CN1193043C - 稳定化变性脂蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供长期保存稳定性优良(即,蛋白质不易变性),可作为血液中变性脂蛋白量测定和生理活性测定用标准物质使用的变性脂蛋白及其制备方法。本发明的稳定化变性脂蛋白的制备方法包括,人为使脂蛋白变性,获得变性脂蛋白,对该变性脂蛋白进行冷冻干燥;或对含有变性脂蛋白的溶液实施包括至少一次冷冻的步骤,使该溶液中含有的脂蛋白变性,获得变性脂蛋白,再对该变性脂蛋白进行冷冻干燥。
Description
技术领域
本发明涉及稳定化变性脂蛋白及其制备方法。详细言之,本发明涉及将脂蛋白变性后,冷冻干燥变性脂蛋白而得到的具有优良的长期保存稳定性的变性脂蛋白及其制备方法。
本发明还涉及变性脂蛋白的制备方法。详细言之,本发明涉及的变性脂蛋白的制备方法是对含有脂蛋白的溶液实施包括至少一次冷冻的步骤而使该脂蛋白变性的方法,并且本发明还涉及将这样制备的变性脂蛋白再进行冷冻干燥而得到的具有优良的长期保存稳定性的变性脂蛋白及其制备方法。
已知变性脂蛋白与心肌梗塞和心绞痛等冠状动脉系统的疾病、脑梗塞和脑血管性痴呆等脑动脉系统的疾病、或肾病、糖尿病性肾病等肾动脉系统的疾病、以及外周动脉闭塞症等外周动脉系统的疾病等各种循环器官、系统的疾病密切相关,而用于定量测定变性脂蛋白的标准物质以及用于研究变性脂蛋白生理作用和生理活性的各种实验用试剂是决定实验结果的非常重要的物质。因此,稳定化变性脂蛋白的应用体现在,如使其与识别变性脂蛋白的抗体接触,通过测定抗体对样品的反应性来测定血液成分中所含的变性脂蛋白的方法中作为标准物质应用;以及作为研究变性脂蛋白的生理作用和生理活性的各种实验用试剂应用。
背景技术
已知血清中的脂质在心肌梗塞和心绞痛等冠状动脉系统的疾病、脑梗塞和脑血管性痴呆等脑动脉系统的疾病、或肾病、糖尿病性肾病等肾动脉系统的疾病、以及外周动脉闭塞症等外周动脉系统的疾病等各种循环器官、系统的疾病中起着重要的作用,而降低血清脂质的药,特别是降低胆固醇的药需要支付相当大的保健医疗费。根据最近的研究,将这种疾病的患者组与健康人组进行比较时,两组间的血清脂质的绝对量几乎无大的差异,而低密度脂蛋白(LDL)变性物、即氧化LDL在血清中的含量在两组间存在显著的差异(例如,Toshima,S.et al.(1996)Circulation,94,Suppl.I:1288)。另外,Steinberg等指出变性脂蛋白之一的氧化脂蛋白与粥样硬化病灶的发展相关(例如,Steinberg,D.,Parthasarathy,S.,Carew,T.E.,Khoo,J.C.,and Witztum,J.L.,(1989)N.Engl.J.Med.,320:915)。因此,近年开发出了应用变性脂蛋白的种种测定方法(例如,特开平8-304395号公报和特开平9-288106号公报),进而研究变性脂蛋白生理作用的试验也显得越来越重要。
但是进行这些实验时,由于得到用于测定的标准物质很难,所以使实验变得复杂起来。也就是说,研究变性脂蛋白的生理作用时,例如,有必要从多个设施多次收集血清中的变性脂蛋白来进行比较,因此每次试验每次的测定值必须没有变动,但如果没有在这些试验进行期间稳定且再现性好的标准物质,就不能确保测定时的再现性。另外,因应用不同的标准物质而使测定者间的实验结果出现明显变动的话,将使其生理作用的解释变得复杂,并且得不到一定的结论。这样,虽然能指出其生理重要性,但由于得不到可稳定保存的标准物质,阻断了如通过测定变性脂蛋白的含量作为正确判断疾病的手段应用的路径。
通常,如测定血清中蛋白质量时,将所谓的标准血清和纯化状态的目的成分,通过某些方法稳定化后作为标准物质应用。对于脂蛋白而言,例如必要时将含有脂蛋白的血浆或血清与蔗糖等非还原性糖混合,冷冻干燥至水分含量为1~10质量%的范围,由此制备长期保存过程中稳定的标准血浆或标准血清的方法(EP-A-617289号公报);将由载脂蛋白和脂质得到的构建脂蛋白在蔗糖和甘露醇等稳定剂存在的条件下进行冷冻干燥,使之稳定化的稳定冷冻干燥物的工业制备方法(US-A-5,652399号公报)已有所报道。但是上述公报只是在谋求使脂蛋白不变性的稳定化手段、即力图使脂蛋白稳定化,而对稳定化变性脂蛋白及其制备方法依然未公开。
另一方面,已知的制备变性脂蛋白的方法有,通过一些熟知的方法,例如通过超速离心法分离、纯化脂蛋白后,用铜离子等金属离子使之氧化,或与醋酸酐反应使之乙酰化,或与丙二醛等反应的方法,进而分别得到氧化脂蛋白、乙酰化脂蛋白及丙二醛化脂蛋白等变性脂蛋白。但是,用这些方法制备的变性脂蛋白与未变性的脂蛋白同样不稳定,因此不可能在该状态下长时间保存。
鉴于这种状况,特开平9-288106号公报公开了将磷脂人为氧化得到的磷脂的氧化物加入到血浆脂蛋白中,用该物质作标准品来测定人氧化脂蛋白的方法。但是,由于上述方法中提及的标准物质的保存稳定性不是十分理想,每次临用时必须重新配制,因此操作显得烦琐。
鉴于以上各种情况,急切需要一种能长期稳定保存的变性脂蛋白及其制备方法。
因此,本发明的目的是提供长期保存稳定性优良(即,测定值不因保存时间的长短而变动)的变性脂蛋白及其制备方法,该变性脂蛋白能作为血液中所含变性脂蛋白量测定用的标准物质,以及可作为研究变性脂蛋白生理功能和生理活性的各种实验用试剂应用。
发明内容
为了解决上述目的,本发明者们进行了悉心研究的结果,对于由含有脂蛋白的卵黄、乳汁、全血、血清和血浆中部分分级出的脂蛋白组分,以及通过超离心等方法分级纯化出的脂蛋白等脂蛋白,用铜离子等金属离子催化剂进行氧化得到氧化脂蛋白,通过醋酸酐等使之乙酰化得到乙酰化脂蛋白,或用丙二醛等使之醛化得到丙二醛化脂蛋白等人为变性的脂蛋白后,通过将这些变性脂蛋白冷冻干燥可显著提高变性脂蛋白的长期保存稳定性,进而达到了本发明的目的。另外,本发明者们在冷冻干燥时,通过应用蔗糖、乳糖、海藻糖、牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)等稳定剂,进一步提高了变性脂蛋白的长期保存稳定性,进而更好地解决了上述各种问题。
为了解决上述目的,本发明者们进一步悉心研究的结果,通过对含脂蛋白的溶液实施包括至少一次冷冻的步骤使该溶液中含有的脂蛋白变性后,得到了血液中变性脂蛋白量测定用标准物质和作为研究变性脂蛋白生理功能和生理活性的各种实验用试剂的变性脂蛋白。再通过对所得变性脂蛋白进行冷冻干燥,使变性脂蛋白在干燥状态下的长期保存稳定性及将该干燥状态的变性脂蛋白溶解于溶液后的保存稳定性显著提高,进而达到了本发明的目的。在此,本发明者们在冷冻干燥时,同样通过应用蔗糖、乳糖、海藻糖、牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)等稳定剂,进一步提高了变性脂蛋白的长期保存稳定性,进而更好地解决了上述各种问题。
本发明者们基于以上观点,完成了本发明。
也就是说,上述目的是通过如下的稳定化变性脂蛋白的制备方法来达到,该方法包括人为使脂蛋白变性,得到变性脂蛋白,通过将该变性脂蛋白冷冻干燥而使之稳定化。
上述目的还通过如下的变性脂蛋白的制备方法来达到,该方法包括对含脂蛋白的溶液实施包括至少一次冷冻的步骤,使该溶液中所含脂蛋白变性。
上述目的还通过如下的稳定化变性脂蛋白的制备方法而达到,该方法包括对含脂蛋白的溶液实施包括至少一次冷冻的步骤,使该溶液中所含脂蛋白变性,得到变性脂蛋白,再通过将该变性脂蛋白冷冻干燥而使之稳定化。
附图的简单说明
图1是表示以本发明实施例1中所得氧化LDL(用铜氧化的LDL经冷冻干燥后,用规定的方法进行溶解)为样品制作的检测标准曲线的图。
