CN1442201A - 一种含有破骨细胞形成抑制因子及多糖的复合物 - Google Patents

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Abstract

一种新的复合物，该复合物含有至少一种选自破骨细胞形成抑制因子(OCIF)及其类似物及变异体的物质，该物质与至少一种选自多糖及其衍生物的物质结合，该复合物在给予患者时在血流中的滞留时间延长，这对于治疗和预防骨代谢疾病是非常有用的。

Description

一种含有破骨细胞形成抑制因子及多糖的复合物
发明的技术领域
本发明涉及一种含有至少一种破骨细胞形成抑制因子(以下简称为OCIF)、其类似物或其变异体和至少一种多糖或其衍生物的复合物，本发明也涉及产生该复合物的方法、治疗或预防骨代谢疾病且含有该活性成分复合物的药物、及所述复合物在治疗或预防骨代谢疾病中的用途。
发明的技术背景
骨骼中约含有活体中的总钙99％的量，所以不仅在支持身体时起重要作用而且是机体中最大的钙储存器官。骨骼在保持钙的动态平衡中起重要的作用。众所周知，在骨骼吸收中起重要作用的破骨细胞的活化将导致骨骼中的钙过量流失到血液中，打破血液中的钙的动态平衡，这样就会诱导血钙过多。骨吸收升高及破骨细胞活化产生的血钙过多可能是癌扩散至骨中导致的不正常分泌的细胞因子所致[例如参见Jean-Jacques Body，Current and Future Directions InMedical Therapy：Hypercalcemia，CANCER Supplement，88(12)，3054-3058(2000)]。患有癌性血钙过高的病人预后常常不好，因此非常希望有一种有效的治疗手段治疗该疾病。
在风湿病例如风湿性关节炎及其类似病症或者骨关节炎中，破骨细胞不正常的形成或活化是患这些病症的病人的骨及关节的各种症状的主要原因[例如，参见E.Romas，M.T.Gillespie and T，J，Martin，类风湿关节炎中骨破坏中NF-KB配体和α肿瘤坏死因子的受体激活因子的作用，《骨》，30(2)，340-346(2002)]。由于风湿病例如风湿性关节炎或骨关节炎所导致的关节及骨疼痛非常强烈，严重影响患有这些疾病的病人的生活质量。因此，高度期望发现一种治疗这些疾病的方法。
破骨细胞已知在骨质疏松症中也起到一定作用。因为更年期后女性激素分泌的减少或者老化，由破骨细胞辅助的骨吸收及成骨细胞辅助的骨形成之间的平衡逐渐向骨吸收倾斜，其结果是骨密度降低，如果骨密度降低非常严重就会导致骨质疏松。当具有高骨质疏松风险的老年患者经历一次骨折，他们卧床不起的可能性是非常高的，由于全球人口的不断老龄化，这已成为一个社会问题。[例如，参见Brumo Fautrel和Francis Guillemin，类风湿疾病研究的代价，Current Opinion in Rheumatology，14，121-126(2002)]。因此寻求一种可有效治疗和预防骨质疏松症的方法变得极为迫切。
治疗这些疾病的传统的方法包括补充激素例如雌激素及使用药剂例如二膦酸盐或降钙素来抑制破骨细胞的活性[例如，参见Mohammad M.Iqbal和Tanveer Sobhan，Osteoporosis：A Review，Missouri Medicine，99(1)，19-23(2002)]。然而，激素也有不希望有的副作用例如肿瘤形成的高风险性、诱导子宫内膜异位的发生及生殖器的非正常出血[例如，参见Joyce Penrose White和Judith S.Schilling，绝经后的激素替代：历史前景和现代影响，对护理工作者有临床优势，4(5)，277-285(2000)]。尽管已知二膦酸盐很容易结合血液中的钙且在骨中积累，一些研究者怀疑由此会将骨强度提高到何种程度。另外，同样也有报道与其使用相关的肾功能损坏的危险性[例如，参见Jonathan R.Green，Yves Seltenmeyer，Knut A.Jaeggi和Leo Wildler，新的有潜力的双膦酸盐在两个短期大鼠模型中的肾忍受性方案，《药理和毒理》80，225-230(1997)]。至于降钙素，不幸的是使用其所获得的骨密度的增加只是短暂的。同样也有报道中止降钙素的使用会导致所治疗症状的回复，而且是来自动物而不是人的降钙素其有效性在长期治疗后会降低，因为在人体中出现抗降钙素的循环抗体[S.L.Porcel，J.A.Cumplido，B.Dela Hoz，M Cuevas和E.Losada，对降钙素的敏感性，Allergologia et Immunopathologia，28(4)，243-245(2000)]。
如上所述，破骨细胞在辅助骨吸收中起主要作用，而骨吸收是在血液中控制钙浓度提升的关键因子。然而，确信上面所提到的任一种已知药剂无一具有抑制破骨细胞形成的活性。结果是这些传统药剂无一适宜于骨代谢疾病的基础治疗，因为其仅能够治标而不治本。
最近，OCIF已被证明是一种内源蛋白，它可以抑制破骨细胞祖细胞分化为一种破骨细胞或者/和成熟破骨细胞的骨吸收活性(参见WO-A-96/26217及EP-A-0816380)。OCIF也称为Osteoprotegerin(参见WO-A-97/23614)。考虑到上述骨代谢疾病例如血钙过多，骨质疏松症及风湿性关节炎都至少在某种程度上起因于骨吸收，希望通过使用OCIF(因为其可以抑制破骨细胞自身的形成和/或抑制成熟破骨细胞骨吸收活性的能力)对上述疾病进行成功治疗。然而，OCIF是一种碱性蛋白，其等电点大约在9左右，且其在给药后在血液中流失的很快。因此解决该问题的一种办法在WO-A-2000/24416及EP-A-1127578中已有报道，其中通过共给药多糖例如肝素或硫酸右旋糖酐使OCIF在血液中滞留的时间(因此也使OCIF的效果)延长至一定程度。然而结果达到滞留时间的延长可能不足以使OCIF在血流中长期滞留从而使其成为用于治疗骨代谢疾病例如血钙过高、骨质疏松及关节炎的真正的候选药剂，因此，需要OCIF在给药后滞留在血流中的时间延长的更好方法。
发明简述
因此本发明的目的是提供一种包含有OCIF的制剂，该制剂能使OCIF在给药后保留在血流中的时间延长，因此提供一种药剂，其中OCIF在治疗和预防由破骨细胞介导的骨代谢疾病例如血钙过高、骨质疏松症及关节炎等中的效果增强并延长。
本发明的其他的目的及优点将会在随后的说明书中表明。
因此，本发明提供了一种复合物，其包含至少一种选自OCIF、其类似物及其变异体的物质，该物质结合于至少一种选自多糖及其衍生物的物质。
本发明也提供了一种延长OCIF或其类似物或其变异体在给药患者后在血流中滞留的时间的方法，该方法将至少一种所述的OCIF、其类似物或其变异体与至少一种多糖或其变异体复合。
本发明也提供了一种药物组合物，它含有有效剂量的药物活性成分及一种载体或稀释剂，其中所述的药物活性成分是一种复合物，该复合物含有至少一种选自OCIF、其类似物及其变异体的物质，该物质结合有至少一种选自多糖及其衍生物的物质。尤其是本发明提供了这样一种药物组合物，其可以治疗或预防骨代谢疾病。
本发明也提供了一种治疗或预防患者的骨代谢疾病的方法，该方法包括给予所述患者有效剂量的复合物，该复合物含有至少一种选自OCIF、其类似物及其变异体的物质，该物质结合有至少一种选自多糖及其衍生物的物质。
本发明也提供了一种复合物在制造治疗或预防骨代谢疾病的药剂中的用途，所述复合物含有至少一种选自OCIF、其类似物及其变异体的物质，该物质结合至少一种选自多糖及其衍生物的物质。
发明详述
我们已经发现在一定条件下温育至少一种选自OCIF、其类似物和变异体的物质和至少一种选自多糖及其衍生物的物质，结果形成一种复合物，其中所述一种或多种选自OCIF、其类似物及变异体的物质结合所述至少一种选自多糖及其衍生物的物质，因此产生了一种试剂，其中所述OCIF或其类似物或变异体在治疗和预防由破骨细胞介导的骨代谢疾病例如血钙过高、骨质疏松及关节炎等中的疗效增强且延长。这主要归功于这样的事实：与WO-A-2000/24416及EP-A-1127578中公开的OCIF及多糖的已知技术组合相比，OCIF或其类似物或变异体给药后在血流中滞留的时间延长了。
如上所述，本发明的复合物包含至少一种选自OCIF、其类似物及变异体的物质，该物质结合至少一种选自多糖及其衍生物的物质。在所述的复合物中，OCIF及多糖相互之间通过一个化学键例如共价键(例如形成席夫碱)、离子键、配位键或非化学键例如疏水性相互作用、氢键、静电相互作用或亲和力进行结合。
本发明所用到的OCIF、其类似物或变异体可以是天然型也可以是重组型，且其起源并不特别限制。天然型的OCIF意指从获自人或非人动物的器官、体液、细胞培养物、或培养基中抽提、纯化和/或分离而作为天然产生的蛋白获取的OCIF。重组型的OCIF、其类似物或变异体是一种通过从通常用于这类技术中的寄主例如已经使用含有编码OCIF、其类似物或变异体的多聚核苷酸的载体进行转化的原核寄主细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如人或非人细胞系)中抽提、纯化和/或分离所述蛋白得到的重组蛋白[例如，参见公开于EP-A-0816380(WO-A-9626217)及WO-A-97/23614的重组技术]。
本发明所用到的OCIF、其类似物及其变异体的起源并不特别限制，可以来自人或非人动物。优选是其可以来自哺乳动物例如人、大鼠、小鼠、兔子、狗、猫、牛、猪、绵羊或山羊或鸟类例如禽、鹅、鸡或火鸡，更为优选的是其来自哺乳动物，最为优选的是其来自人。
本发明所用到的OCIF或其类似物可以是单体类型的OCIF(例如，在人体中在非还原条件下的SDS-PAGE测量的单体的分子量大约为60000)或者二聚体类型(例如，在人体中在非还原条件下SDS-PAGE测量的分子量大约为120000)[参见EP-A-0816380(WO-A-96/26217)]。
众所周知OCIF在细胞中是以一种在氨基末端具有一个信号肽的多肽形式翻译的，然后通过涉及到移去所述信号肽的加工步骤而成熟[例如，参见公开于EP-A-0816380(WO-A-96/26217)及WO-A-97/23614的重组方法]。本发明所用到的OCIF、其类似物或其变异体同时包括具有信号肽的多肽及其成熟形式。优选的实施例包括具有所列的序列表SEQ.ID.NO.1的氨基酸-21至+380的含有信号肽的OCIF及具有所列的序列表SEQ.ID.NO.1的氨基酸+1至+380的不含信号肽的成熟的OCIF。在所有这些中，成熟OCIF尤其推荐。
众所周知，当在寄主细胞中尤其是当在一种原核寄主细胞例如大肠杆菌中作为重组蛋白表达时，甲硫氨酸可以被加到这种成熟形式的OCIF、其类似物或变异体中。这可以通过加入核苷酸三联密码ATG(AUG)至编码OCIF、其类似物或变异体的成熟形式的多聚核苷酸的5’末端，然后将所得到的多聚核苷酸插入到合适的表达载体中而获得。这样便可以由被所述重组表达载体转化的合适宿主细胞表达在氨基末端具有甲硫氨酸的所需成熟蛋白。此外，一个或多个氨基酸可以被加入到所述蛋白的氨基末端甲硫氨酸的下一位置，其通过在加到编码OCIF、其类似物或其变异体的成熟形式的多聚核苷酸的5’端的ATG三联密码的下一位置增加额外的核苷酸三联密码而完成。
在本发明中，OCIF类似物意指为一个天然存在于人体或上所列举的非人动物细胞、体液、和/或器官中的多聚核苷酸所编码的蛋白质。这样的类似物的具体的优选实施例包括OCIF2、OCIF3、OCIF4及OCIF5[参见EP-A-0816380(WO96/26217)]。这样的OCIF类似物或其活性片段可以通过下述方法获得：从一个人体或非人动物的体液、组织、器官或细胞中抽提出RNA；使用反转录酶合成与所述RNA互补的cDNA的第一条链，然后以第一条链作为模板使用DNA聚合酶合成所述cDNA的第二条链；如此获得的双链cDNA插入进一个适当的、常规使用的表达载体；然后将该表达载体转化进入一个适当的常规使用的寄主细胞；然后使用杂交技术例如使用OCIF cDNA或其片段作为探针在严格条件下进行噬斑杂交或噬菌体杂交，筛选产生目的多肽的寄主(参见EP-A-0816380(WO-A-96/26217))]；最后经过常规的技术由如此获得的寄主细胞表达需要的OCIF类似物。
在本发明中，OCIF变异体意指一个蛋白，其具有一个氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸残基已被替代、删除、加入或插入一个OCIF或其类似物的氨基酸序列，但依然具有至少部分OCIF活性。这样的OCIF变异体例如，可以通过下述方法获得：使用聚合酶链式反应法(以下简称PCR)、基因重组法或使用核酸内切酶或核酸外切酶例如限制性酶的核酸酶消化法，在一个编码OCIF或其类似物的核苷酸序列中替代、删除、增加和/或插入一个核苷酸或多个核苷酸；利用已经插入了得到的编码目的OCIF变异体的核苷酸的表达载体转化一个真核寄主细胞例如一个动物细胞或一个原核寄主细胞例如大肠杆菌；然后按照本领域技术人员所普遍已知的技术从所述的转化寄主的细胞培养物产生的包含蛋白部分中抽提、纯化和/或分离需要的多肽。
