SK9492002A3

SK9492002A3 - A complex comprising osteoclastogenesis inhibitory factor and polysaccharide

Info

Publication number: SK9492002A3
Application number: SK949-2002A
Authority: SK
Inventors: Shinichi Yamamoto; Junichi Okada; Atsushi Kurihara; Taku Numazawa; Junichi Kondo; Eisuke Tsuda; Shinichi Mochizuki; Hirotaka Nishi; Hideki Miyazaki
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 2001-06-29
Filing date: 2002-06-28
Publication date: 2003-02-04
Also published as: KR20030003124A; HU0202119D0; PA8549401A1; AU5071902A; CZ20022231A3; PL354799A1; AR034716A1; EP1270015A2; US20060084595A1; AU783126B2; IL150448A0; SG98059A1; HUP0202119A2; RU2232594C2; US20030139325A1; BR0202439A; CA2392383A1; PE20030254A1; MXPA02006511A; ZA200205164B

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka komplexu skladajúceho sa z aspoň jedného faktora inhibujúceho osteoklastogenézu (tu pod názvom OCIF), jeho analógu alebo variantu a aspoň jedného polysacharidu alebo jeho derivátu. Vynález sa taktiež týka metódy na prípravu uvedenej zlúčeniny; liečiva na liečbu alebo prevenciu chorôb kostného metabolizmu, ktoré obsahuje uvedenú zlúčeninu ako aktívnu zložku; a použitia uvedenej zlúčeniny pri liečbe alebo prevencii chorôb kostného metabolizmu.

Doterajší stav techniky

Kosti obsahujú asi 99 % celkového vápnika vyskytujúceho sa v organizme ¹ a tak sú významné nielen ako opora tela, ale súčasne aj ako najväčšia zásobáreň kalcia v tele. Kosti majú dôležitú funkciu v udržiavaní homeostázy kalcia. Je známe, že aktivácia osteoklastov, ktoré sú významným článkom v kostnej resorpcii, vedie k zvýšenému uvoľňovaniu kalcia do krvi z kostí. Tento stav významne narúša homeostázu kalcia v krvi, a dochádza k hyperkalcémii. Indukcia hyperkalcémie a aktivácia osteoklastov, spolu s indukciou kostnej resorpcie je spôsobená citokinmi, ktoré sú abnormálne sekrétované pri metastatickom postihnutí kostí (pozri Jean-Jacques Body, Current and Future Directions in Medical Therapy: Hypercalcemia, CANCER Supplement, 2000, 88(12), 3054-3058). Prognóza pacientov trpiacich hyperkalcémiou na základe karcinómov je všeobecne nepriaznivá a preto je veľmi žiaduce nájsť spôsob liečby tohto stavu.

Pri reumatizme, napríklad reumatoidnej artritíde a pod., alebo pri osteoartritíde sa za hlavnú príčinu rôznych symptómov ochorenia kosti a kĺbov považuje abnormálna produkcia a abnormálna aktivácia osteoklastov (pozri E. Romas, M.T. Gillespie a T.J. Martin, Involvement of Receptor Activator of NF-kB Ligand and Tumor Necrosis Factor-a in Bone Destruction in Rheumatoid Arthritis, Bone, 2002, 30(2), 340-346). Bolesť v kĺboch a kostiach postihnutých reumatizmom, napríklad reumatoidnou artritídou alebo osteoartritídou, je mimoriadne intenzívna a významne znižuje kvalitu života pacientov trpiacich týmto ochorením. Je teda velmi žiaduce nájsť efektívny spôsob liečby týchto ochorení.

Taktiež je známe, že osteoklasty hrajú dôležitú úlohu pri osteoporóze. Rovnováha medzi kostnou resorpciou spôsobenou osteoklastmi a kostnou novotvorbou podporovanou osteoblastmi sa postupne presúva na stranu kostnej resorpcie. Dôvodom je redukovaná sekrécia ženských hormónov po menopauze a starnutie, vďaka čomu sa znižuje hustota kostí. Ak je resorpcia kostí dostatočne významná, dochádza k osteoporóze. V prípade, že pacient s vysokým rizikom osteoporózy utrpí fraktúru kosti, je veľká pravdepodobnosť, že zostane dlho pripútaný na lôžko. Osteoporóza sa stáva v dôsledku vzrastajúceho priemerného veku populácie vo väčšine zemí sveta sociálnym problémom (pozri Bruno Fautrel and Francis Guillemin, Cost illnes studies in rheumatic diseases, Current Opinion in Rheumatology, 2002, 14, 121126). Je teda veľmi žiaduce, aby bol objavený efektívny spôsob liečby osteoporózy.

Obvyklá liečby hormónov, napríklad potláčajú aktivitu bisfosfonáty a kalcitonín týchto chorôb zahŕňa estrogénmi a použitie osteoklastov, akými (pozri Mohammad

Tanveer Sobhan, Osteoporosis: A Review, Missouri'Medicíne, suplementáciu látok, ktoré sú napríklad M. Iqbgal and

2002, 99(1), 19-23). Avšak hormóny môžu mať nežiaduce

J vedľajšie účinky, ako napríklad zvýšené riziko vzniku nádorov, indukciu endometriózy a abnormálne krvácanie z genitálií (Joyce Penrose White and Judith S.

Schilling,

Postemenopausal

Hormone

Replacement:

Historical

Perspectives and Current Concerns, Clinical Excellence for Nurse Practitioners, 2000, 4(5), 277-285). Hoci je známe, že bisfosfonáty ľahko viažu nadbytok kalcia v krvi a akumulujú sa v kostiach, mnoho odborníkov pochybuje o ich blahodarnom účinku na zvýšenie pevnosti kostí. Ďalej sa objavili informácie o tom, že s ich používaním sú spojené poruchy funkcií obličiek (Jonathan R. Green, Yves Seltenmeyer, Knút A. Jaeggi a Leo Wildler, Renal Tolerability Profile of Novel, Potent Bisphosphonates in Two Short-Term Rat Model, Pharmacology and Toxicology, 1997, 80, 225-230). V prípade podávania kalcitonínu je dosiahnuté zvýšenie kostnej denzity bohužiaľ len dočasné. Taktiež sú správy o tom, že prerušenie podávania kalcitonínu môže spôsobiť regresiu choroby, zatiaľ čo účinnosť kalcitonínu živočíšneho pôvodu (nie však humánneho) sa môže pri prolongovanom podávaní znížiť. Dôvodom sú cirkulujúce protilátky proti kalcitonínu v ľudskom tele (S.L.

Cuevas a E. Losadda,

Procel, J.A. Cumplido, B. Anaphylaxis to calcitoni, 2000, 28(4), 243-245).

dela Hoz, M.

Allergologie et Immunopathologie,

Ako bolo vyššie uvedené, osteoklasty hrajú dôležitú úlohu v kostnej resorpcii, ktorá je dôležitým faktorom zaisťujúcim zvýšenie hladiny kalcia v krvi. Predpokladá sa, že žiaden z vyššie uvedených liečebných prípravkov nemá vplyv na potlačenie tvorby osteoklastov. Dôsledkom toho je, že žiaden z bežne užívaných liečivých prípravkov nie je vhodný na dôkladnú liečbu chorôb metabolizmu kostí. Dostupné liečivá sú schopné len preliečiť symptómy, ale nie sú schopné ovplyvniť príčinu ochorenia. Úplne recentne bolo zistené, že OCIF je endogénny proteín, ktorý inhibuje diferenciáciu prekurzorov osteoklastov na osteoklasty a/alebo inhibuje kostnú resorpciu spôsobenú zrelými osteoklastmi (pozri WO-A-96/26 217 a EP-A-0 816 380). OCIF je známy aj pod názvom osteoprotegerin (pozri WO-A-97/23 614). Vzhľadom na to, že všetky vyššie uvedené choroby .metabolizmu' kostí, ako napríklad hyperkalcémia,. osteoporóza a reumatoidná artritída sú podložené určitým stupňom kostnej resorpcie, bol predpoklad, že tieto choroby možno úspešne liečiť pomocou OCIF, vďaka jeho schopnosti potláčať tvorbu osteoklastov ako takých a/alebo potláčať resorpčnú aktivitu zrelých osteoklastov. OCIF je bázický proteín, ktorého izoelektrický bod sa pohybuje okolo 9 a po podaní je z krvného obehu veľmi rýchlo eliminovaný. Pokus vyriešiť tento problém je uvedený v WO-A-2000/24 416 a EP-A-1 127

578, kde bolo pomocou polysacharidu, ktorým je napríklad heparín alebo dextránsulfát, podaného spolu s OCIF dosiahnuté predĺženie cirkulácie OCIF v krvnom obehu. Avšak predĺženie retenčného času dosiahnuté týmto spôsobom nie je dostatočné na· používanie tejto zlúčeniny ako účinnej látky na liečbu metabolických chorôb kosti, ktorými sú napríklad hyperkalcémia, osteoporóza a reumatizmus. Je teda potrebné pripraviť zlepšený prípravok, ktorý umožní predĺženie retenčného času OCIF v krvnom obehu po jeho podaní.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález uvádza prípravok obsahujúci OCIF, ktorý po podaní umožní predĺženie retenčného času OCIF v krvnom riečišti. Prípravok vynálezu sa vyznačuje zvýšeným a predĺženým efektom OCIF v liečbe a profylaxii chorôb metabolizmu kostí, ktoré sú spôsobené osteoklastmi, ako je napríklad hyperkalcémia, osteoporóza a reumatizmus.

Ďalšie charakteristiky a výhody prípravku budú ozrejmené v ďalšom opise.

Predkladaný vynález predstavuje komplex skladajúci sa z aspoň jednej látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty, pričom táto látka je naviazaná na aspoň jednu látku vybranú zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy a ich deriváty.

Predkladaný vynález opisuje aj metódu na predĺženie retenčného času OCIF alebo jeho analógu alebo variantu v krvnom riečišti pacienta po podaní komplexu obsahujúceho aspoň jeden OCIF, jeho analóg alebo variant a aspoň jeden polysacharid alebo jeho variant.

Predkladaný vynález tiež predstavuje farmaceutický prípravok obsahujúci účinné množstvo farmaceutický aktívnej látky a nosič alebo rozpúšťadlo, pričom uvedená farmaceutický aktívna látka je komplexom skladajúcim sa z aspoň jednej látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty, ktorá je naviazaná na aspoň jednu látku vybranú zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy a ich deriváty. Konkrétne vynález predkladá farmaceutický prípravok na liečbu a profylaxiu metabolických chorôb kostí.

Predkladaný vynález taktiež predstavuje metódu liečby alebo profylaxie metabolických chorôb kostí u pacientov, ktorým bola podaná účinná dávka komplexu skladajúceho sa z aspoň jednej látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty, ktorá je naviazaná na aspoň jednu látku vybranú zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy a ich deriváty.

Predkladaný vynález predstavuje aj použitie komplexu skladajúceho sa z aspoň jednej látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty, ktorá je naviazaná na aspoň jednu látku vybranú zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy a ich deriváty. Tento komplex je pripravený tak, aby slúžil ako liečivo na profylaxiu alebo liečbu chorôb kostného metabolizmu.

Zistilo sa, že inkubáciou aspoň jednej látky vybranej zo skupiny OCIF, jeho analógov alebo variantov, š aspoň jednou látkou vybranou zo skupiny polysacharidov a ich derivátov, v podmienkach vhodných na tvorbu komplexov, v ktorých jedna alebo viac látok zo skupiny OCIF, jeho analógov alebo variantov je naviazaná na aspoň jednu látku zo skupiny polysacharidov alebo ich derivátov, vzniká látka, ktorá sa vyznačuje zvýšeným a predĺženým účinkom OCIF, jeho analógov alebo derivátov v liečbe a profylaxii chorôb metabolizmu kosti súvisiacich činnosťou osteoklastov, akými sú napríklad hyperkalcémia, osteoporóza a reumatizmus. Aktivita komplexu súvisí s faktom, že retenčný čas OCIF, jeho analógov alebo variantov v krvnom riečišti po podaní pacientovi je predĺžený, v porovnaní s pôvodnými prípravkami obsahujúcimi OCIF a polysacharid, uvedenými v patentoch WO-A-2000/24 416 a EP-A-1 127 578.

Ako bolo uvedené vyššie, zlúčenina predkladaného vynálezu obsahuje aspoň jednu látku vybranú zo skupiny OCIF, jeho analógov alebo variantov, ktorá je naviazaná na aspoň jednu látku vybranú zo skupiny polysacharidov alebo ich derivátov. V uvedenom komplexe je OCIF naviazaný na polysacharid väzbou, ktorou je napríklad kovalentná väzba (napr. tvorba Schiffovej bázy), iónová väzba alebo koordinačná väzba, alebo nechemická väzba, ako je napríklad hydrofóbna interakcia, vodíkový mostík, elektrostatická interakcia alebo afinitná väzba.

OCIF, jeho analógy a varianty použité v predkladanom vynáleze sú prírodného pôvodu alebo sú rekombinantného pôvodu, pričom ich pôvod nie je nijako obmedzený. OCIF prírodného pôvodu sú látky, ktoré sú produkované ako prirodzené proteíny a sú získavané extrakciou, purifikáciou a/alebo izolovaním z orgánov, telových kvapalín, tkanivových kultúr alebo kultivačných médií pochádzajúcich z ľudských alebo zvieracích buniek. Rekombinantné typy OCIF, ich analógy alebo varianty sú rekombinantné proteíny, ktoré sú získavané extrakciou, purifikáciou a/alebo izolovaním z hostiteľa, ktorý je bežne používaný v týchto technológiách. Hostiteľom je spravidla prokaryontná bunka (napr. Escherichia Coli) alebo eukaryontná bunka ako napríklad ľudské alebo zvieracie tkanivové kultúry, ktoré boli transformované vektorom nesúcim kódujúcu sekvenciu OCIF, jeho analógu alebo variantu (pozri rekombinantné techniky uvedené v EP-A-0 816 380, WO-A-96/26 217 a WO-A97/23 614).

Pôvod OCIF, jeho analógov alebo variantov, použitých v predkladanom vynáleze, nie je nijako špeciálne obmedzený. Tieto látky môžu byť ľudského alebo zvieracieho pôvodu. Výhodne sú tieto látky pôvodu ľudského, krysieho, myšieho, králičieho, psieho, mačacieho, kravského, prasacieho, ovčieho alebo kozieho; alebo vtáčieho, napríklad hydinového, husieho, kuracieho alebo morčacieho. Výhodnejšie je, ak sú tieto látky cicavčieho pôvodu, výhodne ľudského.

OCIF, jeho analógy a varianty v predkladanom vynáleze sú monomérneho typu (t. j. u ľudí ide o monomér s molekulovou hmotnosťou meranou SDS-PAGE v neredukujúcich podmienkach približne 60 000 Da) alebo dimérneho typu (t.j. u ľudí ide o dimér s molekulovou hmotnosťou meranou SDSPAGE v neredukujúcich podmienkach približne 120 000 Da) (pozri EP-A-0 816 380, WO-A-96/26 217).

Je známe, že OCIF je v bunkách translatovaný ako polypeptid nesúci signálny peptid na jeho amino-konci. V priebehu maturácie uvedeného polypeptidu dochádza k odštiepeniu signálneho peptidu (pozri rekombinantné techniky v EP-A-0 816 380, WO-A-96/26 217 a WO-A-97/23 614). OCIF, jeho analóg a variant použité v predkladanom vynáleze zahŕňajú obidve formy peptidu - so signálnym peptidom, aj bez signálneho peptidu. Výhodne použitým OCIF je ten, ktorý obsahuje signálny peptid na pozíciách -21 až +380 (sekvencia č. 1 v zozname sekvencií) a maturovaný OCIF bez signálneho peptidu, teda bez aminokyselín -21 až +380 uvedených v sekvencií č. 1 v zozname sekvencií. Z týchto dvoch foriem je mimoriadne výhodný OCIF vo svojej maturovanej forme.

Taktiež je známe, že k maturovanej forme OCIF, jeho analógu alebo variantu možno pripojiť metionin. Toto je výhodné, keď je proteín exprimovaný v hostiteľovi, ako napríklad prokaryont Escherichia Coli. Pripojenie metionínu ku kódujúcej sekvencii sa uskutoční tak, že sa na 5'-koniec polynukleotidového reťazca kódujúceho maturovanú formu OCIF, jeho analóg alebo variant pridá nukleotidový triplet ATG (AUG) a vzniknutý polynukleotidový reťazec sa vloží do vhodného expresného vektora. Navyše, k aminoterminálnemu metionínu možno pripojiť ďalšie aminokyseliny tým, že sa ku

5'-koncu polynukleotidového reťazca kódujúceho OCIF, jeho analóg alebo variant pripoja ďalšie nukleotidové triplety.

