JPH11500904A - Ｍｐｌリガンド類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 対応するアミノ酸数の天然型ｍｐｌリガンド配列と比較して１つ以上の変化したグリコシル化部位を有するｍｐｌリガンド類似体を開示する。この発明はまた、ｍｐｌリガンド類似体をコードするＤＮＡ配列、類似体発現用の組換えプラスミド及び宿主細胞、並びにそのような類似体を含有する治療組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＭＰＬリガンド類似体 発明の分野 本発明は、少なくとも一つの変化したＯ−またはＮ−結合型グリコシル化部位 を有するｍｐｌリガンド類似体に関する。本発明は、これらのｍｐｌリガンド類 似体をコードするＤＮＡ配列、ならびに類似体発現のための組み換えプラスミド および宿主細胞にも関する。 発明の背景 ＭＧＤＦ、すなわち巨核球成長および発生因子は、循環血小板量の主要な調節 物質であるらしい最近クローニングされたサイトカインである。バートレイ（Ｂ ａｒｔｌｅｙ，Ｔ．Ｄ．）らのＣｅｌｌ第７７巻：１１１７〜１１２４頁（１９ ９４年）；ロック（Ｌｏｋ，Ｓ．）らのＮａｔｕｒｅ第３６９巻：５６５〜５６ ８頁（１９９４年）；ドゥ・ソーベジ（ｄｅ Ｓａｕｖａｇｅ，Ｆ．Ｊ．）らの Ｎａｔｕｒｅ第３６９巻：５３３〜５３８頁（１９９４年）；ミヤザキ（Ｍｉｙ ａｚａｋｅ，Ｈ）らのＥｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．第２２巻：８３８頁（１９９４ 年）；およびクッター（Ｋｕｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．）らのＰＮＡＳ ＵＳＡ第９１巻：１１１０４〜１１１０８頁（１９９４年）参照。バートレイ（ Ｂａｒｔｌｅｙ，Ｔ．Ｄ．）らのＣｅｌｌ第７７巻：１１１７〜１１２４頁（１ ９９４年）に記載されたＭＧＤＦは、トロンボポイエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏ ｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）、ｍｐｌリガンドおよびメガポイエチン（ｍｅｇａｐｏｉ ｅｔｉｎ）とも呼ばれる。本明細書中で、“ｍｐｌリガンド”という用語は、一 般的に、ＴＰＯおよびＭＧＤＦを含む、ｍｐｌレセプターを活性化する全てのポ リペプチドに言及するのに用いられる。ｍｐｌレセプターは、活性化時に巨核球 および血小板の生成および／または発生に導く細胞表面タンパクである。ＷＯ９ ２／０７０７４を参照されたい。 “ｍｐｌリガンド類似体”は、炭水化物結合部位の数、位置または型に影響を 与えるように天然の配列と異なるポリペプチドである。そのようなポリペプチド は、本発明の一つの態様である。成熟した天然ヒトｍｐｌリガンドは、合計で３ ３２個のアミノ酸を有するタンパクである。（２１アミノ酸長のリーダー配列に 結合された）このタンパクの配列および対応するｃＤＮＡを、図１に示す（配列 番号１および２）。 チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＥ．ｃｏｌｉ 細胞の両方において生成される組み換えｍｐｌリガンドは、マウス、ラットおよ びサルの生体内において巨核球および／または血小板を特異的に刺激または増加 させる生物学的活性を有することが示された。例えば、フント（Ｈｕｎｔ，Ｐ． ）らのＢｌｏｏｄ第８４（１０）巻：３９０Ａ頁（１９９４年）を参照のこと。 図１のアミノ酸位置２２から出発して少なくとも１５１個のアミノ酸をもつよう に切頭（truncated）されたヒトｍｐｌリガンド分子は（ヒトのｃＤＮＡにより コードされる３３２アミノ酸のタンパクと比較して）、生体内において生物学的 活性を維持している。図２（配列番号３および４）は、成熟型で１７４個のアミ ノ酸を有し生物学的活性を有する切頭型ｍｐｌリガンド分子の一例を示す。図２ には、２１アミノ酸のＮ末端リーダー配列に結合している１７４アミノ酸長のタ ンパクが示されている。