reaccionar con la muestra proximales a su generación, es decir, cerca de la enzima, pero se convierten rápidamente en una especie no reactiva de modo que el conjugado de señalización no se deposita en sitios distales del sitio en el que se deposita la enzima. Los ejemplos de restos reactivos latentes incluyen: análogos de quinona metida (QM), tales como los descritos en el documento WO2015124703A1, y conjugados de tiramida, tales como los descritos en
el documento WO2012003476A2. En algunos ejemplos, el resto reactivo latente se conjuga directamente a un tinte, tal como N,N'-biscarboxipentil-5,5'-disulfonato-indo-dicarbocianina (Cy5), 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL), tetrametilrrodamina (DISCO Purple) y rodamina 110 (rodamina). En otros ejemplos, el resto reactivo latente se conjuga a un miembro de un par de unión específico y el tinte se enlaza al otro miembro del par de unión específico. En otros ejemplos, el resto reactivo latente se enlaza a un miembro de un par de unión específico y una enzima se enlaza al otro miembro del par de unión específico, en la que la enzima es (a) reactiva con un sustrato cromógeno para efectuar la generación del tinte, o (b) reactiva con un tinte para efectuar el depósito del tinte (tal como DAB). Los ejemplos de pares de unión específicos incluyen:
(1) una biotina o un derivado de biotina (tal como destiobiotina) enlazado al resto reactivo latente y una entidad de unión a biotina (tal como avidina, estreptavidina, avidina desglucosilada (tal como NEUTRAVIDIN) o una proteína de unión a biotina que tiene una tirosina nitrada en su sitio de unión a biotina (tal como CAPTAVIDIN)) enlazada a un tinte o a una enzima reactiva con un sustrato cromógeno o reactiva con un tinte (por ejemplo, una peroxidasa enlazada a la proteína de unión a biotina cuando el tinte es DAB); y
(2) un hapteno enlazado al resto reactivo latente y un anticuerpo antihapteno enlazado a un tinte o a una enzima reactiva con un sustrato cromógeno o reactiva con un tinte (por ejemplo, una peroxidasa enlazada a la proteína de unión a biotina cuando el tinte es DAB).
Los ejemplos no limitantes de combinaciones de reactivo específico de biomarcador y reactivo de detección se exponen en la tabla 1, se incluyen específicamente.
Tabla 1
En un modo de realización específico, los reactivos específicos de biomarcador y los reactivos de detección específicos expuestos en la tabla 1 son anticuerpos. Como se apreciaría por un experto en la técnica medio, el esquema de detección de cada reactivo específico de biomarcador puede ser el mismo o puede ser diferente.
Los ejemplos no limitantes de reactivos o kits de detección disponibles comercialmente que comprenden reactivos de detección adecuados para su uso con los presentes procedimientos incluyen: sistemas de detección VENTANA ultraView (anticuerpos secundarios conjugados con enzimas, incluyendo HRP y AP); sistemas de detección VENTANA iVIEW (anticuerpos secundarios antiespecies biotinilados y enzimas conjugadas con estreptavidina); sistemas de detección VENTANA OptiView (OptiView) (anticuerpo secundario antiespecie conjugado con un hapteno y un anticuerpo terciario antihapteno conjugado con un multímero enzimático); kit de amplificación VENTANA (anticuerpos secundarios no conjugados, que se pueden usar con cualquiera de los sistemas de detección VENTANA anteriores para amplificar el número de enzimas depositadas en el sitio de unión del anticuerpo primario); sistema de amplificación VENTANA OptiView (anticuerpo secundario antiespecie conjugado con un hapteno, un anticuerpo terciario antihapteno conjugado con un multímero enzimático y una tiramida conjugada con el mismo hapteno. En uso, el anticuerpo secundario se pone en contacto con la muestra para efectuar la unión al anticuerpo primario. A continuación, la muestra se incuba con el anticuerpo antihapteno para efectuar la asociación de la enzima al anticuerpo secundario. A continuación, la muestra se incuba con la tiramida para efectuar el depósito de moléculas de hapteno adicionales. A continuación, la muestra se incuba de nuevo con el anticuerpo antihapteno para efectuar el depósito de moléculas enzimáticas adicionales. A continuación, la muestra se incuba con el resto detectable para efectuar el depósito del tinte); anticuerpo antihapteno, anticuerpo secundario, cromógeno, fluoróforo y kits de tinción VENTANA DI<s>C<o>VERY, DISCOVERY OmniMap, DISCOVERY UltraMap, de los que cada uno está disponible en Ventana Medical Systems, Inc. (Tucson, Arizona); sistemas de detección IHQ PowerVision y PowerVision+ (anticuerpos secundarios polimerizados directamente con HRP o AP para producir polímeros compactos que tienen una alta proporción de enzimas con respecto a anticuerpos); y el sistema DAKO EnVision™+ (polímero marcado con enzima que se conjuga con anticuerpos secundarios).
III.D Contratinción
Si se desea, los portaobjetos teñidos con biomarcador se pueden contrateñir para ayudar a identificar áreas morfológicamente pertinentes para identificar RDI, de forma manual o bien automática. Los ejemplos de contratinciones incluyen contratinciones nucleares cromógenas, tales como hematoxilina (tiñe de azul a violeta), azul de metileno (tiñe de azul), azul de toluidina (tiñe los núcleos de azul oscuro y los polisacáridos de rosa a rojo), Fast Red nuclear (también llamado tinte Kernechtrot, tiñe de rojo) y verde de metilo (tiñe de verde); tinciones cromógenas no nucleares, tales como eosina (tiñe de rosa); tinciones nucleares fluorescentes, incluyendo 4',6-diamino-2-pheylindol (DAPI, tiñe de azul), yoduro de propidio (tiñe de rojo), tinción de Hoechst (tiñe de azul), verde nuclear DCS1 (tiñe de verde), amarillo nuclear (Hoechst S769121, tiñe de amarillo a pH neutro y de azul a pH ácido), DRAQ5 (tiñe de rojo), DRAQ7 (tiñe de rojo); tinciones fluorescentes no nucleares, tales como faloidina marcada con fluoróforo (tiñe de actina filamentosa, el color depende del fluoróforo conjugado).
III.E. Tinción morfológica de muestras
En determinados modos de realización, también puede ser deseable teñir morfológicamente un corte seriado del corte teñido con biomarcador. Este corte se puede usar para identificar las RDI a partir de las que se realiza la puntuación. Las técnicas de tinción morfológica básicas a menudo se basan en teñir estructuras nucleares con un primer tinte y teñir estructuras citoplásmicas con un segundo tinte. Son conocidas muchas tinciones morfológicas, incluyendo pero sin limitarse a, tinción con hematoxilina y eosina (HyE) y tinción de Lee (azul de metileno y fucsina básica). En un modo de realización específico, al menos un corte seriado de cada portaobjetos teñido con biomarcador se tiñe con HyE. Se puede usar cualquier procedimiento de aplicación de tinte HyE, incluyendo procedimientos manuales y automatizados. En un modo de realización, al menos un corte de la muestra es una muestra teñida con HyE teñida en un sistema de tinción automatizado. Los sistemas automatizados para realizar la tinción con HyE típicamente funcionan según uno de dos principios de tinción: tinción por lotes (también conocida como "inmersión y remojo"("dip ’n dunk'))o tinción de portaobjetos individual. Los teñidores por lotes en general usan cubas o baños de reactivos en los que se sumergen muchos portaobjetos al mismo tiempo. Los teñidores de portaobjetos individuales, por otra parte, aplican el reactivo directamente a cada portaobjetos y no hay dos portaobjetos que compartan la misma alícuota de reactivo. Los ejemplos de teñidores de HyE disponibles comercialmente incluyen los teñidores de HyE series VENTANA SYMpHONY (teñidor de portaobjetos individual) y VENTANA HE 600 (teñidor de portaobjetos individual) de Roche; el Dako CoverStainer (teñidor por lotes) de Agilent Technologies; el Leica ST4020 Small Linear Stainer (teñidor por lotes), Leica ST5020 Multistainer (teñidor por lotes) y los teñidores de HyE serie Leica ST5010 Autostainer XL (teñidor por lotes) de Leica Biosystems Nussloch GmbH.