V predkladanom vynáleze predstavuje analóg OCIF-u proteín kódovaný polynukleotidom, ktorý sa prirodzene vyskytuje v bunkách, telových tekutinách a/alebo v ludských alebo vyššie uvedených zvieracích orgánoch. Špecifické, výhodne použité príklady týchto analógov zahŕňajú OCIF2, OCIF3, OCIF4 a OCIF5 (pozri EP-A-0 816 380, WO-A-96/26 217). OCIF analóg alebo jeho aktívne fragmenty možno získať týmto spôsobom. RNA je extrahovaná z buniek, orgánov, tkanív alebo telových tekutín ľudského alebo zvieracieho pôvodu. Prvý reťazec cDNA je syntetizovaný s použitím RNA ako templátu pomocou DNA polymerázy.

Takto získaná dvoj reťazcová

DNA je vložená do vhodného, bežne používaného, expresného vektora.

Potom je toto natransformované do vhodného hostiteľa, ktorý je nakoniec analyzovaný pre prítomnosť očakávaného proteinu. Analýza je uskutočňovaná hybridizačnou technikou, napríklad plagovou hybridizáciou alebo fágovou hybridizáciou, pričom sa ako sonda použije OCIF cDNA alebo jej fragment. Analýza sa uskutočňuje v striktných teplotných podmienkach (pozri EPA-0 816 380, WO-A-96/26 217). Po objavení exprimujúceho klonu je očakávaný analóg OCIF exprimovaný jednou z bežných metód v hostiteľskej bunke.

V predkladanom vynáleze variant OCIF predstavuje proteín, ktorého aminokyselinová sekvencia sa od divého typu proteínu líši v jednej alebo niekoľkých aminokyselinách. Tieto aminokyseliny sú substituované, deletované alebo inzerované do sekvencie divého typu OCIF alebo jeho analógu. Tieto proteíny majú určitú OCIF aktivitu. Tieto OCIF varianty možno získať napríklad pomocou substitúcie, delécie, inzercie jedného alebo viacerých nukleotidov do nukleotidovej sekvencie OCIF alebo jeho analógu pomocou polymerázovej reťazovej reakcie(PCR), genetických rekombinančných metód pomocou reštrikčných endonukleáz a potom transformácia eukaryotickej bunky alebo prokaryotickej hostiteľskej bunky, ako napríklad Escherichia Coli pomocou expresného vektora nesúceho sekvenciu očakávaného variantu OCIF proteínu. Ďalším krokom je extrakcia, purifikácia a/alebo izolácia očakávaného peptidu z proteínovej frakcie bunkovej kultúry alebo transformovanej hostiteľskej bunky bežnými molekulárnymi technikami.

Skrátené formy OCIF, z ktorých bola deletovaná značná časť aminokyselinovej sekvencie z karboxy-konca sa tiež vyznačuje určitou formou aktivity (pozri EP-A-0 816 380, WO-A-96/26 217 a WO-A-97/23 614). Tieto skrátené typy OCIF, ktoré majú aspoň časť aktivity kompletného OCIF polypeptidu sú taktiež súčasťou OCIF variantov predkladaného vynálezu.

Ďalej OCIF alebo jeho skrátená forma, ktorá je fúzovaná s imunoglobulínovou doménou, ako napríklad Fc fragment (napr. fúzny polypeptid, v ktorom Fc fragment ľudského IgG je napojený na karboxy-koniec OCIF) a ktorá má aspoň nejakú aktivitu kompletného OCIF polypeptidu je známa (WO-A-97/23 614) a tieto fúzne proteíny sú taktiež zahrnuté ako OCIF varianty predkladaného vynálezu.

Taktiež bolo zistené, že OCIF alebo jeho analógy alebo varianty možno chemicky modifikovať a že si zachovávajú užitočnú aktivitu a v niektorých prípadoch majú niektoré výhody, ako napríklad zvýšenú stabilitu alebo zníženú imunogenicitu. Tieto chemické modifikácie zahŕňajú derivatizáciu na jednom mieste molekuly OCIF, jeho analógu alebo variantu, alebo na viacerých miestach. Napríklad sa zistilo, že OCIF a varianty (deriváty), akými sú skrátené formy, možno chemicky modifikovať pomocou jedného alebo viacerých, vo vode rozpustných polymérov, ako je napríklad polyetylénglykol, kopolymérov etylénglykol/propylénglykol, karboxymetylcelulózy a polyvinylalkoholu. Takto vzniknuté zlúčeniny sa vyznačujú zlepšenými biologickými vlastnosťami (pozri WO-A-97/23 614). Takto chemicky modifikované typy OCIF alebo jeho analógu alebo variantu sú taktiež zahrnúté v OCIF variantoch predkladaného vynálezu.

Príklady známych OCIF variantov, ktoré sú vhodné na použitie v príprave komplexov predkladaného vynálezu zahŕňajú: OCIF-C19S, OCIF-C20S, OCIF-C21S, OCIF-C22S, OCIFC23S, OCIF-DCR1, OCIF-DCR2, OCIF-DCR3, OCIF-DCR4, OCIFDDD1, OCIF-DDD2, OCIF-CL, OCIF-CC, OCIF-CDD2, OCIF-CDD1, OCIF-CCR4, OCIF-CCR3, OCIF-CBst, OCIF-CSph, OCIF-CBsp, OCIF-CPst [pozri EP-A-0 816 380 (WO-A-96/26 217)], muOPG[22401J-FC, muOPG[22-194]-Fc, muOPG[22-185]-Fc, muOPG[22-180]-Fc, muOPG[22-401], muOPG[22-401]C195, muOPG[22-401]C202, muOPG[22401JC277, muOPG[22-401]C319, muOPG[22-401]C400, muOPG[22-185], muOPG[22-194], muOPG[22-200], muOPG[22-212], muOPG[22-293], muOPG[22-355], huOPG[22-401]-Fc, huOPG[22-201]-Fc, huOPG[22401]-Fc P26A, huOPG[22-401]-Fc Y28F, huOPG[22-401], huOPG[27401]-Fc, huOPG[29-401]-Fc, huOPG[32-401]-Fc, muOPG met[22-194] 5k PEG, muOPG met[22-194]20k PEG, huOPG met[22-194]P25A, huOPG met[22-194]P25A 5k PEG, huOPG met[22-194]P25A 20k PEG, huOPG met[22-194]P25A 31k PEG, huOPG met[22-194]P25A 57k

PEG, huOPG met[22-194]P25A 12k PEG, ’ huOPG met[22-194]P25A

20k vetvený PEG, huOPG met[22-194]P25A 8k PEG dimér, huOPG met[22-194]P25A disulfidový kroslink (WO-A-97/23614) , OPG [22-194J-FC, OPG[22-201]-Fc, OPG[22-194]-Fc Δ C, OPG[22-201]Fc Δ C, OPG[22-194]-FcGio, metFc Δ C-OPG[22-194] (WO-A2001/17 543), OPG[22-194]-Fc Δ C, OPG[22-194]-FcGi₀, Fc Δ COPG[22-194], metFc Δ C-OPG[22-194], metFc Δ C-22-194, OPG[22194]-Fc, OPG[22-194]-Fc Δ C, metOPG[22-l 94], metOPG[22-201],

OPG[22-293], OPG[22-401] a metFc Δ C-22-194 (WO-A-2001/18

203) .

Výhodne použité príklady zahŕňajú: OCIF-C19S, OCIFC20S, OCIF-C21S, OCIF-C22S, OCIF-C23S, OCIF-DCR1, OCIFDCR2, OCIF-DCR3, OCIF-DCR4, OCIF-DDD1, OCIF-DDD2, OCIF-CL,

OCIF-CC, OCIF-CDD2, OCIF-CDD1, OCIF-CCR4,

OCIF-CCR3, OCIFCBst, OCIF-CSph,

OCIF-CBsp, OCIF-CPst, muOPG[22-401]-Fc, muOPG[22-194]-Fc, muOPG[22-185]-Fc, muOPG[22-401]C195, muOPG[22-401]C202, muOPG[22-401]C319, muOPG[22-401]C400, muOPG[22-194], muOPG[22-200], muOPG[22-293], muOPG[22-355], huOPG[22-401]-Fc, huOPG[22-201]-Fc, huOPG[22-4 01]-Fc P26A, huOPG[22-401]-Fc Y28F, huOPG[22-401], huOPG[27-401]-Fc, huOPG[29-401]-Fc, huOPG[32-401]-Fc, muOPG met[22-194] 5k PEG, muOPG met[22-194]20k PEG, huOPG met[22-194]P25A 5k PEG, huOPG met[22-194]P25A 20k PEG, huOPG met[22-194]P25A 31k

PEG, huOPG met[22-194]P25A 57k PEG, huOPG met[22-194]P25A 12k PEG, huOPG met[22-194]P25A 20k vetvený PEG, huOPG met[22-194]P25A 8k PEG dimér, huOPG met[22-194]P25A disulfidový kroslink, OPG [22-194]-Fc, OPG[22-201]-Fc, OPG[22-194]-Fc Δ C, OPG[22-201]-Fc Δ C, OPG[22-194]-FcG₁₀, metFc Δ C-OPG[22-194], OPG[22-194]-Fc Δ C, OPG[22-194]-FcGi₀, Fc Δ C-OPG[22-194], metFc Δ C-OPG[22-194], metFc Δ C-22-194,

OPG[22-194]-Fc, OPG[22-194]-Fc Δ C, metOPG[22-194], metOPG[22

201], OPG[22-293], OPG[22-401] a metFc Δ C-22-194.

OCIF, jeho analóg alebo variant v predkladanom vynáleze obsahuje cukrový reťazec ako súčasť molekuly. Akýkoľvek prirodzene sa vyskytujúci OCIF, jeho analóg alebo variant a akýkoľvek rekombinantný OCIF, jeho analóg alebo variant môže obsahovať cukrový reťazec, ktorý je pripojený na OCIF alebo jeho analóg alebo variant posttranslačne. Prirodzene produkované OCIF alebo ich analógy alebo varianty obsahujúce cukrový reťazec možno získať bežnými technikami z bunkových línií, tkanív, orgánov, telových tekutín alebo bunkových línií odvodených od ľudských alebo zvieracích buniek. Rekombinantný OCIF alebo jeho analóg alebo variant obsahujúci cukrový reťazec možno získať z kultúry eukaryontných hostiteľských buniek transformovaných vektorom, ktorý nesie nukleotidovú sekvenciu kódujúcu OCIF alebo jeho analóg uvedený a opísaný buniek, ktoré sú alebo variant, vyššie. schopné alebo rovnakým postupom, ako bol

Príklady vhodných hostiteľských posttranslačne modifikovať OCIF variant tým, že pripoja cukrový a COS bunky 139, 1329alebo jeho analóg reťazec, zahŕňajú bunky ovárií čínskeho škrečka et al., Endocrinology, 1998, jeho analóg alebo variant sú vhodné na tvorbu (pozri Yasuda, H. 1337). OCIF alebo cukrový reťazec obsahuj úci komplexov v predkladanom vynáleze.

V prípade, že je potrebné pripraviť rekombinantný OCIF alebo jeho analóg alebo variant, ktorý nesie cukrový reťazec pripojený v procese posttranslačnej modifikácie, je výhodne použitým hostiteľom prokaryontná bunka, ako napr. Escherichia Coli.

Polysacharid použitý na prípravu komplexov v predkladanom vynáleze je polymérnym glykánom pripraveným glykozidovou väzbou dvoch alebo viacerých monosacharidov a je výhodne heteropolysacharidom (heteroglykánom), pozostávajúcim z aspoň dvoch rôznych druhov monosacharidov. Akýkoľvek polysacharid, buď prirodzene sa vyskytujúci alebo syntetický možno použiť na prípravu komplexov predkladaného vynálezu.

V predkladanom vynáleze je derivátom polysacharidu polysacharid, v ktorom aspoň časť polysacharidu je substituovaná jednou alebo viacerými molekulami alebo zvyškami inými než sacharid. Výhodne použité deriváty zahŕňajú kyslé estery polysacharidov a mimoriadne výhodnými sú sulfátové estery polysacharidov.

Príklady prírodných polysacharidov vhodných na použitie pri príprave komplexov v predkladanom vynáleze zahŕňajú kyselinu hyalurónovú, kyselinu chondroitinsírovú, kyselinu dermatánovú, kyselinu heparánovú, kyselinu keratánovú, karagenan, pektín a heparín. Príklady syntetických polysacharidov vhodných na použitie pri príprave komplexov v predkladanom vynáleze zahŕňajú dextrán, zatiaľ čo príklady vhodných derivátov syntetických polysacharidov zahŕňajú dextránsulfát. Z polysacharidov a ich derivátov je najvýhodnejším na použitie pri príprave komplexov v predkladanom vynáleze dextránsulfát.

V predkladanom vynáleze polysacharidy a ich deriváty, napríklad dextránsulfát, zahŕňajú aj ich soli. Najvýhodnejšou soľou dextránsulfátu je jeho sodná soľ. Príklady sodných solí dextránsulfátu zahŕňajú sodnú soľ dextránsulf átu síra 5 (z toho skratka DS5; výrobok firmy Meito Sangyo Co., Ltd.), sodnú soľ dextránsulfátu 5000 a sodnú soľ 10000 (obidve sú vyrobené firmou Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

Molekulová hmotnosť dextránsulfátu sa určí týmto spôsobom:

1. Meraním molekulovej hmotnosti dextránu

Molekulová hmotnosť dextránu sa vypočíta pomocou nižšie uvedenej Šatovej rovnice (pozri Manual for

Pharmacopoeia of Japan, 13^th revision, Hirokawashoten,

1998, kapitola týkajúca sa. dextránu 40). Určenie molekulovej hmotnosti je založené na meraní viskozity dextránu.

Limitujúca viskozita = 9.00 x 10’⁴ x molekulová hmotnosť^0-50

2. Meraním obsahu síry

Obsah síry konkrétneho dextránsulfátu sa meria ako hmotnostné percento ktoroukoľvek známou technikou, napríklad metódou opísanou v kapitole, ktorá sa týka sodnej soli dextránsulfátu síra 5 vo Pharmacopoeia of Japan (14^threvision, Jihou, 2001).

Zatiaľ čo molekulová hmotnosť glukózy, ktorá tvorí základ dextránu, je 180, skutočná molekulová hmotnosť glukózovej jednotky v molekule dextránu je 162. Táto hodnota je výsledkom subtrakcie molekulovej hmotnosti vody od 180, pretože susedné jednotky glukózy sú v molekule dextránu pomocou a-1,6 glykozidovej väzby. Atóm vodíka je nahradený skupinou sulfátu sodného (SO₃Na, jeden gramekvivalent je 103) v každej jednotke glukózy dextránsulfátu, ktorý je týmto spôsobom substituovaný. Pomocou týchto údajov možno stupeň substitúcie molekuly dextránsulfátu (nazývané ako stupeň substitúcie) vyjadriť nižšie uvedeným vzťahom:

Obsah síry (hmotn.%) = [32 x stupeň substitúcie/(162 + 102 x stupeň substitúcie)J x 100

3. Výpočtom molekulovej hmotnosti dextránsulfátu

Ako bolo uvedené vyššie, molekulová hmotnosť jednotky glukózy v dextránsulfátovom reťazci je 162. Z tohto údaja možno vypočítať molekulovú hmotnosť dextránsulfátu a stupeň substitúcie uvedený v bode 2. a to nasledovnou rovnicou:

Molekulová hmotnosť dextránsulfátu = molekulová hmotnosť dextránu x (162 + 102 x stupeň substitúcie)/162

Je známe, molekulových dextránsulfátu že polysacharidy sa vyznačujú hmotností, napríklad každý konkrétne rozloženie distribúciou má hmotnosti. Molekulová prípravu priemerná hmotnosť komplexov v molekulová iný typ molekulovej použitého na sa uvádza ako hmotnosť polysacharidu predkladanom vynáleze : hmotnosť. Priemerná molekulová polysacharidov v predkladanom vynáleze nie je žiadnym spôsobom limitovaná. Rozsah molekulovej hmotnosti najvýhodnejších derivátov polysacharidov predkladaného vynálezu: dextránsulfát má všeobecne molekulovú hmotnosť od 1500 do 12000, výhodne od 1800 do 6000. Molekulová hmotnosť štandardná odchýlka) DS5 je približne 1950 ± 70 (n

Stupeň odchýlka) v DS5, substitúcie síry (priemer ± počítaný ako bolo uvedené štandardná vyššie, je približne

0, 32

0,01 (a

7). Priemerná molekulová sodnej dextránsulfátu hmotnosť sodnej soli

10000 je približne 5000 a 10000.

soli dextránsulfátu 5000 a

Polysacharidy použité na prípravu komplexov v predkladanom vynáleze možno použiť bez akejkoľvek ďalšej purifikácie a/alebo frakcionácie. Polysacharidy alebo ich deriváty v predkladanom vynáleze neobsahujú žiaden cukrový reťazec, ktorý je posttranslačne pripojený na rekombinantný OCIF alebo jeho analógy alebo varianty, alebo na prirodzene, endogénne v bunkách sa vyskytujúci OCIF, alebo jeho analógy alebo varianty.