下記の実施例において、この分子を用いてｍｐｌリガン ド類似体の幾つかを製造した。他の類似体は、図１のアミノ酸１〜１９９、１〜 １９１、および１〜１８３に基づく。成熟型ヒト配列ｍｐｌリガンドタンパクの Ｎ末端の最初の６個のアミノ酸を除去し、生物学的活性を維持することも可能で ある。従って、図１に示すヒトｍｐｌリガンドの成熟型アミノ酸 配列のアミノ酸７〜１５１（７および１５１も含む）内に生物学的活性が維持さ れるようである。 通常、真核生物細胞により産生された多くの細胞表面の分泌タンパクは、一ま たはそれ以上のオリゴ糖基により修飾される。この修飾は、グリコシル化と呼ば れるが、タンパクの物理的性質に大きく影響を与えることができ、タンパクの安 定性、分泌および細胞内局限において重要でもあり得る。適正なグリコシル化は 、生物学的活性に必須であり得る。実際、真核生物からの一部の遺伝子は、タン パクをグリコシル化するための細胞過程を欠くバクテリア（例えば、Ｅ．ｃｏｌ ｉ）において発現されたときに、グリコシル化の欠如により活性がほとんどない かまたは全く無い状態で回収されるタンパクを生成する。 グリコシル化は、ポリペプチド主鎖に沿った特異的な位置または部位において 生じ、通常二つの型がある。すなわち、Ｏ−結合型オリゴ糖はセリン（Ｓｅｒ） またはトレオニン（Ｔｈｒ）残基に結合し、一方、Ｎ−結合型オリゴ糖（鎖）は 、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸であり 得る）の一部である場合、アスパラギン（Ａｓｎ）残基に結合する。Ｘは、好ま しくは、プロリンを含まない１９個の 天然アミノ酸の一つである。Ｎ−結合型およびＯ−結合型オリゴ糖と各型におい て見られる糖残基の構造は異なる。両方において共通して見られる一つの型の糖 はＮ−アセチルノイラミン酸（以下、シアル酸と呼ぶ）である。シアル酸は、通 常、Ｎ−結合型およびＯ−結合型オリゴ糖の両方の末端残基であり、その陰電荷 故に、糖タンパクに酸性を付与し得る。 本明細書中で用いられるグリコシル化“部位”は、グリコシル残基に構造的に 結合することのできるアミノ酸残基であるが、そのような部位はグリコシル残基 に実際に結合しても結合しなくてもよい。前述したように、Ｏ−結合部位はＳｅ ｒまたはＴｈｒ残基であるが、Ｎ−結合部位はＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ −Ｘ−Ｔｈｒであり、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸と定義される（好ましく はＰｒｏを除く１９個の天然アミノ酸の一つである）。所定の部位がグリコシル 鎖でグリコシル化されるかどうかは、分子が発現される宿主細胞、その部位に隣 接するアミノ酸、および他の因子により決定される。 本明細書中で用いられる、所定のｍｐｌリガンド類似体に結合される“鎖”の 数は、特定の宿主細胞により発現される所定のｍｐｌリガンド分子に結合される 炭水化物（すなわちグリコ シル）鎖の平均の数である。特に、天然および対応する組み換えｍｐｌリガンド のためのグリコシル化部位は通常同じであるが、鎖の数は、組み換え発現のため に用いられる特定の宿主細胞がグリコシル鎖を、天然源と比べて同じ部位に結合 させるか否かによっておそらく変化する。本明細書中で、組み換え型と天然型の ｍｐｌリガンド類似体を比較する場合常に、天然源がその長さを有するｍｐｌリ ガンド分子を実際に生成するか否かに拘わらず同じ数のアミノ酸が比較される。 すなわち、“天然型”とは、そのような天然源中に実際に発現される分子の長さ よりも特定の種（例えばヒト）において用いられる配列に言及する。 天然型ｍｐｌ配列はグリコシル化分子である。天然型ｍｐｌリガンドのグリコ シル化パターンは、ｍｐｌリガンドにおいて見られた二つの重要なドメインに関 係する。分子の活性部分に相当する、成熟型ヒトｍｐｌリガンドの最初の約１５ １個のアミノ酸の配列は、エリトロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ： ＥＰＯ）、すなわち赤血球の生成を刺激することのできるサイトカインに著しく 類似しており、ヒトｍｐｌリガンドの“ＥＰＯ様”ドメインと呼ばれる。