III.F. Selección de RDI y cálculo de parámetro de rasgo característico
En un modo de realización, la función de puntuación continua se aplica a un vector de rasgo característico derivado de la imagen digital, en el que el vector de rasgo característico incluye una densidad de células CD3+ en una región de margen invasivo (MI) o una región peritumoral (PT) del corte tumoral.
En algunos modos de realización, la RDI se puede identificar manualmente por un lector capacitado, que delinea la(s) correspondiente(s) área(s) a una región MI o PT, regiones delineadas que a continuación se pueden usar como la RDI para el cálculo de la densidad de células CD3+. En otros modos de realización, un sistema implementado por ordenador puede ayudar al usuario a anotar la RDI (denominada "anotación de RDI semiautomática"). Por ejemplo, el usuario puede marcar una región tumoral completa en la imagen digital. A continuación, el sistema implementado por ordenador puede definir automáticamente una región que se extiende una distancia predefinida (por ejemplo, 0,5 mm, 1 mm o 1,5 mm) más allá del borde de la región tumoral delineada por el usuario capacitado, que se usa como el MI. En otros modos de realización, el sistema implementado por ordenador puede definir automáticamente una región que se extiende una distancia predefinida más allá del borde de la región tumoral (por ejemplo, 0,5 mm, 1 mm o 1,5 mm) y una distancia predefinida (por ejemplo, 0,5 mm, 1,0 mm o 1,5 mm) dentro de la región tumoral delineada por el usuario capacitado, que a continuación se usa como la RDI (en este caso, denominada RDI peritumoral (PT)). En cada modo de realización expuesto en este párrafo, la RDI se puede identificar directamente en un corte teñido con biomarcador, o se puede identificar en un corte seriado del corte teñido con biomarcador y a continuación registrar en la imagen digital del portaobjetos teñido con biomarcador.
El parámetro de rasgo característico se calcula aplicando un parámetro de la RDI a los datos de expresión CD3+ dentro de la RDI. Los ejemplos de parámetros de RDI que se podrían usar para el cálculo de parámetros de rasgo característico incluyen, por ejemplo, el área de la RDI o la longitud de un borde que define la RDI (tal como la longitud de un borde de una región tumoral completa alrededor de la que se define la región MI). Los ejemplos específicos de parámetros de rasgo característico incluyen:
(a) una densidad de área de células CD3+ dentro de la RDI (número de células positivas sobre el área de RDI), y
(b) una densidad lineal de células CD3+ (número total de células que expresan el biomarcador dentro de la RDI sobre la longitud lineal de un borde que define la RDI, tal como una línea que indica una región tumoral alrededor de la que se calcula la región MI),
El parámetro de rasgo característico se puede basar directamente en los recuentos brutos en la RDI (denominado a continuación en el presente documento "parámetro total"), o basar en una media o mediana del parámetro de rasgo característico de una pluralidad de regiones de control dentro de la RDI (a continuación en el presente documento denominado "parámetro global"). Estos dos enfoques se ilustran en la fig. 1. En ambos casos, se proporciona una imagen de un portaobjetos IHQ que tiene una RDI anotada (indicada como la región dentro de la línea discontinua) y objetos de interés identificados (por ejemplo, células CD3+). Para el enfoque de parámetro total, el parámetro de rasgo característico se calcula cuantificando el parámetro pertinente de todos los rasgos característicos marcados dentro de la RDI ("parámetro de objeto de r Di") y dividiendo el parámetro de objeto de RDI (tal como el total de objetos marcados o el área total de expresión de biomarcador marcado, etc.) por el parámetro de RDI (tal como el área de la RDI, el número total de celdas dentro de la RDI, etc.) (etapa A1). Para el enfoque de parámetro global, se superpone una pluralidad de regiones de control (ilustradas por los círculos abiertos) en la RDI (etapa B1). Un parámetro de región de control ("parámetro RC") se calcula cuantificando el parámetro pertinente de la región de control ("parámetro de objeto de RC") (tal como objetos marcados totales dentro de la región de control o área total de expresión de biomarcador marcado dentro de la región de control, etc.) y dividirlo entre un parámetro de RDI de región de control ("parámetro de RDI de RC") (tal como el área de la región de control, número total de células dentro de la región de control, etc.) (etapa B2). Se calcula un parámetro de RC separado para cada región de control. El parámetro se obtiene calculando la media o la mediana de todos los parámetros de RC (etapa B3).
Cuando se usan regiones de control, se puede usar cualquier procedimiento de superposición de regiones de control para procesamiento de parámetros. En un modo de realización específico, la RDI se puede dividir en una pluralidad de espacios de cuadrícula (que pueden tener igual tamaño, un tamaño aleatorio o alguna combinación de tamaños variables), constituyendo cada espacio de cuadrícula una región de control. De forma alternativa, se pueden colocar una pluralidad de regiones de control que tienen tamaños conocidos (que pueden ser iguales o diferentes) contiguas entre sí o superpuestas entre sí para cubrir sustancialmente toda la RDI. También se pueden usar otros procedimientos y disposiciones, siempre que el resultado sea un parámetro de rasgo característico para la RDI que se puede comparar entre diferentes muestras.
Si se desea, los parámetros de rasgo característico calculados se pueden convertir opcionalmente en un vector de rasgo característico normalizado.
En el ejemplo típico, antes de que se modele la función de puntuación continua, se representan los parámetros de rasgo característico calculados para las muestras de la cohorte y se evalúa la distribución para identificar cualquier sesgo hacia la derecha o hacia la izquierda. Se identifican valores de corte biológicamente significativos (valores de corte máximos para distribuciones sesgadas a la derecha y/o valores de corte mínimos para distribuciones sesgadas a la izquierda), y cada muestra que tiene un valor más allá del valor de corte (por arriba en el caso de una distribución sesgada a la derecha, o por debajo en el caso de distribución sesgada a la izquierda) se le asigna un parámetro de rasgo característico igual al valor de corte. A continuación, se aplica el valor de corte (a continuación en el presente documento denominado "factor de normalización") a cada parámetro de rasgo característico. En el caso de una distribución sesgada a la derecha, el parámetro de rasgo característico se divide entre el factor de normalización para obtener el parámetro de rasgo característico normalizado, caso en el que el parámetro de rasgo característico se expresa en una escala máxima (es decir, el valor del parámetro normalizado no excederá un máximo predeterminado, tal como 1, 10, 100, etc.). De forma similar, en el caso de una distribución sesgada a la izquierda, el parámetro de rasgo característico se divide entre el factor de normalización para obtener el parámetro de rasgo característico normalizado, caso en el que el parámetro de rasgo característico se expresa en una escala mínima (es decir, el valor del parámetro normalizado no caerá por debajo de un mínimo predeterminado, tal como 1, 10, 100, etc.). Si se desea, el parámetro de rasgo característico normalizado también se puede multiplicar o dividir por un valor constante predeterminado para obtener la escala deseada (por ejemplo, para distribuciones sesgadas a la derecha, multiplicar por 100 para obtener un porcentaje del factor de normalización en lugar de una fracción del factor de normalización). Los parámetros de rasgo característico normalizados se pueden calcular para muestras de prueba aplicando el factor de normalización y/o los valores de corte máximos y/o mínimos identificados para modelar al parámetro de rasgo característico calculado para la muestra de prueba.