Molekulárny pomer látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty k látke vybranej zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy a ich deriváty v komplexoch predkladaného vynálezu variruje v závislosti od rôznych faktorov. Tieto zahŕňajú charakteristiky jednotlivých zložiek komplexov a podmienky, v ktorých bol konkrétny komplex pripravený. Molekulárny pomer látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty k látke vybranej zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy a ich deriváty v komplexoch predkladaného vynálezu nie je nijako obmedzený. Výhodne použité komplexy skladajúce sa z látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty a dextránsulfátu majú molekulárny pomer jednotlivých zložiek (látka vybraná zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty : dextránsulfát) 1:1 až 1:10, výhodne 1:1 až 1:8, výhodnejšie od 1:1 do 1:5. Avšak najvýhodnejší molekulárny pomer jednotlivých zložiek je 1:1 až 1:4,5.

Ako bolo uvedené vyššie, OCIF, jeho analóg alebo variant môže existovať vo forme monoméru alebo tvorí diméry, takže napríklad OCIF, jeho analógy alebo varianty vyskytujúce sa v predkladanom vynáleze môžu tvoriť homodimér alebo heterodimér, homooligomér, heterooligomér, homopolymér alebo heteropolymér obsahujúci viac než dve monomérne jednotky OCIF-u alebo jeho analógu alebo jeho variantu (pozri US 6 369 027). Molekulárny pomer látky vybranej zo skupiny OCIF, jeho analógy alebo varianty a látky vybranej zo skupiny polysacharidov a ich derivátov v komplexe obsahujúcom OCIF, jeho analógy alebo varianty a látku vybranú zo skupiny polysacharidov a ich derivátov v predkladanom vynáleze sa počíta ako počet molekúl polysacharidu alebo jeho derivátu na monomerickú jednotku OCIF, jeho variantu alebo analógu.

Počet molekúl polysacharidu alebo jeho derivátov v komplexoch predkladaného vynálezu možno výhodne určiť nasledovným spôsobom: obsah neutrálnych cukrov testovaného komplexu (označené ako x) a obsah neutrálnych cukrov referenčnej vzorky, ktorá obsahuje len nekomplexované, volné OCIF, jeho analógy alebo varianty (označené ako y) sa kvantifikujú pomocou metódy založenej na fenolsírovej kyseline (táto metóda je detailne opísaná na inom mieste predkladaného vynálezu). Množstvo polysacharidu alebo derivátov, ktoré je naviazané na OCIF, jeho analóg alebo variant v testovanom komplexe je potom určené odčítaním y od x. Pomocou čísla, ktoré sa týmto spôsobom získa, možno vypočítať počet molekúl polysacharidu alebo jeho derivátu, ktoré sú naviazané na OCIF, jeho analóg alebo variant, týmto spôsobom:

1. číslo reprezentujúce množstvo polysacharidu alebo jeho derivátu, ktoré je naviazané na OCIF, jeho analóg alebo variant sa delí priemernou molekulovou hmotnosťou uvedeného polysacharidu alebo jeho derivátu. Výsledné číslo predstavuje celkový počet molekúl polysacharidu alebo jeho derivátu v testovanom komplexe.

2. číslo reprezentujúce množstvo polysacharidu alebo jeho derivátu, ktoré je naviazané na OCIF, jeho analóg alebo variant sa delí množstvom (mg) uvedeného OCIF, jeho analógu alebo variantu v uvedenom komplexe. Výsledné číslo, ktoré predstavuje množstvo polysacharidu alebo jeho derivátu na 1 mg OCIF, jeho analógu alebo variantu v komplexe, je potom použité na výpočet počtu molekúl polysacharidu alebo jeho derivátu na jednu molekulu OCIF, jeho analógu alebo variantu, na základe priemernej molekulovej hmotnosti uvedeného polysacharidu alebo jeho derivátu a molekulovej hmotnosti uvedeného OCIF, jeho analógu alebo variantu (napr. podľa nižšie uvedeného príkladu 4d).

Počet molekúl OCIF, jeho analógov alebo variantov v komplexe možno výhodne určiť pomocou imunoštúdií, ako napríklad tými, ktoré sú opísané na inom mieste v predkladanom vynáleze.

Výhodnou charakteristickou vlastnosťou komplexov predkladaného vynálezu je ich afinita k heparínu. Heparín je polysacharid obsahujúci D-glukózamín, d-glukurónovú kyselinu a D-idurónovú kyselinu, ktoré sú čiastočne alebo úplne derivatizované sulfátovými a acetylovými skupinami.

Výhodnou charakteristickou vlastnosťou komplexov predkladaného vynálezu je, že sila absorpcie uvedených komplexov s OCIF, jeho analógmi alebo variantmi na heparin je nižšia ako sila absorpcie voľných, nekomplexovaných OCIF, jeho analógov alebo variantov. Stupeň absorpcie možno určiť pomocou kolóny s vysoko cross-linkovanými agarózovými guličkami, na ktorých je imobilizovaný heparin (napr. heparin z hovädzej črevnej mukózy). Vhodnými kolónami uvedeného typu sú HiTrap heparinová HP kolóna, HiPrep 16/10 Heparin a Heparin Sepharose (všetky uvedené kolóny sú od firmy Amersham Pharmacia). Sila absorpcie (afinita) komplexu sa určí ktoroukolvek vhodnou, v odbore známou metódou, ktorá je vhodná na určenie afinity proteínu na polysacharid. Výhodne možno určiť stupeň absorpcie porovnaním množstva komplexu, ktoré sa viaže na heparínovú kolónu v podmienkach nízkej iónovej sily, ale ktoré je z uvedenej kolóny v podmienkach vysokej iónovej sily eluované, s množstvom komplexov, ktoré sa neviaže na heparínovú kolónu v podmienkach nízkej iónovej sily (iónová sila sa nastaví pomocou soli silnej kyseliny, napríklad chloridom sodným). Typicky možno stanoviť stupeň adsorpcie komplexu na heparin nasledovným spôsobom:

a) Kolóna naplnená cross-linkovanými agarózovými guličkami, na ktorých je imobilizovaný heparin, je ekvilibrovaná pufrom s relatívne nízkou iónovou silou (napr. sodno-fosfátový pufer obsahujúci 0,1 až 0,8 M chlorid sodný).

b) Komplex predkladaného vynálezu, ktorý sa bude testovať je rozpustený v rovnakom pufri s nízkou iónovou silou, ako v bode a) a nanesený na kolónu. Následne je odobraná prvá elučná frakcia (A).

c) Kolóna je potom prepláchnutá rovnakým pufrom s nízkou iónovou silou, aký bol použitý v kroku (a) . Následne je odobraná druhá elučná frakcia (B).

d) Kolóna je potom prepláchnutá pufrom s relatívne vysokou iónovou silou (napr. sodno-fosfátový pufer obsahujúci 1,0 až 2,0 M chlorid sodný). Následne je odobraná tretia elučná frakcia (C).

e) Množstvo komplexov vyskytujúcich sa v každej z elučných frakcií A, B, C /označené (a), (b) a (c)/ je potom stanovené napr. imunoštúdiou.

f) Stupeň adsorpcie komplexov na heparín je potom stanovený podľa nasledovného vzťahu:

stupeň adsorpcie = (c)/(a) + (b) + (c)

Čím väčšia je sila väzby komplexov na kolónu, tým väčšia je hodnota (c) (pretože ich možno z kolóny odstrániť pomocou eluátov s relatívne vysokou iónovou silou) a tým väčší je stupeň adsorpcie. Stupeň adsorpcie komplexov predkladaného vynálezu, stanovený pomocou vyššie uvedeného vzťahu, do určitej miery varíruje v závislosti od typu heparinovej kolóny a podmienok, v ktorých sa stanovenie väzby uskutočňuje. Avšak stupeň adsorpcie voľných nekomplexovaných OCIF je vždy okolo 1,0, zatiaľ čo stupeň adsorpcie komplexov OCIF predkladaného vynálezu je menej ako 1,0. To demonštruje, že sila väzby komplexov obsahujúcich OCIF, jeho analóg alebo variant na heoarín je nižšia, ako sila väzby voľných nekomplexovaných OCIF, analógov alebo variantov (napr. pomocou prasačieho heparínu imobilizovaného na agarózových guličkách, ako napríklad HiTrap heparínová HP kolóna, prvá a druhá elúcia pomocou 10 mM sodno-fosfátového pufra obsahujúceho 0,7 M chlorid sodný a tretia elúcia pomocou 10 mM sodno-fosfátového pufra obsahujúceho 2,0 M chlorid sodný, stupeň adsorpcie komplexov predkladaného vynálezu obsahujúcich OCIF, jeho analógy alebo varianty nie je väčší ako 0,7, výhodne nie je väčší ako 0,6 a najvýhodnejšie nie je väčší ako 0,5).

Ďalším výhodným charakteristickým znakom komplexov predkladaného vynálezu je pomer počtu molekúl OCIF, jeho analógov alebo variantov, ktoré sa vyskytujú v uvedenom komplexe, meraný imunotestom (napr. ELISA), k počtu molekúl OCIF, jeho analógov alebo variantov, ktoré sa vyskytujú v uvedenom komplexe, meraný technikou vhodnou na stanovenie celkového množstva proteínu, ktoré sa vyskytuje v uvedenom komplexe (napr. Lowryho metóda: Lowry, O.H. et al., J. Biol. Chem., 1951, 193, 265-275, absorbancia pri 280 nm, farbenie striebrom alebo BCA metóda) .

Počet molekúl OCIF, jeho analógov alebo variantov, ktoré sa vyskytujú v uvedených komplexoch možno stanoviť pomocou imunoštúdie, napríklad testom ELISA. Protilátky pre väzbu na imobilizovanú fázu a na farbenie reportérovým enzýmom, napríklad peroxidáza na použitie v ELISA technike, sú akékoľvek protilátky proti OCIF, jeho analógom alebo variantom, ktoré sú vhodné na tieto účely. Vhodné protilátky pre väzbu na pevnú fázu zahŕňajú napríklad 0126, purifikovanú z hybridómovej kultúry produkujúcej protilátku 01-26 (FERM BP-6 421) a 01-19, purifikovanú z hybridómovej kultúry produkujúcej protilátku 01-19 (FERM BP-6 420), zatiaľ čo vhodnou značenou protilátkou s reportérovým enzýmom v mobilnej fáze je napríklad monoklonálna protilátka proti ľudskému OCIF OI-4, purifikovaná z hybridómovej kultúry produkujúcej protilátku 01-4 (FERM BP-6 419), ktorá je nakoniec konjugovaná peroxidázou. Typický postup merania počtu molekúl OCIF, jeho analógov alebo variantov v komplexe je napríklad tento:

a) Známe koncentrácie voľných nekomplexovaných OCIF sú použité na zostrojenie kalibračnej krivky.

b) Pomocou testu ELISA a následným porovnaním s kalibračnou krivkou je stanovená koncentrácia OCIF.

c) Pomocou výsledku z (b) a molekulovej hmotnosti OCIF monomérov sa vypočíta počet molekúl OCIF v testovanom komplexe.

Počet molekúl OCIF, jeho analógov alebo variantov,

I ktoré sa vyskytujú v uvedenom komplexe, meraný technikou na zistenie celkového množstva proteínu v komplexe možno stanoviť napríklad Lawryho metódou. Typický postup je napríklad tento:

a) Známa koncentrácia hovädzieho sérového albumínu sa použije na zostrojenie kalibračnej krivky.

b) Lowryho metóda sa použije na určenie celkovej koncentrácie proteínu v testovanom komplexe a na stanovenie koncentrácie OCIF sa použije kalibračná krivka z (a).

c) Pomocou výsledku z (b) a molekulovej hmotnosti OCIF monomérov možno vypočítať počet molekúl OCIF v testovanom komplexe.

Skutočný pomer varíruje v závislosti od typu imunoštúdie a/alebo testu použitého na meranie celkového proteínu. Výhodne použitou zlúčeninou predkladaného vynálezu je komplex skladajúci sa z OCIF, jeho analógu alebo variantu ludského pôvodu, s dextránsulfátom, kde pomer počtu molekúl uvedeného OCIF, alebo analógu alebo jeho variantu v uvedenom komplexe, ako bolo stanovené imunoštúdiou (ELISA) pomocou monoklonálnej protilátky proti ľudskému OCIF 01-19, purifikovanej z hybridómovej kultúry produkujúcej protilátku 01-19 (FERM BP-6 420), zatial čo vhodnou značenou protilátkou s reportérovým enzýmom v mobilnej fáze je napríklad monoklonálna protilátka proti ľudskému OCIF OI-4, purifikovaná z hybridómovej kultúry produkujúcej protilátku 01-4 (FERM BP-6 419), ktorá je

I nakoniec konjugovaná s peroxidázou, k počtu molekúl OCIF, jeho analógov alebo variantov v uvedených komplexoch, ako bolo stanovené Lowryho metódou, aspoň 0,5, ale nie viac ako

1,2. Výhodnejším je pomer aspoň 0,6, ale nie viac ako 1,1 a najvýhodnejší pomer je aspoň 0,7, ale nie viac ako 1,1.

Výhodne použité zahŕňajú nasledovné: a) komplex obsahujúci zahŕňajúcej OCIF, ľudským monomérnym zmerané pomocou približne 60000, molekulovou hmotnosťou, komplexy predkladaného vynálezu skupiny ktorá je ako bolo látku vybranú zo jeho analógy alebo varianty,

OCIF s molekulovou hmotnosťou,

SDS-PAGE v neredukujúcich podmienkach alebo je ľudským dimérnym ako bolo zmerané pomocou podmienkach približne jeho deriváty, ktoré sú vybrané zo kyselinu kyselinu keratánovú, karagenan, ich deriváty; molekulový pomer skupiny zahŕňajúcej látke vybranej ich deriváty je od obsahujúci látku

OCIF s

SDS-PAGE hyalurónovú, dermatánovú,

120000;

v neredukujúcich a polysacharid alebo skupiny zahŕňajúcej chondroitinsirovú, heparánovú, kyselinu heparin, dextrán a látky vybranej alebo varianty polysacharidy a b) komplex zahŕňajúcej OCIF, ľudským monomérnym zmerané pomocou približne 60000, molekulovou hmotnosťou, zo zo

1:1 kyselinu kyselinu pektín, uvedenej analógy

OCIF, jeho skupiny zahŕňajúcej do 1:10.

skupiny ktorá je ako bolo vybranú zo jeho analógy alebo varianty, OCIF s molekulovou hmotnosťou,

SDS-PAGE v neredukujúcich podmienkach alebo je ľudským dimérnym OCIF s ako bolo zmerané pomocou SDS-PAGE v neredukujúcich podmienkach približne 120000;

polysacharidy alebo ich deriváty, ktoré sú vybrané zo skupiny zahŕňajúcej dextránsulfát a jeho soli; molekulový pomer uvedenej látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty k látke vybranej zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy a ich deriváty je od 1:1 do 1:10. c) komplex, kde uvedená látka vybraná zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty je ľudský monomérny alebo dimárny OCIF, v ktorom monomér alebo alebo jedna jednotka OCIF diméru obsahuje aminokyseliny +1 až +380 podľa sekvencie č. 1 uvedenej v zozname sekvencií, a derivát polysacharidu je sodná soľ dextránsulfátu s priemernou molekulovou hmotnosťou od 1500 do 12000, molekulový pomer látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty k sodnej soli dextránsulfátu je od 1:1 do 1:10.

d) komplex podľa (c), kde molekulový pomer látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty k sodnej soli dextránsulfátu je od 1:1 do 1:10.

e) komplex podľa (c), kde molekulový pomer látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty k sodnej soli dextránsulfátu je od 1:1 do 1:5.

f) komplex podľa (c) až (d) , kde derivát polysacharidu je sodnou soľou dextránsulfátu s priemernou molekulovou hmotnpsťou od 1800 do 6000.

Komplexy predkladaného vynálezu sa pripravia ktoroukoľvek z vhodných metód, ktoré umožňujú väzbu polysacharidu alebo jeho variantov na OCIF alebo jeho analógy alebo varianty. Ďalším dôležitým prvkom predkladaného vynálezu je spôsob prípravy komplexov obsahujúcich aspoň jednu látku vybranú zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty, ktorý je naviazaný na aspoň jednu látku vybranú zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy alebo ich deriváty. Uvedený spôsob zahŕňa inkubáciu aspoň jednej látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty s aspoň jednou látkou vybranou zo skupiny zahŕňajúcej polysacharid alebo jeho deriváty, v podmienkach umožňujúcich tvorbu komplexov medzi uvedeným OCIF, jeho analógmi alebo variantmi a uvedenými polysacharidmi alebo ich variantmi. Ďalší krok spôsobu zahŕňa odstránenie všetkých voľných polysacharidov alebo ich variantov, ktoré nie sú naviazané na uvedený OCIF, jeho analógy alebo varianty.

Inkubácia aspoň jednej látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty s aspoň jednou látkou vybranou zo skupiny zahŕňajúcej polysacharid alebo jeho deriváty sa uskutočňuje v akýchkoľvek vhodných podmienkach, ale obvykle sa uskutočňuje vo vodnom prostredí. Výhodne sa inkubácia uskutočňuje v alkalických podmienkach. Výhodnejšie je, ak sa inkubácia uskutočňuje pri pH 9,5 až 12. Najvýhodnejšie je, keď sa inkubácia uskutočňuje pri pH od 10 do 11.