图2是表示将本发明实施例1中所得氧化LDL(用铜氧化的LDL经冷冻干燥)于4℃保存,每隔一定时间用规定的方法进行溶解,以所得产物作样品进行测定时,与用铜氧化的LDL不经冷冻干燥,直接于4℃保存,每隔一定时间取样进行测定时的测定值的比较图。
图3是表示以本发明实施例2中所得氧化HDL(用铜氧化的HDL经冷冻干燥后,用规定的方法进行溶解)为样品制作的检测标准曲线的图。
图4是表示将本发明实施例2中所得氧化HDL(用铜氧化的HDL经冷冻干燥)于4℃保存,每隔一定时间用规定的方法进行溶解,以所得产物作样品进行测定时,与用铜氧化的HDL不经冷冻干燥,直接于4℃保存,每隔一定时间取样进行测定时的测定值的比较图。
图5是表示以本发明实施例3中所得氧化脂蛋白a[Lp(a)](用铜氧化的Lp(a)经冷冻干燥后,用规定的方法进行溶解)为样品制作的检测标准曲线的图。
图6是表示将本发明实施例3中所得氧化Lp(a)(用铜氧化的Lp(a)经冷冻干燥)于4℃保存,每隔一定时间用规定的方法进行溶解,以所得产物作样品进行测定时,与用铜氧化的Lp(a)不经冷冻干燥,直接于4℃保存,每隔一定时间取样进行测定时的测定值的比较图。
图7是表示实施例4中,通过对血浆实施包括冷冻的步骤制备变性脂蛋白的图。
图8是表示实施例5中,对于实施例5(2)中制备的冷冻变性人血清标准品及实施例1(3)中制备的氧化LDL标准品,用ELISA法评价溶解后保存稳定性时的测定值(吸光度)的比较图。
图9是表示实施例6中,通过对人LDL实施包括冷冻的步骤制备变性脂蛋白的图。
图10是表示实施例6中,对于实施例6(2)中制备的冷冻变性LDL标准品及实施例1(3)中制备的氧化LDL标准品,用ELISA法评价溶解后保存稳定性时的测定值(吸光度)的比较图。
实施发明的最佳方案
以下,对本发明进行详细说明。
本发明的第一方案是提供稳定化变性脂蛋白的制备方法,它包括人为使脂蛋白变性,得到变性脂蛋白,通过将该变性脂蛋白冷冻干燥而使之稳定化等步骤。
本说明书中“变性脂蛋白”是指氧化脂蛋白、乙酰化脂蛋白及通过丙二醛等作用醛化的脂蛋白等经化学变化的变性脂蛋白,以及经过凝集和3级结构变化等结构变化的变性脂蛋白两种意义;也包含相对于未变性的脂蛋白,发生电荷变化、分子量变化、对生物体内受体的亲和性的变化,及与FOH1a/DLH3(保藏编号:FERM BP-7171)产生的抗体(J.Biol.Chem.1994,269:15274-15279;及特开平7-238098号公报)等变性脂蛋白特异性抗体的结合性产生变化等情况。此时,与上述FOH1a/DLH3产生的抗体等变性脂蛋白特异性抗体的结合性变化是指,例如将来变性脂蛋白和本发明的变性脂蛋白作为抗原固定于不溶性固相载体后,与该抗体反应,随后加入对该抗体具有特异性的酶标抗体,并以酶量作为结合于固相化抗原的该抗体量的指标进行检测时,由未变性脂蛋白抗原所得信号量与由变性脂蛋白抗原所得信号量之间有差异。
本发明中应用的脂蛋白可来自任何一种生物,例如人、牛、马、山羊、绵羊、兔子、狗和豚鼠等哺乳类;鸡、鹌鹑等鸟类;鲑和鲱等鱼类;以及细菌和真菌等微生物来源的脂蛋白等。作为本发明中所使用的脂蛋白的具体例子,例如存在于上述来源的细胞膜、线粒体膜、髓磷脂结构膜和细菌细胞膜等生物膜中的结构脂蛋白;存在于血浆、卵黄和乳汁等中的可溶性脂蛋白;以及通过超速离心法分级得到的乳糜微粒、超低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、脂蛋白X、中密度脂蛋白(IDL)、脂蛋白a[Lp(a)]、HDL2和HDL3等高密度脂蛋白(HDL)、及超高密度脂蛋白(VHDL)等脂蛋白组分。这些脂蛋白可单独使用也可2种以上混合使用。其中,优选来源于人的脂蛋白,更优选人血浆和血清来源的乳糜微粒、VLDL、LDL、Lp(a)、HDL2或HDL3、或它们的混合物,最优选人血浆和血清来源的LDL。
本发明中使用的人脂蛋白的典型代表可通过下述步骤制备,用离心沉降法和超离心法等已知的方法从人血清中获得具有所需比重的组分,然后用透析和脱盐等已知方法对该组分进行纯化。例如制备低密度脂蛋白(LDL)的方法可参照以下(1)~(3)的方法。
(1)向20~30mL正常人血清中加入乙二氨四乙酸钠(EDTA-2Na),并使其终浓度为1mmol/L.向其中加入NaBr,将比重调至1.000。分装到离心管中,在其上部依次加入用NaBr将比重调至1.15、1.063、1.019和1.006的缓冲液,4℃离心24小时(120000×g).依次从上端开始分级,用折射计测定各组分的比重,收集比重为1.019~1.063的LDL组分.将如此得到的LDL组分,收集后立即用含0.25mmol/L EDTA的PBS[10mmol/L的磷酸缓冲液,140mmol/LNaCl(pH7.4)]透析(特开平7-238098号公报,段落号0040);
(2)向用肝素采血得到的人血浆中加入终浓度达0.25mmol/L的EDTA,取0.75mL分别加到超离心用试管中(1~4mL体积)后,加入含0.3mmol/L EDTA的0.15mol/L NaCl 250μl,185000×g、10℃离心2.5小时。去掉上层150μl,取下层750μl,加入KBr(50w/v%)150μl,使其比重为1.063。将调整了比重的血浆转移到超速离心用试管(1~4mL体积)的底部,244000×g、10℃离心16小时。小心地回收上层的橙色带(约100~150μl),用含0.25mmol/L EDTA的PBS于4℃透析6小时(将3升透析液以2小时间隔更换2次)(特开平8-304395号公报,段落号0050);或
(3)从由EDTA作抗凝剂的人血浆中回收超速离心时比重为1.019~1.063的组分,并作为LDL组分。以琼脂糖凝胶电泳获得单一锐利的条带来确认LDL纯度后,用含0.25mmol/L EDTA的PBS(pH7.4)充分透析(特开平9-288106号公报,段落号0062)。
另外,作为制备脂蛋白a[Lp(a)]的方法的例子,如以下所述。向用肝素采血得到的人血浆中加入终浓度达0.25mmol/L的EDTA,在其上部加入含0.3mmol/L EDTA的0.15mol/L NaCl 250μl,105000×g、8℃离心20小时。舍弃上层,向下层加入预先用乳钵粉末化的KBr,于4℃溶解,溶解时要避免产生气泡,并将比重调至1.125,105000×g、8℃离心20小时。小心地回收上层的橙色带,用BiogelA-5m(BioRad公司制),以1mol/L NaCl、2mmol/L EDTA、10mmol/L磷酸缓冲液作展开剂进行凝胶过滤。得到的各组分用Lp(a)测定试剂盒(テルモ株式会社制)进行测定,并回收Lp(a)组分。将该组分过赖氨酸-Sepharose 4B(Pharmacia制)柱,吸附部分用含0.2mol/Lε-氨基己酸的缓冲液洗脱后,用含0.25mmol/L EDTA的PBS透析(特开平8-304395号公报,段落号0050)。
本发明中对人为使脂蛋白变性的方法没有特殊限制,可使用已知的方法。例如,作为人脂蛋白的变性方法如以下所述的几种方法。在金属离子存在的条件下氧化人脂蛋白的方法;使人脂蛋白乙酰化的方法;用丙二醛使人脂蛋白醛化的方法;以及将磷脂人为氧化后得到的化合物(例如,1-棕榈酰-2-(9-氧代壬酰)-甘油-3-磷酰胆碱和1-棕榈酰-2-(5-氧代戊酰)-甘油-3-磷酰胆碱)溶解到适当的溶剂(如DMSO)中,然后所得溶液添加到人脂蛋白中的方法。其中,优选在金属离子存在的条件下氧化人脂蛋白的方法、使人脂蛋白乙酰化的方法、以及用丙二醛使人脂蛋白醛化的方法。
下面,对上述优选的3种方法的典型例子进行详细说明。
第一、对在金属离子存在的条件下氧化人脂蛋白的实施方案进行如下详细叙述。以下,对上述实施方案的具体例子进行叙述。用不含EDTA的缓冲液[例如,PBS(pH7.4)]透析由上述一些步骤制备的人脂蛋白(组分),以除去EDTA,随后将蛋白质浓度调至所定的浓度(50~2000μg/mL,优选100~500μg/mL)将硫酸铜(CuSO4)添加到所定浓度,在约36~38℃条件下进行反应。