III.F. Modelado de la función de puntuación continua
Para generar la función de puntuación continua, los parámetros de rasgo característico de una cohorte de pacientes se modelan para determinar su capacidad para predecir el pronóstico tumoral relativo, el riesgo de progresión y/o la probabilidad de responder a un ciclo de tratamiento particular. En un modo de realización, se usa un modelo de "tiempo hasta el evento". Estos modelos prueban la capacidad de cada variable para predecir el riesgo relativo de que se produzca un acontecimiento definido en un punto de tiempo dado. El "acontecimiento" en dicho caso es típicamente supervivencia global, supervivencia sin enfermedad y supervivencia sin progresión. En un ejemplo, el modelo de "tiempo hasta el evento" es un modelo de riesgos proporcionales de Cox para supervivencia global, supervivencia sin enfermedad o supervivencia sin progresión. El modelo de riesgos proporcionales de Cox se puede escribir como la fórmula 1:
=exp (b1X1 b 2X2+...bpXp)• Fórmula 1
en cada caso, en la queXi, X 2,... Xpson los valores del/de los parámetro(s) de rasgo característico (que opcionalmente pueden estar sujetos a valores de corte máximos y/o mínimos, y/o normalización),bi, b2...bpson constantes extrapoladas del modelo para cada uno del/de los parámetro(s) de rasgo característico. Para cada muestra de paciente de la cohorte de prueba, se obtienen datos sobre el resultado que se rastrea (tiempo hasta la muerte, tiempo hasta la recaída o tiempo hasta la progresión) y el parámetro de rasgo característico para cada biomarcador que se analiza. Los modelos proporcionales de Cox candidatos se generan introduciendo los datos de parámetro de rasgos característicos y los datos de supervivencia para cada individuo de la cohorte en un paquete informático de análisis estadístico informatizado (tal como The R Project for Statistical Computing (disponible en https://www.r-project.org/), SAS, MATLAB, entre otros). Cada modelo candidato se somete a prueba para determinar la capacidad predictiva usando un índice de concordancia, tal como el índice C. El modelo que tiene la mayor puntuación de concordancia usando el índice de concordancia seleccionado se selecciona como función de puntuación continua.
Adicionalmente, se pueden seleccionar uno o más valores de corte de estratificación para separar a los pacientes en "grupos de riesgo" de acuerdo con el riesgo relativo (tal como "riesgo alto" y "riesgo bajo", cuartiles, deciles, etc.). En un ejemplo, los valores de corte de estratificación se seleccionan usando curvas de eficacia diagnóstica (ROC). Las curvas ROC permiten a los usuarios equilibrar la sensibilidad del modelo (es decir, priorizar la captura de tantos candidatos "positivos" o de "riesgo alto" como sea posible) con la especificidad del modelo (es decir, minimizar los falsos positivos para "candidatos de riesgo alto"). En un modo de realización, se selecciona un valor de corte entre grupos de riesgo alto y riesgo bajo para la supervivencia global, supervivencia sin enfermedad o supervivencia sin progresión, teniendo el valor de corte elegido la sensibilidad y la especificidad equilibradas.
IV. Puntuación de contexto inmunológico con una función de puntuación continua
Después de que se haya modelado la función de puntuación continua y se hayan seleccionado los valores de corte de estratificación opcionales, la función de puntuación continua se puede aplicar a imágenes de muestras de prueba para calcular una puntuación de contexto inmunológico (ICS) para la muestra de prueba. Las muestras de prueba típicamente son similares a los tipos de muestra usados para modelar la función de puntuación continua, excepto que los resultados aún no son conocidos. Las muestras de prueba se tiñen para determinar los biomarcadores pertinentes para la función de puntuación continua (por ejemplo, proteína CD3 humana) y se calculan los parámetros de rasgo característico pertinentes y, si se están usando, el/los factor(es) de normalización y/o los valores de corte máximos y/o mínimos se aplican a los parámetros de rasgo característico para obtener los parámetros de rasgo característico normalizados. La ICS se calcula aplicando la función de puntuación continua a los parámetros de rasgo característico o a los parámetros de rasgo característico normalizados. A continuación, la puntuación de contexto inmunológico se puede integrar por un médico en las decisiones de diagnóstico y/o tratamiento.
Por tanto, en una divulgación, la puntuación de contexto inmunológico se puede aplicar en un procedimiento para seleccionar un tratamiento para un sujeto que tiene un cáncer colorrectal en estadio III, comprendiendo dicho procedimiento:
(a) obtener dicha puntuación de contexto inmunológico (ICS) para el tumor colorrectal del sujeto como se describe en otra parte en el presente documento y, en particular, anotar una región de interés (RDi) de margen invasivo (MI) o peritumoral (PT) en una imagen digital de una muestra de prueba de un tumor colorrectal en estadio III;
(b) opcionalmente, obtener un estado de la vía reparadora (VR) o un estado de la inestabilidad microsatelial (IMS) del tumor colorrectal; y
(c) seleccionar un tratamiento para el sujeto en base a la ICS y opcionalmente en base además al estado de la vía reparadora.
Típicamente, el procedimiento mencionado anteriormente se llevará a caboex vivo,es decir, en base a una imagen digital de una muestra de prueba.
Aún en otro modo de realización del procedimiento mencionado anteriormente de la invención, seleccionar un tratamiento comprende:
(c1) si la ICS es indicativa de un mal pronóstico, seleccionar un tratamiento que comprende un ciclo completo de quimioterapia neoplásica posquirúrgica; y
(c2) si la ICS es indicativa de un buen pronóstico, seleccionar un tratamiento que comprende un ciclo reducido de quimioterapia neoplásica posquirúrgica o que no comprende una quimioterapia neoplásica posquirúrgica.
Aún en otro modo de realización del procedimiento mencionado anteriormente de la invención, seleccionar un tratamiento comprende:
(c1) si el tumor tiene un estado de AVR o IMSalta y la ICS es indicativa de un buen pronóstico, seleccionar un tratamiento que comprende un tratamiento dirigido por inhibidor del punto de control y opcionalmente que comprende además una quimioterapia neoplásica posquirúrgica; y
(c2) si el tumor tiene un estado de AVR o IMSalta y la ICS es indicativa de un mal pronóstico, seleccionar un tratamiento que comprende una quimioterapia neoplásica posquirúrgica y opcionalmente que comprende además un tratamiento dirigido por inhibidor del punto de control;
(c3) si el tumor tiene un estado de VIR o IMSbaja y la ICS es indicativa de un buen pronóstico, seleccionar un tratamiento que comprende una quimioterapia neoplásica posquirúrgica y opcionalmente que comprende además un tratamiento dirigido por inhibidor del punto de control; y
(c4) si el tumor tiene un estado de VIR o IMSbaja y la ICS es indicativa de un mal pronóstico, seleccionar un tratamiento que comprende una quimioterapia neoplásica posquirúrgica sin un tratamiento dirigido por inhibidor del punto de control.
Más típicamente, (c1) y (c3) comprenden un ciclo reducido de quimioterapia neoplásica posquirúrgica o (c1) y (c3) no comprenden quimioterapia neoplásica posquirúrgica.
Más típicamente, (c2) y (c4) comprenden un ciclo completo de quimioterapia neoplásica posquirúrgica.
En algunos modos de realización del procedimiento de la invención mencionado anteriormente, el tratamiento dirigido por inhibidor del punto de control comprende una tratamiento dirigida por PD-1 o una tratamiento dirigida por PD-L1.
Aún en otro modo de realización del procedimiento mencionado anteriormente, dicho procedimiento se lleva a cabo usando un ordenador o una red informática, por ejemplo, como se describe en otra parte en el presente documento con más detalle.
Además, en un modo de realización, la invención también proporciona el uso de una puntuación de contexto inmunológico obtenible por los procedimientos mencionados anteriormente de la invención para seleccionar un tratamiento para un sujeto que tiene un cáncer colorrectal en estadio III.
IV.A. Aplicaciones clínicas de determinadas puntuaciones de contexto inmunológico
Los cánceres colorrectales en estadio III son cánceres que han crecido a través de la pared del colon o del recto, y posiblemente hasta el tejido cercano, y se han diseminado a los ganglios linfáticos, pero aún no se han diseminado a sitios distantes. La función de puntuación continua se desarrolla para el cáncer colorrectal en estadio III en función del pronóstico del paciente (por ejemplo, usando supervivencia global, supervivencia sin enfermedad o supervivencia sin progresión). En un modo de realización específico, la función de puntuación continua usa una densidad CD3+ en una RDI que comprende un margen invasivo (con una densidad que se puede normalizar y/o estar sujeta a valores de corte máximos y/o mínimos). En un modo de realización, las densidades son densidades de área o densidades lineales. En un modo de realización, cada densidad se deriva de un parámetro total o parámetro global. En un modo de realización, la función de puntuación continua es un pronóstico de supervivencia sin enfermedad a 5 años. En otro modo de realización, la función de puntuación continua es un pronóstico de supervivencia sin progresión a 5 años. En otro modo de realización, la función de puntuación continua es un pronóstico de supervivencia global a 5 años.