已知氨基酸序列的相当一部分片段已经从OCIF多肽的羧基末端删除的OCIF的截短形式，也保留了至少部分OCIF活性[例如，参见EP-A-0816380(WO-A-96/26217)和WO-A-97/23614]。这些截短的保留了完整OCIF多肽的至少部分活性的OCIF，同样包括在本发明的OCIF变异体中。
更进一步，OCIF或其截短形式与一个免疫球蛋白区域例如Fc区域融合体也是已知的(例如，一个融合多肽，其中人类IgG的Fc区域附着于OCIF的羧基末端)，其至少具有部分完整OCIF多肽的活性(参见WO-A-97/26314)，这样的融合蛋白同样包括在本发明的OCIF变异体中。
同样也可以看到，OCIF或其类似物或其变异体可被化学修饰且依然保持有效的活性，且在某些情况下，还可以表现出一些优势，例如稳定性的增加或免疫原性的减少。这些化学修饰可以包括在OCIF或其类似物或其变异体分子的一个单一位点或多个位点衍生化。例如，已经显示OCIF及其变异体(衍生物)，例如截短的形式，可以使用一个或多个水溶性聚合物例如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚体、羧甲基纤维素及聚乙烯醇进行化学修饰，其结果表现出生物学活性提高(例如，参见WO-A-9726314)。这些OCIF或其类似物或其变异体的化学修饰类型同样包括在本发明的OCIF变异体中。
已知的适宜于制备本发明的复合物的OCIF衍生物的例子包括：OCIF-C19S、OCIF-C20S、OCIF-C21S、OCIF-C22S、OCIF-C23S、OCIF-DCR1、OCIF-DCR2、OCIF-DCR3、OCIF-DCR4、OCIF-DDD1，OCIF-DDD2、OCIF-CL、OCIF-CC、OCIF-CDD2、OCIF-CDD1、OCIF-CCR4、OCIF-CCR3、OCIF-CBst、OCIF-CSph、OCOIF-CBsp、OCIF-CPst[参见EP-A-0816380(WO-A-96/26217)]、muOPG[22-401]-Fc、muOPG[22-194]-Fc、muOPG[22-185]-Fc、muOPG[22-180]-Fc、muOPG[22-401]、muOPG[22-401]C195、muOPG[22-401]C202、muOPG[22-401]C277、muOPG[22-401]C319、muOPG[22-401]C400、muOPG[22-185]、muOPG[22-194]、muOPG[22-200]、muOPG[22-212]、muOPG[22-293]、muOPG[22-355]、huOPG[22-401]-Fc、huOPG[22-201]-Fc、huOPG[22-401]-Fc P26A、huOPG[22-401]-Fc Y28F、huOPG[22-401]、huOPG[27-401]-Fc、huOPG[29-401]-Fc、huOPG[32-401]-Fc、muOPG met[22-194]、muOPG met[22-194]5k PEG、muOPG met[22-194]20k PEG、huOPG met[22-194]P25A、huOPG met[22-194]P25A 5k PEG、huOPG met[22-194]P25A 20k PEG、huOPG met[22-194]P25A 31k PEG、huOPG met[22-194]P25A 57k PEG、huOPG met[22-194]P25A 12k PEG、huOPG met[22-194]P25A 20k支链PEG、huOPG met[22-194]P25A 8k pEG二聚体、huOPG met[22-194]P25A二硫键交联(WO-A-97/23614)、OPG[22-194]-Fc、OPG[22-201]-Fc、OPG[22-194]-FcΔC、OPG[22-201]-FcΔC、OPG[22-194]-FcG10、metFcΔC-OPG[22-194](WO-A-2001/17543)、OPG[22-194]-FcΔC、OPG[22-194]-FcG10、FcΔC-OPG[22-194]、metFcΔC-OPG[22-194]、metFcΔC-22-194、OPG[22-194]-Fc、OPG[22-194]-FcΔC、metOPG[22-194]、metOPG[22-201]、OPG[22-293]、OPG[22-401]及metFcΔC-22-194(WO-A-2001/18203)。
在这些中，优选的实施例包括：OCIF-C19S、OCIF-C20S、OCIF-C21S、OCIF-C22S、OCIF-C23S、OCIF-DCR1、OCIF-DCR2、OCIF-DCR3、OCIF-DCR4、OCIF-DDD1、OCIF-DDD2、OCIF-CL、OCIOCIF-CCR4、OCIF-CCR3、OCIF-CBst、OCIF-CSph、OCIF-CBsp、OCIF-CPst、MuOPG[22-401]-Fc、muOPG[22-194]-Fc、muOPG[22-185]-Fc、muOPG[22-401]C195、muOPG[22-401]C202、muOPG[22-401]C319、muOPG[22-401]C400、muOPG[22-194]、muOPG[22-200]、muOPG[22-293]、muOPG[22-355]、huOPG[22-401]-Fc、huOPG[22-201]-Fc、huOPG[22-401]-FcP26A、huOPG[22-401]-Fc Y28F、uOPG[22-401]、huOPG[27-401]-Fc、huOPG[29-401]-Fc、huOPG[32-401]-Fc、muOPG met[22-194]5k PEG、muOPG met[22-194]20k PEG、huOPG met[22-194]P25A 5k PEG、huOPG met[22-194]P25A 20k PEG、huOPGmet[22-194]P25A 31k PEG、huOPG met[22-194]P25A 57k PEG、huOPG met[22-194]P25A 12k PEG、huOPG met[22-194]P25A 20k支链PEG、huOPG met[22-194]P25A 8k PEG二聚体、huOPG met[22-194]P25A二硫键交联、OPG[22-194]-Fc、OPG[22-201]-Fc、OPG[22-194]-FcΔC、OPG[22-201]-FcΔC、OPG[22-194]-FcG10、metFcΔC-OPG[22-194]、OPG[22-194]-FcΔC、OPG[22-194]-FcG10、FcΔC-OPG[22-194]、metFcΔC-OPG[22-194]、metFcΔC-22-194、OPG[22-194]-Fc、OPG[22-194]-FcΔC、metOPG[22-194]、metOPG[22-201]、OPG[22-293]、OPG[22-401]及metFcΔC-22-194。
本发明所述的OCIF或其类似物或其变异体可能包含一个糖链作为分子的一部分。任一天然产生的OCIF或其类似物，或重组OCIF或其类似物或变异体，都可以包含一个糖链，其在翻译后粘附于OCIF或其类似物或其变异体。包含有一个糖链的天然产生的OCIF或其类似物可通过传统技术从获自人或非人动物的细胞培养物、组织、器官、体液或细胞系得到。正如上述或举例所述，含有一个糖链的重组OCIF或其类似物或变异体可以从使用一个含有编码任一OCIF或其类似物或变异体的核苷酸序列的载体转化的真核寄主细胞的培养物中得到。可以用到的适宜寄主细胞能够翻译后修饰OCIF或其类似物或变异体以至于粘附在糖链上，这样的寄主的例子包括CHO细胞及COS细胞[Yasuda，H.等人，Endocrinology，139，1329-1337(1998)]。含有这样一个糖链的OCIF或其类似物或变异体适用于形成本发明所述的复合物。
在另一方面，如果希望产生的重组OCIF或其类似物或变异体不含有翻译后修饰所加入的糖链，那么优选的寄主细胞是原核细胞例如大肠杆菌。
形成本发明复合物所用的多糖是一个多聚体(聚糖)，其由两个或多个单糖的糖苷键合产生，优选地是一个至少含有两种不同类型单糖的杂多糖。任一多糖，不管是天然产生的或人工合成的都可用于本发明所述的复合物。
在本发明中，多糖的衍生物指的是这样一种多糖：至少一部分所述多糖分子为一个或多个非糖分子和/或残基所取代。优选的衍生物包括多糖的酸酯尤其是多糖的硫酸酯。
适用于生产本发明所述复合物的天然多糖的例子包括透明质酸、硫酸软骨素、酸性皮肤素、酸性乙酰肝素、酸性角质素、角叉胶、果胶及肝素。适用于生产本发明所述复合物的合成多糖的例子包括右旋糖酐，而适宜的合成多糖衍生物的例子包括硫酸右旋糖酐。在多糖及其衍生物中，最为适用于生产本发明所述复合物的是硫酸右旋糖酐。
在本发明中，多糖或其衍生物例如硫酸右旋糖酐包括其盐。最适宜的硫酸右旋糖酐盐是其钠盐。硫酸右旋糖酐钠盐的例子包括硫酸右旋糖酐钠盐硫5(以下简称DS5：为Meito Sangyo公司所生产)，和硫酸右旋糖酐钠盐5000及硫酸右旋糖酐钠盐10000(其均为Wako Pure化学公司所生产)。
硫酸右旋糖酐的分子量如下进行测定：
1)右旋糖酐分子量的测定
右旋糖酐的分子量可以按照下述的Sato’s公式进行计算[例如，参见日本药学手册，第13修正版，为Hirokawashoten所出版(1998)，有关右旋糖酐40的内容]，其基于所述右旋糖酐极限粘度的测量。
极限粘度＝9.00×10-4×分子量0.50
2)硫含量的测量
相关的硫酸右旋糖酐的硫含量可以通过本领域已知技术以重量百分比进行测量，例如在日本药物手册[第14版，Jihou出版(2001)]中有关硫酸右旋糖酐钠盐硫5的内容中所述的方法。
尽管构成右旋糖酐单元的葡萄糖的分子量为180，右旋糖酐分子中的葡萄糖单元的实际分子量为162，该值是通过从180中减去水的分子量而得到的，因为在右旋糖酐分子中邻近的葡萄糖单元相互之间通过α-1，6糖苷键连接。一个氢原子为硫酸钠基团(SO3Na：一克当量为103)所取代，在硫酸右旋糖酐的每一葡萄糖单元中其以这种方式取代。利用该信息，硫酸右旋糖酐分子的取代程度(以下简称取代度)可以依下述公式确定：
硫含量(重量百分比)＝[32×取代度/(162+102×取代度)]×100
3)硫酸右旋糖酐分子量的计算
如上所述，因为右旋糖酐链中葡萄糖单元的实际分子量为162，所以硫酸右旋糖酐的分子量可以使用下式公式从这一数据和2)中所确定的取代度计算：
硫酸右旋糖酐分子量＝右旋糖酐分子量×(162+102×取代度)/162
已知多糖表现出分子量的分布，例如每一不同类型的硫酸右旋糖酐表现出一确定的分子量分布。形成本发明所述复合物所用到的多糖的分子量是以平均分子量的形式给出的。本发明所用到的多糖的平均分子量并不以任何形式限制，本发明的最适宜的多糖衍生物即硫酸右旋糖酐的平均分子量的范围，一般为1500～12000，且最好是1800～6000。DS5的分子量(平均±标准方差)大约为1950±70(n＝7)。DS5的硫取代度(平均±标准方差)，如上计算，大约为0.32±0.01(n＝7)。硫酸右旋糖酐钠盐5000及硫酸右旋糖酐钠盐10000的平均分子量分别大约为5000及10000。在形成本发明所述复合物中所用到的多糖可以或不在使用前纯化和/或分级分离。在本发明中，多糖或其衍生物不包括粘附在重组OCIF或其类似物或变异体或翻译后和/或内源地于人或非人动物细胞或组织或机体中天然产生的OCIF或其类似物或变异体上的任何糖链。
在本发明所述的复合物中，选自OCIF、其类似物及其变异体的物质与选自多糖或其衍生物的物质的分子比例将根据各种因素有所变化，包括所述复合物中各种成分的特征和该复合物制备的条件。在本发明所述的复合物中，选自OCIF、其类似物及其变异体的物质与选自多糖及其衍生物的物质的分子比例并没有特别限制。在本发明优选的复合物中，包括选自OCIF、其类似物及其变异体的物质及硫酸右旋糖酐，其中所述选自OCIF、其类似物及其变异体的物质：硫酸右旋糖酐的分子比例是从1∶1至1∶10，更为优选的分子比例为1∶1至1∶8，更为优选的分子比例为1∶1至1∶5，最为优选的分子比例为1∶1.1至1∶4.5。
正如上面已经提到的那样，OCIF或其类似物或变异体可以以单体或二聚体的形式存在，这样本发明所述复合物中所含的OCIF或其类似物或变异体可以是均二聚体或杂二聚体，或其可以是均低聚体、杂低聚体、均聚合物或含有两个以上的OCIF或其类似物或其变异体的单体单元的杂聚合物(例如，参见US6369027)。按照本发明在含有OCIF、其类似物或变异体及多糖或其衍生物的复合物中，选自OCIF、其类似物或其变异体的物质与选自多糖及其衍生物的物质的分子比例计算为每单体单元的OCIF、其类似物或其变异体的多糖或其衍生物的分子的数量。