作为上述实施方案中所使用的金属离子,例如氟化铜(II)二水合物、溴化铜(II)、氧化铜(II)、氢氧化铜(II)、硫酸铜(II)、硫酸铜(II)五水合物、硒化铜(I)、硒化铜(II)、硒酸铜(II)五水合物、六氟硅酸铜(II)四水合物、醋酸铜(II)一水合物、四氨合铜(II)硫酸盐一水合物、二(乙二胺)铜(II)硫酸盐二水合物来源的铜离子;氯化铁(II)、溴化铁(II)六水合物、硝酸铁(II)六水合物、硫氰酸铁(II)三水合物、醋酸铁(II)四水合物、草酸铁(III)五水合物、硫酸铵铁(II)六水合物、硫酸钾铁(III)十二水合物、硫酸铵铁(II)十二水合物、及硫酸铁来源的铁离子;血红蛋白(Hb)、转铁蛋白(Tf)和乳铁蛋白(Lf)的金属离子及它们的混合物。其中,优选使用硫酸铜(II)、硫酸铜(II)五水合物来源的铜离子或它们的混合物。这些金属离子可单独使用,或以2种以上混合物的形式使用。
另外,上述实施方案中金属离子的使用量只要是能充分氧化人脂蛋白的量,就没有特殊限制。例如,相对于1g被氧化的人脂蛋白,金属离子的浓度为10~200μmol/L,优选25~100μmol/L的量。
另外,在上述实施方案中,反应时间过短时,脂蛋白质的变性(氧化)不充分,另一方面,反应时间过长时,会引起蛋白质自身的分解,进而导致如脱辅基蛋白的抗原性丢失等问题。另外,反应时间可根据残存的EDTA量和溶液总量等进行变动,所以通常不进行规定,但对于上述实施方案中制备的脂蛋白(组分),可在约36~38℃进行1~24小时,优选2~4小时。
第二、对使人脂蛋白乙酰化的实施方案详细说明如下。以下,对上述实施方案的具体例子进行叙述。向所定蛋白质浓度(约500~2000μg/mL,优选500-1000μg/mL)的由上述一些步骤制备的人脂蛋白(组分)溶液中加入等体积的饱和醋酸钠,0~4℃搅拌1~2小时。然后,加入醋酸酐0.25~4μl(即,对于人脂蛋白为0.5~2μl/mg),优选加入0.4~2.4μl(即,对于人脂蛋白为0.8~1.2μl/mg),0~4℃搅拌60~120分钟,然后在2~8℃用含0.25mmol/LEDTA的PBS(pH7.4)充分透析(用500~1000倍体积透析2~3次(2小时以上/次))。
第三、对用丙二醛使人脂蛋白醛化的实施方案详细说明如下。以下,对上述实施方案的具体例子进行叙述。向0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.5)中所定蛋白质浓度(约0.25~1mg/mL,优选0.25~0.5mg/mL)的由上述一些步骤制备的人脂蛋白(组分)溶液中加入的丙二醛溶液(1mol/L丙二醛双二甲基乙缩醛在0.1mol/L盐酸存在下,100℃加热5分钟后的水解产物)0.625~10μl(即,对于人脂蛋白为2.5~10μl/mg),优选加入1~6μl(即,对人脂蛋白为4~6μl/mg),30~40℃反应2~4小时后,将此反应液在2~8℃、用含0.25mmol/L EDTA的PBS(pH7.4)充分透析(用500~1000倍体积透析2~3次(2小时以上/次))。
本发明的方法以稳定化由上述步骤得到的变性脂蛋白为目的,其中包括冷冻干燥的步骤是十分必要的。本说明书中提到的“冷冻干燥”一词的意义与该领域中使用的意义相同,即,将样品冷冻,在冷冻状态下直接进行减压处理,进而从样品中除去水和升华性物质,使之干燥。本发明中,冷冻干燥的条件只要是可使变性脂蛋白稳定化的条件,就没有特殊的限制。但通常在温度为-80~20℃,优选-80~15℃,压力为0.667~13.33Pa,优选0.667~1.333Pa,冷冻干燥12~72小时,优选24~72小时。通过这样的冷冻干燥步骤,含变性脂蛋白的冷冻干燥物中的水分含量通常在10质量%以下,优选1质量%以下。
本发明的冷冻干燥过程中优选存在稳定剂。作为上述方案中使用的稳定剂,是该领域中通常所使用的稳定剂,具体而言,例如蔗糖、乳糖、海藻糖等糖类;牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)等蛋白质等。其中,优选使用蔗糖、乳糖、海藻糖、牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)作为稳定剂。上述稳定剂可单独使用,或以2种以上混合物的形式使用。另外,此时稳定剂的用量只要是达到使变性脂蛋白稳定化的量,就没有特殊的限制,通常为1~20质量%,优选2~5质量%。
另外,本发明的冷冻干燥过程中存在稳定剂时,对于稳定剂的添加时间无特殊限制,但优选在冷冻干燥前预先添加稳定剂,尤其是特别优选在变性步骤和冷冻干燥步骤之间添加稳定剂。其次,冷冻干燥后,没必要特意加以去除稳定剂的步骤,考虑到变性脂蛋白的保存稳定性,反而优选在保持冷冻干燥状态期间存在稳定剂。
根据本发明的第二实施方案,它提供变性脂蛋白的制备方法,包括对含脂蛋白的溶液施加包括至少一次冷冻的步骤,使该溶液中所含脂蛋白变性。另外,根据本发明的第三实施方案,它提供稳定化变性脂蛋白的制备方法,包括对由上述步骤得到的变性脂蛋白再进行冷冻干燥而使该变性脂蛋白稳定化。本发明者们发现,通过对含脂蛋白的溶液施加包括至少一次冷冻的步骤使该溶液中所含脂蛋白变性而得到的变性脂蛋白,也可用作测定血液中变性脂蛋白含量时的标准物质和研究变性脂蛋白的生理功能和生理活性时的试剂;以及通过对上述得到的变性脂蛋白再进行冷冻干燥而得到的变性脂蛋白,在干燥状态下具有优良的长期保存稳定性及将该干燥状态的变性脂蛋白溶解到溶液中后的保存稳定性优良,基于以上观点,得到了上述实施方案的方法。
第二或第三实施方案中的方法,以包括对含有脂蛋白的溶液进行冷冻的步骤作为必要条件。第二或第三实施方案中的“脂蛋白”一词与上述第一实施方案中的定义相同。作为含有脂蛋白的溶液,例如血清、血浆和乳糜微粒、超低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、脂蛋白X、中密度脂蛋白(IDL)、脂蛋白a[Lp(a)]、HDL2和HDL3等高密度脂蛋白(HDL)及超高密度脂蛋白(VHDL)等脂蛋白组分。其中,更优选血清、血浆、乳糜微粒、VLDL、LDL、Lp(a)、HDL2或HDL3、或它们的混合物等含有脂蛋白的溶液,最优选人血浆、人血清、以及人血浆和血清来源的LDL。
第二实施方案的方法,以对含有脂蛋白的溶液实施包括冷冻的步骤作为必要条件。本说明书中的“包括冷冻的步骤”一词是指,包含至少一次将该溶液中所含脂蛋白内或将该脂蛋白周围环境中的水分部分或全部冷冻的步骤。作为通过本发明的包括冷冻的步骤而得到的变性脂蛋白,例如上述第一实施方案中所述的变性脂蛋白中的任何一种。通过本发明的包含冷冻的步骤而得到的变性脂蛋白优选氧化脂蛋白、醛化脂蛋白、或与杂交瘤细胞系FOH1a/DLH3(保藏编号:FERM BP-7171)产生的抗体(在本说明书中,略作“DLH3抗体”)反应的脂蛋白。另外,上述方法中所使用的杂交瘤细胞系FOH1a/DLH3委托位于日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所保藏,保藏日期为1994年2月17日,保藏编号为FERM P-14153,并以“Mouse-Mouse hybridoma FOH1a/DLH3(小鼠-小鼠杂交瘤FOH1a/DLH3)”的标识保藏。根据布达佩斯条约,2000年5月26日该保藏在同一保藏单位转为国际保藏,保藏编号为FERM BP-7171。