Pri inkubácii vo vodnom prostredí nie je rozmedzie koncentrácií OCIF, jeho analógov alebo variantov špeciálne obmedzené, nutné je len, aby dochádzalo k tvorbe očakávaných komplexov. Typická maximálna koncentrácia OCIF, jeho analógov alebo variantov vo vodnom roztoku je 0,1 až¹0,5 mM, minimálna koncentrácia je od 0,001 do 0,05 mM.

Výhodná koncentrácia OCIF, jeho analógov alebo variantov vo vodnom roztoku je 0,01 až 0,2 mM, najvýhodnejšia je od 0,05 do 0,1 mM. V prípade OCIF, maximálna koncentrácia vo vodnom roztoku je 10 až 50 mg/ml a minimálna koncentrácia je od 0,1 do 5 mg/ml. Výhodná koncentrácia OCIF vo vodnom roztoku je od 1 do 20 mg/ml, výhodnejšie od 5 do 10 mg/ml.

Pri inkubácii vo vodnom prostredí nie je rozmedzie koncentrácií polysacharidu alebo jeho variantov špeciálne obmedzené, nutné je len, aby dochádzalo k tvorbe očakávaných komplexov. Typická maximálna koncentrácia polysacharidu alebo jeho variantov vo vodnom roztoku je 0,1 až 0,5 M, minimálna koncentrácia je od 0,0005 do 0,05 M.

Výhodná koncentrácia polysacharidu alebo jeho variantov vo vodnom prostredí je 0,005 až 0,25 M, výhodnejšia je od 0,05 do 0,1 M. V prípade sodnej soli dextránsulfátu síra 5, maximálna koncentrácia polysacharidu alebo jeho variantov vo vodnom roztoku je 200 až 1000 mg/ml a minimálna koncentrácia je od 0,1 do 100 mg/ml. Výhodná koncentrácia polysacharidu alebo jeho variantov vo vodnom roztoku je od 10 do 500 mg/ml, výhodnejšie od 100 do 200 mg/ml.

Pri inkubácii nie je teplota špeciálne obmedzená, nutné je len to, aby dochádzalo k tvorbe očakávaných komplexov. Horný limit inkubačnej teploty je typicky od 10 do 50 °C a dolný limit je rozmedzie od 4 do 37 °C, je od 4 do 10 °C.

Ako bolo uvedené od 0 do 4 °C. Výhodne je teplotné najvýhodnejšie teplotné rozmedzie vynálezu neobsahujú voľné ktoré nie sú naviazané vyššie, komplexy predkladaného polysacharidy alebo ich varianty, na OCIF, jeho analógy alebo sa voľné polysacharidy alebo ich je nijako obmedzený, jedinou z metód, ktoré izoláciu a/alebo frakcionáciu.

varianty. Spôsob, ktorým varianty odstránia, nie podmienkou je, že použitá metóda je jednou možno použiť na purifikáciu, Príklady adsorpčnú filtračnú zahŕňajú ionexovú chromatografiu, deliacu chromatografiu, gélovú hydrofóbnu chromatografiu, kryštalizáciu, odsoľovanie a ultrafiltráciu. Z uvedených metód sú výhodne používané afinitnú vhodných metód chromatografiu, chromatografiu, chromatografiu, gélová filtračná chromatografia (nazývaná aj gélová filtrácia) a ultrafiltrácia. Najvýhodnejším prístupom je ale gélová filtrácia.

Pokiaľ ide o gél používaný pri gélovej filtrácii na odstránenie voľných polysacharidov alebo ich variantov z očakávaných komplexov po inkubácii, nie sú pre jeho výber žiadne obmedzenia. Jedinou podmiekou je, aby použitý gél bol schopný oddeliť z frakcie komplexov voľné polysacharidy alebo ich varianty, ktoré nie sú naviazané na OCIF. Vhodné príklady zahŕňajú agarózový gél, dextránový gél a polyakrylamidový gél.

Komplexy predkladaného vynálezu zahŕňajúce aspoň jednu látku vybranú zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty, ktorý je naviazaný na aspoň jednu látku vybranú zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy alebo ich deriváty, možno od voľných nekomplexovaných OCIF, ich analógov alebo variantov odlíšiť použitím rôznych meradiel, ktoré zahŕňajú izoelektrický bod, obsah cukrov a imunologickú detekciu.

Izoelektrický bod sa meria pomocou bežnej, v odbore známej izoelektrickej elektroforézy. OCIF je bázický proteín a jeho izoelektrický bod je okolo pi 9. To je signifikantne viac, ako je izoelektrický bod komplexov predkladaného vynálezu, zahŕňajúcich OCIF a polysacharidy a ich varianty, napríklad dextránsulfát. Typický izoelektrický bod týchto komplexov sa pohybuje v rozmedzí od 5 do 7. Touto metódou je teda možné rýchlo odlíšiť komplexované a nekomplexované OCIF.

Obsah cukrov komplexov predkladaného vynálezu a volných nekomplexovaných OCIF alebo ich analógov a variantov možno merať ktoroukoľvek metódou používanou v odbore na kvantifikáciu obsahu neutrálnych cukrov. Medzi typické príklady týchto metód patrí metóda založená na fenolsírovej kyseline (M. Dubois, et al., 1956, Anál. Chem., 28, 350). Pretože obsah celkových cukrov komplexov predkladaného vynálezu zahŕňajúcich OCIF, jeho analógy alebo varianty a polysacharid alebo jeho variant je väčší než samotného OCIF, možno ich navzájom ľahko odlíšiť.

Ďalšou alternatívnou metódou na rozlíšenie voľných nekomplexovaných OCIF alebo ich analógov a variantov od komplexov predkladaného vynálezu zahŕňajúcich OCIF alebo jeho analógy alebo varianty, naviazaný na polysacharid alebo jeho varianty je kvantifikácia množstva polysacharidu alebo jeho variantov pomocou protilátky, ktorá sa špecificky viaže na uvedený polysacharid alebo jeho variant.

Na meranie množstva proteínu v OCIF alebo jeho analógu alebo variante, alebo v komplexe predkladaného vynálezu zahŕňajúceho OCIF alebo jeho analóg alebo variant a polysacharid alebo jeho variant, možno použiť ktorúkoľvek z metód bežne používaných v odbore na meranie celkového obsahu proteínu. Vhodným príkladom je Lowryho metóda (Lowry, O.H. et al., J. Biol. Chem., 1951, 193, 265-275, meranie absorbancie pri vlnovej dĺžke 280 nm, farbenie striebrom) a BCA metóda.

Voľné, nekomplexované OCIF alebo ich analógy alebo varianty, alebo OCIF alebo jeho analógy alebo varianty v komplexoch predkladaného vynálezu možno merať imunologický metódou, ktorá využíva aspoň jednu monoklonálnu protilátku proti OCIF. Príklady vhodných monoklonálnych protilátok proti OCIF, výhodne používaných na imunologickú detekciu ľudského OCIF, zahŕňajú protilátku produkovanú hybridómom 01-19 (FERM BP-6 420), protilátku produkovanú hybridómom 01-4 (FERM BP-6 419) a protilátku produkovanú hybridómom 01-26 (FERM BP-6 421) (napr. WO-A-99/15 691) . Tieto protilátky sú v predkladanom vynáleze nazývané ako „protilátka 01-19”, „protilátka 01-4 a „protilátka 01-26”. Protilátka 01-19 a 01-4 rozoznávajú ako OCIF monomér, tak OCIF dimér s rovnakou afinitou, zatiaľ čo protilátka 01-26 špecificky viaže dimér. Imunolgické meranie sa uskutočňuje pomocou protilátok tohto typu a pomocou akejkoľvek metódy známej v odbore, ktorá sa používa na imunologickú detekciu (napr. WO-A-99/15 691). Príklady vhodných metód zahŕňajú enzýmovú imunoštúdiu (nazývanú EIA), rádio-imunoštúdiu, imunotest založený na väzbe enzýmu (ELISA) a sendvičovú EIA. Z týchto metód je najvýhodnejšia ELISA. V prípade, že OCIF je ľudského pôvodu, možno použiť test ELISA v kombinácii s protilátkou 01-19 alebo 01-26 ako imobilizovanou protilátkou a protilátku 01-4 ako protilátku označenú enzýmom. Výhodne použitý enzým na konjugáciu s protilátkou je peroxidáza (nazývaná ako POD).

Hybridom produkujúci protilátku 01-4 bol uložený v domácej hybridómovej banke pod názvom „01-4 v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 Chome, Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8 566, Japan (tento ústav sa teraz nazýva International Patent Organism Depository, National Inštitúte of Advanced Industrial Science and

Technology at AIST Tsukuba Centrál 6, 1-1, Higashi 1 Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8 566, Japan). Hybridom bol uložený 16. októbra 1997 (Heisei-9) a dostal názov a číslo FERM BP-16 473. Potom bol 13. júla 1998 (Heisei-10) prenesený do medzinárodnej banky, kde tento hybridom dostal evidenčné číslo FERM BP-6 419.

Hybridom produkujúci protilátku 01-19 bol uložený v domácej hybridómovej banke pod názvom „01-19 v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 Chome, Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8 566, Japan (tento ústav sa teraz nazýva International Patent Organism Depository, National Inštitúte of Advanced Industrial Science and Technology at AIST Tsukuba Centrál 6, 1-1, Higashi 1 Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8 566, Japan). Hybridom bol uložený 16. októbra 1997 (Heisei-9) a dostal názov a číslo FERM BP-16 474. Potom bol 13. júla 1998 (Heisei-10) prenesený do medzinárodnej banky, kde tento hybridom dostal evidenčné číslo FERM BP-6 420.

Hybridom produkujúci protilátku 01-26 bol uložený v domácej hybridómovej banke pod názvom „01-26 v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 Chome, Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8 566, Japan (tento ústav sa teraz nazýva International Patent Organism Depository, National Inštitúte of Advanced Industrial Science and Technology at AIST Tsukuba Centrál 6, 1-1, Higashi 1 Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8 566, Japan). Hybridom bol uložený 16. októbra 1997 (Heisei-9) a dostal názov a číslo FERM BP-16 475. Potom bol 13. júla 1998 (Heisei-10) prenesený do medzinárodnej banky, kde tento hybridom dostal evidenčné číslo FERM BP-6 421.

Krvná ' a sérová koncentrácia komplexu predkladaného vynálezu zahŕňajúceho OCIF alebo jeho analóg alebo variant a polysacharid alebo jeho variant sa meria nasledovným spôsobom:

Najprv sa uvedený komplex podá človeku alebo zvieraťu. Potom sa po presne stanovenom časovom období odoberú vzorky krvi alebo séra. Krvná a sérová koncentrácia uvedeného komplexu je následne zisťovaná testom ELISA, s použitím aspoň jednej monoklonálnej protilátky proti OCIF, ako je to opísané na inom mieste predkladaného patentu (pozri WO-A99/15 691).

Komplex predkladaného vynálezu obsahujúci aspoň jednu látku vybranú zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty, ktorý je naviazaný na aspoň jednu látku vybranú zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy alebo ich deriváty, je vhodný na liečbu alebo prevenciu metabolických ochorení kostí. V predkladanom vynáleze sú za metabolické ochorenia kosti pokladané všetky choroby kostí, ktoré sú charakterizované zníženou celkovou kostnou hmotou a u ktorých je nutné potlačiť kostnú resorpciu a/alebo rýchlosť kostnej resorpcie za účelom liečby alebo prevencie týchto chorôb. Metabolické ochorenia kosti, ktoré možno liečiť alebo im predchádzať komplexom predkladaného vynálezu, zahŕňajú: primárnu osteoporózu, (senilná osteoporóza, postmenopauzálna osteoporóza a idiopatická juvenilná osteoporóza); endokrinná osteoporóza (hypertyreodizmus, hyperparatyreodizmus, Cushingov syndróm a akromegália); osteoporóza sprevádzajúca hypogonadizmus (hypopituitarizmus, Klinefelterov syndróm, Turnerov syndróm);

(osteogenesis a Riley-Dayov záťaže alebo hereditárna imperfecta, syndróm); fixácie a choroba; osteomyelitis; hyperkalcémia v' dôsledku prsníka, karcinóm pľúc, prostaty); hematologické malignity a kongenitálna osteoporóza homocystinúria, Menkesov syndróm osteopénia v dôsledku poklesu imobilizácie končatín); Pagetova infekčný fókus so stratou kosti; pevného tumoru (napríklad karcinóm obličky a (mnohopočetný karcinóm karcinóm myelóm, lymfómy a hyperkalcémia nedostaťočnoť leukémia);

medikácie;

osteopénia na (imunosupresiva, napr.' metotrexát a antiepileptiká); osteopénia na obličiek; osteopénia na základe idiopatická hyperkalcémia; sprevádzajúca hypertyreodizmus alebo obličiek; osteopénia na podklade steroidnej podklade iných liekov a cyklosporin A, heparín podklade nedostatočnoti chirurgických zákrokov alebo chorôb tráviaceho traktu (napr. prekážka na tenkom alebo hrubom čreve, chronická hepatitída, gastrektómia, primárna biliárna cirhóza pečene alebo cirhóza pečene); osteopénia na podklade rôznych typov reumatizmu, napríklad reumatoidná artritída; poškodenie kĺbov v dôsledku rôznych napríklad reumartritída; mutilujúci strata periodontu; metastázy metastatica);

typov reumatizmu, reumatizmus;

osteoartritída;

karcinómov kostiach (osteolysis osteonekróza alebo zánik osteocytov :

poranenia, Gaucherova choroba, anémia, systémový lupus erythematosus, netraumatické poranenia, osteodystrofia, napríklad renálna osteotraumatické sprevádzajúci kosákovitá dystrofia, osteopénia sprevádzajúca nutričnú nedostatočnosť a iné osteopénie. Choroby kostného metabolizmu zahŕňajú aj kachexiu v dôsledku pevných tumorov alebo ich metastáz do kostí alebo hematologických malígností (pozri japonský patent 2 000-178 200) .

Prípravok, ktorý obsahuje komplex predkladaného vynálezu skladajúci sa aspoň z jednej látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty, ktorý je napojený na aspoň jednu látku vybranú zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy alebo ich deriváty, spolu s farmaceutický prijateľným nosičom alebo rozpúšťadlom, možno človeku alebo zvieraťu bezpečne podávať orálne alebo parenterálne. Dávkovú formu možno vhodne vybrať v závislosti od rôznych faktorov, napríklad: typ choroby, ktorá bude liečená, rozsah ochorenia, vek, pohlavie a hmotnosť pacienta. Komplex možno podať napríklad orálne vo forme tabliet, kapsúl, práškov, granúl alebo sirupov, injekčné intravenózne a to buď samostatne alebo v kombinácii s bežnými aditivami, ako je napríklad glukóza, aminokyseliny a podobne, injekčné intramuskulárne, subkutánne, intrakutánne alebo intraperitoneálne, transdermálne, transnazálne vo forne nosných kvapiek, možno ho podať na sliznicu alebo do ústnej dutiny vo forme látky aplikovateľnej na sliznice, alebo intrarektálne vo forme čapíka. Tieto látky možno pripraviť ako bežné liekové formy pomocou známych, v medicíne všeobecne používaných aditív, ako sú napríklad vysušovadlá, spojivá, dezintegranty, lubrikanty, aromatizujúce látky, rozpúšťadlá, suspendujúce látky, farbivá, regulátory pH, antiseptiká, gélujúce látky, povrchovo aktívne látky a obalové látky.

V prípade, že komplex predkladaného vynálezu je pripravený vo forme tabliet, možno na ich prípravu použiť akýkoľvek v odbore známy a dostupný nosič. Medzi nosiče patria: vysušovadlá, napr. laktóza, biely cukor, chlorid sodný, glukóza, močovina, škrob, uhličitan vápenatý, kaolín, kryštalická celulóza, silikát a podobne; spojivá, napr. voda, etanol, propanol, jednoduchý sirup, roztok glukózy, roztok škrobu, roztok želatíny, karboxymetylcelulóza, šelak, metylcelulóza, fosforečnan draselný, polyvinalpyrolidón a podobne; dezintegranty, napr. suchý škrob, alginát sodný, agarový prášok, lamináriový prášok, hydrogénuhličitan sodný, uhličitan vápenatý, estery mastných kyselín, laurylsulfát sodný, monoglycerid kyseliny stearovej, škrob, laktóza a podobne; stabilizátory, napríklad biely cukor, stearín, kakaové maslo, hydrogénovaný olej a podobne; urýchľovače absorpcie, napríklad kvartérne amóniové bázy, laurylsulfát sodný a podobne; zvlhčovače, napríklad glycerín, škrob alebo podobne; absorbenty, napríklad škrob, laktóza, kaolín, bentonit, koloidný silikát a podobne; a lubrikanty, napríklad jemný mastenec, prášok kyseliny boritej, polyetylénglykol a podobne. Ďalej v prípade potreby možno tablety obaliť, napríklad cukrovými vrstvami, vrstvou zo želatíny alebo formou enterosolventných obalov. Tablety možno obaliť jednou, dvoma alebo viacerými vrstvami obalu.