本发明复合物中多糖或其衍生物的分子的数量优选可以如下进行确定：所测试的复合物[指定为(X)]及仅含有未复合的游离OCIF或其类似物或变异体的参考样品[指定为(Y)]中中性糖含量使用苯酚硫酸方法进行定量(在本申请其他部分进行详细描述)。然后所测试的复合物中结合至OCIF或其衍生物或变异体中的多糖或其衍生物的数量通过从(X)中减去(Y)而确定。使用这样得到的数据，结合至OCIF或其类似物或变异体的多糖或其衍生物的分子数量按照下述(I)或(II)进行计算：
(I)结合至OCIF或其类似物或变异体的多糖或其衍生物的数量除以所述多糖或其衍生物的平均分子量。结果的数据代表了在测试复合物中多糖或衍生物的总的分子数目。
(II)结合至OCIF或其类似物或变异体的多糖或其衍生物的数量除以在所述复合物中所述的OCIF或其类似物或变异体的数量(mg)。得到的数据是在所述复合体中每1mg OCIF或其类似物或变异体中的多糖或其衍生物的数量，该数据再用于以所述多糖或其衍生物的平均分子量及所述OCIF或其类似物或变异体的分子量为基础计算每一分子OCIF或其类似物或变异体中的多糖或其衍生物中的分子数目[例如参照下述实施例4(d)]。
本发明复合物中OCIF或其类似物或变异体的分子数量优选可以使用免疫测试技术例如本申请其他部分所述的技术来确定。
本发明所述的复合物的一个可以用于鉴定它们的优选特征是其对肝素的亲和力。肝素是含有D-葡萄糖胺、D-葡萄糖醛酸及D-艾杜糖醛酸的多糖，其部分或全部被乙酰基或硫酸基衍生化。本发明的复合物的一个优选特征是所述OCIF或其类似物或变异体的复合物对肝素的吸附强度低于游离的未复合的OCIF或其类似物或变异体的吸附强度。吸附程度可以用装填有已固定了肝素(例如获自牛肠粘膜的肝素)的高度交联的琼脂糖珠的柱子来进行确定。适宜的这类柱子包括Hitrap肝素HP柱子、Hiprep16/10肝素及肝素琼脂糖凝胶(均获自Amersham Pharmacia)。复合物的吸附强度(亲和性)可以按照本领域技术人员所普遍已知的用于确定蛋白与多糖的亲和性的任何适当技术确定。优选的是，吸附程度可以通过比较在低离子强度下结合至肝素柱但是在高离子强度下从所述柱中洗脱的复合物的数量与在低离子强度下并不结合于肝素柱的复合物的数量(离子强度可以使用强酸盐例如氯化钠进行调节)来确定。这样，一般来说，复合物对肝素的吸附程度可以通过下述方法确定：
(a)载有已经固定了肝素的支持物如交联的琼脂糖小珠的柱用相对低离子强度的缓冲液平衡(例如使用含有0.1-0.8M氯化钠的磷酸钠缓冲液)。
(b)将进行测试的本发明的复合物溶于(a)中使用的相同的低离子强度缓冲液中，并加到柱中，收集首次洗出液(A部分)。
(c)然后使用使用于步骤(a)的相同的低离子强度缓冲液进一步洗涤柱子并收集第二次洗出液(B部分)。
(d)然后使用具有相对高离子强度的缓冲液(例如，含有1.0-2.0M氯化钠的磷酸钠缓冲液)洗涤柱子，收集第三次洗出液(C部分)。
(e)然后确定A、B、C各部分中所含的复合物的数量[分别指定为(a)、(b)、(c)](例如通过免疫测定法)。
(f)复合物对肝素的吸附程度按照下列公式确定：
(g)吸附程度＝(c)/(a)+(b)+(c)
复合物与柱子的结合力越大，(c)值就越高(正如其仅能使用具有相对高离子强度的洗脱液从柱子中移去)，因而吸附程度也越高，使用上述公式计算的本发明复合物的吸附程度可因肝素柱的类型及进行测定的条件而在一定程度范围变化。然而，游离的未复合的OCIF的吸附程度总是大约为1.0，而本发明的OCIF复合物的吸附程度低于1.0，这样就证明了含有本发明所述的OCIF或其类似物或变异体的复合物与肝素结合的强度要弱于游离的未复合的OCIF或其类似物或变异体的结合强度(例如，使用猪肝素固定在琼脂糖小珠上，例如一个HiTrap肝素HP柱，使用含有0.7M氯化钠的10mM磷酸钠缓冲液进行首次及第二次洗脱，使用含有2.0M氯化钠的10mM磷酸纳缓冲液进行第三次洗脱，含有OCIF或其类似物或变异体的本发明复合物的吸附强度并不高于0.7，最好不高于0.6，尤其是不要高于0.5)。
可用于鉴定本发明复合物的另一个优选特征是使用免疫测试技术(例如ELSLA)测量的所述复合物中的OCIF或其类似物或变异体的分子数目与使用测量所述复合物中蛋白总量的技术[例如，Lowry’s方法Lowry，O.H.等人，生物化学杂志193，265-275(1951)；吸光值(λ280nm)银染色或BCA方法]测量的所述复合物中OCIF或其类似物或变异体的分子数目的比例。
测量在所述复合物中的OCIF或其类似物或变异体的分子数目可以利用免疫测试技术，例如ELISA来确定，用于与固定相结合的抗体及用报道酶例如ELISA中的过氧化酶标记的抗体可以是针对相关OCIF或其类似物或变异体的任何适用于此目的的抗体，例如适宜于与固相结合的抗体包括自可产生抗体OI-26的杂交瘤培养物(FERM BP-6421)纯化的OI-26及纯化自可产生抗体OI-19的杂交瘤培养物(FERM BP-6420)的OI-19，而在流动相中适宜于用作用报道酶标记的抗体包括用过氧化酶标记的抗人OCIF单克隆抗体OI-4，它纯化自可产生抗体OI-4的杂交瘤培养物(FERM BP-6419)。测量复合物中的OCIF或其类似物或变异体的分子数目的一个典型的程序如下：
(a)用游离的未复合的OCIF的已知浓度制作校准曲线；
(b)在相关复合物上进行ELISA且用校准曲线确定OCIF的浓度；
(c)使用(b)中所获得的信息及OCIF单体的分子量计算所测试复合物中OCIF的分子数目。
所述复合物中的OCIF或其类似物或变异体的分子数目可以使用测量所述复合物中蛋白总量的技术来测定，这一数目也可以例如用Lowry方法进行测量，一个典型的程序如下：
(a)用牛血清白蛋白的已知浓度制作校准曲线；
(b)用Lowry方法确定所测试复合物中的总蛋白浓度，使用校准曲线确定OCIF的浓度；
(c)使用(b)中所获得的信息及OCIF单体的分子量计算所测试复合物中OCIF的分子数目。
实际的比例可按照所使用的免疫测试技术的类型和/或用于测量总蛋白的技术而变化。本发明的一个优选实施方案包括一个人源OCIF或其类似物或变异体与硫酸右旋糖酐的复合物，其中，利用从产生抗体OI-19的杂交瘤(FERMBP-6420)的培养物中纯化的抗人OCIF单克隆抗体OI-19作为结合于固相的抗体和用流动相中的过氧化物酶标记从产生抗体OI-4的杂交瘤(FERM BP-6419)的培养物中纯化的抗人OCIF单克隆抗体OI-4进行酶联免疫吸附试验(ELISA)确定的所述复合物中存在的OCIF或其类似物或变异体的分子的数目与利用Lowry方法测量总蛋白质含量测定的所述复合物中的OCIF或其类似物或变异体的分子数目的比例至少是0.5，但不大于1.2。更为优选的是该比例至少为0.6，但不大于1.1，最为优选的是该比例至少为0.7，但不大于1.1。
优选的本发明的复合物包括：
(a)一种复合物，其中所述选自OCIF或其类似物或变异体的物质为人类单体OCIF，其在非还原条件下用SDA-PAGE测量的分子量大约为60000；或人类二聚体OCIF，其在非还原条件下用SDS-PAGE测量的分子量大约为120000，所述多糖及其衍生物选自透明质酸、硫酸软骨素、酸性皮肤素、酸性乙酰肝素、酸性角质酸、角叉藻聚糖、果胶、肝素、右旋糖酐及其衍生物，所述选自OCIF或其类似物或变异体的物质与所述选自多糖及其衍生物的物质的分子比例是1∶1至1∶10；
(b)一种复合物，其中所述选自OCIF或其类似物或变异体的物质为人类单体OCIF，其在非还原条件用SDA-PAGE测量的分子量大约为60000；或为人类二聚体OCIF，其在非还原条件下用SDS-PAGE测量的分子量大约为120000，所述多糖和其衍生物选自硫酸右旋糖酐及其盐，所述选自OCIF或其类似物或变异体的物质与所述选自多糖及其衍生物的物质的分子比例是1∶1至1∶10；
(c)一种复合物，其中所述选自OCIF或其类似物或变异体的物质为人类单体或二聚体OCIF，其中所述单体或所述OCIF二聚体的一个单元含有序列表的SEQ.ID.NO.1的+1～+380氨基酸，所述多糖衍生物是一具有平均分子量从1500-12000的硫酸右旋糖酐钠盐，所述选自OCIF或其类似物或变异体的物质与所述硫酸右旋糖酐钠盐的分子比例为1∶1～1∶10；
(d)如(c)所述复合物，其中所述选自OCIF或其类似物或变异体的物质与所述硫酸右旋糖酐钠盐的分子比例为1∶1～1∶8；
(e)如(c)所述复合物，其中所述选自OCIF或其类似物或变异体的物质与所述硫酸右旋糖酐钠盐的分子比例为1∶1～1∶5；
(f)如(c)～(e)之一所述复合物，其中所述多糖衍生物是一个具有平均分子量从1800至6000的硫酸右旋糖酐的钠盐。
本发明所述复合物可使用有利于多糖或其衍生物与OCIF或其类似物或变异体结合的任何合适的方法进行制备。在本发明更进一步的实施方案中，提供了一种复合物的制备方法，所述复合物含有至少一种选自OCIF或其类似物或变异体的物质，所述物质与至少一种选自多糖及其衍生物的物质结合，所述方法包括如下步骤：在有利于在所述OCIF或其类似物或变异体与所述多糖或其衍生物之间形成复合物的条件下，温育所述至少一种选自OCIF或其类似物或变异体的物质及所述至少一种选自多糖及其衍生物的物质，然后除去没有结合至所述OCIF或其类似物或变异体的游离的多糖或其衍生物。
温育所述至少一种选自OCIF或其类似物或变异体的物质及所述至少一种选自多糖及其衍生物的物质是在适宜的条件下进行的，但典型的温育条件是在水环境下进行的。优选温育在碱性条件下进行，更为优选的是温育在pH从9.5至12的条件下进行，最为优选的是温育在pH从10至11的条件下进行。
在温育过程中，水溶液中的所述OCIF或其类似物或变异体的浓度范围并不特别限制，只要其适宜于形成所述的复合物。一般来说，水溶液中的所述OCIF或其类似物或变异体的最大浓度是从0.1至0.5mM，最小浓度是从0.001至0.05mM，优选地，水溶液中的所述OCIF或其类似物或变异体的浓度为从0.01至0.2mM，最为优选的是0.05至0.1mM。以OCIF为例，水溶液中的最大浓度是从10至50mg/ml，最小浓度是从0.1至5mg/ml，优选的是，水溶液中的OCIF浓度为从1至20mg/ml，更为优选的是从5至10mg/ml。
在温育过程中，水溶液中的所述多糖或衍生物的浓度范围并不特别限制，只要其适宜于形成所述的复合物。一般来说，水溶液中所述多糖或衍生物的最大浓度是从0.1至0.5M，最小浓度是从0.00005至0.05M。优选的是，水溶液中所述多糖或衍生物的浓度是从0.005至0.25M，更为优选的是0.05至0.1M。以硫酸右旋糖酐钠盐硫5为例，水溶液中所述多糖或衍生物的最大浓度是从200至1000mg/ml，最小浓度是从0.1至100mg/ml。优选地，水溶液中所述多糖或其衍生物的浓度为从10至500mg/ml，最优选地100至200mg/ml。
在温育过程中，只要适宜于形成所述的复合物，温度并不特别限制。一般来说，温育的上限温度是10-50℃，下限是0-4℃，优选温度范围是4-37℃，最为优选地4-10℃。
如上所述，本发明的复合物并不包括未与OCIF或其类似物或变异体结合的游离多糖或其衍生物。用于除去游离多糖或其衍生物的方法并不特别限制，只要其为实验中常规使用的方法例如纯化、分离和/或分级分离。适宜的方法的例子包括离子交换色谱、吸附色谱、分配层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、结晶、盐析及超过滤。在所有这些中，凝胶过滤层析(下文中称为“凝胶过滤”)及超过滤是优选的，凝胶过滤最为优选。
只要能够用于从含有目的复合物的部分中分离出不结合至OCIF上的游离多糖或衍生物，用于温育后从预期复合物中除去游离多糖或其衍生物的凝胶过滤中使用的凝胶并不特别限制，适宜的实例有琼脂糖凝胶、右旋糖酐凝胶及聚丙烯酰胺凝胶。
本发明的复合物含有至少一种选自OCIF或其类似物或变异体的物质，其结合至少一种选自多糖及其衍生物的物质，该复合物可以使用不同的方法，包括等电点、糖含量及免疫检测等将其与游离的未复合的OCIF或其类似物或变异体本身区别开来。
等电点可以使用本领域技术人员公知的任何传统的等电电泳法来进行测量，OCIF为碱性蛋白，其等电点大约为pI9。这明显高于本发明所述的含有OCIF及多糖及其衍生物例如硫酸右旋糖酐的复合物，该复合物典型的pI值一般在5-7这个区域，因此使用该技术是易于区别未复合的OCIF和复合的OCIF的。
本发明所述复合物和游离非复合OCIF或其类似物或变异体的糖含量可以使用传统的测量中性糖含量的任何方法进行测量，其典型实例包括苯酚硫酸法[MDubois等人，化学分析，28，350(1956)]。由于含有OCIF或其类似物或变异体及多糖或衍生物的本发明复合物的总的糖含量大于OCIF本身，因而其可以相互区别。
将本发明所述的含有结合有多糖及其衍生物的OCIF或其类似物或变异体的复合物与游离的未复合的OCIF或其类似物或变异体区别的另一种方法是使用可特异性结合至所述多糖或衍生物的抗体定量每一种中的多糖或其衍生物。
为了测量OCIF或其类似物或变异体中或本发明所述的含有OCIF或其类似物或变异体和多糖及其衍生物的复合物中的蛋白数量，用于测量总蛋白含量的任何传统方法都可以利用。适宜的例子包括Lowry方法[Lowry，O.H.等人，生物化学杂志193，265-275(1951)]、光吸收(λ280nm)银染色及BCA方法。