En un modo de realización específico, la función de puntuación continua se usa para seleccionar pacientes con cáncer colorrectal en estadio III para recibir una quimioterapia, en la que la función de puntuación continua incorpora densidades celulares del área positiva para CD3 dentro de una RDI que comprende o consiste en un área de margen invasivo (MI). Los protocolos de tratamiento actuales típicamente incluyen extirpación quirúrgica del tumor y los ganglios linfáticos cercanos y quimioterapia. Para cánceres de colon, la quimioterapia se administra típicamente como tratamiento posquirúrgico. En el cáncer rectal, la quimioterapia típicamente se administra en combinación con radioterapia (denominada quimiorradiación) antes de la resección quirúrgica. En algunos casos rectales, la quimioterapia se puede administrar sola en primer lugar, seguida de quimiorradiación y seguida de resección quirúrgica. Aún en otros casos, el cáncer rectal en estadio III se puede tratar por resección quirúrgica, seguida de quimioterapia o quimiorradiación. Las quimioterapias comunes usadas en el cáncer colorrectal en estadio III incluyen FOLFOX (oxaliplatino, 5-FU y leucovorina), FOLFIRI (leucovorina cálcica 5-FU clorhidrato de irinotecán), 5-FU y leucovorina, CapeOx (capecitabina más oxaliplatino) o capecitabina sola. En un modo de realización, la función de puntuación continua se usa como sigue:
(a) para sujetos con cáncer colorrectal en estadio III que tienen un mal pronóstico como se determina por una puntuación de contexto inmunológico (opcionalmente en combinación con otros criterios de diagnóstico, tales como el estado de VR), administrar un ciclo completo de una quimioterapia neoplásica posquirúrgica; o (b) para sujetos con cáncer colorrectal en estadio III que tienen un buen pronóstico como se determina por una puntuación de contexto inmunológico (opcionalmente en combinación con otros criterios de diagnóstico, tales como el estado de VR), administrando un ciclo de tratamiento que incluye seguimiento posquirúrgico y no incluye quimioterapia o incluye un ciclo reducido de quimioterapia.
En otro modo de realización, la función de puntuación continua se puede usar en combinación con el estado de VR para seleccionar pacientes con cáncer colorrectal en estadio III para recibir un tratamiento dirigido a punto de control inmunitario. Los tratamientos dirigidos a punto de control inmunitario ejemplares incluyen inhibidores de punto de control que se dirigen a PD-1 (tales como pembrolizumab y nivolumab), PD-L1 (tales como atezolizumab o durvalumab), CTLA-4 (tales como ipilimumab), inhibidores de IDO (tales como NLG919), etc. En un modo de realización, la función de puntuación continua se usa como sigue:
(a) para sujetos con cáncer colorrectal en estadio III clasificado como AVR o IMSalta y que tienen un buen pronóstico como se determina por una puntuación de contexto inmunológico, administrar un ciclo de tratamiento que incluye la administración posquirúrgica de un inhibidor de punto de control inmunitario y opcionalmente incluye quimioterapia neoplásica posquirúrgica (que se puede administrar durante una duración reducida);
(b) para sujetos con cáncer colorrectal en estadio III: (a) clasificado como AVR o IMSalta y que tiene un mal pronóstico como se determina por una puntuación de contexto inmunológico, o bien (b) clasificado como VIR o IMSbaja y que tiene un buen pronóstico como se determina por una puntuación de contexto inmunológico, administrar un ciclo de tratamiento que incluye quimioterapia neoplásica posquirúrgica, incluyendo opcionalmente la administración posquirúrgica de un inhibidor del punto de control inmunitario; y
(c) para sujetos con cáncer colorrectal en estadio III clasificado como VIR o IMSbaja y que tiene un mal pronóstico como se determina por una puntuación de contexto inmunológico, administrar un ciclo de tratamiento que incluye quimioterapia neoplásica posquirúrgica y no incluye un inhibidor del punto de control inmunitario.
En un modo de realización, el tratamiento dirigido a punto de control inmunitario es una tratamiento dirigido a PD-1 o PD-L1.
IV.B. Sistemas de puntuación de contexto inmunológico
En un modo de realización, la función de puntuación continua como se describe en el presente documento se implementa por un sistema de puntuación de contexto inmunológico. En la fig. 2 se ilustra un sistema de puntuación de contexto inmunológico ejemplar.
El sistema de puntuación de contexto inmunológico incluye un sistema de análisis de imágenes 100. El sistema de análisis de imágenes 100 puede incluir uno o más dispositivos informáticos tales como ordenadores de escritorio, ordenadores portátiles, tabletas, teléfonos inteligentes, servidores, dispositivos informáticos de aplicaciones específicas o cualquier otro tipo de dispositivo(s) electrónico(s) que pueda realizar las técnicas y operaciones descritas en el presente documento. En algunos modos de realización, el sistema de análisis de imágenes 100 se puede implementar como un único dispositivo. En otros modos de realización, el sistema de análisis de imágenes 100 se puede implementar como una combinación de dos o más dispositivos que juntos logran las diversas funcionalidades analizadas en el presente documento. Por ejemplo, el sistema de análisis de imágenes 100 puede incluir uno o más ordenadores servidores y uno o más ordenadores cliente acoplados comunicativamente entre sí por medio de una o más redes de área local y/o redes de área amplia tales como Internet.
Como se ilustra en la FIG. 2, el sistema de análisis de imágenes 100 puede incluir una memoria 116, un procesador 117 y una pantalla 118. La memoria 116 puede incluir cualquier combinación de cualquier tipo de memorias volátiles o no volátiles, tales como memorias de acceso aleatorio (RAM), memorias de solo lectura tales como una memoria de solo lectura programable borrable eléctricamente (EEPROM), memoriasflash,discos duros, unidades de estado sólido, discos ópticos y similares. Para propósitos de brevedad, la memoria 116 se representa en la FIG. 2 como un único dispositivo, pero se aprecia que la memoria 116 también se puede distribuir entre dos o más dispositivos.
El procesador 117 puede incluir uno o más procesadores de cualquier tipo, tales como unidades centrales de procesamiento (CPU), unidades de procesamiento de gráficos (GPU), procesadores de señales o imágenes de propósito especial, conjuntos de puertas programables en campo (FPGA), unidades de procesamiento de tensor (TPU), etc. Para propósitos de brevedad, el procesador 117 se representa en la FIG. 2 como un único dispositivo, pero se aprecia que el procesador 117 también se puede distribuir entre cualquier número de dispositivos.
La pantalla 118 se puede implementar usando cualquier tecnología adecuada, tal como LCD, LED, OLED, TFT, plasma, etc. En algunas implementaciones, la pantalla 118 puede ser una pantalla táctil (una pantalla sensible al tacto).
Como se ilustra en la FIG. 2, el sistema de análisis de imágenes 100 también puede incluir un identificador de objeto 110, un generador de región de interés (RDI) 111, un módulo de interfaz de usuario 112 y un motor de puntuación 114. Aunque estos módulos se representan en la FIG. 2 como módulos independientes, será evidente para los expertos en la técnica que cada módulo se puede implementar en cambio como un número de submódulos, y que en algunos modos de realización se puede combinar cualquiera de dos o más módulos en un solo módulo. Además, en algunos modos de realización, el sistema 100 puede incluir motores y módulos adicionales (por ejemplo, dispositivos de entrada, módulos de comunicación y redes, etc.) no representados en la FIG. 2 por brevedad. Además, en algunos modos de realización, algunos de los bloques representados en la FIG.