成熟型 タンパクの残りの アミノ酸は、Ｎ−結合型グリコシル化のための天然部位の全てでないにしても大 部分を含むので、いわゆる“Ｎ−結合型炭水化物”ドメインを構成する。ヒトｍ ｐｌリガンドにおいて、Ｎ−結合型グリコシル化ドメインに全てが含まれる６つ のＮ−結合型グリコシル化部位が存在する。両方のドメインがＯ−結合型グリコ シル化部位を含む。分子内に推定１２〜１４個のＯ−結合型グリコシル化鎖が存 在する。ＣＨＯ細胞内に組み換え的に発現されたヒトｍｐｌリガンドＤＮＡを用 いた実験的証拠は、ＥＰＯ様ドメインにおいて少なくとも二つのＯ−結合部位が １位（Ｓｅｒ）および３７位（Ｔｈｒ）においてグリコシル化されることを示し ている。 ｍｐｌリガンドのような糖タンパクは、等電点電気泳動（ＩＥＦ）のような技 術を用いて異なる電荷形に分離され得る。例えば、幾つかのグループが、粗製の または部分精製のエリスロポイエチン調製物のＩＥＦによる研究を報告している （ルコフスキー（Ｌｕｋｏｗｓｋｙ）らのＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第５０巻：９０ ９頁（１９７２年）；シェルトン（Ｓｈｅｌｔｏｎ）らのＢｉｏｃｈｅｍ.Ｍｅ ｄ.第１２巻:４５頁(１９７５年)；フール（Ｆｕｈｒ）らのＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂ ｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．第９８巻：９３０頁（１９８１年））。 ｍｐｌリガンド分子のグリコシル化に関する前記情報にも拘わらず、異なるグ リコシル化パターンを有し向上した生物学的活性を維持または有するｍｐｌリガ ンド分子を得る必要性が残っている。 従って、本発明の目的は、ｍｐｌリガンド類似体と呼ばれる新規グリコシル化 ｍｐｌリガンド分子を提供することである。本発明のさらなる目的は、そのよう な分子を含む医薬組成物、およびｍｐｌリガンドで治療できる症状を、本発明の ｍｐｌリガンド類似体を用いて治療する方法を提供することにある。 発明の要約 一つの実施態様において、本発明は、対応する天然型配列ｍｐｌリガンドと比 べて、グリコシル化のための部位が少なくとも一つ付加された、少なくとも一つ 欠失された、および／または少なくとも一つ付加されると共に欠失されたアミノ 酸配列を含むｍｐｌリガンドの類似体に関する。グリコシル化のための付加また は欠失された部位によって、対応する天然型配列ｍｐｌリガンド、特にヒトｍｐ ｌリガンドよりも、炭水化物鎖の数がより多くまたはより少なくなり、またシア ル酸含量がより高 くまたはより低くなる。例えば、一つの型の類似体は、同じ位置または別の位置 における、一つ以上のＮ−またはＯ−結合部位の除去、および一つ以上のＮ−ま たはＯ−結合部位の付加を含み得る。 前記実施態様のもう一つの態様において、本発明は、一つ以上のＮ−またはＯ −結合型グリコシル化部位が一つ以上の非天然部位で置換されているアミノ酸配 列を含むリガンドｍｐｌリガンド類似体に関する。すなわち、Ｎ−結合部位は異 なるＮ−結合部位で置換されてよく；Ｎ−結合部位はＯ−結合部位で置換されて よく；Ｏ−結合部位は異なるＯ−結合部位で置換されてよく;およびＯ−結合部 位はＮ−結合部位で置換されてよい。 いかなる前記変化の組み合わせも、さらに本発明に含まれる。 本発明は、さらに、そのようなｍｐｌリガンド類似体をコードするＤＮＡ配列 、ならびに類似体発現のための組み換えプラスミドおよび宿主細胞に関する。 前記の全ての場合において、グリコシル化部位の変化は、得られるｍｐｌリガ ンド類似体におけるグリコシル鎖の数、量、位置または型（Ｎ−とＯ−）の変化 を導き、ｍｐｌリガンドの生物学的活性を維持する、すなわち、類似体はｍｐｌ レセプタ ーをなお、活性化することができる。ｍｐｌレセプターの活性化は、巨核球産生 が高められ、それにより生体内で血小板が増加することを意味する。 