V prípade, že komplex predkladaného vynálezu je vo forme pilulky, obsahuje nosiče známe v odbore, napríklad glukózu, laktózu, kakaové maslo, škrobový prášok, stužené rastlinné tuky, kaolín, mastenec a podobne, a dezintegranty, ako napríklad laminaran, agar a podobne.

V prípade, že komplex predkladaného vynálezu je pripravený ako čapik, prípravok obsahuje bežné nosiče, ako napríklad polyetylénglykol, kakaové maslo, vyššie alkoholy, estery vyšších alkoholov, želatínu, semi-syntetický glycerid a podobne.

V prípade, že komplexy predkladaného vynálezu sú vo forme injekcií, je výhodné, ak je prípravok vo forme roztoku alebo suspenzie sterilizovaný a je izotonický s krvou. V prípade, že prípravky vo forme roztoku, emulzie alebo suspenzie, možno k nim pridať akékoľvek v odbore známe rozpúšťadlo. Príklady vhodných rozpúšťadiel zahŕňajú vodu, etanol, propylénglykol, etoxylovaný izostearylalkohol, polyoxylovaný izostearylalkohol a estery mastných kyselín polyoxyetylénsorbitany. Injekčné prípravky obsahujú navyše aj soli, glukózu, glycerín a pod., v množstve dostatočnom pre zachovanie izotonicity s krvou. Ďalej obsahujú látky zahŕňajúce solubilizačné činidlá, pufrovacie činidlá, zjemňujúce látky, regulátory pH, stabilizátory a solubilizačné činidlá. Po formulácii je injekcia vysušená mrazom.

Prípravky predkladaného vynálezu obsahujú aj ďalšie pomocné látky, napríklad farbivá, ochranné zložky, parfumovacie zložky, dochucovadlá, sladidlá alebo iné látky.

Neexistuje špecifické obmedzenie, pokial ide o množstvo komplexu predkladaného vynálezu skladajúceho sa z aspoň jednej látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty a aspoň jednej látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy a ich deriváty, ktoré sa vyskytuje v zlúčeninách určených na podávanie za účelom prevencie alebo liečby chorôb metabolizmu kostí, ale obvykle tvorí 0,1 až 70 % hmotnosti, výhodne 1 až 30 % hmotnosti celého prípravku.

Dávka zlúčeniny vzhľadom na predkladaný vynález varíruje v závislosti od množstva faktorov, ako je napríklad: choroba, ktorá má byť liečená, vek, pohlavie a telesná hmotnosť pacienta a spôsob podávania. Avšak množstvo zlúčeniny podané dospelému človeku je všeobecne v rozsahu od 0,001 až 0,03 mg na deň do 30 až 1000 mg na deň. Výhodne použité rozmedzie je od 0,03 do 30 mg na deň. Podané množstvo je všeobecne v rozsahu od 0,01 do 0,5 mg/kg na deň do 1 až 20 mg/kg na deň. Výhodne použité rozmedzie sa pohybuje od 0,5 Mg/kg do 1 mg/kg na deň. Komplex predkladaného vynálezu sa podáva raz denne alebo častejšie ako raz denne, v závislosti od faktorov, ktorými sú forma podávania a stav pacienta.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady, referenčný a testovací príklad sú určené na ďalšiu ilustráciu predkladaného vynálezu a v žiadnom prípade neobmedzujú rozsah predkladaného vynálezu.

Príklad 1

Príprava komplexov obsahujúcich OCIF a dextránsulfát (I) l(a) Príprava dimérneho rekombinantného ľudského OCIF

Rekombinantný dimérny ľudský OCIF s molekulovou hmotnosťou asi 120 000 bol získaný postupom uvedeným v EPA-0 816 380 (WO-A-96/26 217). Konkrétne, pBKOCIF, plazmidový vektor nesúci nukleotidovú sekvenciu ľudského

OCIF, nesúcu signálny peptid, ktorý bol získaný z transformantov kmeňa E. coli pBK/01F10 (uložené ako FERM

BP-5 267 na základe Budapeštianskej zmluvy v

Národnom ústave biovedy a ľudských technológií,

Agentúra priemyselnej vedy a technológie,

1-3, Higashi

Chome,

Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8 566, Japonsko, ktorá sa nakoniec stala inštitúciou International Patent Organism

Depository, National Inštitúte of Advanced Industrial Science and Technology), pripraveného podlá príkladu 11 v EP-A-0 816 380. Nukleotidová sekvencia kódujúca cDNA ľudského OCIF bola získaná postupom opísaným v príklade 14 EP-A-0 816 380. Po separácii a purifikácii uvedenej nukleotidovej sekvencie bola táto vložená do expresného vektora pcDL-SRa296 (Molecular a Cellular Biology, 1988, 8,

466) a potom bol transformovaný DH5 a kmeň E. coli (Gibco BRL). Na transformáciu bol použitý postup opísaný v príklade 14 EP-A-0 816 380. Týmto spôsobom bol získaný rekombinantný vektor pSRaOCIF, ktorý bol z uvedenej bunkovej kultúry extrahovaný a purifikovaný.

Postup uvedený v príklade 14 EP-A-0 816 380 bol aplikovaný aj na prípravu rekombinantného zrelého ľudského OCIF. Konkrétne boli CHO dhFr bunky (ATCC, CRL 9 096) transfekované pomocou rekombinantného plazmidu pSRaOCIF a plazmidu exprimujúceho dihydrofolát reduktázu (DHFR) (plazmid pBAdDSV, uvedený v WO-A-92/Ol 053) . Potom sa uskutočnila selekcia transfektantov na DHFR. Transformanty, ktoré exprimovali veľké množstvá OCIF boli rozklonavané. Klony, ktorých kondicionované médium obsahovalo OCIF vo vysokých koncentráciách boli vybrané a kloň exprimujúci najvyššie množstvo OCIF (5 561) bol vybraný. Na základe tohto klonu vznikla kultúra klonu 5 561, médium bolo filtrované a nanesené na Heparin-Sepharose kolónu FF (2,6 x 10 cm, od firmy Pharmacia). Bola uskutočnená chromatografia na kolóne pomocou lineárneho gradientu chloridu sodného ako elučného činidla. Frakcia obsahujúca OCIF, ktorá sa eluovala pomocou 0,6 až 1,2 M NaCl bola potom nanesená na afinitnú kolónu (blue-5PW, 0,5 x 5,0 cm, od firmy Tosoh). Bola uskutočnená afinitná chromatografia pomocou lineárneho grádientu NaCl ako elučného činidla. Eluované frakcie, boli nanesené na SDS-polyakrylamidovú gélovú elektroforézu, v redukujúcich a neredukujúcich podmienkach. Frakcie obsahujúce purifikovaný rekombinantný ludský maturovaný OCIF boli určené ako rovnaké frakcie, ktoré majú molekulovú hmotnosť od 60 000 do 120 000, ako bolo uvedené v príklade 14 EP-A-0 816 380. Aminokyselinová sekvencia monomérneho peptidu je uvedená ako sekvencia č. 1 v zozname sekvencii. Táto sekvencia je identická s plnou sekvenciou č. 4 alebo aminokyselinami č. 1 až 380 sekvencie č. 5, ktoré sú uvedené v WO-A-96/26 217 a EP-A-0 816 380.

Kombinované frakcie obsahujúce získaný ludský OCIF boli potom doplnené 1/100 objemu 25% kyselinou trifluóroctovou a vzniknutá zmes bola nanesená na kolónu s reverznou fázou (PROTEIN-RP, 2,0 mm x 250 mm, od firmy YMC), ktorá bola preekvilibrovaná pomocou 30 % acetonitrilu obsahujúceho 0,1% kyselinu trifluóroctovú. Potom bola kolóna eluovaná v lineárnom gradiente od 30 do 55 % acetonitrilu, pri prietoku 0,2 ml/min počas 50 min. Dve hlavné frakcie boli odobrané oddelene a následne boli lyofilizované. Frakcia s molekulovou hmotnosťou 120 000 podľa SDS-PAGE v redukujúcich podmienkach bola potom použitá v nasledujúcich príkladoch ako dimérny ľudský oCIF (pozri príklad 17 a 18 v WO-A-96/26 217 a EP-A-0 816 380) .

(b) Príprava komplexov zahŕňajúcich OCIF a dextránsulfát

Purifikovaný dimérny ludský OCIF, pripravený podlá vyššie opísaného postupu v príklade 1(a), bol rozpustený v 10 mM pufrovacom roztoku fosfátu sodného (pH 6,0) obsahujúcom 0,15 M chlorid sodný, pričom vznikli roztoky s koncentráciou OCIF 1,5, 2, 5, 6,5, 10, 12,5, 20 a 50 mg/ml. Sodná soľ dextránsulfátu sira 5 (od firmy Meito Sangyo, preto nazývaná aj DS5) bola rozpustená vo vode a boli pripravené roztoky s finálnou koncentráciou 40, 100, 130, 150, 200, 400, 500, 510 a 1 000 mg/ml. Potom bol do roztokov pridaný 1 N roztok NaOH a pH bolo nastavené na 10,

10,5 a 11. Získané vodné roztoky boli inkubované pri teplote 4, 7, 25 a 37 °C, počas 1, 3, 6, 18, 24, 48, 72, 96, 144, 168 a 288 hodín.

Po ukončení inkubácie boli 4 ml vzniknutého roztoku nanesené na Superdex 200 prep gráde gélovú filtračnú kolónu (vnútorný priemer kolóny: 16 mm, dĺžka 60 cm, exklúzna limitná molekulová hmotnosť 1 300 000, od firmy Amersham Pharmacia Biotech), ktorá bola predtým ekvilibrovaná pomocou 10 mM sodno-fosfátového pufra (pH 6,0) obsahujúceho 0,3 M chlorid sodný. Potom bola kolóna eluovaná rovnakým pufrom, pri rýchlosti prietoku 2 ml/min.

Pomocou UV spektrofotometra bola monitorovaná absorpcia pri vlnovej dĺžke 280 nm. Eluáty s retenčným časom 28 až 36 min boli pozberané. Voľný DS5, ktorý sa nenaviazal na OCIF bol · vyplavený v retenčnom čase 50 až 70 min.

Všetky kroky gélovej filtrácie boli uskutočňované pri laboratórnej teplote. Získané preparáty, ktoré obsahovali očakávané komplexy dimérneho ľudského OCIF a DS5 boli zamrazené a uskladnené pri -60 ’C. Podmienky preparácie jednotlivých komplexov sú uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka 1

číslo preparácie	DS5 kone. (mg/ml)	OCIF kone. (mg/ml)	Teplota (’C)	PH	Čas inkubácie (hodiny)
prep. 1	130	6, 5	4	10,5	18
prep. 2	510	6, 5	4	10,5	18
prep. 3	130	6, 5	4	11	18
prep. 4	130	6, 5	4	10,5	72

prep.	5	500	5	4	10,	5	144
prep.	6	130	6, 5	4	10,	5	48
prep.	7	130	6, 5	4	10,	5	144
prep.	8	130	6, 5	4	10,	5	288
prep.	9	400	20	4	1—» o	5	18
prep.	10	200	10	4	10,	5	18
prep.	11	100	5	4	10,	5	18
prep.	12	40	2	4	10,	5	18
prep.	13	1000	12,5	4	10,	5	18
prep.	14	1000	50	4	10,	5	18
prep.	15	400	2	4	10,	5	144
prep.	16	1000	5	4	10,	5	18
prep.	17	1000	2	4	10,	5	18
prep.	18	150	5	37	10,	5	1
prep.	19	150	5	37	10,	5	3
prep.	20	150	5	37	10,	5	6
prep.	21	150	5	37	10,	5	24
prep.	22	150	5	7	10,	5	168
prep.	23	150	5	4	10	144
prep.	24	150	5	25	10	24
prep.	25	130	6, 5	4	10,	5	24
Prep.	26	150	5	37	10	24
prep.	27	150	5	4	10,	5	144
prep.	28	150	5	4	11	24
prep.	29	150	5	4	10,	5	24
prep.	30	150	1,5	4	10,	5	72
prep.	31	130	6, 5	25	10,	5	1
prep.	32	130	6, 5	25	10,	5	3
prep.	33	130	6, 5	25	10,	5	6
prep.	34	130	6, 5	25	10,	5	24
prep.	35	130	6, 5	25	10,	5	168
prep.	36	130	6, 5	25	10,	5	288
prep.	37	150	5	4	10,	5	96

prep. 38	150	5	4	10, 5	288
prep. 39	130	6, 5	25	10,5	18
prep. 40	130	6, 5	37	10,5	18

1(c) Príprava prirodzeného ľudského OCIF'

Prirodzene produkovaný ľudský OCIF bol pripravený postupom opísaným v príkladoch 1 až 4 v WO-A-96/26 217 a EP-A-0 816 380, z kultúry fibroblastov ľudských fetálnych pľúc IMR-90 (ATCC-CCL186).

Príklad 2

Príprava komplexov obsahujúcich OCIF a dextránsulfát (II)

Purifikovaný dimérny ľudský OCIF, pripravený postupom ako v príklade l(a) bol rozpustený v 10 mM sodno-fosfátovom pufri (pH 6,0) obsahujúcom 0,15 M chlorid sodný, pričom vznikol roztok s koncentráciou OCIF 5 mg/ml. Sodná soľ dextránsulfátu (od firmy Wako Pure Chemical Industries, preto názov DS 5 000) bola rozpustená vo vode, čím vznikol roztok s finálnou koncentráciou DS 5 000 150 mg/ml. Potom bol do roztoku pridaný 1 N roztok hydroxid sodný a pH bolo nastavené na 10,5. Vodný roztok získaný týmto spôsobom bol potom 24 hodín inkubovaný pri teplote 4 °C.

Po uplynutí tejto doby boli 4 ml vzniknutého roztoku nanesené na Superdex 200 prep gráde gélovú filtračnú kolónu, ako to bolo opísané v príklade 1(b). Pomocou UV spektrofotometra bola stanovená absorbancia pri vlnovej dĺžke 280 nm a eluát s retenčným časom 28 až 36 min bol odoberaný. Voľné DS 5 000, ktoré sa nenaviazali na OCIF boli eluované v retenčnom čase 40 až 65 min.

Získané preparáty, ktoré obsahovali očakávané komplexy dimérneho ľudského OCIF a DS5 boli zamrazené a uskladnené pri teplote -60 °C. Podmienky prípravy jednotlivých komplexov sú uvedené v tabuľke'2.

Tabuľka 2

číslo preparácie	DS 5000 kone. (mg/ml)	OCIF kone. (mg/ml)	Teplota (°C)	PH	Čas inkubácie (hodiny)
prep. 41	150	5	4	10, 5	24

Príklad 3

Meranie izoelektrického bodu

Purifikovaný dimérny ludský OCIF, ktorý bol pripravený postupom uvedeným v príklade l(a) a komplex OCIF a dextránsulfát, v príklade 1(b) označený ako preparácia č. 22 v tabuľke 1, boli separátne nanesené na izoelektrický elektroforézny gél IEF PAGE mini (rozsah pH od 3 do 10, od firmy Iwaki Glass) , s použitím IEF pH 3 až 7 pufrovacej súpravy (od firmy Technical Frontier). Voltáž experimentu bola 'nasledovná: 100 V počas 1 hodiny, potom počas 1 hodiny 200 V a nakoniec 30 minút 500 V. Po skončení elektroforézy bol získaný gél zafarbený pomocou Coomassie Blue.

Pomocou elektroforéznych gélov získaných vyššie uvedeným spôsobom bol stanovený izoelektrický bod dimérneho ľudského OCIF na približne pi 9 a izoelektrický bod komplexu OCIF a dextránsulfátu označeného ako preparácia č. 22 v tabulke 1 na približne pi 6,5. Hodnoty boli získané porovnaním pozícií pruhov OCIF a OCIF komplexu s pi markerom.