2 se pueden desactivar u omitir. Como se analizará con más detalle a continuación, la funcionalidad de algunos o todos los módulos del sistema 100 se puede implementar enhardware, software, firmwareo como cualquier combinación de los mismos. Los paquetes informáticos disponibles comercialmente ejemplares útiles para implementar módulos como se divulga en el presente documento incluyen los paquetes informáticos VENTANA VIRTUOSO; Definiens TISSUE STUDIO, DEVELOPER XD, e IMAGE MINER; y Visopharm BIOTOPIX, ONCOTOPIX, y STEREOTOPIX.
Después de adquirir la imagen, el sistema de análisis de imágenes 100 puede pasar la imagen a un identificador de objeto 110, que funciona para identificar y marcar objetos pertinentes y otros rasgos característicos dentro de la imagen que después se usarán para la puntuación. El identificador de objeto 110 puede extraer de (o generar para) cada imagen una pluralidad de rasgos característicos de imagen que caracterizan los diversos objetos en la imagen, así como píxeles que representan la expresión del/de los biomarcador(es). Los rasgos característicos de imagen extraídos pueden incluir, por ejemplo, rasgos característicos de textura tales como rasgos característicos de Haralick, rasgos característicos de bolsa de palabras y similares. Los valores de la pluralidad de rasgos característicos de imagen se pueden combinar en un vector de alta dimensión, denominado a continuación en el presente documento "vector de rasgo característico" que caracteriza la expresión del biomarcador. Por ejemplo, si se extraen M rasgos característicos para cada objeto y/o píxel, cada objeto y/o píxel se puede caracterizar por un vector de rasgo característico de M dimensiones. La salida del identificador de objeto 110 es eficazmente un mapa de la imagen que anota la posición de objetos y píxeles de interés y asocia esos objetos y píxeles con un vector de rasgo característico que describe el objeto o los píxeles. Los rasgos característicos extraídos por el identificador de objeto 110 incluyen al menos rasgos característicos o vectores de rasgos característicos suficientes para distinguir células CD3+ de células CD3- en una imagen teñida histoquímicamente con un reactivo específico de biomarcador de CD3 humano.
El sistema de análisis de imágenes 100 también puede pasar la imagen al generador de RDI 111. El generador de RDI 111 se usa para identificar la RDI o las r Di de la imagen a partir de la que se calculará la puntuación de contexto inmunológico. En los casos en los que el identificador de objeto 110 no se aplica a toda la imagen, la RDI o RDI generadas por el generador de RDI 111 también se pueden usar para definir un subconjunto de la imagen en el que se ejecuta el identificador de objeto 110.
En un modo de realización, se puede acceder al generador de RDI 111 a través del módulo de interfaz de usuario 112. Una imagen de la muestra teñida con biomarcador (o un corte seriado teñido morfológicamente de la muestra teñida con biomarcador) se muestra en una interfaz gráfica de usuario del módulo de interfaz de usuario 112, y el usuario anota una o más regiones en la imagen para considerarse RDI. La anotación de RDI puede adoptar una serie de formas en este ejemplo. Por ejemplo, el usuario puede definir manualmente la RDI (denominado en lo sucesivo "anotación de RDI manual"). En otros ejemplos, el generador de RDI 111 puede ayudar al usuario a anotar la RDI (denominado "anotación de RDI semiautomática") como se describe anteriormente en la sección III.F.
En algunos modos de realización, el generador de RDI 111 también puede incluir una función de registro, con lo que una RDI anotada en un corte de un conjunto de cortes seriados se transfiere automáticamente a otros cortes del conjunto de cortes seriados. Esta funcionalidad es especialmente útil cuando se analizan múltiples biomarcadores o cuando se proporciona un corte seriado teñido con HyE junto con los cortes marcados con biomarcador.
El identificador de objeto 110 y el generador de RDI 111 se pueden implementar en cualquier orden. Por ejemplo, el identificador de objeto 110 se puede aplicar en primer lugar a toda la imagen. Las posiciones y rasgos característicos de los objetos identificados a continuación se pueden almacenar y recuperar después cuando se implementa el generador de RDI 111. En dicha disposición, se puede generar una puntuación por el motor de puntuación 113 de inmediato después de la generación de la RDI. Un flujo de trabajo de este tipo se ilustra en la fig.
3A. Como se puede observar en la fig. 3A, se obtiene una imagen que tiene una mezcla de diferentes objetos (ilustrados por óvalos oscuros y rombos oscuros). Después de que se implementa la tarea de identificación de objetos, se identifican todos los rombos de la imagen (ilustrados con rombos abiertos). Cuando se adjunta la RDI a la imagen (ilustrado por la línea discontinua), solo los rombos localizados en la región RDI se incluyen en el cálculo de parámetro para la RDI. A continuación se calcula un vector de rasgo característico que incluye el parámetro de rasgo característico y cualquier parámetro adicional usado por una función de puntuación continua como se describe a continuación. De forma alternativa, el generador de RDI 111 se puede implementar en primer lugar. En este flujo de trabajo, el identificador de objeto 110 se puede implementar solo en la RDI (lo que minimiza el tiempo de cálculo), o todavía se puede implementar en toda la imagen (lo que permitiría ajustes sobre la marcha sin volver a ejecutar el identificador de objeto 110). Dicho flujo de trabajo se ilustra en la fig. 3B. Como se puede observar en la fig. 3B, se obtiene una imagen que tiene una mezcla de diferentes objetos (ilustrados por óvalos oscuros y rombos oscuros). La RDI se adjunta a la imagen (ilustrada por la línea discontinua), pero aún no se ha marcado ningún objeto. Después de que se implemente la tarea de identificación de objetos en la RDI, todos los rombos en la RDI se identifican (ilustrados por rombos abiertos) y se incluyen en el cálculo de parámetro de rasgo característico para la RDI. A continuación se calcula un vector de rasgo característico que incluye el/los parámetro(s) de rasgo característico y cualquier parámetro adicional usado por la función de puntuación continua. También puede ser posible implementar el identificador de objeto 110 y el generador de RDI 111 simultáneamente.
Después de que se hayan implementado tanto el identificador de objeto 110 como el generador de RDI 111, se implementa un motor de puntuación 112. El motor de puntuación 112 calcula el/los parámetro(s) de rasgo característico para la RDI a partir de al menos un parámetro de RDI (tal como el área de RDI o la longitud lineal de un borde de RDI), parámetros pertinentes para objetos en la RDI (tales como el número de células CD3+ en la RDI) y, si se usan, valores de corte máximos y/o mínimos predeterminados y/o factores de normalización. Cuando el parámetro de rasgo característico es un parámetro global, el motor de puntuación 112 también puede incluir una función que superpone una pluralidad de regiones de control en la RDI para calcular el parámetro de RC. Un vector de rasgo característico de RDI que incluye los parámetros de rasgo característico calculados y cualquier otra variable derivada de la RDI usada por la función de puntuación continua, y aplica la función de puntuación continua al vector de rasgo característico de RDI.
Como se representa en la FIG. 2, en algunos modos de realización el sistema de análisis de imágenes 100 se puede acoplar comunicativamente a un sistema de adquisición de imágenes 120. El sistema de adquisición de imágenes 120 puede obtener imágenes de muestras y proporcionar esas imágenes al sistema de análisis de imágenes 100 para su análisis y presentación al usuario.
Como se ilustra en la fig. 4, el sistema de análisis de imágenes puede incluir un sistema informático 400 para implementar las diversas funciones, comprendiendo el sistema informático 400 un recurso de procesamiento 410 y un medio legible por ordenador no transitorio 420. El medio legible por ordenador no transitorio 420 incluye, por ejemplo, instrucciones para ejecutar una función/funciones que: obtienen una imagen de muestra biológica 422; identifican objetos pertinentes en la imagen 424; generan una RDI en la imagen 426; calculan un parámetro de RDI para la RDI 426; generan un parámetro de rasgo característico en base a los objetos pertinentes en la RDI, el parámetro de RDI 428 y otros factores opcionales que se van a usar, tales como factores de normalización y/o valores de rasgo característico máximos y/o mínimos; generan un vector de rasgo característico que incluye el parámetro de rasgo característico y al menos otro parámetro de rasgo característico de la muestra (que puede ser, por ejemplo, un parámetro de rasgo característico adicional para un biomarcador diferente) 430; calculan la puntuación de contexto inmunológico en base al vector de rasgo característico 432; y generan un informe que incluye la puntuación de contexto inmunológico 434.