上述实施方案中,以变性为目的对含有脂蛋白溶液实施包括冷冻的步骤,只要能使该溶液中所含脂蛋白变性,就对其条件没有特殊限制。另外,包含冷冻的步骤中,由于进行冷冻时脂蛋白周围的环境能大大左右冷冻的效果,所以一般对其条件无法进行限定,例如包含冷冻的步骤中的冷冻条件是,降温速度为0.01~10℃/分,优选0.01~1℃/分,降到0~-196℃,优选降到-5~-85℃的温度进行冷冻,在所定温度维持0~36小时,优选0~16小时。另外,在第二实施方案中,含有使脂蛋白变性的冷冻的步骤,有必要至少进行一次,并且反复进行也无所谓。反复进行时的包括冷冻的步骤数为1~10次,更优选1~4次。本发明中,反复的步骤内容可与包含冷冻的步骤内容不相同,各步骤的冷冻条件可相同,亦可不同。此时,冷冻干燥步骤数超过10次时,与之相对应的脂蛋白变性效果减弱,因此显得不经济。
另外,第二实施方案中,使脂蛋白变性的包含冷冻的步骤也可包含冷冻后融解的步骤。上述第二实施方案中包含冷冻的步骤中包含融解步骤时,对其条件没有特殊限制,融解可以0.01~10℃/分,优选0.1~10℃/分的升温速度,升温到0~42℃,优选到0~37℃来进行。
另外,第二实施方案中,使脂蛋白变性的包含冷冻的步骤,也可在该步骤内包含干燥的步骤。此时,对包含冷冻后干燥的步骤的条件没有特殊限制,可以在-80~20℃,优选-80~15℃的温度,以0.6~13Pa,优选0.6~1.3Pa的压力,干燥12~72小时,优选24~72小时。
另外,上述第二实施方案中,以使脂蛋白变性为目的的包含冷冻的步骤也可包含将含脂蛋白的溶液冷冻干燥后,将所得干燥物溶解到溶剂中,然后对该溶液再次进行冷冻干燥的步骤。此时的冷冻干燥步骤与第一实施方案中的定义相同。此外,对溶解最初的冷冻干燥产物的溶剂没有特殊限制,只要能溶解干燥物即可,例如水、去离子水和蒸馏水等。
第三实施方案的方法的必要条件是,将根据上述第二实施方案的方法得到的变性脂蛋白再进行冷冻干燥,从而使该变性脂蛋白稳定化。除稳定剂的添加时期以外,上述实施方案中的冷冻干燥步骤与第一实施方案中的定义相同。也就是说,在第三实施方案中,稳定剂根据第二实施方案中包含冷冻的步骤内容而不同,例如,对含有变性脂蛋白的溶液实施包括冷冻的处理步骤时,在包括冷冻的步骤前预先添加稳定剂,或者在以变性为目的的包括冷冻的步骤与以稳定化为目的的冷冻干燥步骤之间添加。另外,将含有变性脂蛋白的溶液进行冷冻时,优选在包括冷冻的步骤之前添加稳定剂。
根据本发明的第四实施方案,本发明提供由上述第一或第三实施方案制备的稳定化变性脂蛋白。
由上述步骤制备的变性脂蛋白及稳定化变性脂蛋白具有优良的长期保存稳定性,例如,使之与识别变性脂蛋白的抗体接触,通过测定该抗体对样品的反应性来测定血液成分中所含变性脂蛋白的方法中可作为标准物质应用,也可作为研究变性脂蛋白生理功能和生理活性的各种实验用试剂。
因此,根据本发明的第五实施方案,本发明提供变性脂蛋白的测定方法,这种方法将由上述第一或第三实施方案制备的稳定化变性脂蛋白作为标准物质使用。另外,根据本发明的第六实施方案,本发明提供变性脂蛋白测定用的试剂盒,该试剂盒中含有由上述第一或第三实施方案制备的稳定化变性脂蛋白作为标准物质。
上述第五实施方案中,变性脂蛋白的测定方法没有特殊限制,可使用已知的方法。具体而言,使变性脂蛋白与识别变性脂蛋白的抗体接触,通过测定该抗体对样品的反应性来测定血液成分中所含变性脂蛋白的免疫学测定方法,例如放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、荧光免疫法(FIA)、发光免疫法、凝集免疫法、免疫比浊法及免疫浊度测定法等。测定方式可采用竞争法及夹芯法等。这些方法中,优选将本发明的稳定化变性脂蛋白在免疫学方法,尤其是在放射免疫法、酶联免疫吸附法、荧光免疫法和发光免疫法中作为标准物质使用。
上述第六实施方案中,对变性脂蛋白测定用的试剂盒没有特殊限制,只要含有本发明的稳定化变性脂蛋白作为标准物质即可,除使用本发明的稳定化变性脂蛋白作为标准物质以外,其它组成与已知的试剂盒的组成相同。例如,使用本发明的稳定化变性脂蛋白作为ELISA法中的标准物质时,本试剂盒的组成包含抗体稀释液、抗体固相化的固相、反应用缓冲液、洗涤液、标记的二抗(优选酶标二抗)、检测用试剂(例如显色液)、及作为标准物质的本发明的稳定化变性脂蛋白等的全部或一部分。上述实施方案也包含在本发明的概念中。因此,根据第七实施方案,本发明提供变性脂蛋白测定用的试剂盒,它含有抗体稀释液、抗体固相化的固相、反应用缓冲液、洗涤液、标记的二抗、检测用试剂、及作为标准物质的由上述第一或第三实施方案制备的稳定化变性脂蛋白等的全部或一部分作为组成要素。
上述第七实施方案中,即便试剂盒中不包含标准物质时,在使用试剂盒这一前提实际存在情况下,也应该认识到本发明的标准物质是试剂盒的构成要素。
以下,以通过ELISA法测定变性脂蛋白活性为例,参照下述实施例,对本发明变性脂蛋白的制备方法及其效果进行更详细地说明,但毋庸置疑,本发明的实施方案不限定于下述实施例。
实施例1
(1)LDL的制备
从用EDTA作抗凝剂获得的人血浆获得超速离心法(10℃,调整比重为1.019,120000×g,离心20小时后,回收上层部分,调整比重为1.063,再120000×g离心24小时)中比重为1.019~1.063的部分,作为LDL组分进行回收。此时,通过琼脂糖凝胶电泳法中得到单一锐利条带来确认LDL的纯度。
接着,将该LDL组分用含0.25mmol/L EDTA的PBS(pH7.4)进行充分透析(16小时或一晚),使之纯化。再将上述纯化的LDL溶解到含0.25mmol/L EDTA的PBS(pH7.4)中,使LDL蛋白浓度为1mg/mL,4℃保存备用。本实施例中,蛋白质含量用Lowry改进方法测定。简而言之,将2(w/v)%碳酸钠、0.4(w/v)%氢氧化钠、0.16(w/v)%酒石酸、1(w/v)%SDS溶液和4(w/v)%硫酸铜溶液以100比1混合的试剂1.5mL,分别加到0.5mL的样品及标准物质(BSA)中进行混合。室温反应20分钟后,添加0.15mL的酚试剂,立即混合。室温反应45分钟后,在660nm处测定吸光度。
(2)LDL的氧化
将(1)中制备的LDL在500~1000倍体积以上不含EDTA的PBS(pH7.4)中进行3次以上透析(2小时以上/次),以去除EDTA,将LDL溶解到不含EDTA的PBS(pH7.4)中,使其浓度达200μg/mL。然后向该LDL溶液10mL中加入终浓度为5μmol/L的硫酸铜(CuSO4),37℃温育3小时,以氧化LDL。再向该溶液中加入EDTA,使其终浓度达1mmol/L,终止氧化反应后,在500~1000倍体积以上含1mmol/L EDTA的PBS(pH7.4)中进行3次以上透析(2小时以上/次),去除CuSO4,制备氧化的LDL,并于4℃保存。
另外,本实施例中的氧化LDL量用原料LDL的蛋白质量进行定义。
(3)氧化LDL冷冻干燥品的制备
用PBS(pH7.4)稀释(2)中制备的氧化LDL,使蛋白质浓度达6.25ng/mL(称作L型)和12.5ng/mL(称作H型),然后再分别添加终浓度为2(w/v)%的BSA和终浓度达5(w/v)%的蔗糖,充分混合。接着,将该混合液分装到玻璃瓶中,每瓶装入1mL,用共和真空冷冻干燥装置RL-201BS(共和真空技术株式会社制),-50℃冷冻16小时后,于20℃、1.33Pa的减压条件下冷冻干燥48小时,使水分气化,去除水分,然后密封,4℃保存。此时,冷冻干燥品中水分含量为0.8质量%。
(4)用氧化LDL的冷冻干燥品作为标准品制作检测标准曲线
a.过氧化物酶标记抗体的制备