游离的未复合的OCIF或其类似物或变异体或本发明所述的复合物中的OCIF或其类似物或变异体可以使用至少一种抗OCIF的单克隆抗体的免疫学方法进行测量。优选用于免疫学测量人类OCIF的适宜的抗OCIF单克隆抗体包括由杂交瘤OI-19(FERM BP-6420)产生的抗体、由杂交瘤OI-4(FERM BP-6419)产生的抗体、由杂交瘤OI-26(FERM BP-6421)产生的抗体(参见WO-A-99/15691)，这些抗体在本发明中分别被称为“抗体OI-19”、“抗体OI-4”和“抗体OI-26”。抗体OI-19及抗体OI-4都以相同的亲和力结合OCIF单体及二聚体，而抗体OI-26特异性结合OCIF二聚体。按照本领域普通技术人员的任一已知技术可以使用该种类型抗体进行免疫学测量(例如，参见WO-A-99/15691)，适宜的方法包括酶免疫试验(称为EIA)、放射性免疫试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)及夹层EIA。在所有这些中，ELISA是优选的。OCIF如果是人源的，使用抗体OI-19或抗体OI-26作为固定抗体而抗体OI-14作为酶标抗体可以优选地进行ELISA。用于标记抗体的优选的酶是过氧化物酶(称为POD)。
产生抗体OI-4的杂交瘤于1997年(平成-9)10月16日以“OI-4”保藏在1-3，Higashi 1 chome，Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8566，日本的工业科学和技术部，人生物科学和人技术国家研究院(其已成为国际专利生物保藏中心，国立高科技研究所在AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashil-Chome Tsukubashi，Ibaraki-ken 305-8566，日本)，并给予保藏号FERMP-16473，它已于1998年(平成-10)7月13日转为国际保藏，保藏号为FERMBP-6419。
产生抗体OI-19的杂交瘤于1997年(平成-9)10月16日以“OI-19”保藏在1-3，Higashi 1 chome，Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8566，日本的工业科学和技术部，国立生物科学和人技术研究院(其已成为国际专利生物保藏中心，国立高科技研究所在AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashil-Chome Tsukubashi，Ibaraki-ken 305-8566，日本)并给予保藏号FERM BP-16474。它已于1998年(平成-10)7月13日转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6420。
产生抗体OI-26的杂交瘤于1997年(平成-9)10月6日以“OI-26”保藏在1-3，Higashi 1 chome，Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8566，日本的工业科学和技术部，国立生物科学和人技术研究院(其已成为国际专利生物保藏中心，国立高科技研究所在AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashil-Chome Tsukubashi，Ibaraki-ken 305-8566，日本)并给予保藏号FERM P-16475。它已于1998年(平成-10)7月13日转为国际保藏，保藏号为FERMBP-6421(参见WO-A-99/15691)。
本发明所述的含有OCIF或其类似物或变异体和多糖及其衍生物的复合物的血液或血清浓度可以如下进行测量；首先，将所述复合物对人或非人动物给药，然后，经过一段时间，从中移出血清或血液，所述复合物的血液或血清浓度使用ELISA，利用至少一种如本申请其他部分所述的抗OCIF单克隆抗体进行测量(参见WO-A-99/15691)。
含有至少一种结合至至少一种选自多糖及其衍生物的物质的选自OCIF或其类似物或变异体的物质的本发明的复合物，对于治疗或预防骨代谢疾病是非常有用的。在本发明中，骨代谢疾病可以是下述特征的疾病：患者中骨的净数量减少，且治疗或预防所述疾病需要抑制骨的吸收和/或骨吸收的速率。可使用本发明所述复合物治疗或预防的骨代谢疾病包括：原发性骨质疏松症(老年骨质疏松症、绝经后骨质疏松症及自发性青少年骨质疏松症)；内分泌骨质疏松症(甲亢、甲状旁腺功能亢进、Cushing综合症及肢端肥大症)；骨质疏松症伴随症性腺机能衰退(垂体机能衰退、Klinefelter综合症及Turner综合征)；遗传及先天骨质疏松症(成骨不全、高胱氨酸尿、Menkes综合症及Riley-Day综合症)；因为重力运载缓解或肢体固定的骨减少；Paget疾病；骨髓炎；骨质丢失引起的感染病灶；由实体瘤(例如，乳腺癌、肺癌、肾癌及前列腺癌)导致的高血钙；恶性溶血症(多重骨髓瘤、淋巴瘤及白血病)；自发性高血钙；高血钙伴随甲亢或者肾功能障碍；由类固醇药物引起的骨减少；由其他药物(例如，免疫抑制剂例如氨甲喋呤及环孢菌素A、肝素及抗癫痫药)引起的骨减少；由于肾功能障碍引起的骨减少；由于外科手术及消化器官疾病(例如小肠障碍、大肠障碍、慢性肝炎、胃切除、原发性胆肝硬化及肝硬化)引起的骨减少；由于各种类型的风湿病例如风湿性关节炎、骨折引起的骨减少；由于各种类型的风湿病例如风湿性关节炎引起的关节损坏；粘蛋白血症风湿病骨关节炎；牙周骨损失；骨的癌转移(骨溶解转移)；伴随外伤产生的骨坏死或骨细胞死亡、Gaucher疾病、镰刀性细胞贫血症、红斑狼疮症系统性或非外伤伤害；骨营养不良例如肾骨膜炎；伴随血碱性磷酸酶不足或者糖尿病的骨减少；伴随营养紊乱或饮食不良的骨减少；以及其他骨减少。骨代谢疾病也包括由于实体癌或骨癌转移或恶性溶血疾病产生的恶疾(参见日本专利申请公开2000-178200)。
含有至少一种选自OCIF、其类似物及其变异体的物质与至少一种选自多糖及其衍生物的物质的本发明的复合物与药物适宜性载体或稀释剂的组合物可以以安全口服或非口服的方式对人体或非人动物给药。药剂形式可以适宜选择并根据各种因素改变，例如待治疗疾病的类型、疾病的严重程度、患者的年龄性别及体重等。例如，复合物可以以片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆的形式口服给药；单独或结合有传统的助剂例如葡萄糖、氨基酸或其类似物静脉注射；肌肉注射；皮下注射；皮内或者腹腔单独注射；以泥敷剂的形式经皮给药；以鼻滴的形式经过鼻腔给药；经粘膜给药，或以粘膜应用剂形式口腔给药；或者以栓剂的形式直肠内给药。这些药剂可以以传统的方法加入制药领域的一般使用的添加剂例如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、调味剂、溶解剂、悬浮剂、色料、pH调节剂、杀毒剂、胶凝剂、表面活性剂及包衣剂来配制。
当本发明的复合物以片剂形式配制时，可以用本领域已知的任何载体。例如载体包括赋形剂例如乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、硅酸盐等等；粘合剂例如水、乙醇、丙醇、简单的糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液、羧甲基纤维素、虫漆、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂例如干的淀粉、藻酸钠、琼脂粉末、昆布多糖粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、月桂基硫酸钠、硬脂酸甘油一酸酯、淀粉、乳糖等等；分解抑制剂例如白糖、硬脂精、可可油脂、氢化油等等；吸收加速剂例如季铵碱、月桂基硫酸钠等；加湿剂例如甘油、淀粉等等；吸附剂例如淀粉、乳糖、高岭土、斑脱土、硅胶等等；润滑剂例如精制滑石、硬脂酸、硬脂酸金属盐如硬脂酸钙和硬脂酸镁、滑石、硼酸粉末、聚乙二醇等。此外，如果需要，片剂可以包衣，如形成糖包衣片剂、明胶包衣片剂、肠衣片剂、薄膜包衣片剂、双层片剂或多层片剂。
本发明的复合物可以以小丸药的形式配制，制剂可含有本领域已知的载体，例如，赋形剂例如葡萄糖、乳糖、可可油脂、淀粉粉末、硬化植物油、高岭土、滑石等等；粘合剂例如有阿拉伯树胶粉末、黄芪胶粉末、明胶、乙醇等等；崩解剂例如昆布多糖、琼脂等等。
当本发明复合物以栓剂形式配制时，制剂可以含有传统的载体例如聚乙二醇、可可油脂、高级醇、高级醇酯、明胶、半合成甘油酯等等。
当本发明复合物以注射形式配制时，最好将溶液或悬浮液形式的制剂消毒且制成和血液等渗。当以溶液、乳状液或悬浮液形式制备时，可以使用任何已知的和传统使用的稀释剂，例如水、乙醇、丙二醇、乙氧基异十八烷醇、多氧化异十八烷醇及聚乙烯山梨醇脂肪酸酯。此外，在可注射配方中，制剂也可以含有盐、葡萄糖、甘油等等，其量足以与血液保持等渗。它们也可含有其他试剂，包括增溶剂、缓冲剂、抚慰剂、pH调节剂、稳定剂及溶解剂。配制后可将注射剂冻干。
本发明的制剂也可进一步含有色料、防腐剂、香味剂、调味剂、甜味剂及其他药品等添加剂。
含有至少一种选自OCIF、其类似物及其变异体的物质和至少一种选自多糖及其衍生物的物质的本发明的复合物存在于用于治疗和预防骨代谢疾病的组合物中的量并不特别限制，但是其一般的重量百分比为0.1％～70％，最好是占有整个制剂重量的1～30％。
按照本发明的复合物的剂量将根据多种因素而改变，这些因素包括所治疗的症状、患者的年龄、性别、体重等及给药的途径。然而给予成人的量一般有这样一个范围，其上限是每天30-1000mg，下限是每天0.001～0.03mg，优选的范围是每于0.03～30mg。给予的量一般是这样一个范围，其上限是每天1～20mg/kg，下限是每天0.01～0.5μg/kg，优选的范围是从0.5μg/kg～1mg/kg每天。根据这样的因素例如给药形式及患者的身体状况，本发明的复合物可以以一天一次或一天数次给予。
下述实施例、参考实施例和试验实施例用于进一步举例说明本发明，不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
含有OCIF和硫酸右旋糖酐(I)的复合物的制备
1(a)重组二聚体人OCIF的制备
按照EP-A-0816380(WO-A-96/26217)的实施例中所述的方法获得分子量为大约120000的重组二聚体人OCIF。命名为pBKOCIF的质粒载体包含编码含有信号肽的人OCIF的核苷酸序列，是从根据EP-A-0816380的实施例11产生的大肠杆菌转化株pBK/01F10中获得的[根据布达佩斯条约，以保藏号FERMBP-5267保藏在1-3，Higashi lchome，Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8566 Japan的工业科学和技术部，生物科学和人技术国立研究院(已经成为现代工业科学和技术国家研究院国际专利生物体保藏中心)]。将该质粒用限制性酶SalI和EcoRV消化。按照EP-A-0816380的的实施例14所描述的程序，回收编码含有信号肽的人OCIF的核苷酸，该核苷酸等同于人OCIF cDNA。在所说的核苷酸被分离和提纯后，它被插入表达载体pcDL-SRα296(分子和细胞生物学，第8期，p466，1988)，然后用它转化大肠杆菌菌株DH5α(Gibco BRL)(见EP-A-0816380描述的程序)。这样所获得的名为pSRαOCIF的重组载体从所说的转化培养物中提取并纯化。
采用EP-A-0816380的实施例14的程序获得重组人成熟OCIF。具体地说，将CHO dhFr-细胞(ATCC，CRL9096)用上面产生的重组质粒pSRαOCIF和表达二氢叶酸还原酶(DHFR)的质粒(WO-A-92/01053中公开的质粒pBAdDSV)进行转染，然后选择DHFR-表达转染子。表达大量OCIF的转化体被克隆。选择其条件培养基中含有高浓度OCIF的克隆，并获得表达最大量OCIF的克隆5561。调节获得的克隆5561培养物，过滤，然后应用于肝素琼脂糖-FF凝胶柱(2.6×10cm，Pharmacia Co.)并采用线性氯化钠梯度洗脱液进行柱层析。含有OCIF活性的部分用约0.6～1.2M氯化钠作为洗脱液洗脱，然后加入亲和层析柱(blue-5PW，0.5×5.0cm，Tosoh Co)并采用线性氯化钠梯度作为洗脱液进行亲和层析。洗脱出的各部分在还原和非还原条件下进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，含有所期望的提纯的重组人成熟OCIF的部分被确定是那些产生与EP-A-0816380例14中产生的OCIF蛋白质同样条带的部分，其表观分子量为60000和120000。这个单体肽的氨基酸序列如序列表的SEQ.ID.NO.1所示，它与SEQ.ID.NO.4的全序列或WO-A-96/26217和EP-A-0816380的SEQ ID.No.5中氨基酸No.1到No.380相同。