El sistema de adquisición de imágenes 120 también puede incluir una plataforma de exploración 125 tal como un escáner de portaobjetos que puede explorar los portaobjetos teñidos a 20x, 40x u otros aumentos para producir imágenes digitales de portaobjetos completos de alta resolución, incluyendo, por ejemplo, escáneres de portaobjetos como se analiza anteriormente en la sección IV. En un nivel básico, el escáner de portaobjetos típico incluye al menos: (1) un microscopio con objetivos de lente, (2) una fuente de luz (tal como halógeno, diodo emisor de luz, luz blanca y/o fuentes de luz multiespectrales, dependiendo del tinte), (3) robótica para mover los portaobjetos de vidrio (o para mover la óptica alrededor del portaobjetos), (4) una o más cámaras digitales para la captura de imágenes, (5) un ordenador y su programa informático asociado para controlar la robótica y para manipular, gestionar y visualizar los portaobjetos digitales. Los datos digitales en una serie de localizaciones X-Y diferentes (y en algunos casos, en múltiples planos Z) en el portaobjetos se capturan por el dispositivo de carga acoplada (CCD) de la cámara, y las imágenes se unen entre sí para formar una imagen compuesta de toda la superficie explorada. Los procedimientos comunes para lograr esto incluyen:
(1) exploración basada en mosaicos, en la que la platina de portaobjetos o la óptica se mueven en incrementos muy pequeños para capturar tramas de imagen cuadradas, que se superponen a cuadrados contiguos en un grado leve. A continuación, los cuadrados capturados se emparejan automáticamente entre sí para construir la imagen compuesta; y
(2) exploración basada en líneas, en la que la platina de portaobjetos se mueve en un único eje durante la adquisición para capturar una serie de "tiras" de imagen compuestas. A continuación, las tiras de imagen se pueden emparejar entre sí para formar la imagen compuesta más grande.
Se puede encontrar una visión general detallada de diversos escáneres (tanto fluorescentes como de campo brillante) en Farahaniet al., Whole slide imaging in pathology: advantages, limitations, and emerging perspectives,Pathology and Laboratory Medicine Int'l, Vol. 7, p. 23-33 (junio 2015). Los ejemplos de escáneres de portaobjetos disponibles comercialmente incluyen: 3DHistech PANNORAMIC SCAN II; DigiPath PATHSCOPE; Hamamatsu NANOZOOMER RS, HT y XR; Huron TISSUESCOPE 4000, 4000XT y HS; Leica SCANSCOPE AT, AT2, CS, FL y SCN400; Mikroscan D2; Olympus VS120-SL; Omnyx VL4 y VL120; PerkinElmer LAMINA; Philips ULTRA-FAST SCANNER; Sakura Finetek VISIONTEK; Unic PRECICE 500 y PRECICE 600x; VENTANA ISCAN COREO e ISCAN HT; y Zeiss AXIO SCAN.Z1. Se pueden encontrar otros sistemas y rasgos característicos ejemplares, por ejemplo, en el documento WO2011-049608) o en la solicitud de patente de EE. UU. n.° 61/533.114, presentada el 9 de septiembre de 2011, titulada IMAGING SYSTEMS, CASSETTES, AND METHODS OF USING THE SAME.
Las imágenes generadas por la plataforma de exploración 125 se pueden transferir al sistema de análisis de imágenes 100 o a un servidor o base de datos accesible por el sistema de análisis de imágenes 100. En algunos modos de realización, las imágenes se pueden transferir automáticamente por medio de una o más redes de área local y/o redes de área amplia. En algunos modos de realización, el sistema de análisis de imágenes 100 se puede integrar con o incluir en la plataforma de exploración 125 y/u otros módulos del sistema de adquisición de imágenes 120, caso en el que la imagen se puede transferir al sistema de análisis de imágenes, por ejemplo, a través de una memoria accesible tanto por la plataforma 125 como por el sistema 120. En algunos modos de realización, el sistema de adquisición de imágenes 120 puede no estar acoplado comunicativamente al sistema de análisis de imágenes 100, caso en el que las imágenes se pueden almacenar en un medio de almacenamiento no volátil de cualquier tipo (por ejemplo, una unidadflash)y descargar desde el medio a sistema de análisis de imágenes 100 o a un servidor o base de datos acoplado comunicativamente al mismo. En cualquiera de los ejemplos anteriores, el sistema de análisis de imágenes 100 puede obtener una imagen de una muestra biológica, donde la muestra se puede haber fijado a un portaobjetos y teñido por la plataforma de tinción histoquímica 123, y donde el portaobjetos se puede haber explorado por un escáner de portaobjetos u otro tipo de plataforma de exploración 125. Se aprecia, sin embargo, que en otros modos de realización, las técnicas descritas a continuación también se pueden aplicar a imágenes de muestras biológicas adquiridas y/o teñidas a través de otros medios.
El sistema de adquisición de imágenes 120 también puede incluir una plataforma de tinción histoquímica automatizada 123, tal como un teñidor de portaobjetos IHQ/ISH automatizado. Los teñidores de portaobjetos IHQ/ISH automatizados típicamente incluyen al menos: depósitos de los diversos reactivos usados en los protocolos de tinción, una unidad dosificadora de reactivo en comunicación fluida con el/los depósito(s) para dosificar reactivo en un portaobjetos, un sistema de retirada de residuos para retirar reactivos usados y otros residuos del portaobjetos, y un sistema de control que coordina las acciones de la unidad dosificadora de reactivo y el sistema de retirada de residuos. Además de realizar etapas de tinción, muchos teñidores de portaobjetos automatizados también pueden realizar etapas complementarias a la tinción (o son compatibles con sistemas separados que realizan dichas etapas complementarias), incluyendo: cocción de portaobjetos (para adherir la muestra al portaobjetos), desparafinado (también denominado desparafinización), recuperación de antígeno, contratinción, deshidratación y limpieza, y cobertura. Prichard,OverView of Automated Immunohistochemistry,Arch Pathol Lab Med., Vol. 138, pp. 1578-1582 (2014), incorporado en el presente documento como referencia en su totalidad, describe varios ejemplos específicos de teñidores de portaobjetos IHQ/ISH automatizados y sus diversos rasgos característicos, incluyendo los teñidores de portaobjetos automatizados intelliPATH (Biocare Medical), WAVE (Celerus Diagnostics), DAKO OMNIS y DAKO AUTOSTAINER LINK 48 (Agilent Technologies), BENCHMARK (Ventana Medical Systems, Inc.), Leica BOND y Lab Vision Autostainer (Thermo Scientific). Adicionalmente, Ventana Medical Systems, Inc. es el cesionario de una serie de patentes de los Estados Unidos que divulgan sistemas y procedimientos para realizar análisis automatizados, incluyendo las patentes de EE. UU. n.os 5.650.327, 5.654.200, 6.296.809, 6.352.861, 6.827.901 y 6.943.029, y las solicitudes de patente de EE. UU. publicadas n.os 20030211630 y 20040052685, de las que cada una se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. Típicamente, las unidades de tinción disponibles comercialmente funcionan según uno de los siguientes principios: (1) tinción de portaobjetos individuales abiertos, en la que los portaobjetos se sitúan horizontalmente y los reactivos se dosifican como un charco en la superficie del portaobjetos que contiene una muestra de tejido (tal como la implementada en los teñidores DAKO AUTOSTAINER Link 48 (Agilent Technologies) e IntelliPATH (Biocare Medical)); (2) tecnología de superposición de líquidos, en la que los reactivos se cubren con o bien se dosifican a través de una capa de fluido inerte depositada sobre la muestra (tal como la implementada en los teñidores VENTANA BenchMark y DISCOVERY); (3) tinción de espacio capilar, en la que la superficie del portaobjetos se coloca en proximidad a otra superficie (que puede ser otro portaobjetos o una placa de recubrimiento) para crear un espacio estrecho, a través del que las fuerzas capilares atraen y mantienen los reactivos líquidos en contacto con las muestras (tal como los principios de tinción usados por los teñidores DAKO TECHMATE, Leica BOND y DAKO OMNIS). Algunas iteraciones de tinción de espacio capilar no mezclan los fluidos en el espacio (tal como en el DAKO TECHMATE y el Leica BOND). En variaciones de la tinción de espacios capilares denominada tinción de espacios dinámicos, se usan fuerzas capilares para aplicar la muestra al portaobjetos y a continuación las superficies paralelas se trasladan entre sí para agitar los reactivos durante la incubación para efectuar la mezcla de reactivos (tal como los principios de tinción implementados en teñidores de portaobjetos DAKO OMNIS (Agilent)). En la traslación de la tinción de espacios, un cabezal trasladable se sitúa sobre el portaobjetos. Una superficie inferior del cabezal se espacia del portaobjetos por un primer espacio suficientemente pequeño para permitir que se forme un menisco de líquido a partir del líquido del portaobjetos durante su traslación. Una extensión de mezcla que tiene una dimensión lateral menor que el ancho de un portaobjetos se extiende desde la superficie inferior del cabezal trasladable para definir un segundo espacio más pequeño que el primer espacio entre la extensión de mezcla y el portaobjetos. Durante la traslación del cabezal, la dimensión lateral de la extensión de mezcla es suficiente para generar un movimiento lateral en el líquido sobre el portaobjetos en una dirección que se extiende en general desde el segundo espacio hasta el primer espacio. Véase el documento WO 2011-139978 A1. Recientemente se ha propuesto el uso de tecnología de chorro de tinta para depositar reactivos en portaobjetos. Véase el documento WO 2016-170008 A1. Esta lista de tecnologías de tinción no pretende ser exhaustiva, y cualquier sistema total o semiautomático para realizar la tinción de biomarcadores se puede incorporar en la plataforma de tinción histoquímica 123.