図面の簡単な説明 図１は、シグナルペプチド（アミノ酸−２１〜−１）および成熟アミノ酸配列 （１〜３３２）を含む天然ヒトｍｐｌリガンドのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示 す。 図２は、２１アミノ酸長のシグナルペプチドに結合しているヒト成熟ｍｐｌリ ガンド配列のアミノ酸１〜１７４に対応するｍｐｌリガンドのＤＮＡおよびアミ ノ酸配列を示す。コード領域に隣接する配列が、ＸｂａＩおよびＳａｌＩクロー ニング部位をそれぞれ５’および３’末端に導入した。 図３は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣＨＯ発現ｍｐｌリガンドを用いたウエスタンブ ロットを示す。ＭＫは、Ｅ．ｃｏｌｉ内において発現されるようにｍｐｌリガン ドのＮ−末端に付加されるＭｅｔ−Ｌｙｓを表し、カテプシンＣのようなジペプ チダーゼを用いて切除され得る。ＭＫが除去された分子はｄｅｓＭＫと呼ばれる 。グリコシダーゼノイラミニダーゼおよびＯ−グリカナーゼでの処理が示されて いる。 図４は、正常マウスにおけるＥ．ｃｏｌｉおよびＣＨＯ発現ｍｐｌリガンドの 生体内活性を血小板数として示す。データは、グリコシル化ｍｐｌリガンド（Ｃ ＨＯ）物質が非グリコシル化（Ｅ．ｃｏｌｉ）物質よりも優れた活性を有するこ とを示している。これは、グリコシル化物質についての増加した半減期の結果で あり得る。例えば、ＣＨＯ３３２は、ＣＨＯ細胞内に発現されたヒトｍｐｌリガ ンドアミノ酸１〜３３２（図１）を示す。 図５は、組み換えヒトｍｐｌリガンドおよび類似体４、６、７、９、１０およ び１１のＣＯＳ細胞上澄みのウエスタンブロット分析を示す。類似体の構築は実 施例４に示されている。類似体４、７および１０は、ゲル移動が遅いことにより 証明されるように少なくとも一つのさらなる炭水化物鎖を有する。類似体番号は 表１に提供されている類似体番号に相当する（すなわち、１１は類似体Ｎ１１に 相当する）。対照は、表１中のＮ１である。 図６は、組み換えヒトｍｐｌリガンドおよび類似体４、５、１３、１４および １５のＣＯＳ細胞上澄みのウエスタンブロット分析を示す。類似体の構築は実施 例４に示されている。類似 体４、１３、１４および１５は、ゲル移動が遅いことにより証明されるように少 なくとも一つのさらなる炭水化物鎖を有する。 図７は、Ｎ−グリカナーゼで処理した後のヒトｍｐｌリガンドおよび示された ｍｐｌリガンド類似体のＣＯＳ細胞上澄みのウエスタンブロット分析を示す。結 果は、類似体が異なるグリコシル化パターンを有することを示している。 図８は、ｍｐｌリガンド類似体を用いたヒト巨核球成長バイオアッセイの結果 を示す。パネルＡおよびＤは、それぞれ陽性および陰性の対照である。パネルＡ に示されるウエルには、３７．５ｐｇの野生型（すなわち天然型配列）ｍｐｌリ ガンド１〜１７４ＣＯＳ−１ならし培地を入れたが、実質的な巨核球成長を示し ている。パネルＤには、１．５μｌのＣＯＳ−１ｍｏｃｋならし培地を入れたが 、成長を示していない。パネルＢおよびＣは、それぞれｍｐｌリガンド１〜１７ ４類似体７および１０である。パネルＢには、９．０ｐｇのｍｐｌリガンドＣＯ Ｓ−１ならし培地を入れ、パネルＣには、２７ｐｇを入れたが、共に優れた巨核 球成長を示している。 図９は、ＣＨＯｍｐｌリガンド１〜１７４ならびに類似体Ｎ４およびＮ１５の ウエスタンブロット分析を示している（表１ 参照）。ゲル移動が遅いことは、類似体Ｎ４（４Ｂ）が一つの更なるオリゴ糖を 有し、類似体Ｎ１５（１５−８）が二つの更なるオリゴ糖を有することを示して いる。 図１０は、示されるＮ−グリカナーゼでの処理を行うまたは行わないときのＣ ＨＯ細胞産生ｍｐｌリガンド類似体のウエスタンブロットを示す。Ｎ−グリカナ ーゼでの処理後のゲル移動が遅いことは、Ｎ−結合オリゴ糖の存在を示している 。 図１１は、種々の形態のｍｐｌリガンドを種々の投与量で用いて処理したマウ スからの血小板数を示している。データは、Ｎ−および／またはＯ−結合型炭水 化物の量の増加が生体内活性の向上につながることを示している。 