然后用1/100体积的25％的三氟乙酸补充含有获得的人OCIF的合并部分并将得到的混合物注入反相柱(购自YMC CO.的PROTEIN-RP，2.0mm×250mm)，该柱已经用含有0.1％的三氟乙酸的30％的乙腈进行了预平衡处理。然后该柱以0.2ml/分钟的流速采用从30％到55％的乙腈线性梯度进行洗脱50分钟。分别收集两个峰部分，然后冻干。在还原条件下在SDS-PAGE上显示出表观分子量120000的条带的部分随后在下列实施例中作为二聚体人OCIF使用(见WO-A-96/26217和EP-A-0816380的实施例17和18)。
1(b)含有OCIF和硫酸右旋糖酐的复合物的制备
将如上面实施例1(a)中所述制备的提纯后的二聚体人OCIF溶解在10mM磷酸钠缓冲溶液中(pH6.0)，缓冲液含有0.15M氯化钠，从而得到浓度为1.5、2、5、6.5、10、12.5、20或50mg/ml的OCIF溶液。硫酸右旋糖酐钠盐硫5(MeitoSangyo Co.，Ltd制造，以下简称“DS5”)溶解在水溶液中，从而获得40、100、130、150、200、400、500、510或1000mg/ml的最后浓度，然后加入1N氢氧化钠到最终pH为10、10.5或11。将获得的水溶液在4、7、25或37℃下温育1、3、6、18、24、48、72、96、144、168或288小时。
在温育结束后，将4ml各溶液注入Superdex 200预制级凝胶过滤柱(柱的内径16mm；长度：60em，排阻极限分子量：1,300,000；由Amersham PharmaciaBiotech制作)，该柱预先用含有0.3M氯化钠的10mM磷酸钠缓冲液(pH6)平衡，然后以2毫升/分钟的流速用同一缓冲液进行洗脱。用紫外分光光度计监测280nm的吸收，收集大约28到36分钟保留时间内的洗出液。在大约50到70分钟的保留时间，不结合OCIF的游离DS5被洗脱。所有凝胶过滤步骤在室温下进行。获得的含有期望的二聚体人OCIF和DS5的复合物的制备物在-60℃冷冻并储存。每一种复合物的制备条件归纳在下表1。
                                         表1
制备序号   DS5浓度(mg/m1)   OCIF浓度(mg/ml)   温度(℃)     pH   温育时间(小时)
1   130   6.5   4     10.5   18
2   510   6.5   4     10.5   18
3   130   6.5   4     11   18
4   130   6.5   4     10.5   72
5   500   5   4     10.5   144
6   130   6.5   4     10.5   48
7   130   6.5   4     10.5   144
8   130   6.5   4     10.5   288
9   400   20   4     10.5   18
10   200   10   4     10.5   18
11   100   5   4     10.5   18
12   40   2   4     10.5   18
13   1000   12.5   4     10.5   18
14   1000   50   4     10.5   18
15   400   2   4     10.5   144
16   1000   5   4     10.5   18
17   1000   2   4     10.5   18
18   150   5   37     10.5   1
19   150   5   37     10.5   3
20   150   5   37     10.5   6
21   150   5   37     10.5   24
22   150   5   7     10.5   168
23   150   5   4     10   144
24   150   5   25     10   24
25   130   6.5   4     10.5   24
26   150   5   37     10   24
27   150   5   4     10.5   144
28   150   5   4     11   24
29   150   5   4     10.5   24
30   150   1.5   4     10.5   72
31   130   6.5   25     10.5   1
32   130   6.5   25     10.5   3
33   130   6.5   25     10.5   6
34   130   6.5   25     10.5   24
35   130   6.5   25     10.5   168
36   130   6.5   25     10.5   288
37   150   5   4     10.5   96
38   150   5   4     10.5   288
39   130   6.5   25     10.5   18
40   130   6.5   37     10.5   18
1(c)天然人OCIF的制备
按照WO-A-96/26217和EP-A-0816380的实施例1到4中描述的方法从人胎儿肺成纤维细胞IMR-90(ATCC-CCL186)的培养物中制备天然生产的人OCIF。
实施例2
含有OCIF和硫酸右旋糖酐(II)的复合物的制备
按照上面的实施例1(a)的描述制备的提纯的二聚体人OCIF溶于10mM的磷酸钠缓冲溶液(pH6.0)，这种溶液含有0.15M的氯化钠，从而得到5mg/ml OCIF浓度的溶液。具有5000分子量的硫酸右旋糖酐钠(DS5000，由Wako PureChemical Industries公司制造)溶于这样得到的水溶液，DS5000最后浓度为150mg/ml，然后加入1N氢氧化钠，最后的pH值为10.5。这种水溶液然后在4℃温育24小时。
在温育结束后，按照上面实施例1(b)的描述，对获得的4ml溶液进行Superdex200预制级凝胶过滤柱色谱。用紫外分光光度计检测280nm波长处的吸收，收集保留时间为大约28到36分钟的洗出液。没有结合OCIF的游离DS5000在保留时间约为40到65分钟内洗脱。
所得的含有希望的二聚体人OCIF和DS5000的复合物的制备物被冷冻并在-60℃储存。复合物的制备条件归纳在表2如下。
表2
制备序号  DS5000浓度(mg/ml)  OCIF浓度(mg/ml)  温度(℃)   pH   温育时间(小时)
41  150  5  4   10.5   24
实施例3
等电点的测量
如上所述在实施例1(a)中制备的提纯的重组二聚体人OCIF和实施例1(b)制备的表1中制备序号为22的OCIF和硫酸右旋糖酐的复合物，使用IEFpH3～7缓冲剂试剂盒(Technical Frontier Co.)分别注入等电电泳凝胶IEF PAGE mini(pH范围3到10，由IWAKI GLASS制作)，按照下列方案使电压作用于凝胶：100V1小时，随后200V 1小时，最后为500V30分钟。在完成电泳后，每一种条件下获得的凝胶用考马斯蓝染色。
由上述获得的电泳凝胶测定的二聚体人OCIF的等电点大约为pI9，通过将OCIF和OCIF复合物的条带位置与pI标志物进行比较，制备序号22的OCIF和硫酸右旋糖酐复合物的等电点大约为pI6.5。
实施例4
含有OCIF和硫酸右旋糖酐的复合物中OCIF和硫酸右旋糖酐的分子比例的测量
4(a)用过氧化物酶标记的抗人OCIF单克隆抗体OI-4原液的制备
在该步骤中，使用EZ-Link马来酰亚胺活化的辣根过氧化物酶试剂盒(Pierce公司生产)，按照该试剂盒提供的说明书中所述的程序II，用过氧化物酶标记抗人OCIF单克隆抗体。具体操作如下。
按照EP-A-0974671(WO-A-99/15691)的实施例4所述的方法，从产生抗体OI-4的杂交瘤(FERM BP-6419)的培养物中纯化抗人OCIF单克隆抗体OI-4，然后用10mM磷酸盐缓冲液(pH7.6)将其稀释至最终蛋白浓度为1mg/ml。
在使用前，将S-乙酰硫代乙酸N-琥珀酰亚胺酯(在所述EZ-Link马来酰亚胺活化的辣根过氧化物酶试剂盒中提供)溶于二甲基甲酰胺中，得到浓度为10mg/ml的溶液。加入4μl等份试样到上面制备的稀释的1ml含OI-4的溶液中，获得的溶液在室温下温育30分钟。温育结束后，加入20μl通过在使用之前将5mg盐酸羟胺溶解在100μl的马来酰亚胺共轭缓冲液(提供在所述的EZ-Link马来酰亚胺活化的辣根过氧化酶试剂盒中)中得到的溶液，然后在室温温育得到的溶液2小时。然后，将反应混合物注入聚丙烯酰胺脱盐柱(10ml，包含在所述EZ-Link马来酰亚胺活化的辣根过氧化酶试剂盒中)，该柱在使用前用30ml的马来酰亚胺共轭缓冲液平衡。然后，在该柱中加入马来酰亚胺共轭缓冲液。以0.5ml为一部分收集洗脱液。含有抗体的第7和第10部分合并。就在使用前将5mg的EZ-LINK马来酰亚胺活化的辣根过氧化物酶(包含在所述EZ-Link马来酰亚胺活化的辣根过氧化酶试剂盒中)溶于500微升的蒸馏水中，取100μl加入到合并的洗脱部分中，得到的混合物在室温下温育1小时。温育后，加入等体积的甘油，所获得的溶液在-20℃保存。
上述方法获得的溶液用作为用过氧化物酶标记的注抗人OCIF单克隆抗体OI-4(以下简称为POD-OI-4)原液，以下简称为“POD-OI-4原液”。
4(b)OCIF的定量
通过采用两个抗OCIF单克隆抗体进行酶联免疫吸附试验(ELISA)测量实施例1和实施例2中制备的任何复合物和参考实施例1制备的混合物中的OCIF的含量，详细步骤如下。
按照EP-A-0974671(WO-A-99/15691)的实施例4所描述的方法，从产生抗体OI-26的杂交瘤(FERM BP-6421)的培养物中提纯抗人OCIF单克隆抗体OI-26，然后溶解在0.1M的碳酸氢钠中获得蛋白质终浓度为5μg/ml的溶液。将100μl的等分试样转移到96孔的微滴盘(Maxisorp，由NUNC制造)的每个孔中，然后将该盘密封，并在4℃下温育过夜。温育后，每一孔都用250微升的磷酸缓冲盐(PBS)(pH7.4)冲洗三次，这种缓冲液含有0.1％聚山梨醇酯20。将20μl稀释缓冲液(含有0.2M的TRIS盐酸、40％Block Ace(购自Dainippon Pharmaceutical公司)和0.1％聚山梨醇酯20；pH7.4]加入到每个孔中，然后，将盘保持在室温下20分钟以封闭未结合OI-26的孔的区域。
欲加入上述制备的OI-26结合孔中的样品优选采用上面用于封闭孔的稀释缓冲液进行稀释。为了制作标准曲线，含有已知浓度的人OCIF的稀释缓冲液用作标准。稀释缓冲液用作对照。将每种样品50μl转移到各个孔。
在样品加入到这些孔中后，将50μl的通过用稀释缓冲液[0.2MTris-盐酸、40％Block Ace(购自Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)、0.1％聚山梨醇酯20(pH7.4)]稀释POD-OI-4原液(如在实施例4(a)所描述的方法制备)1500倍得到的溶液加入每个孔中，并且在室温下温育微滴盘2小时。然后，每个孔用250μl的含0.1％的聚山梨醇酯20的磷酸缓冲液(以下简称PB pH7.4)冲洗四次。
将0.1M的柠檬酸和0.2M的磷酸氢二钠混合，用作底物溶液(pH4.5)。将32.5ml等分试样转移到试管中，并加入6.5μl的过氧化氢。然后，将13mg的邻苯二胺二盐酸盐(OPD)片(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产)溶解于上述溶液。将100微升等分试样注入每个孔，用铝膜覆盖微滴盘，然后在室温下温育15分钟。然后加入50微升的反应终止液到每个孔中，这种终止液含有体积比为250∶50的纯水和浓硫酸。在用振动器(Titer Mixer MB-1，由JapanTrika制造)轻轻搅拌孔中的溶液后，采用微板读数器(SPECTRAFLUOR：TECAN制造)测量490nm波长处每个孔的吸收。
在从上述已知浓度的人OCIF的标准溶液的吸光度产生的标准曲线的基础上，计算每份样品中人OCIF的量。
4(c)硫酸右旋糖酐的定量
如上实施例1和2所述产生的每种复合物中硫酸右旋糖酐的量，是通过苯酚硫酸方法作为中性糖来测定的，具体描述如下。