向1mL纯化的抗人B蛋白抗体(兔,Chemicon公司制)溶液(5mg/mL,0.1mol/L硼酸缓冲液,pH8.0)中加入50μl的2-亚氨基四氢噻吩-HCl(60mmol/L,0.1mol/L硼酸缓冲液,pH8.0),30℃反应30分钟,然后反应液用预先经含5mmol/L EDTA的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)平衡过的Sephadex G-25(1cm×30cm)(Pharmacia公司制)进行过柱,回收洗脱出的抗体组分。向1mL辣根过氧化物酶溶液(略作HRP,东洋纺社制)(10mg/mL,0.1mol/L磷酸缓冲液,pH7.0)中加入50μl的EMSC溶液(同人化学社制,50mmol/L DMSO溶液),30℃反应30分钟,然后反应液用预先经0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.5)平衡过的Sephadex G-25(1cm×30cm)(Pharmacia公司制)进行过柱,回收洗脱出的HRP组分。混合回收的抗体组分和HRP组分,30℃反应30分钟,然后反应液用预先经0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)平衡过的Sephadex G-200(1cm×100cm)(Pharmacia公司制)进行过柱,回收洗脱出的抗体-HRP连接的组分,将之作为过氧化物酶标记的抗人B蛋白抗体。向回收的组分中直接加入终浓度为1(w/v)%的BSA,-50℃保存备用。
b.DLH3抗体的制备
向8周龄以上的雄性Balb/c小鼠腹腔内注入鲨肝油烷(2,6,10,14-四甲基十五烷),注射量为0.5mL/只,饲养2周。然后,将可生成所期望单克隆抗体的细胞杂交瘤细胞系FOH1a/DLH3(保藏编号:FERM BP-7171;J.Biol.Chem.1994,269:15274-15279;及特开平7-238098号公报)按1×106/只的量接种到小鼠腹腔内。7~14天后,当小鼠腹腔内潴留大量腹水时,用18G的注射器从腹腔收集腹水,3000rpm离心10分钟,回收上清。向该上清中加入等量的PBS(pH7.4)后,向该混合液中滴加1小时等量的饱和硫酸铵,同时充分搅拌,再继续搅拌1小时,然后3000rpm离心10分钟,弃上清,回收沉淀物。将该沉淀物加入到含0.5mol/L NaCl的PBS(pH7.4)中,使之溶解,将该溶液用预先经含0.5mol/L NaCl的PBS(pH7.4)平衡过的Sephacryl S-300(2.5cm×100cm)(Pharmacia公司制)进行过柱,回收IgM组分作为DLH3抗体。DLH3抗体的浓度测定是,在光路1cm的280nm处测定吸光度,所得吸光度除以1.3,将所得值作为抗体浓度(mg/mL)。
c.夹芯ELISA分析
向在(3)中制备的氧化LDL冷冻干燥品中加入1mL纯化水溶解后,用含1(w/v)%BSA的PBS稀释成所定浓度(0ng/mL、3.125ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、及25ng/mL)。
在上述b.中制备的DLH3抗体用Tris~HCl(pH8.0)稀释成10μg/mL后,以1μg/孔的量加入到96F微量培养板(ヌンク公司制)的各孔中,4℃孵育16小时。弃抗体溶液,加入350μL含1(w/v)%BSA的Tris-HCl(pH8.0),室温孵育2小时进行封闭后,用含0.05%(v/v)Tween20的PBS(pH7.4)洗涤4次。
然后,每孔分别加入100μL上述制备的含有所定浓度氧化LDL冷冻干燥品的稀释液,室温孵育2小时,然后用含0.05%(v/v)Tween20的PBS(pH7.4)洗涤4次。
再向各孔中加入100μL用含1(w/v)%BSA的PBS(pH7.4)稀释1000倍的上述a.中制备的过氧化物酶标记的抗人B蛋白抗体溶液,室温孵育30分钟。然后,用含0.05%(v/v)Tween20的PBS(pH7.4)洗涤4次,然后加入100μL含3mg/mL邻苯二胺(和光纯药工业社制)的0.03%(w/v)过氧化氢水,显色30分钟,然后加入1mol/L硫酸50μL以终止反应,测定492nm的吸光度。其结果在图1中显示。如图1所示,用本发明的氧化LDL的冷冻干燥品可制作出漂亮的检测标准曲线。
(5)保存稳定性的比较
所定时间(0,1,3,4周)内4℃保存(3)中制备出的氧化LDL的冷冻干燥品[氧化LDL标准品(1)(H型):12.5ng;氧化LDL标准品(2):6.25ng(L型)]。另外,用PBS(pH7.4)将(2)中制备的氧化LDL稀释成蛋白质浓度为6.25ng/mL(称做“L型”)和12.5ng/mL(称做“H型”),然后分别添加终浓度为2(w/v)%的BSA及终浓度为5(w/v)%的蔗糖,充分混合。将该混合物不进行冷冻干燥,直接于4℃冷藏[分别称作氧化LDL比较品(1)(H型):12.5ng/mL;氧化LDL比较品(2)(L型):6.25ng/mL],在所定时间(0,1,3,4周)内4℃保存。
保存所定时间后,向氧化LDL标准品(1)和(2)中加入纯化水1mL溶解,对其溶液以及氧化LDL比较品(1)和(2)分别进行与上述(4)c.同样的操作,测定492nm的吸光度。其结果在图2中显示。
如图2所示,本发明的冷冻干燥的氧化LDL标准品(1)和(2),与制备后直接(0周)测定相比较,测定值几乎没有变化,与此相对,冷藏保存的氧化LDL比较品(1)和(2)与制备后直接(0周)测定相比较,经过4周后,测定值分别降低约50%和约45%,这表明与本发明的氧化LDL标准品(1)和(2)相比,它们的保存稳定性相当差。
实施例2
(1)HDL的制备
从用EDTA作抗凝剂获得的人血浆中去除LDL以后,调整比重为1.21,通过超速离心法(10℃,120000×g,48小时)获得比重为1.063~1.21的部分,作为HDL组分进行回收。此时,通过琼脂糖凝胶电泳法中得到单一锐利条带来确认HDL的纯度。
接着,将该HDL组分用含0.25mmol/L EDTA的PBS(pH7.4)进行充分透析(16小时),使之纯化。再将该纯化的HDL溶解到含0.25mmol/L EDTA的PBS(pH7.4)中,使HDL蛋白浓度为1mg/mL,4℃保存备用。本实施例中,蛋白质量用实施例1(1)中所述的Lowry改进方法进行测定。
(2)HDL的氧化
将(1)中制备的HDL用500~1000倍体积以上不含EDTA的PBS(pH7.4)中进行3次以上透析(2小时以上/次),以去除EDTA。将HDL溶解到不含EDTA的PBS(pH7.4)中,使其浓度达100μg/mL。然后向该HDL溶液10mL中加入终浓度为10μmol/L的硫酸铜(CuSO4),37℃温育18小时,以氧化HDL。再向该溶液中加入EDTA,使其终浓度达1mmol/L,终止氧化反应后,在500~1000倍体积以上含1mmol/L EDTA的PBS(pH7.4)中进行3次以上透析(2小时以上/次),去除CuSO4,制备氧化的HDL,并于4℃保存。
本实施例中,氧化HDL的量用原料HDL的蛋白质量进行定义。
(3)氧化HDL冷冻干燥品的制备
(2)中制备的氧化HDL中分别添加终浓度为2(w/v)%的BSA和终浓度为5(w/v)%的蔗糖,充分混合。然后分装到玻璃瓶中,每瓶中装入1mL,用共和真空冷冻干燥装置RL-201BS(共和真空技术株式会社制),-50℃冷冻16小时后,于20℃、1.33Pa的减压条件下冷冻干燥48小时,使水分气化,去除水分,然后密封,于4℃保存。此时,冷冻干燥品中水分含量为0.8质量%。
(4)用氧化HDL的冷冻干燥品作为标准品制作检测标准曲线
a.浓度调整
向在(3)中制备的氧化HDL冷冻干燥品中加入1mL纯化水溶解后,用含1(w/v)%BSA的PBS稀释成所定浓度(0ng/mL、3.125ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL和75ng/mL)。