Príklad 4

Meranie molekulárneho pomeru OCIF a dextránsulfátu v komplexe zahŕňajúcom OCIF a dextránsulfát (a)· Príprava zásobného roztoku monoklonálnej. protilátky proti ľudskému OCIF 01-4 značenej peroxidázou

V tomto kroku bola monoklonálna protilátka proti ľudskému OCIF značená peroxidázou pomocou EZ-Link Maleimid

Activated Horseradish Peroxidase kitu (od firmy Pierce) podlá protokolu opísaného v inštruktáži dodávanej spolu s kitom. Detaily postupu sú uvedené nižšie:

Monoklonálna protilátka proti ľudskému OCIF bola purifikovaná z hybridómovej kultúry produkujúcej protilátku 01-4 (FERM BP 6 419) postupom opísaným v príklade 4 v EP-A0 974 671 (WO-A-99/15 691) a následne rozriedená na finálnu proteínovú koncentráciu 1 mg/ml pomocou 10 mM fosfátového pufra (pH 7,6). N-sukcínimidyl S-acetyltioacetát (dodávaný v súprave EZ-Link Maleimide Activated Horseradish Peroxidase) bol rozpustený v dimetylformamide, pričom vznikol roztok s koncentráciou 10 mg/ml tesne pred použitím. Alikvot 4 μΐ bol pridaný do 1 ml roztoku obsahujúceho rozriedenú 01-4 protilátku a výsledný roztok bol potom 30 min inkubovaný pri laboratórnej teplote. Potom bolo čerstvo pripravených 20 μΐ roztoku vzniknutého rozpustením 5 mg hydroxylamínhydrochloridu v 100 μΐ

Maleimid Conjugation Buffer (dodávaný v súprave EZ-Link

Maleimide Activated Horseradish Peroxidase) a tento roztok bol pridaný do roztoku protilátky. Vzniknutý roztok bol 2 hodiny inkubovaný pri laboratórnej teplote. Potom bola vzniknutá zmes nanesená na polyakrylamidovú odsoľovaciu kolónu (10 ml, obsiahnutá v uvedenej súprave EZ-Link

Maleimide

Activated

Horseradish

Peroxidase), preekvilibrovanú pomocou 30 ml Maleimide Conjugation Buffer (obsiahnutý v uvedenej súprave). Uvedený pufer bol nanesený na kolónu. Eluát bol zbieraný v 0,5 ml frakciách. Siedma a desiata frakcia obsahujúca protilátku boli spojené. 100 μΐ roztoku získaného rozpustením 5 mg EZ-Link Maleimide Activated Horseradish Peroxidase (obsiahnutej v súprave EZLink Maleimide Activated Horseradish Peroxidase) v 500 μΐ destilovanej vody tesne pred použitím bolo potom pridaných k spojeným elučným frakciám a vzniknutá zmes bola 1 hodinu inkubovaná pri laboratórnej teplote. Po inkubácie bol k rekčnej zmesi pridaný rovnaký objem glycerolu a vzniknutý roztok bol uložený pri -20 °C.

Roztok vzniknutý vyššie uvedeným postupom bol používaný ako zásobný roztok monoklonálnej protilátky proti ľudskému OCIF 01-4 značenej peroxidázou (z toho názov POD01-4) a v ďalšom je nazývaný ako POD-OI-4 zásobný roztok. 4(b) Kvantifikácia OCIF

Množstvo OCIF vyskytujúce sa v ktoromkolvek z komplexov pripravených v príkladoch 1 a 2 a kombinácie pripravené v citovanom príklade 1 bolo merané pomocou testu s enzýmom spojeným imunosorbentom (ELISA) pomocou dvoch monoklonálnych protilátok proti OCIF.. Detaily postupu sú uvedené nižšie:

Monoklonálna protilátka proti ľudskému OCIF 01-26 bola purifikovaná z hybridómovej kultúry produkujúcej protilátku 01-26 (FERM BP 6 421) postupom opísaným v príklade 4 v EPA-0 974 671 (WO-A-99/15 691) a potom bola rozpustená v 0,1 M roztoku hydrogénuhlučitanu sodného, pričom vznikol roztok s konečnou koncentráciou proteínu 5 μρ/ιηΐ. Alikvot 100 μΐ z tohto roztoku bol pridaný do každej jamky 96-jamkovej mikrotitračnej platničky (Maxisorp, od firmy. NUNC), platnička bola zakrytá a cez noc uložená pri teplote do 4 °C. Potom bola každá jamka trikrát premytá 250 μΐ PBS (pH 7,4) obsahujúcim 0,1% polysorbát 20. 20 μΐ roztoku dilučného pufra (obsahujúceho 0,2 M Tris-hydrochlórnu kyselinu, 40 % Block Ace, /od firmy Dainippon Pharmaceutical/ a 0,1 % polysorbát 20, pH 7,4) bolo pridaných do každej jamky a platnička bola 20 min inkubovaná pri laboratórnej teplote, aby došlo k vyblokovaniu oblastí v jamkách, na ktoré nebola naviazaná protilátka 01-26.

Vzorky, ktoré boli pridané do 01-26 spracovaných jamôk, ako bolo uvedené vyššie, boli výhodne rozriedené pomocou dilučného pufra, použitého na blokovanie jamôk. Na prípravu kalibračnej krivky bol použitý OCIF známej koncentrácie, rozriedený v dilučnom pufri. Roztok dilučného pufra bol použitý ako kontrola. 50 μΐ každej vzorky bolo nanesených do jamky.

Po pridaní vzoriek' do jamôk bolo do každej jamky pridaných 50 μΐ roztoku 1500 x rozriedeného zásobného roztoku POD-OI-4 protilátky v dilučnom pufri (obsahujúceho 0,2 M Tris-hydrochlórnu kyselinu, 40 % Block Ace, /od firmy Dainippon Pharmaceutical/ a 0,1 % polysorbát 20, pH 7,4). Platnička bola potom 2 hodiny inkubovaná pri laboratórnej teplote. Potom bola každá jamka štyrikrát premytá 250 μΐ fosfátového pufra obsahujúceho 0,1 % polysorbát 20 (z toho názov PB, pH 7,4).

0,1 M kyselina citrónová a 0,2 M hydrogénfosfát disodný boli zmiešané a použité ako substrátový roztok (pH 4,5). Alikvot 32,5 ml bol odobraný do testovacej skúmavky a následne bolo pridaných 6,5 μΐ peroxidu vodíka. 13 mg ofenyléndiamínhydrochloridu (OPD) v tablete (od firmy Wako Pure Chemical Industries) bolo potom rozpustených vo vzniknutom roztoku. Alikvot 100 μΐ uvedeného roztoku bol pridaný do každej jamky, platnička bola prikrytá hliníkovou fóliou a 15 minút inkubovaná pri laboratórnej teplote. Potom bolo do každej jamky pridaných 50 μΐ zastavovacieho činidla obsahujúceho čistú vodu a koncentrovanú kyselinu sírovú, v pomere 250:50. Po jemnom premiešaní vzoriek v jamkách pomocou mixéra (Titer mixér MB-1, firma Japan Trika), bola meraná absorbancia pri 490 nm. Na meranie absorbancie bola použitá čítačka na mikroplatničky (SPECTRA FLUÓR, od firmy TECAN).

Na základe kalibračnej krivky pripravenej pomocou vyššie uvedenej absorbancie štandardov s ľudským OCIF v známej koncentrácii, bolo vypočítané množstvo ľudského

OCIF v každej vzorke.

4(c) Kvantifikácia dextránsulfátu

Množstvo dextránsulfátu v každom komplexe pripravenom ako v príklade 1 a 2 bolo merané ako neutrálny cukor pomocou metódy založenej na kyseline fenolsírovej. Detaily sú uvedené nižšie:

Roztok so známou koncentráciou DS5 v rozsahu od 10 do 60 gg/ml (od firmy Meito Sangyo) alebo DS 5 000 (od firmy Wako Pure Chemical Industries) bol pripravený pomocou dilučnúho roztoku (0,01 M kyselina citrónová, 0,3 M chlorid sodný, 0,01 % polysorbát 80 vodný roztok, pH 6,0) a bol použitý ako štandardný roztok. 0,2 ml štandardu, vzorka alebo dilučný roztok, bolo nanasených do každej testovacej skúmavky. 0,2 ml vodného roztoku fenolu s koncentráciou 50 mg/ml bolo pridaných do skúmavky a zmes bola rýchlo miešaná. Po 20 sekundovej inkubácii vzniknutej zmesi pri 60 °C, vo vodnom kúpeli bol do reakčnej zmesi pridaný 1,0 ml koncentrovanej kyseliny sírovej. Po jemnom, ale rýchlom miešaní boli skúmavky 10 minút inkubované pri laboratórnej teplote, následne boli reakčné zmesi opäť rýchlo zamiešané a potom 20 minút inkubované pri laboratórnej teplote. Absorbancia roztoku v skúmavke bola meraná pri vlnovej dĺžke 490 nm. Na meranie bol použitý spektrofotometer (UV— 240, od firmy Shimadzu Seisakusho).

Z hodnôt absorbancie a pomocou kalibračnej krivky bol stanovený obsah neutrálnych cukrov. Ľudský OCIF obsahuje cukrový reťazec. Množstvo dextránsulfátu naviazaného na ľudský OCIF v analyzovanej preparácii bol teda určený dedukciou hodnoty obsahu neutrálnych cukrov v ľudskom OCIF z hodnôt nameraných pre každú analyzovanú preparáciu.

4(d) Výpočet molekulového pomeru OCIF a dextránsulfátu v 'komplexe zahŕňajúcom OCIF a dextránsulfát

Množstvo dextránsulfátu vyskytujúceho sa v analyzovaných preparátoch, určené ako bolo uvedené v príklade 4(c) , bolo delené množstvom ľudského OCIF vyskytujúceho sa v analyzovaných preparátoch, určeným ako v príklade 4 (b) . Výsledné číslo predstavuje množstvo dextránsulfátu vyskytujúceho sa v 1 mg ľudského OCIF v analyzovaných preparátoch. Takto získané číslo bolo potom použité na výpočet molekulového pomeru OCIF monoméru a dextránsulfátu v analyzovaných preparátoch tak, že sa spočítal počet molekúl dextránsulfátu pripadajúcich na jednu molekulu OCIF monoméru. Výpočet bol založený na predpoklade, že molekulová hmotnosť ľudského OCIF monoméru je 60 000 a molekulová hmotnosť DS5 je 1 950 a molekulová hmotnosť DS 5 000 je 5 000. Získané výsledky sú uvedené v tabuľke 3. Tabuľka 3

komplex	množstvo dextránsulfátu v komplexe (Mg/mg OCIF)	molekulový pomer OCIF monoméru a dextránsulfátu v komplexe
prep. 1	48,7	1:1,5
prep. 2	100,2	1:3,1
prep. 3	39,7	1:1,2
prep. 4	62,0	1:1,9
prep. 5	136, 4	1:4,3
prep. 6	60,7	1:1,9
prep. 7	58,5	1:1,8
prep. 8	60,3	1:1,9
prep. 9	67,7	1:2,1
prep. 10	94,3	1:2,9
prep. 11	63, 6	1:2,0
prep. 12	60,8	1:1,9
prep. 13	144, 9	1:4,5
prep. 14	116, 4	1:3,6
prep. 15	126, 9	1:4,0
prep. 16	145, 0	1:4,5
prep. 17	116, 5	1:3,6
prep. 18	46, 0	1:1,4

prep. 19	61,0	1:1,9
prep. 20	68,3	1:2,1
prep. 21	110,7	1:3,4
prep. 22	100,3	1:3,1
prep. 23	65, 8	1:2,1
prep. 24	58,2	1:1,8
prep. 25	43,8	1:1,4
prep. 26	80, 1	1:2,5
prep. 27	61,8	1:2,0
prep. 28	57,1	1:1,8
prep. 29	69,3	1:2,2
prep. 30	77,1	1:2,4
prep. 31	34,5	1:1,1
prep. 32	53,0	1:1,7
prep. 33	47,4	1:1,5
prep. 34	62,2	1:2,0
prep. 35	96,2	1:3,0
prep. 36	122,5	1:3,9
prep. 37	67,8	1:2,1
prep. 38	69, 5	1:2,4
prep. 39	78,0	1:2,5
prep. 40	98,4	1:3, 1
prep. 41	161,2	1:1,9

Príklad 5

Stabilita väzby medzi OCIF a dextránsulfátom v komplexoch

OCIF/dextránsulfát

Gélová filtrácia komplexu zahŕňajúceho OCIF a dextránsulfát bola dvakrát opakovaná, ako to bolo opísané v príklade 4 (c) a bolo merané množstvo dextránsulfátu vyskytujúceho sa v komplexe získanom po každej gélovej filtrácii. Detaily sú uvedené nižšie:

5(a) Inkubácia OCIF a dextránsulfátu

Bola použitá metóda, ktorá bola opísaná v príklade 1 (b) . Rekombinantný dimérny ľudský OCIF pripravený podľa príkladu l(a) bol rozpustený v 10 mM sodno-fosfátovom pufri (pH 6,0) obsahujúcom 0,15 M chlorid sodný, pričom vznikol roztok obsahujúci OCIF v koncentrácii 5 mg/ml. DS5 bol rozpustený v takto získanom roztoku, pričom vznikol roztok s finálnou koncentráciou DS5 150 mg/ml. Potom bol do roztoku pridaný 1 N hydroxid sodný a pH bolo nastavené na 10,5. Výsledný roztok bol 7 dní inkubovaný pri teplote. 4 °C, pričom vznikol komplex ľudského dimérneho OCIF a DS5.

5(b) Prvá gélová filtrácia

Roztok obsahujúci komplex ľudského dimérneho OCIF a DS5, ktorý bol získaný po inkubácii ako to bolo uvedené v príklade 5 (a), bol podrobený gélovej filtrácii podľa metódy opísanej v príklade 1(b). Frakcie boli zbierané v retenčnom čase 28 až 36 minút, zatiaľ čo voľný dextránsulfát, ktorý sa nenaviazal na OCIF bol eluovaný v retenčnom čase 50 až 70 minút.

5(c) Meranie obsahu proteínov

Množstvo proteínov vyskytujúce sa v komplexe bolo merané pomocou Lowryho metódy (Lowry, O.H. et al., 1951, J. Biol. Chem., 193, 265-275) nasledovným spôsobom:

0,2 g pentahydrátu sulfátu medi (II) (od firmy Wako Pure Chemical) bolo rozpustených vo vode s výsledným objemom 50 ml. 0,4 g dihydrátu tartarátu sodného (Wako Pure Chemical) bolo rozpustených vo vode s výsledným objemom 50 ml. 20 g uhličitanu sodného bolo rozpustených vo vode s výsledným objemom 100 ml. Tieto tri vodné roztoky boli zmiešané v objemovom pomere 1:1:2, tesne pred použitím. Výsledný roztok bol nazvaný ako roztok A. 10 g dodecylsulfátu sodného (od firmy Nacalai Tesque) bolo rozpustených vo vode s výsledným objemom 200 ml. Výsledný roztok bol nazvaný ako roztok B. 3,2 g hydroxidu sodného (od firmy Wako Pure Chemical) bolo rozpustených vo vode s výsledným objemom 100 ml. Výsledný roztok bol nazvaný ako roztok C. Roztoky A, B a C boli zmiešané v objemovom pomere 1:2:1, tesne pred použitím.

Separátne boli zmiešané folin-ciocalteu reagent (od firmy Wako Pure Chemical) a voda v objemovom pomere 1:5, tesne pred použitím. 2,76 g kyseliny citrónovej, dihydrátu trisodnej soli (Wako Pure Chemical), 0,13 g monohydrátu kyseliny citrónovej (Wako Pure Chemical), 1,75 g chloridu sodného a 0,1 g polysorbátu 80 bolo rozpustených vo vode s výsledným objemom 1,0 1 (pH 6,9), pričom vznikol roztok nazývaný ako dilučný roztok.

9,5 ml dilučného roztoku bolo pridaných do 50 μΐ štandardného roztoku hovädzieho albumínového séra (Pierce), obsahujúceho 2 mg/ml hovädzieho albumínového séra (BSA) v 0,9 % vodnom roztoku chloridu sodného obsahujúceho azid sodný v koncentrácii menšej ako 0,1 %, pričom vznikol roztok nazývaný ako 100 pg/ml BSA roztok. 3,5 ml, 3 ml, 2,5 ml a 2 ml dilučného roztoku bolo pridaných do 1,5 ml, 2 ml,

2,5 ml a 3 ml 100 μς/πιΐ BSA roztoku a vznikol roztok nazývaný ako 30 μg/ml BSA roztok, 40 μς/πιΐ BSA roztok, 50 pg/ml BSA roztok a 60 μg/ml BSA roztok. 3 ml dilučného roztoku bolo pridaných do 60 μg/ml BSA roztoku a vznikol roztok nazývaný ako 20 μg/ml BSA roztok.

Vzorka, ktorej obsah proteínov bol meraný, bola rozriedená dilučným roztokom, pričom vznikol roztok s finálnou koncentráciou proteínov približne 40 pg proteínu na 1 ml. 1 ml 20 pg/ml BSA roztoku, 30 pg/ml BSA roztoku, 40 pg/ml BSA roztoku, 50 pg/ml BSA roztok a 60 pg/ml BSA roztoku, rozriedená vzorka alebo dilučný roztok (n=3) bolo umiestnených do testovacej skúmavky. Do zmesi v skúmavke bol pridaný 1 ml alkalického činidla s meďou. Vzniknutý roztok premiešaný a 10 minút inkubovaný pri laboratórnej teplote. Potom bolo do roztoku pridaných 0,5 ml riedeného folin-ciocalteu reagent, zmes bola premiešaná a 30 minút inkubovaný pri .laboratórnej teplote. Následne bola pri vlnovej dĺžke 750 nm meraná absorbancia všetkých testovaných zmesi a to pomocou kremíkovej komôrky šírky 10 mm. Meranie bolo uskutočňované na UV spektrofotometri (Lambda 20: Perkin Elmer). Potom bolo stanovené množstvo proteinu obsiahnuté vo vzorkách. Stanovenie bolo uskutočnené pomocou kalibračnej krivky, vytvorenej meraním absorbancie BSA roztokov (ako hodnota zmenšená o množstvo BSA) .