具有已知浓度在10到60μlg/ml范围的DS5(Meito Sangyo Co.Ltd.生产)或DS5000(Wako Pure Chemical Industries公司生产)溶液是用稀释溶液(0.01M柠檬酸、0.3M氯化钠、0.01％聚山梨醇酯80水溶液：pH6.0)制备的，用作标准溶液。将标准品、样品或稀释溶液各0.2ml转移到每个试管。0.2ml的50mg/ml水性苯酚被加入其中，并快速搅拌。将得到的混合物在60℃水浴温育20秒后，将1.0ml的浓硫酸加入其中。轻柔但快速搅拌后，试管被置于室温温育10分钟，再次快速搅拌，然后被置于室温温育20分钟。然后，试管中溶液在490nm波长的吸光度用分光光度计(UV-20：Shimadzu Seisakusho，K.K.制造)测量。
根据吸光度和标准曲线，测定了中性糖的含量。人OCIF含有一个糖链。因此，可根据所分析的制备物的中性糖含量测量值推导出人OCIF本身的中性糖含量值，从而计算出所分析的制备物中与人OCIF结合的硫酸右旋糖酐的含量。
4(d)含有OCIF和硫酸右旋糖酐的复合物中OCIF和硫酸右旋糖酐分子比的计算。
如例4(c)所述测定的被分析的制备物中硫酸右旋糖酐的含量除以如例4(b)所述测定的被分析的制备物的人OCIF的含量，得到在所分析的制备物中每1mg人OCIF中所含的硫酸右旋糖酐的量。
所获得的数字用于根据设定的人OCIF单体分子量是60000，DS5的分子量是1950，DS5000的分子量是5000，借助计算每个OCIF单体分子的硫酸右旋糖酐分子的数目，计算所分析的制备物中单体OCIF和硫酸右旋糖酐的分子比。
结果在下列表3中显示。
                      表3
    复合物(制备序割 复合物中硫酸右旋糖酐的含量(μg/mg OCIF)   OCIF单体与硫酸右旋糖酐在复合物中的分子比
    1     48.7     1∶1.5
    2     100.2     1∶3.1
    3     39.7     1∶1.2
    4     62.0     1∶1.9
    5     136.4     1∶4.3
    6     60.7     1∶1.9
    7     58.5     1∶1.8
    8     60.3     1∶1.9
    9     67.7     1∶2.1
    10     94.3     1：2.9
    11     63.6     1∶2.0
    12     60.8     1∶1.9
    13     144.9     1∶4.5
    14     116.4     1∶3.6
    15     126.9     1∶4.0
    16     145.0     1∶4.5
    17     116.5     1∶3.6
    18     46.0     1∶1.4
    19     61.0     1∶1.9
    20     68.3     1∶2.1
    21     110.7     1∶3.4
    22     100.3     1∶3.1
    23     65.8     1∶2.1
    24     58.2     1∶1.8
    25     43.8     1∶1.4
    26     80.1     1∶2.5
    27     61.8     1∶2.0
    28     57.1     1∶1.8
    29     69.3     1∶2.2
    30     77.1     1∶2.4
    31     34.5     1∶1.1
    32     53.0     1∶1.7
    33     47.4     1∶1.5
    34     62.2     1∶2.0
    35     96.2     1∶3.0
    36     122.5     1∶3.9
    37     67.8     1∶2.1
    38     69.5     1∶2.4
    39     78.0     1∶2.5
    40     98.4     1∶3.1
    41     161.2     1∶1.9
实施例5
OCIF/硫酸右旋糖酐复合物中OCIF和硫酸右旋糖酐之间的结合稳定性
如上面实施例4(c)所述，含有OCIF和硫酸右旋糖酐的复合物的凝胶过滤重复两次，测量每次凝胶过滤后得到的复合物中的硫酸右旋糖酐的量。
5(a)OCIF和硫酸右旋糖酐的温育
使用实施例1(b)所述的步骤。如实施例1(a)所述制备的重组二聚体人OCIF溶于含有0.15M氯化钠的10mM的磷酸钠缓冲液(pH6.0)中，获得OCIF5mg/ml浓度的溶液。将DS5溶于这个溶液中，获得最后DS5浓度为150mg/ml，然后加入1N的氢氧化钠溶液调整pH值到10.5。所获得的溶液在4℃温育7天，获得含有人二聚体OCIF和DS5复合物的溶液。
5(b)第一次凝胶过滤
按照实施例1(b)描述的方法，在实施例5(a)中温育后获得的含有人二聚体OCIF和DS5的复合物的溶液进行凝胶过滤。收集保留时间约为28到36分钟的部分，而未结合OCIF的游离硫酸右旋糖酐是在保留时间约为50到70分钟内洗脱的。
5(c)蛋白质含量测量
按照如下Lowry方法[Lowry，O.H.等人，生物化学杂志，193，265-275(1951)]，测量复合物中的蛋白质含量。
将0.2g五水硫酸铜(II)(Wako Pure Chemical)溶于水获得50ml的最终体积。将0.4g酒石酸钠二水合物(Wako Pure Chemical)溶于水获得50ml的最终体积。将20g碳酸钠溶于水获得最终100ml的体积。在使用之前上述三种水溶液按照1∶1∶2的体积比混合(该溶液称A溶液)。10g十二烷基硫酸钠(Nacalai TesqueInc.)溶于水获得最终200ml的体积(该溶液称B溶液)。3.2g氢氧化钠(Wako PureChemical)溶于水至最终体积为100ml(该溶液称为C溶液)。A、B和C溶液在使用之前按照1∶2∶1的体积比混合。
在使用之前，福林(Folin-ciocalteu)试剂(Wako Pure Chemical)和水按照1∶5的体积比混合。2.76g的柠檬酸三钠盐二水合物(Wako PureChemical)、0.13g的单水柠檬酸(Wako Pure Chemical)、17.5g的氯化钠和0.1g的聚山梨醇酯80溶于水至最终体积为1L(pH6.9)，获得的溶液称为稀释溶液。
9.5ml的稀释溶液加入在含浓度小于0.1％的叠氮化钠的0.9％氯化钠水溶液中的含2mg/ml牛血清白蛋白(称为“BSA”)的牛血清白蛋白(Pierce Co.Ltd)的标准溶液500μL中，得到的溶液称为“100μg/ml BSA溶液”。3.5ml、3ml、2.5ml或2ml的稀释溶液分别加入到1.5ml、2ml、2.5ml或3ml 100μg/ml BSA溶液中，得到的溶液分别称为“30μg/ml BSA溶液”、“40μg/ml BSA溶液”、“50μg/ml BSA溶液”、“60μg/ml BSA溶液”。将3ml稀释溶液加到1.5ml60μg/ml BSA中，得到的溶液称为“20μg/ml BSA溶液”。
用稀释液稀释待确定蛋白质含量的样品，得到最后蛋白质浓度约为40μg蛋白质/ml的溶液。将1ml的20μg/ml BSA溶液、30μg/ml BSA溶液、40μg/mlBSA溶液、50μg/ml BSA溶液、60μg/ml BSA溶液、稀释样品或稀释溶液(n＝3)转移至试管中，加入1ml的碱性铜试剂，将得到的溶液混合，在室温下温育10分钟。然后加入0.5ml稀释的福林试剂，混合得到的溶液，在室温下温育30分钟。然后，用宽10mm的石英杯，在紫外分光光度计中(Lambda20：Perkin ElmerCo Ltd.)测量波长750nm处每种混合物的吸光值。然后，根据用标准BSA溶液的吸光值(作为换算为BSA的量的值)产生的校正曲线，计算样品中含的蛋白质的量。
5(d)硫酸右旋糖酐的定量分析
采用实施例4(c)描述的步骤，测量了实施例5(b)中第一次凝胶过滤后获得的复合物中结合人OCIF的硫酸右旋糖酐的含量。
5(e)第二次凝胶过滤
上面实施例5(b)中获得的合并收集部分转移到两个Centriprep过滤单元(YM-30，30,000MW cutoff，Millipore Amicon Co Ltd.)，采用离机(himacCT60，Hitachi Seisakusho Co Ltd.)以2000rpm的速度离心20分钟。收集从两个Centriprep过滤单元得到的没有过滤出去的浓缩溶液并混合。该溶液按照实施例1(b)的描述进行凝胶过滤，收集保留时间大约为28到36分钟的部分并合并。如实施例5(c)和5(d)所述测量合并部分中的复合物的蛋白质和糖的含量。
5(f)第三次凝胶过滤
实施例5(e)中获得的合并收集部分转移到两个Centriprep过滤单元(YM-30，30,000MW cutoff，Millipore Amicon Co Ltd)，采用离心机(himacCT60，Hitachi Seisakusho Co Ltd.)以2000rpm的速度离心20分钟。收集两个Centriprep过滤单元中没有过滤出去的浓缩溶液并混合。得到的浓缩液按照实施例1(b)的描述进行凝胶过滤，收集保留时间为大约28到36分钟的部分物并混合。然后，合并部分中的复合物的蛋白质和糖的含量按照例5(c)和例5(d)的描述进行测量。
5(g)OCIF与硫酸右旋糖酐的分子比的计算
在实施例5(b)中第一次凝胶过滤后、在实施例5(e)中第二次凝胶过滤后、在实施例5(f)中第三次凝胶过滤后获得的部分中的复合物中存在的单体OCIF和硫酸右旋糖酐的分子比按照实施例4(d)进行计算。得到的结果汇总在如下表4中。
表4
    凝胶过滤  OCIF单体与硫酸右旋糖酐在复合物中的分子比
    第1次  1∶2.2
    第2次  1∶2.3
    第3次  1∶2.1
可以从上表立刻明显发现，本发明的复合物中OCIF和硫酸右旋糖酐的分子比经过三次凝胶过滤还非常恒定，表明本发明的复合物中OCIF和硫酸右旋糖酐之间的结合高度稳定。
实施例6
肝素交联柱上OCIF和硫酸右旋糖酐复合物的吸附程度
6(a)肝素柱色谱
本例中以每分钟4ml的流速进行所有的柱色谱步骤。
采用5ml的含有0.7M氯化钠的10mM磷酸钠缓冲液预平衡肝素交联柱(HiTrap肝素HP柱，Lot.289212，Amersham Pharmacia Biotech)。取实施例1中表1的制备物，并用含有0.7M氯化钠的10mM磷酸钠缓冲液稀释到最终蛋白质浓度为0.1mg/ml。获得的1ml稀释溶液注入色谱柱，收集1ml的第一次洗提液(部分A)。再注入5ml的10mM的含有0.7M氯化钠的10mM磷酸钠缓冲液，收集第二次洗提液5ml(部分B)。最后，注入4ml的1含有2M氯化钠的10mM磷酸钠缓冲液，收集4ml的洗提液(部分C)。
6(b)洗提液中OCIF的含量测量
将以10μg/ml的浓度溶解了抗人OCIF单克隆抗体OI-19(FERM BP-6420)的100μL的0.1M的碳酸氢钠(pH9.6)转移到96孔的微量滴定平板(Maxisorp：NUNCCo Ltd.)的每一孔中。将平板密封并在4℃温育过夜。然后，通过倾注，清除每个孔中的溶液，将300μL的50％的BLOCK ACE(购自Dainippon PharmaceuticalCo.，Ltd.)加入每个孔中，在室温下温育平板2小时。在清除每个孔中的溶液后，用300μL含有0.1％聚山梨醇酯20的PBS(pH7.4)和SERA WASHER MW-96R(Bio Tec Co Ltd.)冲洗每个孔三次。
在如上所述预备了每个孔后，将实施例6(a)获得的各20μl三种洗提液(部分A、B和C)采用含有40％Block Ace、10μg/ml的小鼠免疫球蛋白G和0.1％的聚山梨醇酯20的0.2M Tris-盐酸(pH7.4)稀释，获得最终体积为120μL，然后用同样体积的纯水稀释。同时，已知量的人OCIF溶解于120μl含有40％Block Ace、10μg/ml的小鼠免疫球蛋白G和0.1％的聚山梨醇酯20的0.2MTris-HCl(pH7.4)中，然后用同样体积的纯水稀释。将这样得到的溶液用作标准。
100μL的每一种稀释洗提液和标准溶液注入如上所述预备好的微量滴定平板的每一个孔中，然后在室温用微板混合器(NS-P：Iuchi Seiei-Do，Co Ltd.)轻轻搅拌，将平板温育2小时。然后，从每个孔中清除溶液，采用300μL的含有0.1％聚山梨醇酯20的PBS(pH7.4)和SERA WASHER MW-96R(Bio Tec CoLtd.)冲洗每个孔6次。在100μL的含有25％Block Ace、10μg/ml的小鼠免疫球蛋白G和0.1％的聚山梨醇酯20的0.1M Tris-HCl(pH7.4)中加入实施例4(a)制备的POD-OI-4原液，获得体积比为0.01％的溶液，然后再注入每个孔中，在室温用相同的微板混合器温和搅拌2小时温育平板。从每个孔中清除溶液，采用300μL的含有0.1％聚山梨醇酯20的PBS(pH7.4)和SERA WASHERMW-96R(Bio Tec Co Ltd.)冲洗每个孔6次。