b.夹芯ELISA分析
用碳酸缓冲液(pH9.5)将抗人AI蛋白小鼠单克隆抗体(Chemicon公司制)稀释成10μg/mL,并以0.1mL/孔的量加入到96F微量培养板(ヌンク公司制)的各孔中,4℃孵育16小时。弃抗体溶液,加入350μL含1(w/v)%BSA的PBS(pH7.4),室温孵育2小时以进行封闭以后,用含0.05%(v/v)Tween20的PBS(pH7.4)洗涤4次。
然后,每孔分别加入100μL含有上述a.中制备的所定浓度的氧化HDL冷冻干燥品的稀释液,室温孵育2小时,然后用含0.05%(v/v)Tween20的PBS(pH7.4)洗涤4次。
再向各孔中加入100μL用含1(w/v)%BSA的PBS(pH7.4)稀释150倍的DLH3抗体溶液,室温孵育1小时。然后用含0.05%(v/v)Tween 20的PBS(pH7.4)洗涤4次,再加入100μL用含1(w/v)%BSA的PBS稀释1000倍的过氧化物酶标记的抗小鼠IgM抗体(ザイメット公司制),室温孵育30分钟。用含0.05%(v/v)Tween20的PBS(pH7.4)洗涤4次,然后加入100μL含3mg/mL邻苯二胺的0.03%(w/v)过氧化氢水,显色30分钟,然后加1mol/L硫酸50μL终止反应,测定492nm的吸光度。其结果在图3中显示。如图3所示,用本发明的氧化HDL冷冻干燥品可制作出漂亮的检测标准曲线。
(5)保存稳定性的比较
所定时间(0,1,2,3,4周)内4℃保存(3)中制备出的氧化HDL的冷冻干燥品[氧化HDL标准品(1)(H型):12.5ng;氧化HDL标准品(2)(L型):6.25ng]。另外,用PBS(pH7.4)将(2)中制备的氧化HDL稀释成蛋白质浓度为6.25ng/mL(称做“L型”)和12.5ng/mL(称做“H型”),然后分别添加终浓度为2(w/v)%的BSA及终浓度为5(w/v)%的蔗糖,充分混合。将该混合物不进行冷冻干燥,直接于4℃冷藏[分别称作氧化HDL比较品(1)(H型):12.5ng/mL;氧化HDL比较品(2)(L型):6.25ng/mL],在所定时间(0,1,2,3,4周)内于4℃保存。
保存所定时间后,向氧化HDL标准品(1)和(2)中加入纯化水1mL溶解,对其溶液以及氧化HDL比较品(1)和(2)分别进行与上述(4)b.同样的操作,测定492nm的吸光度。其结果在图4中显示。
如图4所示,本发明的冷冻干燥的氧化HDL标准品(1)和(2),与制备后直接(0周)测定相比较,测定值几乎没有变化,与此相对,冷藏保存的氧化HDL比较品(1)和(2)与制备后直接(0周)测定相比较,测定值分别降低约40%和约30%,这表明与本发明的氧化HDL标准品(1)和(2)相比,它们的保存稳定性相当差。
实施例3
(1)Lp(a)的制备
从用EDTA作抗凝剂获得的人血浆中,通过超速离心法(15℃,120000×g,48小时)回收比重为1.060~1.125的部分,再用BiogelA-5m(BioRad公司制)进行凝胶过滤,回收Lp(a)组分。此时,通过琼脂糖凝胶电泳法中得到单一锐利条带来确认Lp(a)的纯度。
接着,将该Lp(a)组分用含0.25mmol/L EDTA的PBS(pH7.4)进行充分透析(16小时),使之纯化。再将该纯化的Lp(a)溶解到含0.25mmol/L EDTA的PBS(pH7.4)中,使Lp(a)蛋白浓度为1mg/mL,4℃保存备用。本实施例中,蛋白质量用实施例1(1)中所述的Lowry改进方法进行测定。
(2)Lp(a)的氧化
将(1)中制备的Lp(a)在500~1000倍体积以上不含EDTA的PBS(pH7.4)中进行3次以上透析(2小时以上/次),以去除EDTA,将Lp(a)溶解到不含EDTA的PBS(pH7.4)中,使其浓度为100μg/mL。然后向10mL该Lp(a)溶液中加入终浓度为10μmol/L的硫酸铜(CuSO4),37℃温育18小时,氧化Lp(a)。再向该溶液中加入EDTA,使其终浓度达1mmol/L,终止氧化反应后,在500~1000倍体积含1mmol/L EDTA的PBS(pH7.4)中进行2~3次透析(2小时以上/次),以去除CuSO4,制备氧化的Lp(a),并于4℃保存。
本实施例中,氧化Lp(a)量用原料Lp(a)的蛋白质量进行定义。
(3)氧化Lp(a)冷冻干燥品的制备
(2)中制备的氧化Lp(a)中分别添加终浓度为2(w/v)%的BSA和终浓度为5(w/v)%的蔗糖,充分混合。然后分装到玻璃瓶中,每瓶中装入1mL,用共和真空冷冻干燥装置RL-201BS(共和真空技术株式会社制),-50℃冷冻16小时后,于20℃、1.33Pa的减压条件下冷冻干燥48小时,使水分气化,去除水分,然后密封,于4℃保存。此时,冷冻干燥品中水分含量为0.8质量%。
(4)用氧化Lp(a)的冷冻干燥品作为标准品制作检测标准曲线
a.浓度调整
将(3)中制备的氧化Lp(a)冷冻干燥品溶解到1mL纯化水中,配成所定浓度(0ng/mL、0.15625ng/mL、0.3125ng/mL、0.625ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、及5ng/mL)。
b.夹芯ELISA分析
用碳酸缓冲液(pH9.5)将抗人Lp(a)小鼠单克隆抗体(Chemicon公司制)稀释成10μg/mL,以1μg/孔的量加入到96F微量培养板(ヌンク公司制)的各孔中,4℃孵育16小时。弃抗体溶液,加入350μL含1(w/v)%BSA的PBS(pH7.4),室温孵育2小时进行封闭后,用含0.05%(v/v)Tween20的PBS(pH7.4)洗涤4次。
然后,每孔分别加入100μL含有上述a.中制备的所定浓度的氧化Lp(a)冷冻干燥品的稀释液,室温孵育2小时,然后用含0.05%(v/v)Tween20的PBS(pH7.4)洗涤4次。
再向各孔中加入100μL用含1(w/v)%BSA的20mmol/L Tris-HCl(pH7.4)将实施例1(4)b.中制备的DLH3抗体稀释成10μg/mL浓度的稀释液,室温孵育1小时。然后用含0.05%(v/v)Tween20的PBS(pH7.4)洗涤4次,再加入100μL用含1(w/v)%BSA的PBS(pH7.4)稀释1000倍的过氧化物酶标记的抗小鼠IgM抗体(Chemicon公司制),室温孵育30分钟。用含0.05%(v/v)Tween20的PBS(pH7.4)洗涤4次,然后加入100μL含3mg/mL邻苯二胺的0.03%(w/v)过氧化氢水,显色30分钟,然后加1mol/L硫酸50ul终止反应,测定492nm的吸光度。其结果在图5中显示。如图5所示,用本发明的氧化Lp(a)的冷冻干燥品可制作出漂亮的检测标准曲线。
(5)保存稳定性的比较
所定时间(0,1,2,3,4周)内4℃保存(3)中制备出的氧化Lp(a)的冷冻干燥品[氧化Lp(a)标准品(1)(H型):12.5ng;氧化Lp(a)标准品(2)(L型):6.25ng].另外,用PBS(pH7.4)将(2)中制备的氧化Lp(a)稀释成蛋白质浓度为6.25ng/mL(称做“L型”)和12.5ng/mL(称做“H型”),然后分别添加终浓度为2(w/v)%的BSA及终浓度为5(w/v)%的蔗糖,充分混合。将该混合物不进行冷冻干燥,直接于4℃冷藏[分别称作氧化Lp(a)比较品(1)(H型):12.5ng/mL;氧化Lp(a)比较品(2)(L型):6.25ng/mL],在所定时间(0,1,2,3,4周)内于4℃保存。
保存所定时间后,向氧化Lp(a)标准品(1)和(2)中加入纯化水1mL溶解,对其溶液以及氧化Lp(a)比较品(1)和(2)分别进行与上述(4)b.同样的操作,测定492nm的吸光度。其结果在图6中显示。