5(d) Kvantifikácia dextránsulfátu

Množstvo dextránsulfátu naviazaného na ľudský OCIF

v komplexe,	ktorý bol získaný po prvej	gélovej	filtrácii
v príklade	5 (b) bolo merané pomocou	metódy	opísanej
v príklade	4 (c) .
5(e) Druhá	gélová filtrácia

Spojené frakcie získané v príklade 5 (b) boli nanesené na dve Centriprep filtrovacie jednotky (YM-30, 30 000 MW prah, Millipore Amicon) a 20 minút boli centrifúgované pri 2000 otáčkach na centrifúge himacCT60 (Hitachi Seisakusho). Neprefiltrované koncentrované roztoky získané z dvoch Centriprep filtrovacích jednotiek boli spojené. Vzniknutý roztok bol podrobený gélovej filtrácii, ako to bolo opísané v príklade 1(b) a frakcie s retenčnými časmi 28 až 36 minút boli odobrané a spojené. Potom bol meraný obsah proteínov a cukrov v komplexoch nachádzajúcich sa v spojených frakciách pomocou metód opísaných v príkladoch 5(c) a 5(d).

5(f) Tretia gélová filtrácia

Spojené frakcie získané v príklade 5 (b) boli nanesené na dve Centriprep filtrovacie jednotky (YM-30, 30 000 MW prah, Millipore Amicon) a 20 minút boli centrifúgované pri 2000 otáčkach na centrifúge himacCT60 (Hitachi Seisakusho). Neprefiltrované koncentrované roztoky získané z dvoch Centriprep filtrovacich jednotiek boli spojené. Vzniknutý roztok bol podrobený gélovej filtrácii, ako to bolo opísané v príklade 1(b) a frakcie s retenčnými časmi 28 až 36 minút boli odobrané a spojené. Potom bol meraný obsah proteínov a cukrov v komplexoch nachádzajúcich sa v spojených frakciách pomocou metód opísaných v príkladoch 5(c) a 5(d).

5(g) Výpočet molekulového pomeru OCIF k dextránsulfátu

Molekulový pomer OCIF monoméru k dextránsulfátu, vyskytujúcich sa v komplexe vo frakciách získaných po prvej gélovej filtrácii v príklade 5(b), druhej gélovej filtrácii v príklade 5(e) a tretej gélovej filtrácii v príklade 5 (f) bol stanovený postupom uvedeným v príklade 4 (d) . Získané výsledky sú uvedené v tabuľke 4.

Tabuľka 4

gélová filtrácia	Molekulový pomer OCIF monoméru k dextránsulfátu v komplexe
prvá	1 : 2,2
druhá	1:2,3
tretia	1 : 2,1

Z vyššie uvedného je okamžite zrejmé, že molekulový pomer OCIF k dextránsulfátu v komplexe predkladaného vynálezu je pozoruhodne konštantný počas všetkých gélových filtrácií. Toto naznačuje vysoký stupeň stability väzby medzi OCIF a dextránsulfátom v komplexoch predkladaného vynálezu.

Príklad 6

Stupeň adsorpcie komplexu OCIF s dextránsulfátom na kolónu s naviazaným heparínom

6(a) Heparínová stĺpcová chromatografia

Všetky procedúry stĺpcovej chromatografie v tomto príklade boli uskutočnené pri prietokovej rýchlosti 4 ml/min.

Kolóna s naviazaným heparínom (HiTrap Heparin HP column, Amersham Pharmacia Biotech) bola preekvilibrovaná pomocou 5 ml 10 mM sodno-fosfátového pufra obsahujúceho 0,7

M chlorid sodný. Preparát z tabuľky 1 v príklade 1 bol rozpustený na finálnu koncentráciu proteínov 0,1 mg/ml pomocou 10 mM sodno-fosfátového pufra obsahujúceho

0, 7 M chlorid sodný.

ml rozriedeného roztoku bol nanesený na kolónu a bol odobraný prvý 1 mleluátu (frakcia A). Potom bolo na kolónu nanesených 5 ml 10 mM sodno-fosfátového pufra obsahujúceho 0,7 M chlorid sodný a bola odobraná druhá elučná frakcia s objemom 5 ml (frakcia B) . Nakoniec bolo na kolónu nanesených 4 ml 10 mM sodno-fosfátového pufra obsahujúceho 2 M chlorid sodný a boli odobrané 4 ml eluátu (frakcia C).

6(b) Meranie množstva

100 μΐ 0,1 M v ktorých bola rozpustená proti ľudskému OCIF (FERM gg/ml bolo nanesených mikrotitračnej platničky zakrytá a z každej jamky bolo Pharmaceutical) laboratórnej

OCIF v eluáte hydrogénuhličitanu monoklonálna BP-6 do (Maxisorp: inkubovaná počas noci pri teplote jamky odstránený existujúci pridaných 300 μΐ 50 ?

a platnička bola 2 teplote. Po odstránení sodného (pH 9,6), protilátka 01-19 420) s koncentráciou 10 každej jamky 96-jamkovej NUNC). Platnička bola °C. Potom bol roztok a do každej Block Ace (Dainippon hodiny inkubovaná pri roztoku z každej jamky bola každá jamka trikrát

7,4) obsahujúceho 0,1 uskutočnené prístrojom premytá pomocou 300 μΐ PBS (pH polysorbát 20. Premývanie bolo SÉRA WASHER MW-96R (Bio Tec).

o *o

Po príprave každého z troch jamôk eluátov vyššie uvedeným spôsobom bolo 20 μΐ (frakcia A, B a C) získaných v príklade 6(a) rozriedených na finálny objem 120 μΐ pomocou 0,2 M

Tris-HCL (pH 7,4) obsahujúceho 40 %

Block

Ace, 10 μρ/πιΐ boli vzorky čase¹ bolo

V rovnakom myšieho IgG a 0, 1 % polysorbátu 20.

rozriedené rovnakým objemom rozpustené

Potom známe čistej množstvo vody.

ľudského

OCIF v 120 μΐ 0,2 M

Tris-HCL (pH

7,4) obsahujúceho 40 %

Block Ace, myšieho a potom získaný pg/ml rozriedené rovnakým roztok bol použitý ako

IgG a 0,1 % polysorbát 20, objemom čistej vody: Takto štandard.

μΐ každého z rozriedených eluátov a štandardu bolo do jamôk ako to bolo vopred pripravenej uvedené vyššie, a platnička laboratórnej teplote, pri Iuchi mikrotitračnej bola 2 stálom nanesených platničky, hodiny inkubovaná pri premiešavaní mikroplatničkovým mixérom (NS-P, Do) . Potom bol z každej jamky roztok odstránený a

Seieikaždá jamka bola šesťkrát premytá pomocou 300 obsahujúceho 0,1 % polysorbát 20.

uskutočnené prístrojom SÉRA WASHER MW-96R μΐ PBS (pH

Premývanie (Bio Tec).

7,4) , bolo

K 100 μΐ 0,1 M Tris-HCL (pH 7,4) obsahujúceho 25 % Block Ace, 10 μς/πιΐ myšieho IgG a 0,1 % polysorbátu 20 bol pridaný POD01-4 zásobný roztok protilátky pripravenej v príklade 4(a) a vznikol 0,01 % roztoku (v/v). Tento roztok bol pridaný do každej jamky a platnička bola 2 hodiny inkubovaná pri laboratórnej teplote, pri stálom premiešavaní rovnakým mikroplatničkovým mixérom. Po odstránení roztoku z každej jamky boli tieto šesťkrát premyté pomocou 300 μΐ PBS (pH 7,4), obsahujúceho 0,1 % polysorbát 20. Premývanie bolo uskutočnené prístrojom SÉRA WASHER MW-96R (Bio Tec).

Po premytí jamôk bolo do každej jamky pridaných 100 μΐ 3,3',5,5'-tetrametylbenzidínu (TMB) (Scytek) a platnička bola 10 až 15 minút inkubovaná pri laboratórnej teplote pri stálom miešaní na rovnakom mikroplatničkovom mixéri ako bolo uvedené vyššie. .Potom bolo do každej jamky pridaných

100 μΐ TMB stop pufra (Scytek) . Po jemnom, ale dôkladnom premiešaní na mikroplatničkovom mixéri počas 1 minúty bola meraná absorbancia v každej jamke, pri vlnovej dĺžke 450 nm. Absorbancia bola meraná prístrojom SPECTRA THERMO,

TECAN. Množstvo OCIF obsiahnutého (a), (b) pomocou kalibračnej absorbancie každého koncentrácie. Stupeň krivky vyššie adsorpcie v jednotlivých frakciách (c) bolo potom počítané zostrojenej vynesením opísaného štandardu a testovaného komplexu OCIF .

s dextránulfátom na kolónu s naviazaným heparínom bol potom vypočítaný podľa nasledovného vzorca:

(g) («) + (b) + (c)

Výsledky sú uvedené v tabuľke pripravených v príklade 1. Uvedený výsledok pre nekomplexované OCIF. z tabuľky, nekomplexované OCIF kolónu oveľa silnejšie, ako

Taktiež bolo zistené, možno ďalej charakterizovať podľa na kolónu s viazaným heparínom.

vynálezu. vynálezu adsorpcie pre 7 je aj

Ako sú viazané komplexy že komplexy komplexov korešpondujúci možno vidieť na heparínovú predkladaného predkladaného stupňa ich

Tabuľka 5

Preparácia	Stupeň adsorpcie komplexu OCIF/DS na kolónu s naviazaným heparínom
Prep. 6	0,451
Prep. 7	0, 183
Prep. 8	0,153
Prep. 22	0,264
Prep. 24	0,072
Prep. 25	0, 611
Prep. 27	0, 141
OCIF	0, 998

Príklad 7

Imunologická detekcia komplexov OCIF/dextránsulfát (a) Meranie množstva proteínu

Množstvo proteínu obsiahnuté v preparácii v príklade 1 bolo stanovené pomocou metódy komplexu opísanej v príklade 5(c).

(b). Imunologické meranie množstva OCIF

Množstvo OCIF obsiahnuté v preparácii komplexu v príklade, určené imunologickou metódou, bolo stanovené pomocou testu ELISA opísaného v príklade 6.

7(c) Výpočet imunologickej detekčnej citlivosti

Hodnota získaná v príklade 7(b) bola vydelená odpovedajúcou hodnotou získanou v príklade 7 (a). Výsledná hodnota bola nazvaná ako imunologická detekčná citlivosť.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 6. Uvedený je aj odpovedajúci výsledok pre nekomplexovaný OCIF. Bolo zistené, že komplexy predkladaného vynálezu sú ďalej charakterizované pomocou ich imunologickej detekčnej citlivosti.

Tabuľka 6

Preparácia	Imunologická detekčná citlivosť komplexov OCIF/DS
Prep. 6	1,07
Prep. 7	0,74
Prep. 8	0,88
Prep. 22	1,06
Prep. 24	1,02
Prep. 25	0,87
Prep. 27	1,04
OCIF	1,06

Referenčný príklad 1

Preparácia kombinácie OCIF a dextránsulfátu

Kombinácia OCIF a sodnej soli dextránsulfátu (molekulová hmotnosť 5 000 alebo 10 000) bola pripravená nasledovným spôsobom pomocou metódy uvedenej v príklade 1 v EP-A-1 127 578 (WO-A-2000/24 416).

Purifikovaný dimérny ľudský OCIF s molekulovou hmotnosťou asi 120 000, pripravený spôsobom ako v príklade l(a), bol rozpustený v 10 mM sodno-fosfátovom pufri (pH 6,0) obsahujúcom 0,15 M chlorid sodný a 0,01 % polysorbát 80, pričom vznikol roztok s koncentráciou OCIF 0,25 mg/ml. DS 5000 (Wako Pure Chemical Industries), opísaný v príklade 2, alebo sodná sol dextránsulfátu s molekulovou hmotnosťou 10 000 (Wako Pure Chemical Industries, nazývaný DS 10 000) boli rozpustené vo výslednom vodnom roztoku, pričom vznikol roztok s finálnou koncentráciou sodnej soli dextránsulfátu 1 alebo 4 mg/ml. Potom bol do roztoku pridaný hydroxid sodný a pH bolo upravené na 7. Takto získaný vodný roztok bol 24 hodín inkubovaný pri teplote 4 °C, pričom vznikol očakávaný preparát obsahujúci OCIF a DS 5 000 alebo DS 10 000. Tieto preparáty boli použité na porovnanie v testovacom príklade 1, uvedenom nižšie.

Podmienky preparácie pre každú kombináciu sú uvedené v tabuľke 7.

Tabuľka 7

číslo t referenčnej preparácie	Dextránsulfát	OCIF koncen. (mg/ml)	Teplota (°C)	PH	Čas inkubácie
typ	koncentr. (mg/ml)
Ref. prep.l	DS 5000	4	0,25	4	7	24
Ref. prep.2	DS100000	1	0,25	4	7	24

Testovací príklad

Meranie sérovej koncentrácie komplexov obsahujúcich OCIF a dextránsulfát l(a) Injekcie a odber krvných vzoriek

Päťtýždňové samičky krýs kmeňa Wistar (telesná hmotnosť asi 100 g) boli podrobené nočnému· hladovaniu. Preparáty OCIF a dextránsulfátu, pripravené v príklade 1, 2 alebo v referenčnom príklade 1, boli roriedené na koncentráciu 0,25 mg/ml pomocou PBS (pH 7,4), obsahujúceho 0,01 % polysorbát 80. Uvedené roztoky boli pripravené vo forme injekcií a boli podávané intravenózne do chvostíka krýs jedným podaním v dávke 2 ml/kg telesnej hmotnosti, hodín po podaní bola zo srdca krýc odobraná krvná vzorka.

1(b) Frakcionácia séra

Po koagulácii odobranej krvi z príkladu 1(a) počas 30 minút pri laboratórnej teplote bolo po cenrifugácii zrazeniny pri 14 000 otáčkach, počas 3 minút, rotorom s priemerom 10 cm, získané sérum vo forme supernatanta.

1(c) Kvantifikácia OCIF v sére

100 μΐ roztoku, v ktorom bola rozpustená monoklonálna protilátka 01-19 proti ľudskému OCIF (pozri EP-A-0 974 671/WO-A-99/15 691) v 0,1 M hydrogénuhličitane sodnom na finálnu OCIF koncentráciu 10 pg/ml, bolo pridaných do každej jamky 96-jamkovej (Maxisorp: NUNC). Platnička inkubovaná pri teplote do 4 ’C.

mikrotitračnej platničky bola zakrytá a cez noc Potom bol roztok protilátky odstránený a do každej jamky bolo pridaných 300 μΐ blokovacieho pufra (50 % Block

Pharmaceutical). Platnička bola

Ace, od firmy Dainippon hodiny inkubovaná pri laboratórnej teplote. Potom bola každá jamka trikrát premytá pomocou 300 μΐ PBS (pH 7,4), obsahujúceho 0,1 % polysorbát 20.

100 μΐ čistenej vody a 120 μΐ dilučného pufra (0,2 M Tris-hydrochloritá kyselina, 40 % Block Ace, 10 μς/πιΐ myšieho IgG a 0,1 % polysorbátu 20, pH 7,4) bolo pridaných do 20 μΐ testovaného séra, ktoré bolo získané spôsobom uvedeným vyššie v l(b). Zmes bola premiešaná. Ako kontrola bolo zmiešaných 100 μΐ čistenej vody a 120 μΐ dilučného pufra obsahujúceho dimérny ľudský OCIF so známou koncentráciouTáto zmes bola pridaná do 20 μΐ destilovanej vody a bola dôkladne premiešaná.

100 μΐ každej preparácie séra bolo pridaných do každej jamky a platnička bola 2 hodiny inkubovaná pri laboratórnej teplote. Potom bola každá jamka šesťkrát premytá pomocou 300 μΐ roztoku obsahujúceho 0,1 % polysorbát 20 (pH 7,4).

100 μΐ roztoku získaného 1000-násobným rozriedením zásobného roztoku protilátky POD-OI-4 získanej v príklade (a) v dilučnom pufri (0,1 M Tris-hydrochloritá kyselina, % Block Ace, 10 μg/ml myšieho IgG a 0,1 % polysorbát 20, pH 7,4) bolo pridaných do každej jamky a platnička bola 2 hodiny inkubovaná pri laboratórnej teplote.

Potom bola každá jamka šesťkrát premytá pomocou 300 μΐ PBS (pH 7,4), obsahujúceho ,0,1 % polysorbát 20. 100 μΐ substrátového roztoku (TMB solubilizačné činidlo, Scytek) bolo potom pridaných do každej jamky a platnička bola 10 až 15 minút inkubovaná pri laboratórnej teplote. Potom bolo do každej jamky pridaných 100 μΐ roztoku pozastavujúceho reakciu (TMB stop buffer, Scytek).