El sistema de adquisición de imágenes 120 también puede incluir una plataforma de tinción HyE automatizada 124. Los sistemas automatizados para realizar la tinción con HyE típicamente funcionan según uno de dos principios de tinción: tinción por lotes (también conocida como "inmersión y remojo"("dip ’n dunk'))o tinción de portaobjetos individual. Los teñidores por lotes en general usan cubas o baños de reactivos en los que se sumergen muchos portaobjetos al mismo tiempo. Los teñidores de portaobjetos individuales, por otra parte, aplican el reactivo directamente a cada portaobjetos y no hay dos portaobjetos que compartan la misma alícuota de reactivo. Los ejemplos de teñidores de HyE disponibles comercialmente incluyen los teñidores de HyE series VENTANA SYMPHONY (teñidor de portaobjetos individual) y VENTANA HE 600 (teñidor de portaobjetos individual) de Roche; el Dako CoverStainer (teñidor por lotes) de Agilent Technologies; el Leica ST4020 Small Linear Stainer (teñidor por lotes), Leica ST5020 Multistainer (teñidor por lotes) y los teñidores de HyE serie Leica ST5010 Autostainer XL (teñidor por lotes) de Leica Biosystems Nussloch GmbH. La plataforma de tinción de H&E 124 se usa típicamente en flujos de trabajo en los que se desea un corte seriado teñido morfológicamente del/de los corte(s) teñido(s) con biomarcador.
El sistema de puntuación de contexto inmunológico puede incluir además un sistema de información de laboratorio (LIS) 130. El LIS 130 típicamente realiza una o más funciones seleccionadas de: procesos de registro y rastreo realizados en muestras y en portaobjetos e imágenes derivadas de las muestras, instruyendo a diferentes componentes del sistema de puntuación de contexto inmunológico para que realicen procesos específicos en las muestras, portaobjetos y/o imágenes y rastrear información sobre reactivos específicos aplicados a muestras y/o portaobjetos (tales como números de lote, fechas de vencimiento, volúmenes dosificados, etc.). El LIS 130 normalmente comprende al menos una base de datos que contiene información sobre muestras; etiquetas asociadas con muestras, diapositivas y/o archivos de imágenes (tales como códigos de barras (incluyendo códigos de barras unidimensionales y códigos de barras bidimensionales), etiquetas de identificación por radiofrecuencia (REID), códigos alfanuméricos adheridos a la muestra y similares); y un dispositivo de comunicación que lee la etiqueta de la muestra o portaobjetos y/o comunica información sobre el portaobjetos entre el LIS 130 y los otros componentes del sistema de puntuación de contexto inmunológico. Por tanto, por ejemplo, se podría colocar un dispositivo de comunicación en cada una de una estación de procesamiento de muestras, un teñidor histoquímico automatizado 123, una plataforma de tinción de HyE 124 y una plataforma de exploración 125. Cuando la muestra se procesa inicialmente en cortes, se puede introducir información sobre la muestra (como ID del paciente, tipo de muestra, procesos que se van a realizar en el/los corte(s)) en el dispositivo de comunicación y se crea un marcador para cada corte generado de la muestra. En cada estación posterior, el marcador se introduce en el dispositivo de comunicación (tal como explorando un código de barras o etiqueta RFID o introduciendo manualmente el código alfanumérico), y la estación se comunica electrónicamente con la base de datos para, por ejemplo, dar instrucciones a la estación u operario de estación para realizar un proceso específico en el corte y/o para registrar los procesos que se están realizando en el corte. En la plataforma de exploración 125, la plataforma de exploración 125 también puede codificar cada imagen con un marcador o código legible por ordenador que se correlaciona de nuevo con el corte o muestra del que se deriva la imagen, de modo que cuando la imagen se envía al sistema de análisis de imágenes 100, las etapas de procesamiento de imágenes que se van a realizar se pueden enviar desde la base de datos de LIS 130 al sistema de análisis de imágenes y/o las etapas de procesamiento de imágenes realizadas en la imagen por el sistema de análisis de imágenes 100 se registran por la base de datos de LIS 130. Los sistemas LIS disponibles comercialmente útiles en los presentes procedimientos y sistemas incluyen, por ejemplo, el sistema VENTANA Vantage Workflow (Roche).
V. Generación de una función de puntuación continua de CD3 ejemplar para cáncer colorrectal en estadio III
V.A. Muestras y tinción de muestras
Se seleccionaron muestras de tejido fijadas con formol e incluidas en parafina de 563 cánceres de colon en estadio III (AVR n = 278; VIR seleccionado aleatoriamente n = 283) de un ensayo de fase 3 de tratamiento posquirúrgico basado en FOLFOX (N = 2665 [AVR 563, VIR 2102]) para el análisis de densidades de linfocitos T Cd 3+ y CD8+ en el margen invasivo (MI) y el núcleo tumoral (NT). La mediana de seguimiento fue de 6,3 años.
Se obtuvieron cinco cortes de 4 |jm de cada muestra de FFPE, se montaron en un portaobjetos y se tiñeron como sigue:
1. Control negativo de CD3 (es decir, protocolo de tinción con diluyente de anticuerpo primario en lugar de anticuerpo primario)
2. IHQ CD3
3. HyE
4. IHQ CD8
5. CD8, control neg.
Los portaobjetos IHQ se tiñeron en un teñidor de portaobjetos automatizado VENTANA BenchMark XT IHQ/ISH usando la detección OptiView DAB. Los anticuerpos primarios usados fueron anticuerpo primario monoclonal de conejo CONFIRM anti-CD3 (2GV6) (Ventana Medical Systems, Inc.) y anticuerpo monoclonal de conejo anti-CD8 (SP239) (Spring Bioscience). Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina. Los portaobjetos de HyE se tiñeron usando un teñidor de portaobjetos automatizado VENTANA SYMPHONY.
V.B. Adquisición de imágenes, análisis de imágenes y generación de función de puntuación continua
Los portaobjetos se exploraron en un escáner de portaobjetos VENTANA ISCAN COREO. Todo el análisis de imágenes se realizó usando un paquete informático VENTANA VIRTUOSO.