如图6所示,本发明的冷冻干燥的氧化Lp(a)标准品(1)和(2),与制备后直接(0周)测定相比较,测定值几乎没有变化,与此相对,冷藏保存的氧化Lp(a)比较品(1)和(2)与制备后直接(0周)测定相比较,经过4周后,测定值分别降低约50%和约40%,这表明与本发明的氧化Lp(a)标准品(1)和(2)相比,它们的保存稳定性相当差。
实施例4
(1)冷冻变性人血浆的制备
用肝素作抗凝剂从4名被检者中采血,用常规方法提取血浆,按照与实施例1(4)中记载的ELISA法相同的方法进行分析。
然后,将血浆分装到玻璃瓶中,每瓶中装入2mL,从室温(25℃)移到库内温度-30℃的冷冻机内,经过3小时后返回到室温,完全融解内容物。将实施了包括该冷冻的步骤的各血浆,按照与实施例1(4)中记载的ELISA法同样的方法进行分析。其结果显示于图7中。如图7所示,可以确认通过对血浆实施包括冷冻的步骤,血浆中所含脂蛋白变性,进而生成了冷冻变性脂蛋白(氧化LDL)。
(2)冷冻变性人血浆的冷冻干燥品的制备
将实施了4次包含上述(1)中冷冻的步骤的各血浆分别等体积混合,按照实施例1(4)中记载的ELISA方法,用实施例1(4)所述检测标准曲线计算出该混合液中变性LDL(氧化LDL)的浓度。
然后,用含有140mmol/L NaCl、终浓度为2(w/v)%的BSA、终浓度为5(w/v)%的蔗糖、0.25mmol/L EDTA-2Na的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)稀释上述(1)中制备的冷冻变性人血浆,使氧化LDL的浓度为6.25ng/mL(L型)和12.5ng/mL(H型)。然后,将该稀释液分装到玻璃瓶中,每瓶中装入1mL,用共和真空冷冻干燥装置RL-201BS(共和真空技术株式会社制),-50℃冷冻16小时后,于5℃、1.33Pa的减压条件下冷冻干燥48小时,使水分气化,去除水分,然后密封,于4℃保存备用,将之作为冷冻变性人血浆的冷冻干燥品。此时,冷冻干燥品中水分含量为0.8质量%。
(3)冷冻变性人血浆的冷冻干燥品的浓度测定
向(2)中制备的冷冻变性人血浆的冷冻干燥品加入1mL纯化水溶解后,按实施例1(4)中所述夹芯ELISA法测定氧化LDL的方法,测定该溶液492nm的吸光度,用实施例1(4)中制作的检测标准曲线,从其吸光度值计算出氧化LDL的浓度时,几乎未发现冷冻干燥步骤前后冷冻干燥品中氧化LDL浓度的变化。
(4)保存稳定性的比较
所定时间(0,6,12个月)内于4℃保存(2)中制备的冷冻变性人血浆的冷冻干燥品[冷冻变性人血浆标准品(1)(H型):12.5ng;冷冻变性人血浆标准品(2)(L型):6.25ng]。另外,所定时间(0,6,12个月)内于4℃保存实施例1(3)中制备的氧化LDL冷冻干燥品[氧化LDL标准品(1)(H型):12.5ng;氧化LDL标准品(2)(L型):6.25ng]。
保存所定时间后,向冷冻变性人血浆标准品(1)和(2)及氧化LDL标准品(1)和(2)中加入纯化水1mL溶解,按照实施例1(4)中记载的ELISA方法对该溶液进行分析。其结果在下面的表1中显示。
表1
保存时间(月) | OD492 | |||
冷冻变性人血浆标准品(1) | 冷冻变性人血浆标准品(2) | 氧化LDL标准品(1) | 氧化LDL标准品(2) | |
0 | 0.740 | 0.272 | 0.758 | 0.283 |
6 | 0.727 | 0.270 | 0.508 | 0.222 |
12 | 0.677 | 0.274 | 0.430 | 0.207 |
如表1所示,本发明的氧化LDL标准品在低浓度[氧化LDL标准品(2)]时具有优良的保存稳定性,但通过冷冻进行脂蛋白的变性以后,再通过冷冻干燥使之稳定化的本发明的冷冻变性人血浆标准品即便浓度高[冷冻变性人血浆标准品(1)]时,与本发明的氧化LDL标准品相比,也具有优良的长期保存稳定性。
实施例5
(1)冷冻变性人血清的制备
从4名被检者采血,用常规方法分离血清并合并。向该血清中分别加入终浓度为2(w/v)%的BSA和终浓度为5(w/v)%的蔗糖,充分混合后,按每瓶2mL的量分装到玻璃瓶中,用共和真空冷冻干燥装置RL-201BS(共和真空技术株式会社制),-50℃冷冻16小时后,于5℃、1.33Pa的减压条件下冷冻干燥48小时,使水分气化,去除水分,然后密封,并于4℃保存。此时,冷冻干燥品中水分含量为0.8质量%。
(2)冷冻变性人血清冷冻干燥品的制备
向含有(1)中制备的冷冻变性人血清的玻璃瓶中加入2mL纯化水,将内容物充分溶解。按照实施例1(4)中记载的ELISA方法测定氧化LDL的方法,用实施例1(4)所述检测标准曲线中计算出该溶解液中氧化LDL的浓度。
然后,用含有140mmol/L NaCl、终浓度为2(w/v)%的BSA、终浓度为5(w/v)%的蔗糖、0.25mmol/L EDTA-2Na的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)稀释(1)中制备的冷冻变性人血清,使氧化LDL的浓度为6.25ng/mL(L型)和12.5ng/mL(H型)。然后,将该稀释液按每瓶1mL的量分装到玻璃瓶中,用共和真空冷冻干燥装置RL-201BS(共和真空技术株式会社制),-50℃冷冻16小时后,于5℃、1.33Pa的减压条件下冷冻干燥48小时,使水分气化,去除水分,然后密封,并于4℃保存备用,将之作为冷冻变性人血清的冷冻干燥品。此时,冷冻干燥品中水分含量为0.8质量%。
(3)冷冻变性人血清冷冻干燥品的浓度测定
向(2)中制备的冷冻变性人血清冷冻干燥品加入1mL纯化水溶解后,按实施例1(4)中所述ELISA法测定氧化LDL的方法,用实施例1(4)中制作的检测标准曲线,计算出该溶液中氧化LDL的浓度时,几乎看不到冷冻干燥步骤前后冷冻干燥品中氧化LDL浓度的变化。
(4)溶解后保存稳定性的比较
分别向(2)中制备的冷冻变性人血清冷冻干燥品加入1mL纯化水使之溶解,得到氧化LDL的浓度分别为12.5ng/mL和6.25ng/mL的冷冻变性人血清标准品(1)(H型)和(2)(L型)后,在所定时间(0,3,7,10,14天)内于4℃保存。另外,将实施例1(3)中制备的氧化LDL的冷冻干燥品与上述一样溶解,得到氧化LDL浓度分别为12.5ng/mL和6.25ng/mL的氧化LDL标准品(3)(H型)和(4),同样在所定时间(0,3,7,10,14天)内以溶解状态于4℃保存。
按所定时间保存后,按照实施例1(4)所述夹芯ELISA法测定氧化LDL的方法,对冷冻变性人血清标准品(1)和(2)以及氧化LDL标准品(3)和(4)进行分析。其结果如下面的表2和图8所示。
表2
保存时间(日) | OD492 | |||
冷冻变性人血清标准品(1) | 冷冻变性人血清标准品(2) | 氧化LDL标准品(3) | 氧化LDL标准品(4) | |
0 | 0.8175 | 0.3693 | 0.7689 | 0.3608 |
3 | 0.8107 | 0.3533 | 0.6762 | 0.3615 |
7 | 0.7602 | 0.3387 | 0.6705 | 0.3473 |
10 | 0.7800 | 0.3440 | 0.5772 | 0.3240 |
14 | 0.7630 | 0.3400 | 0.5760 | 0.2985 |
如表2所示,本发明的氧化LDL标准品在低浓度[氧化LDL标准品(2)]时,具有优良的溶解后的保存稳定性,但通过冷冻进行脂蛋白的变性以后,再通过冷冻干燥使之稳定化的本发明的冷冻变性人血清标准品即便浓度高[冷冻变性人血清标准品(1)],与本发明的氧化LDL标准品相比,也具有优良的溶解后的保存稳定性。
实施例6