Po jemnom premiešaní pomocou mixéra (Microplate mixér NS-P, Iuchi Seiei-Do), bola na SPECTRA THERMO platničkovej čítačke meraná absorbancia každej jamky pri vlnovej dĺžke 450 nm. Koncentrácia OCIF v testovanom sére bola potom odčítaná z kalibračnej krivky zostrojenej podľa štandardného OCIF roztoku. Dávka bola počítaná ako dávka OCIF na kg telesnej hmotnosti (mg/kg) tak, že sa merala koncentrácia OCIF v každej injekcii pripravenej v príklade l(a) podovným spôsobom, ako meranie OCIF v sére.

l(d) Sérová koncentrácia

OCIF v sére získanom ako bolo uvedené v príklade 1(b) bol kvantifikovaný v každej vzorke pomocou metódy opísanej v l(c). Výsledky sú uvedené v tabuľke 8.

Tabuľka 8

preparácie	dávka (OCIF mg/kg)	sérová koncentrácia (OCIF ng/ml)	korigovaná sérová koncentrácia* (OCIF ng/ml)
prep. 1	0,5	213
prep. 2	0,5	350
prep. 3	0,5	191
prep. 4	0, 5	370
prep. 5	0,5	305
prep. 6	0,5	209

prep.	7	0, 5	371
prep.	8	0,5	571
prep.	9	0,5	164
prep.	10	0,5	174
prep.	11	0,5	235	1
prep.	12	0,5	249
prep.	13	0, 5	177
Prep.	14	0,5	271
prep.	15	0,5	313
Prep.	16	0,5	359
prep.	17	0,5	269
Prep.	18	0,6	400	351
prep.	19	0,4	526	614
prep.	20	0,4	553	760
Prep.	21	0,1	132	611
prep.	22	0, 6	752	651
prep.	23	0, 5	340
Prep.	24	0,5	830
prep.	25	0,5	165
prep.	26	0,5	574
prep.	27	0, 5	584
Prep.	28	0, 5	228
prep.	29	0,5	231
prep.	30	0, 5	620
Prep.	31	0,5	338
Prep.	32	0,5	774
prep.	33	0, 5	879
prep.	34	0,5	667
prep.	35	0,2	318	795
prep.	36	0,1	114	570
Prep.	37	0, 5	535
prep.	38	0,4	631	789
prep.	39	0,5	366

prep. 40	0,5	423
prep. 41	0,4	423	508
Ref. prep. 1	0, 5	75
Ref. prep. 2	0, 5	24

* Korigovaná sérová koncentrácia je koncentrácia OCIF, kedy je dávka OCIF na kg telesnej hmotnosti konvertovaná na 0,5 mg/kg.

Ako je uvedené v tabuľke 8, sérové koncentrácie prípravkov predkladaného vynálezu, podávaného v dávke 0,5 mg/kg telesnej hmotnosti boli. 6 hodín po podaní 2,2 až 11,7x vyššie ako tie, ktoré 'boli dosiahnuté po podaní referenčného prípravku 1 v rovnakej dávke.

Priemyselná využiteľnosť

Ako bolo uvedené vyššie, komplexy predkladaného vynálezu skladajúce sa z aspoň jedného OCIF, jeho analógu alebo variantu a z aspoň jedného polysacharidu alebo jeho variantu sú po podaní udržiavané v krvnom riečišti v signitifikantne' vyššej koncentrácii v porovnaní so známymi kombináciami obsahujúcimi OCIF a polysacharidy, ako napríklad, ktoré sú uvedené v WO-A-2 000/24 416. Komplexy predkladaného vynálezu sú vhodné na prevenciu alebo liečbu rôznych chorôb metabolizmu kostí, ako je napríklad osteoporóza, hyperkalcémia, metastázy karcinómov v kostiach, strata kostnej hmoty v dôsledku reumatoidnej artritídy, osteopénia v dôsledku steroidnej medikácie, mnohopočetný myelóm, osteopénia alebo hyperkalcémia v dôsledku renálnej dysfunkcie, renálna osteodystrofia, osteoartritída a pod.

Zoznam sekvencii <110> Sankyo Company, Limited <120> Komplex skladajúci sa z OCIF a polysacharidu <130> EPP85710 (FP-200229SW) <150> JP 2001-198985 <151> 2001-06-29 <160> 1 <170> Patentln verzia 3.1 <210> 1 <211> 401 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> SIGNÁL <222> (-21)..(-1) <223>

<220>

<221> mat_peptid <222> ( + 1) . .(+380) <223>

<400> 1

Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp íle Ser íle -20 -15 -10

Lys

Trp

Thr

Gin

Glu

Thr

Phe

Pro

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr

Asp

-5

-1

1

5

10

Glu

Thr

Ser

His

Gin

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Pro

Gly

Thr

15

20

25

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

Cys

Thr

Ala

Lys

Trp

Lys

Thr

Val

Cys

Ala

Pro

30

35

40

Cys

Pro

Asp

His

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

45

50

55

Leu

Tyr

cys

Ser

Pro

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gin

Tyr

Val

Lys

Gin

Glu

60

65

70

75

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Lys

Glu

Gly

Arg

Tyr

80

85

90

Leu

Glu

íle

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

His

Arg

Ser

cys

Pro

Gly

Phe

95

100

105

Gly

Val

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Arg

110

115

120

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Asn

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

125

130

135

Arg

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Gin

Lys

140

145

150

155

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

íle

Cys

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Ser

Thr

160

165

170

Gin

Lys

Cys

Gly

íle

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

175

180

185

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Lys

Phe

Thr

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

Val

Leu

Val

190

195

200

Asp

Asn

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

íle

205

210

215

Lys

Arg

Gin

His

Ser

Gin

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

220

225

230

235

Trp

Lys

His

Gin

Asn

Lys

Asp

Gin

Asp

íle

Val

Lys

íle

Gin

240

245

250

Asp

íle

Asp

Leu

Cys

Glu

Asn

Ser

Val

Gin

Arg

His

íle

Gly

His

Ala

255

260

265

Asn

Leu

Thr 270

Phe Glu Gin

Leu

Arg Ser 275

Leu

Met

Glu

Ser 280

Leu

Pro

Gly

Lys

Val

Gly

Ala

Glu

Asp

íle

Glu

Lys

Thr

íle

Lys

Ala

Cys

Lys

285

290

295

Pro

Ser

Asp

Gin

íle

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

íle

Lys

Asn

300

305

310

315

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

His

Ala

Leu

Lys

His

Ser

320

325

330

Lys

Thr

Tyr

His

Phe

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

Gin

Ser

Leu

Lys

Thr

335

340

345

íle

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Lys

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

350

355

360

Phe

Leu

Glu

Met

íle

Gly

Asn

Gin

Val

Gin

Ser

Val

Lys

íle

Ser

Cys

365

370

375

Leu

380

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Komplex, vyznačujúci sa tým, že sa skladá aspoň z jednej látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej faktor inhibujúci osteoklastogenézu OCIF, jeho analógy alebo varianty, ktorá je naviazaná na aspoň jednu látku vybranú zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy alebo ich deriváty.
2. Komplex podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa použije látka vybraná zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy a varianty, ktorá je prírodného alebo rekombinantného typu.
3. Komplex podlá nárokov 1 a 2, vyznačujúci sa tým, že sa použije látka vybraná zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy a varianty, ktorá je vo forme monoméru alebo diméru.
4. Komplex podlá nároku 3, vyznačujúci sa tým, že sa použije látka vybraná zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy a varianty, ktorá je ľudským monomérnym OCIF s molekulovou hmotnosťou približne 60 000, nameranou pomocou metódy SDS-PAGE v neredukujúcich podmienkach; alebo ľudským dimérnym OCIF s molekulovou hmotnosťou 120 000, nameranou pomocou metódy SDS-PAGE v neredukujúcich podmienkach.
5. Komplex podľa nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že sa použije OCIF zahŕňajúci aminokyseliny -21 až +380, ktoré sa nachádzajú v sekvencii číslo 1, uvedenej v zozname sekvencii.
6. Komplex podľa nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že sa použije OCIF zahŕňajúci aminokyseliny +1 až +380, ktoré sa nachádzajú v sekvencii číslo 1, uvedenej v zozname sekvencii.
7. Komplex podľa nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že sa použijú polysacharidy a ich deriváty vybrané zo skupiny zahŕňajúcej kyselinu hyalurónovú, kyselinu chondroitínsírovú, kyselinu dermatánovú, kyselinu heparánovú, kyselinu keratánovú, karagenan, pektín, heparín, dextrán a ich deriváty.
8. Komplex podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že sa použije polysacharidový derivát vybraný z dextránsulfátu a jeho solí.

9. Komplex podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa použije polysacharidový derivát, ktorým je sodná soľ dextránsulfátu. 10. Komplex podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa

použije dextránsulfát s priemernou molekulovou hmotnosťou od 1 500 do 12 000.
11. Komplex podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa použije dextránsulfát s priemernou molekulovou hmotnosťou od 1 800 do 6 000.
12. Komplex podľa nárokov 1 až 11, vyznačujúci sa tým, že molekulový pomer látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy a varianty k látke vybranej zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy a ich deriváty je od 1:1 do 1:10.
13. Komplex podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že molekulový pomer je od 1:1 do 1:8.
14. Komplex podľa nárokov 1 až 13, vyznačujúci sa tým, že sila adsorpcie komplexu zahŕňajúceho OCIF alebo jeho analóg alebo variant na heparin je nižšia ako sila adsorpcie voľných, nekomplexovaných OCIF alebo jeho analógov alebo variantov.
15. Komplex podľa nároku adsorpcie nasledovného tým, že stupeň

a) kolóna na ktorých komplexu spôsobu, naplnená je na

14, vyznačujúci sa heparin, vyčíslený na podklade menší ako 0,7, pričom:

je zosieťovanými agarózovými guličkami, imobilizovaný heparin, pufrom s relatívne nízkou iónovou silou, 0,8 M chlorid sodný ;

b) testovaný komplex je rozpustený s nízkou iónovou silou, ako bol použitý v na kolónu a zbiera sa prvý eluát (frakcia

c) kolóna je prepláchnutá iónovou silou, ako druhý eluát (frakcia

d) kolóna je potom je ekvilibrovaná obsahujúcim 0,1 až v rovnakom pufri (a) a je nanesený A) ;

rovnakým bol použitý v kroku B) .

prepláchnutá pufrom pufrom s nízkou (a) a zbiera sa s vysokou iónovou silou obsahujúcim 1,0 až 2,0’ M chlorid sodný a je odobraný tretí eluát (frakcia C);

e) množstvo komplexu, ktoré sa vyskytuje v každej z frakcií A, B, C, pričom tieto sú označené (a), (b) a (c) je potom stanovené pomocou imunoanalýzy; a

f) stupeň adsorpcie komplexu na heparin sa potom stanoví podľa nasledovného vzorca (Ij :

stupeň adsorpcie = ---------- (I) (a)+ (/>) +(c)
16. Komplex podľa nárokov 1 až 15, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa OCIF alebo analóg alebo variant a dextránsulfát alebo jeho soľ, kde pomer počtu molekúl OCIF alebo jeho analógu alebo variantu vyskytujúci sa v komplexe, ako bolo stanovené ELISA metódou pomocou monoklonálnej protilátky 01-19 proti ľudskému OCIF, ktorá bola purifikovaná z hybridómovej kultúry produkujúcej protilátku 01-19 (FERM BP-6 420), a ktorá je naviazaná na pevnú fázu; a pomocou monoklonálnej protilátky 01-4 proti ľudskému OCIF, ktorá bola purifikovaná z hybridómovej kultúry produkujúcej protilátku 01-4 (FERM BP-6 419), a ktorá je značená peroxidázou v mobilnej fáze, k počtu molekúl OCIF alebo jeho analógov alebo variantov v komplexe, ako bolo

stanovené meraním celkového proteinu pomocou Lowryho metódy, je od 0,5 do 1,2. 17 Komplex podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že pomer sa pohybuje medzi 0,6 a 1,1. 18 Komplex podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že pomer sa pohybuje medzi 0,7 a 1,1. 19 Komplex podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým l že sa

použije látka vybraná zo skupiny zahŕňajúcej OCIF alebo jeho analógy a varianty, ktorá je ľudským monomérnym OCIF, pričom, ako bolo merané pomocou SDS-PAGE v neredukujúcich podmienkach, jej molekulová hmotnosť je približne 60 000, alebo dimérnym OCIF, pričom, ako bolo merané pomocou SDSPAGE v neredukujúcich podmienkach, jej molekulová hmotnosť je približne 120 000; a polysacharidy a ich deriváty, ktoré sú vybrané zo skupiny zahŕňajúcej kyselinu hyalurónovú, kyselinu chondroitinsirovú, kyselinu dermatánovú, kyselinu heparánovú, kyselinu keratánovú, karagenan, pektín, heparín, dextrán a jeho deriváty, pričom molekulový pomer uvedenej látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty k látke vybranej zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy a ich deriváty je od 1:1 do 1:10.
20. Komplex podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa použije látka vybraná zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy a varianty, pričom je monomérnym OCIF s molekulovou hmotnosťou 60 000, určenou pomocou SDS-PAGE v neredukujúcich podmienkach; alebo dimérným OCIF s molekulovou hmotnosťou 120 000, určenou pomocou SDS-PAGE v neredukujúcich podmienkach, jej; a polysacharidy a ich deriváty vybrané zo skupiny zahŕňajúcej dextránsulfát a jeho soli, pričom molekulový pomer uvedenej látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty k látke vybranej zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy a ich deriváty je od 1:1 do 1:10.
21. Komplex podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa použije látka vybraná zo skupiny zahŕňajúcej OCIF alebo jeho analógy a varianty, ktorá je ľudským monomérnym alebo dimérným OCIF, v ktorom monomér alebo jedna jednotka OCIF diméru zahŕňa aminokyseliny +1 až +380 sekvencie uvedené pod číslom 1 v zozname sekvencií; a derivát polysacharidu, ktorým je sodná soľ dextránsulfátu s priemernou molekulovou hmotnosťou od 1500 do 12000, pričom molekulový pomer uvedenej látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty k sodnej soli dextránsulfátu je od 1:1 do 1:10.
22. Komplex podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že molekulový pomer látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty k sodnej soli dextránsulfátu je od 1:1 do 1:8.
23. Komplex podía nároku 21, vyznačujúci sa tým, že molekulový pomer látky vybranej zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty k sodnej soli dextránsulfátu je od 1:1 do 1:5.
24. Komplex podľa nárokov 21 a 23, vyznačujúci sa tým, že sa použije derivát polysacharidu, ktorým je sodná soľ dextránsulfátu s priemernou molekulovou hmotnosťou od 1 800 do 6 000.
25. Spôsob podania, vyznačujúci sa tým, že sa predĺži retenčný čas OCIF, jeho analógu alebo vyriantu v krvnom riečišti po podaní pacientovi, pričom pred podaním sa skomplexuje aspoň jeden OCIF, jeho analóg alebo variant, ako bolo definované v nárokoch 1 až 6, s aspoň jedným polysacharidom alebo jeho derivátom, ako bolo definované v nárokoch 1 až 7 a 11.
26. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje účinné množstvo farmaceutický aktívnej látky spolu s nosičom alebo rozpúšťadlom, pričom farmaceutický aktívna látka predstavuje komplex podľa nárokov 1 až 24.
27. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že sa použije na liečbu alebo profylaxiu chorôb metabolizmu kostí.
28. Použitie komplexu podľa nárokov 1 až 24 na prípravu liečiva určeného na liečbu alebo prevenciu chorôb metabolizmu kostí.
29. Použitie podľa nároku 28 na liečbu chorôb metabolizmu kostí, vybraných zo skupiny zahŕňajúcej osteoporózu, Pagetovu chorobu, osteomyelitídu, stratu kosti na podklade infekčných ložísk, hyperkalcémiu, deštrukciu kĺbov alebo osteopéniu v dôsledku reumatizmu, osteoartritídu, stratu periodontu, metastázy karcinómov v kostiach, osteonekrózu alebo zánik osteocytov. sprevádzajúci traumatické poranenia kostí, Gaucherovu chorobu, kosákovitú anémiu, systémový lupus erythematosus alebo netraumatické poranenia kostí, osteodystrofiu a kachexiu v dôsledku tumorov alebo metastáz tumorov do kosti alebo zhubných ochorení krvotvorby.
30. Spôsob prípravy komplexu podlá nárokov 1 až 24, vyznačujúci sa tým, že sa inkubuje aspoň jedna látka vybraná zo skupiny OCIF, jeho analógy alebo varianty, ako bolo definované v nárokoch 1 až 6, s aspoň jednou látkou vybranou zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy a ich deriváty, ako bolo definované v nárokoch 1 a 7 až 11, pričom pH sa pohybuje od 9,5 do 12; s následným odstránením voľných polysacharidov alebo ich derivátov, ktoré sa nenaviazali na OCIF, jeho analógy alebo varianty.
31. Spôsob podía nároku 30, vyznačujúci sa tým, že sa inkubuje aspoň jedná látka vybraná zo skupiny zahŕňajúcej OCIF, jeho analógy alebo varianty s aspoň jednou látkou vybranou zo skupiny zahŕňajúcej polysacharidy a ich deriváty, pričom reakcia sa uskutočňuje pri pH od 10 do 11.
32. Komplex podľa nárokov 1 až 24, vyznačujúci sa tým, že sa pripraví spôsobom podľa nárokov 30 až 32.