在冲洗这些孔后，100μL的3，3`，5，5`-四甲联苯胺(TMB)可溶试剂(Scytek Co Ltd.)加入每个孔中，然后在室温用相同的微板混合器温和搅拌温育平板10到15分钟。然后，100μl的TMB终止缓冲液(Scytek Co Ltd.)加入每个孔。用微板混合器温和搅拌平板大约1分钟后，采用微板读数器(SPECTRATHERMO：TECAN Co Ltd.)测量450nm处每个孔的吸光值。根据每个所述的标准溶液对浓度的吸光值画出的标准曲线，计算部分A、B和C每部分中含有的OCIF的量[标注为(a)、(b)和(c)]。按照下式计算所测试的OCIF和硫酸右旋糖酐的复合物对肝素交联柱的吸附程度。 ( c ) ( a ) + ( b ) + ( c )
在下表5中汇总了上面的实施例1制备的7个复合物的结果。也给出未复合的OCIF的对应结果。从表中可以看出，未复合OCIF比本发明的复合物更强烈地结合肝素柱。还发现本发明的复合物可以由其对肝素交联柱的吸附程度进一步表征。
                表5
    制备序号     OCIF/DS复合物与肝素交联柱的吸附程度
    6     0.451
    7     0.183
    8     0.153
    22     0.264
    24     0.072
    25     0.611
    27     0.141
    OCIF     0.998
实施例7
OCIF/硫酸右旋糖酐复合物的免疫检测
7(a)蛋白质的含量的测量
按照上面实施例5(c)描述的方法确定实施例1的复合物制备物中的蛋白质的含量。
7(b)OCIF的量的免疫测量
采用实施例6所述的ELISA技术测量免疫方法确定的实施例1的复合物制备物中OCIF的含量。
7(c)免疫检测率的计算
实施例7(b)获得的值除以实施例7(a)获得的对应值，获得的值称为免疫检测率。
这些结果归纳于下表6。也给出未复合OCIF的对应结果。也发现本发明的复合物可以用其免疫检测率进一步表征。
                    表6
    制备序号     OCIF/DS复合物的免疫检测率
    6     1.07
    7     0.74
    8     0.88
    22     1.06
    24     1.02
    25     0.87
    27     1.04
    OCIF     1.06
参考实施例1
OCIF和硫酸右旋糖酐的混合物的制备
采用EP-A-1127578(WO-A-2000/24416)的实施例1公开的步骤如下制备OCIF和硫酸右旋糖酐钠盐(分子量5000或10000)的混合物。
按照实施例1(a)所述制备分子量大约为120000的提纯的二聚体人OCIF，将其溶解到10mM的含有0.15M氯化钠和0.01％聚山梨醇酯80的磷酸钠缓冲液(pH6.0)中，得到OCIF浓度为0.25mg/ml的溶液。将实施例2描述的DS5000(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)或分子量为10000的硫酸右旋糖酐钠盐(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，以下称为DS10000)溶解在上述水溶液中，得到最终硫酸右旋糖酐钠盐浓度为1或4mg/ml的溶液，再加入氢氧化钠得到最终的pH值为7。所得水溶液在4℃温育24小时，得到含OCIF和DS5000或DS10000的期望制剂，然后用于与如下试验实施例1中进行对比。
每一种混合物的制备条件归纳于下表7。
                                       表7
参考制备序号     硫酸右旋糖酐   OCIF浓度(mg/ml) 温度(℃)  pH  温育时间(小时)
 类型  浓度(mg/ml)
参考1  DS5000  4   0.25 4  7  24
参考2  DS10000  1   0.25 4  7  24
试验实施例1
含OCIF和硫酸右旋糖酐的复合物的血清浓度的测量
1(a)注射和收集血液
5周龄Wistar雌性大鼠(体重大约100g)禁食过夜。用含有0.01％聚山梨醇酯80的PBS(pH7.4)稀释所要测试的实施例1、2或参考实施例1中制备的OCIF和硫酸右旋糖酐的制备物到浓度为0.25mg/ml制备注射液，然后注射溶液进入一只试验大鼠的尾巴的静脉，单剂量注射量为2ml/kg体重。注射六小时后，从大鼠的心脏取血。
1(b)血清分级分离
1(a)中收集的血液在室温下凝结30分钟后，用直径10cm的转子以14000rpm离心血液3分钟得到上清液血清。
1(c)血清中的OCIF的定量分析
抗人OCIF单克隆抗体OI-19(参见EP-A-0974671/WO-A-99/15691)溶解在0.1M碳酸氢钠溶液中获得最终OCIF浓度为10μg/ml的溶液，将100μL的该溶液加入96孔微滴平板(Maxisorp：NUNC制造)的每一个孔中，然后密封平板，在4℃下放置过夜。倾注法清除抗体溶液，再加入300μL的封闭缓冲溶液(50％Block Ace：购自Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)到每个孔中，该平板在室温下放置2小时。然后用300μL的含0.1％聚山梨醇酯20的PBS(pH7.4)冲洗每个孔三次。
将100μL的纯水和120μL稀释缓冲溶液[成分：0.2M Tris-HCl、40％Block Ace(购自Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)、10μg/ml小鼠免疫球蛋白G和0.1％聚山梨醇酯20，pH7.4]加入20μL的如1(b)所述收集的待测试血清中，然后混合。作为对照，将100μL的纯水和含有已知浓度的人OCIF二聚体的120μL的稀释缓冲液加入20μL蒸馏水，然后混合。
100μL的每种获得的血清制备物加入到每个孔中，平板在室温下放置2小时。在反应完成后用300μL的含有0.1％聚山梨醇酯20(pH7.4)的溶液冲洗每个孔6次。用稀释溶液[含有0.1M的Tris-HCl、25％Block Ace(购自DainipponPharmaceutical Co.Ltd.)、10μg/ml小鼠免疫球蛋白G和0.1％聚山梨醇酯20(pH7.4)]稀释实施例4(a)获得的POD-OI-4原液1000倍得到的溶液100μl加入到每个孔中，平板在室温放置2小时。
然后，每个孔用含0.1％聚山梨醇酯20的300μL的PBS(pH7.4)冲洗6次。100μL的底物溶液(TMB可溶试剂：Scytek生产)加入每个孔，平板在室温放置10到15分钟。然后，100μL的反应终止液(TMB终止缓冲液：Scytek生产)加入到每个孔中。
在采用振动机(微板混合器NS-P：Iuchi Seiei-Do Co Ltd.制造)温和搅拌后，采用微板读数器(SPECTRA THERMO：TECAN制作)测量450nm波长处每个孔的吸光值。根据用标准OCIF溶液制作的标准曲线，计算试验血清的OCIF浓度。以类似于血清的方法，通过测量1(a)中制备的每个注射液中的OCIF浓度计算每公斤体重的OCIF的剂量(mg/kg)。
1(d)血清浓度
按照1(c)所述的方法，对每个样品定量分析1(b)得到的血清中的OCIF。试验结果表示在表8。
                                   表8
    制备序号     剂量(OCIF mg/kg)     血清浓度(OCIF ng/ml) 校正的血清浓度*(OCIF ng/ml)
    1     0.5     213
    2     0.5     350
    3     0.5     191
    4     0.5     370
    5     0.5     305
    6     0.5     209
    7     0.5     371
    8     0.5     571
    9     0.5     164
    10     0.5     174
    11     0.5     235
    12     0.5     249
    13     0.5     177
    14     0.5     271
    15     0.5     313
    16     0.5     359
    17     0.5     269
    18     0.6     400     35l
    19     0.4     526     614
    20     0.4     553     760
    21     0.1     132     611
    22     0.6     752     651
    23     0.5     340
    24     0.5     830
    25     0.5     165
    26     0.5     574
    27     0.5     584
    28     0.5     228
    29     0.5     231
    30     0.5     620
    31     0.5     338
    32     0.5     774
    33     0.5     879
    34     0.5     667
    35     0.2     318     795
    36     0.1     114     570
    37     0.5     535
    38     0.4     631     789
    39     0.5     366
    40     0.5     423
    41     0.4     423     508
    参考1     0.5     75
    缆     0.5     24
*血清中的校正浓度是当每公斤体重OCIF的剂量转化为0.5mg/kg时，血清中的OCIF浓度。
如表8所示，在以每公斤体重注射0.5mg/kg本发明的制备物6小时后血清的浓度比采用同样剂量的参考制备物1注射后的浓度高2.2到11.7倍。
本发明的先优点
如上所示，与在WO-A-2000/24416中公开的含有OCIF和多糖的已知混合物相比，本发明的含有至少一种OCIF、其类似物或变异体和至少一种多糖或其衍生物的复合物在注射后在血液中的保留浓度明显高得多。本发明的复合物可用于预防或治疗各种骨代谢疾病诸如骨质疏松症、血钙过多症、骨溶解转移、由于风湿性关节炎产生的骨损失、由于类固醇药物产生的骨减少、多重骨髓瘤、或由于肾脏功能障碍产生的骨减少或血钙过多、肾病性骨营养不良、骨关节炎等。
                            序-列表<110>三共株式会社<120>含有OCIF和多糖的复合物<130>EPP85710(FP-200229SW)<150>JP 2001-198985<151>2001-06-29<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>401<212>PRT<213>人<220><221>SIGNAL<222>(-21)..(-1)<223><220><221>mat_peptide<222>(+1)..(+380)<223><400>1Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile
-20                 -15                 -10Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp-5                  -11             5                   10Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr
        15                  20                  25Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro
    30                  35                  40Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys
45                  50                  55Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu60                  65                  70                  75Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr
            80                  85                  90Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe
        95                  100                 105Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg
    110                 115                 120Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys
125                 130                 135Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys140                 145                 150                 155Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr
            160                 165                 170Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg
        175                 180                 185Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val
    190             195                     200Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
205                 210                 215Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu220                 225                 230                 235Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln
            240                 245                 250Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala
        255                 260                 265Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly
    270                 275                 280Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys
285                 290                 295Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn300                 305                 310                 315Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser
            320                 325                 330Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr
        335                 340                 345Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu
    350                 355                 360Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys
365                 370                 375Leu380

Claims (36)

1.一种复合物，所述复合物含有至少一种选自破骨细胞形成抑制因子(OCIF)、其类似物和变异体的物质，它结合于至少一种选自多糖及其衍生物的物质。
2.根据权利要求1所述的复合物，其中所述的选自OCIF、其类似物和变异体的物质是天然类型或重组类型的。
3.按照权利要求1或2所述的复合物，其中所述的选自OCIF、其类似物和变异体的物质是一种单体或二聚体。
4.按照权利要求3所述的复合物，其中所述的选自OCIF、其类似物和变异体的物质，是在非还原条件下采用SDS-PAGE测量时分子量为大约60000的人单体OCIF或采用SDS-PAGE在非还原条件下测量的分子量为大约120000的人二聚体OCIF。
5.按照权利要求1到4中任何一项所述的复合物，其中所述的OCIF含有序列表SEQ.ID.NO.1的-21到+380的氨基酸。
6.按照权利要求1到4中任何一项所述的复合物，其中所述的OCIF含有序列表SEQ.ID.NO.1的+1到+380的氨基酸。
7.按照权利要求1到6中任何一项所述的复合物，其中所述的多糖及其衍生物选自透明质酸、硫酸软骨素、皮肤素酸、己酰肝素酸、角质素酸、角叉胶、果胶、肝素、右旋糖酐和其衍生物。
8.按照权利要求7所述的复合物，其中所述多糖衍生物选自硫酸右旋糖酐及其盐。
9.按照权利要求8所述的复合物，其中所述多糖衍生物是硫酸右旋糖酐的钠盐。
10.按照权利要求9所述的复合物，其中所述硫酸右旋糖酐的平均分子量为1500到12000。
11.按照权利要求9所述的复合物，其中所述硫酸右旋糖酐的平均分子量为1800到6000。
12.按照权利要求1到11中任何一项所述的复合物，其中所述选自OCIF、其类似物和变异体的物质和所述选自多糖及其衍生物的物质的分子比为1∶1到1∶10。
13.按照权利要求12所述的复合物，其中所述的分子比是1∶1到1∶8。
14.按照权利要求1到13中任何一项所述的复合物，其中所述含有OCIF或其类似物或变异体的复合物对肝素的吸附强度比游离的未复合OCIF或其类似物或变异体的吸附强度低。
15.按照权利要求14的复合物，其中按照下列步骤计算的对肝素的吸附度小于0.7：
(a)装填了固定有肝素的交联琼脂糖珠的色谱柱采用含有0.1到0.8M氯化钠的低离子强度缓冲液平衡；
(b)将试验的复合物溶解在与(a)相同的低离子强度缓冲液中并注入柱中，然后收集第一次洗提液(部分A)；
(c)然后采用与(a)相同的低离子强度缓冲液进一步洗脱，收集第二次洗提液(部分B)；
(d)然后采用含有1.0到2.0M氯化钠的高离子强度缓冲液洗脱，收集第三次洗提液(部分C)；
(e)每一部分A、B、和C中的复合物含量(分别标注为(a)，(b)和(c))采用免疫测定法测量；
(f)按照下列公式测定复合物对肝素的吸附度：
吸附度＝(c)/[(a)(b)+(c)]。
16.按照权利要求1到15中任何一项所述的复合物，该复合物包括OCIF或其类似物或变异体和硫酸右旋糖酐或其盐，其中通过酶联免疫吸收测定法(ELISA)测定所述复合物中所述OCIF或其类似物或变异体的分子数目与通过利用Lowry方法测量总蛋白含量测定的所述复合物中OCIF或其类似物或变异体分子数目的比是0.5到1.2，其中ELISA方法利用从产生抗体OI-19的杂交瘤(FERMBP-6420)的培养物纯化的抗人OCIF单克隆抗体OI-19作为结合到固相的抗体，流动相中使用从产生抗体OI-4的杂交瘤(FERM BP-6419)的培养物纯化的用辣根过氧化酶标记的抗人OCIF单克隆抗体OI-4。
17.按照权利要求16所述的复合物，其中所述的比例为0.6到1.1。
18.按照权利要求16所述的复合物，其中所述的比例为0.7到1.1。
19.按照权利要求1所述的复合物，其中所述选自OCIF、其类似物和变异体的物质是通过SDS-PAGE在非还原条件下测量的分子量是大约60000的人单体OCIF，或通过SDS-PAGE在非还原条件下测量的分子量是大约120000的人二聚体OCIF，所述多糖及其衍生物选自透明质酸、硫酸软骨素、皮肤素酸、乙酰肝素酸、角质素酸、角叉胶、果胶、肝素、右旋糖酐和其衍生物，所述选自OCIF、其类似物和变异体的物质与所述选自多糖和其衍生物的分子比是1∶1到1∶10。
20.按照权利要求1所述的复合物，其中所述选自OCIF、其类似物和变异体的物质是在非还原条件下采用SDS-PAGE测量的分子量是大约60000的人单体OCIF，或在非还原条件下采用SDS-PAGE测量的分子量是大约120000的人二聚体OCIF，所述多糖及其衍生物选自硫酸右旋糖酐和其盐，所述选自OCIF、其类似物和变异体的物质与所述选自多糖和其衍生物的物质的分子比为1∶1到1∶10。
21.按照权利要求1所述的复合物，其中所述选自OCIF、其类似物和变异体的物质是人单体或二聚体OCIF，其中所述单体或所述OCIF二聚体的一个单元包括序列表中SEQ.ID.NO.1所示的氨基酸+1至+380，所述的多糖衍生物是平均分子量为1500至12000的硫酸右旋糖酐的钠盐，所述选自OCIF、其类似物和变异体的物质与所述硫酸右旋糖酐钠盐的分子比是1∶1至1∶10。
22.按照权利要求21所述的复合物，其中所述选自OCIF、其类似物和变异体的物质与所述硫酸右旋糖酐钠盐的分子比是1∶1至1∶8。
23.按照权利要求21的复合物，其中所述选自OCIF、其类似物和变异体的物质与所述硫酸右旋糖酐钠盐的分子比是1∶1至1∶5。
24.按照权利要求21至23中任何一项的复合物，其中所述多糖衍生物是平均分子量为1800至6000的硫酸右旋糖酐钠盐。
25.在给药病人后延长OCIF或其类似物或变异体保留在血流内的时间的方法，该方法包括在给药前将权利要求1至6中任何一项定义的至少一种所述OCIF、其类似物或其变异体与至少一种如权利要求1和7至11中任何一项定义的多糖或其衍生物复合。
26.一种药物组合物，包括有效量的药理学活性剂与其载体或稀释剂，其中所述药理学活性剂是按照权利要求1至24中任何一项的复合物。
27.按照权利要求26的药物组合物，该组合物用于骨代谢疾病的治疗和预防。
28.按照权利要求1至24中任何一项的复合物，该组合物用作药物。
29.按照权利要求1至24中任何一项的复合物，该组合物用作预防或治疗骨代谢疾病的药物。
30.按照权利要求1至24中任何一项的复合物，该复合物用作预防或治疗骨代谢疾病的药物，所述骨代谢疾病选自骨质疏松症、骨质减少、佩吉特氏疾病、骨髓炎、归因于骨损失的传染性病灶、血钙过多、骨破折、归因于风湿病的关节损坏或骨质减少、骨关节炎、牙周骨损失、骨的癌转移、伴随跌打损伤的骨坏死或骨细胞死亡、高雪氏病、镰状细胞血症、红斑狼疮全身性或非外伤性损伤、骨质营养不良和归因于实体癌或者骨的癌转移或恶性溶血疾病的恶疾。
31.按照权利要求1至24中任何一项的复合物在制备预防或治疗骨代谢疾病的药物中的用途。
32.按照权利要求31的用途，其中所述骨代谢疾病选自骨质疏松症、骨质减少、佩吉特氏疾病、骨髓炎、归因于骨损失的传染性病灶、血钙过多、骨破折、归因于风湿病的关节损坏或骨质减少、骨关节炎、牙周骨损失、骨的癌转移、伴随跌打损伤的骨坏死或骨细胞死亡、高雪氏病、镰状细胞血症、红斑狼疮全身性或非外伤性损伤、骨质营养不良和归因于实体癌或者骨的癌转移或恶性溶血疾病的恶疾。
33.按照权利要求1至24中任何一项的复合物的制备方法，所述的方法包括在9.5至12的pH温育至少一种选自如权利要求1至6中任何一项定义的OCIF、其类似物和变异体的物质和至少一种选自如权利要求1和7至11中任何一项定义的多糖及其衍生物的物质，然后除去未结合所述OCIF、其类似物或变异体的任何游离多糖或其衍生物。
34.按照权利要求33的方法，其中在10至11的pH进行所述的至少一种选自OCIF、其类似物和变异体的物质和所述至少一种选自多糖及其衍生物的物质的温育。
35.按照权利要求33或权利要求34所述的方法，其中通过凝胶过滤层析法除去温育后未结合所述OCIF、其类似物或变异体的任何游离多糖或其衍生物。
36.如权利要求1至24中任何一项定义的复合物，所述的复合物按照权利要求33至35中任何一项的方法制备。
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