(1)冷冻变性LDL的制备
将实施例1(1)中制备的LDL用500~1000倍体积以上不含EDTA的PBS(pH7.4)进行3次以上透析(2小时以上/次),以去除EDTA,用含有140mmol/L NaCl、终浓度为2(w/v)%的BSA、终浓度为5(w/v)%的蔗糖、0.25mmol/L EDTA-2Na的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)稀释,使LDL的浓度为1mg/mL,然后充分混合。然后,按每瓶2mL的量分装到玻璃瓶中,从室温(22℃)移到库内稳定分别为-85℃和-30℃的冷冻机内,经过1小时以上后,返回室温,使内容物完全融解。将包括上述冻融的步骤反复10次。另外,在包括上述冻融的步骤间,回收一部分内容物,然后按实施例1(4)所述夹芯ELISA法对该样品进行分析。结果如图9所示。
由图9可知,库内温度为-30℃时,包括冻融的步骤只要重复3次,LDL的变性就几乎达到饱和状态;与此相对,库内温度为-85℃时,冻融过程不重复9次时,LDL的变性就达不到饱和状态。这表明由于降温温度的不同,变性LDL的产量会产生变化。
(2)冷冻变性LDL冷冻干燥品的制备
用含有140mmol/L NaCl、终浓度为2(w/v)%的BSA、终浓度为5(w/v)%的蔗糖、0.25mmol/L EDTA-2Na的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)稀释(1)中库内温度为-30℃时反复实施包括冷冻的步骤4次而制备的冷冻变性LDL,使氧化LDL的浓度为6.25ng/mL(L型)和12.5ng/mL(H型)。然后,将该稀释液按每瓶1mL的量分装到玻璃瓶中,用共和真空冷冻干燥装置RL-201BS(共和真空技术株式会社制),-50℃冷冻16小时后,于5℃、1.33Pa的减压条件下冷冻干燥48小时,使水分气化,去除水分,然后密封,并于4℃保存备用,将之作为冷冻变性LDL的冷冻干燥品。此时,冷冻干燥品中水分含量为0.8质量%。
(3)冷冻变性LDL冷冻干燥品的浓度测定
向(2)中制备的冷冻变性LDL冷冻干燥品加入1mL纯化水溶解后,按实施例1(4)中所述ELISA法测定氧化LDL的方法,用实施例1(4)中制作的检测标准曲线计算出该溶液中氧化LDL的浓度时,几乎看不到冷冻干燥步骤前后冷冻干燥品中氧化LDL浓度的变化。
(4)溶解后保存稳定性的比较
分别向(2)中制备的冷冻变性LDL冷冻干燥品加入1mL纯化水使之溶解,得到氧化LDL的浓度分别为12.5ng/mL和6.25ng/mL的冷冻变性LDL标准品(1)(H型)和(2)(L型),并在在所定时间(0,3,7,10,14天)内4℃保存。另外,将实施例1(3)中制备的氧化LDL的冷冻干燥品也与上述一样溶解,得到氧化LDL浓度分别为12.5ng/mL和6.25ng/mL的氧化LDL标准品(3)(H型)和(4),同样在所定时间(0,3,7,10,14天)内以溶解状态于4℃保存。
按所定时间保存后,按照实施例1(4)所述夹芯ELISA法测定氧化LDL的方法,对冷冻变性LDL标准品(1)和(2)以及氧化LDL标准品(3)和(4)进行分析,测定其492nm的吸光度,用实施例1(4)制作的检测标准曲线计算出各标准品中氧化LDL的含量。其结果如下面的表3和图10所示。
表3
保存时间(日) | OD492 | |||
冷冻变性LDL标准品(1) | 冷冻变性LDL标准品(2) | 氧化LDL标准品(3) | 氧化LDL标准品(4) | |
0 | 0.8633 | 0.3826 | 0.7689 | 0.3608 |
3 | 0.8265 | 0.3532 | 0.6762 | 0.3615 |
7 | 0.7924 | 0.3516 | 0.6705 | 0.3473 |
10 | 0.7952 | 0.3439 | 0.5772 | 0.3240 |
14 | 0.7886 | 0.3476 | 0.5760 | 0.2985 |
如表3所示,本发明的氧化LDL标准品在低浓度[氧化LDL标准品(4)]时具有优良的溶解后的保存稳定性,但通过冷冻进行脂蛋白的变性以后,再通过冷冻干燥使之稳定化的本发明的冷冻变性人血清标准品即便浓度高[冷冻变性LDL标准品(1)]时,与本发明的氧化LDL标准品相比,也具有优良的溶解后的长期保存稳定性。
产业上的实用性
如上所述,本发明涉及将脂蛋白人为变性后得到的变性脂蛋白进行冷冻干燥而获得的保存稳定性优良的变性脂蛋白及其制备方法。另外,本发明涉及变性脂蛋白的制备方法,它包括对含有变性脂蛋白的溶液实施包括至少1次冷冻的步骤,从而使该溶液中所含脂蛋白变性;本发明还涉及对由上述方法得到的变性脂蛋白再进行冷冻干燥后得到的保存稳定性优良的变性脂蛋白及其制备方法。变性脂蛋白与心肌梗塞和心绞痛等冠状动脉系统的疾病、脑梗塞和脑血管性痴呆等脑动脉系统的疾病、或肾病、糖尿病性肾病等肾动脉系统的疾病、以及外周动脉闭塞症等外周动脉系统的疾病等各种循环器官、系统的疾病密切相关。血液中变性脂蛋白量测定用的标准物质及研究变性脂蛋白生理作用和生理活性的实验用试剂是决定试验结果的非常重要的物质。
根据本发明的方法可制备保存稳定性优良的变性脂蛋白,换言之,可制备显示恒定测量值的变性脂蛋白。除上述优点外,通过对含有变性脂蛋白的溶液实施包括至少1次冷冻的步骤使脂蛋白变性后,对得到的变性脂蛋白进行冷冻干燥而得到的稳定化脂蛋白不仅保存稳定性优良,而且溶解后的保存稳定性也很优良,且本发明的稳定化变性脂蛋白实际应用的状态为溶液状态时其稳定性也优良,所以非常有利于测定变性脂蛋白。
本发明的稳定化变性脂蛋白例如可在测定血液成分中所含变性脂蛋白的方法中用作标准物质,这种方法包括使血液与识别变性脂蛋白的抗体接触,然后通过测定该抗体对样品的反应性来测定血液中所含变性脂蛋白;本发明的稳定化变性脂蛋白还可用作研究变性脂蛋白生理功能和生理活性的各种实验用试剂;再者,本发明的稳定化变性脂蛋白对于上述各种目的中的诊断技术的商品化和试剂的开发会带来非常重要的影响。
Claims (12)
1.一种稳定化变性脂蛋白的制备方法,它包括通过对含有脂蛋白的溶液实施包括至少一次冷冻的步骤,使该溶液中含有的脂蛋白变性。
2.权利要求1所述的方法,其中,变性脂蛋白可作为血液中变性脂蛋白量测定用标准物质使用,或作为研究变性脂蛋白生理功能和生理活性的实验用试剂使用。
3.权利要求1或2所述的方法,其中,变性脂蛋白为氧化脂蛋白或醛化脂蛋白。
4.权利要求1或2所述的方法,其中,变性脂蛋白可与由杂交瘤细胞系小鼠-小鼠杂交瘤FOH1a/DLH3(保藏编号:FERM BP-7171)产生的DLH3抗体反应。
5.权利要求1至4任一项所述的制备方法,它包括再将通过冷冻的步骤而变性的该变性脂蛋白进行冷冻干燥。
6.一种稳定化变性脂蛋白,它通过权利要求1至5任一项所述的方法制备。
7.一种变性脂蛋白的测定方法,它使用权利要求6所述的稳定化变性脂蛋白作为标准物质。
8.权利要求7所述的方法,其中,稳定化变性脂蛋白作为免疫学测定方法中的标准物质使用。
9.权利要求8所述的方法,其中,免疫学测定方法选自放射免疫法、酶联免疫吸附法、荧光免疫法、发光免疫法、凝集免疫法、免疫比浊法和免疫浊度测定法。
10.权利要求8所述的方法,其中,免疫学测定方法为竞争法或夹芯法。
11.一种变性脂蛋白测定用试剂盒,它含有权利要求6所述的稳定化变性脂蛋白作为标准物质。
12.一种变性脂蛋白测定用试剂盒,它包含抗体稀释液、抗体固相化固相、反应用缓冲液、洗涤液、标记的二抗、检测用试剂、及作为标准物质的权利要求6所述的稳定化变性脂蛋白的全部或一部分作为构成要素。
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