Los portaobjetos IHQ se procesaron previamente para marcar las células CD3+ en los portaobjetos teñidos con CD3 y las células CD8+ en los portaobjetos teñidos con CD8. Una región tumoral, un margen invasivo y una región de núcleo tumoral se anotaron por un lector experto, y se obtuvieron las densidades de células CD3+ y células CD8+.
Los valores de densidad se normalizaron seleccionando en primer lugar un valor de corte significativo máximo a partir de la inspección visual de la distribución de las densidades medidas. Debido a una distribución sesgada a la derecha para ambas densidades de células CD3+ y CD8+, se eligió un valor de corte máximo para permitir una separación significativa de la mayoría de los resultados después de la normalización. Se evaluaron varios valores de corte máximos para identificar el valor de corte de densidad biológicamente significativo máximo más bajo, en incrementos de 500, lo que daría como resultado que menos de 30 sujetos se marcaron por encima de lo biológicamente significativo. A cualquier puntuación por encima del punto de corte seleccionado se le asignó un valor igual al valor de corte. A continuación, las puntuaciones reasignadas se dividieron entre el valor de corte y se multiplicaron por 100.
Se ajustaron modelos de riesgos proporcionales de Cox multivariados usando puntuaciones continuas normalizadas para explorar la asociación entre el resultado (SVG) y para estas puntuaciones. Se ajustaron medidas continuas normalizadas a un modelo ponderado para obtener una puntuación total que reflejara la probabilidad de recaída o supervivencia. Se usaron curvas ROC para maximizar la sensibilidad y especificidad de la puntuación en la predicción del resultado (SVG) y para derivar un valor de corte para estratificar la cohorte en grupos de riesgo alto y bajo. Se seleccionaron valores de corte separados para pacientes con VIR y AVR. Se generaron curvas de Kaplan-Meier para los grupos de puntuación baja y alta, y se calculó un valorpde rango logarítmico. A continuación se ajustaron los modelos de riesgos proporcionales de Cox para obtener el cociente de riesgos instantáneos y CI al 95 % para mostrar el efecto global.
La densidad de linfocitos T CD3+ y CD8+ fue mayor en tumores con AVR frente a VIR (p <0,001) y mostró una heterogeneidad significativa entre pacientes de cada grupo de VR. CD3+ MI fue consecuentemente el marcador de pronóstico más fuerte como se revela por la selección hacia atrás; los otros marcadores no añadieron valor pronóstico adicional. Entre los tumores con AVR, una menor densidad CD3+ MI como variable continua se asoció independientemente con una SVG más corta (ppq =0,007). Usando un punto de corte optimizado, un 58 % (167/278) de los tumores con AVR tuvieron un nivel bajo de CD3+ MI, y estos pacientes tuvieron una SVG más corta frente a tumores con AVR con niveles altos de CD3+ MI (tabla). Además, la SVG de tumores con AVR con un nivel bajo de CD3+ MI fue comparable a la cohorte global de VIR (n=1819; CRIpq 1,05). Entre los tumores con VIR, usando un punto de corte optimizado, un 63 % (177/283) tuvo un nivel alto de CD3+ MI y SVG más larga frente a tumores con VIR con un nivel bajo de CD3+ MI (tabla 2). Los pacientes con tumores con VIR con un nivel alto de CD3+ MI tuvieron una SVG similar a la de tumores con AVR no seleccionados con linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) (p = 0,2).
Los cocientes de riesgos instantáneos usando CD3 se ilustran en la tabla 2:
Tabla 2
Los TIL CD3+ MI pueden estratificar el pronóstico de pacientes con cáncer de colon en estadio III para determinar la supervivencia global. Estos hallazgos pueden indicar que los pacientes con una densidad relativamente alta de células CD3+ en MI pueden ser candidatos para reducir o eliminar la quimioterapia neoplásica posquirúrgica, y pueden indicar que los pacientes con AVR y un nivel alto de CD3 pueden ser candidatos para recibir tratamientos dirigidos por punto de control inmunitario (tales como tratamientos dirigidos a PD-1 o PD-L1), con o sin quimioterapia neoplásica posquirúrgica.
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Claims (14)
1. Un procedimiento implementado por ordenador, que comprende:
(a) anotar un margen invasivo (MI) o una región de interés (RDI) peritumoral (PT) en una imagen digital de una muestra de prueba de un tumor colorrectal en estadio III;
(b) detectar células CD3+ en al menos una porción de la RDI;
(c) obtener una densidad de células CD3+ dentro de la RDI;
(d) aplicar una función de puntuación continua a un vector de rasgo característico que comprende la densidad de células CD3+ para obtener una puntuación de contexto inmunológico (ICS) para el tumor,
en el que aplicar una función de puntuación continua es aplicar una fórmula matemática en la que se introduce la magnitud real de la densidad de células CD3+ obtenida en la etapa (c) o un valor normalizado de la misma.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la RDI se identifica en una imagen digital de un primer corte seriado de la muestra de prueba, en el que el primer corte seriado se tiñe con hematoxilina y eosina, y en el que la RDI se registra automáticamente en una imagen digital de al menos al menos un segundo corte seriado de la muestra de prueba, en el que el segundo corte seriado se tiñe para CD3.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la densidad celular de (c) es una densidad celular de área obtenida dividiendo la cantidad de células marcadas en la RDI entre el área de la RDI.
4. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la densidad celular de (c) se deriva de una media o mediana de la densidad celular de área de una pluralidad de regiones de control de la RDI.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la densidad es un parámetro total o en el que la densidad es una media o mediana de la densidad normalizada derivada de una pluralidad de regiones de control de la RDI.
6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la función de puntuación continua es una función no lineal derivada de un modelo de riesgos proporcionales de Cox.
7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el vector de rasgo característico consiste esencialmente en una densidad de células CD3+ en la región MI o la región PT.
8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el procedimiento se lleva a cabo usando un ordenador o una red informática, en un modo de realización en el que la imagen digital se almacena en un soporte de datos.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que, en la etapa (a), la anotación de la región de interés se realiza usando un algoritmo de reconocimiento de patrón automático.
10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que, en la etapa (b), la detección de las células CD3+ se realiza usando un algoritmo de reconocimiento de patrón automático y/o en el que, en la etapa (c), la densidad celular se obtiene usando un algoritmo de conteo automático.
11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la puntuación de contexto inmunológico (ICS) para el tumor es una o más de: almacenada en un medio legible por ordenador; mostrada en un dispositivo de visualización; transferida electrónicamente por medio de al menos una interfaz electrónica.
12. Un procedimientoin vitropara pronosticar un paciente con cáncer colorrectal en estadio III, comprendiendo el procedimiento:
calcular una puntuación de contexto inmunológico (ICS) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y pronosticar el paciente en base a la ICS.
13. Un sistema para puntuar un contexto inmunológico de una muestra de tejido, comprendiendo el sistema: un procesador; y
una memoria acoplada al procesador, la memoria para almacenar instrucciones ejecutables por ordenador que, cuando se ejecutan por el procesador, hacen que el procesador realice operaciones que comprenden el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
14. Un procedimientoin vitropara seleccionar un tratamiento para un sujeto que tiene cáncer colorrectal en estadio III, comprendiendo dicho procedimiento:
(a) obtener una puntuación de contexto inmunológico (ICS) para el tumor colorrectal del sujeto de acuerdo con un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;
(b) opcionalmente, obtener un estado de la vía reparadora (VR) o un estado de la inestabilidad microsatelial (IMS) del tumor colorrectal; y
(c) seleccionar un tratamiento para el sujeto en base a la ICS y opcionalmente en base al estado de la vía reparadora;
en un modo de realización, en el que:
(c1) si la ICS es indicativa de un mal pronóstico, seleccionar un tratamiento que comprende un ciclo completo de quimioterapia neoplásica posquirúrgica; y
(c2) si la ICS es indicativa de un buen pronóstico, seleccionar un tratamiento que comprende un ciclo reducido de quimioterapia neoplásica posquirúrgica o que no comprende una quimioterapia neoplásica posquirúrgica.
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