図１２は、類似体Ｎ１０、Ｎ１５、Ｎ３３、Ｎ３９、Ｎ３１、Ｎ３５およびＮ ４０と共に、ＣＯＳ産生ｍｐｌリガンド１〜１７４のウエスタンブロット分析を 示している。付加されたＮ−結合型グリコシル化部位の数も示されている。図は 、Ｎ−結合部位の数が増加すると、Ｎ−結合型炭水化物の量の増加のためにｍｐ ｌリガンドの移動度が低下することを示している。 図１３は、類似体Ｎ１５、Ｎ２９、Ｎ３０およびＮ３８と共に、ＣＯＳ産生ｍ ｐｌリガンド１〜１７４のウエスタンブロッ ト分析を示している。Ｎ−結合型グリコシル鎖の数も示されている。 発明の詳細な説明 本発明は、対応する配列を有する天然型ｍｐｌリガンドと比べて異なるグリコ シル化部位を有するｍｐｌリガンドを提供する。好ましくは、得られる分子は、 哺乳動物細胞内（例えばＣＯＳ、ＣＨＯおよびヒト細胞）において発現された際 にグリコシル鎖により占有される付加的グリコシル化部位を有するものである。 第一の実施態様において、本発明は、対応する天然型配列ｍｐｌリガンドと比 べて、グリコシル化のための部位が少なくとも一つ付加された、少なくとも一つ 欠失された、および／または少なくとも一つ付加されると共に欠失されたアミノ 酸配列を含むｍｐｌリガンドの類似体に関する。グリコシル化のための付加また は欠失された部位によって、対応する天然型配列ｍｐｌリガンド、特にヒトｍｐ ｌリガンドよりも、炭水化物鎖の数がより多くまたはより少なくなり、またシア ル酸含量がより高くまたはより低くなる。一つの部位の欠失と別の部位の付加と の組み合わせにより、部位の数は正味変化せず、むしろ部位の 位置および／または型が変化する。そのように組み合わせた変化類似体も本発明 の範囲に入る。 前記実施態様のもう一つの態様において、本発明は、一つ以上のＮ−またはＯ −結合型グリコシル化部位が一つ以上の非天然部位で置換されているアミノ酸配 列を含むｍｐｌ類似体に関する。すなわち、Ｎ−結合部位は異なるＮ−結合部位 で置換されてよく；Ｎ−結合部位はＯ−結合部位で置換されてよく；Ｏ−結合部 位は異なるＯ−結合部位で置換されてよく；および／またはＯ−結合部位はＮ− 結合部位で置換されてよい。実質的に同じ位置においてある一つの部位を別の部 位で置換することは、その部位におけるグリコシル化効率の上昇または他の効果 につながり得る。例えば、Ｓｅｒ残基ではなくＴｈｒ残基がＯ−結合部位におい てグリコシル化効率を向上させ得る効果がここで提供される。 本明細書中で用いられる“ｍｐｌリガンド”という用語は、天然ｍｐｌリガン ド、天然ｍｐｌリガンドの切頭体（truncation）、ならびに、巨核球および／ま たは血小板の成長、発生および／または産生を特異的に刺激する生物学的活性を 有するように天然ｍｐｌリガンドと充分に重複するグリコシ ル化およびアミノ酸配列を有する非天然ポリペプチドを含む。少なくとも図１の アミノ酸７〜１５１からアミノ酸１〜３３２に基づくｍｐｌリガンド類似体が好 ましい。 好ましい実施態様において、ｍｐｌリガンドは、真核生物宿主細胞内にトラン スフェクションされている外来性ＤＮＡ配列の発現生成物である；すなわち好ま しい実施態様において、ｍｐｌリガンドは“組み換えｍｐｌリガンド”である。 好ましい真核生物宿主は哺乳動物、特に好ましくはＣＨＯ細胞である。組み換え ｍｐｌリガンドは、ｍｐｌリガンドのクローニングおよび発現に関して本明細書 に引用されている刊行物および本明細書に記載されている手順に従って有利に生 成される。 一部の更なる好ましいｍｐｌリガンド分子は図１に基づいて以下のアミノ酸配 列を有する： ｍｐｌリガンド１〜３３２ 図１のアミノ酸１〜３３２ ｍｐｌリガンド１〜１９９ 図１のアミノ酸１〜１９９ ｍｐｌリガンド１〜１９１ 図１のアミノ酸１〜１９１ ｍｐｌリガンド１〜１８３ 図１のアミノ酸１〜１８３ ｍｐｌリガンド１〜１７４ 図１のアミノ酸１〜１７４ ｍｐｌリガンド１〜１６３ 図１のアミノ酸１〜１６３ ｍｐｌリガンド１〜１５３ 図１のアミノ酸１〜１５３ ｍｐｌリガンド１〜１５２ 図１のアミノ酸１〜１５２ ｍｐｌリガンド１〜１５１ 図１のアミノ酸１〜１５１ ｍｐｌリガンド７〜３３２ 図１のアミノ酸７〜３３２ ｍｐｌリガンド７〜１９９ 図１のアミノ酸７〜１９９ ｍｐｌリガンド７〜１９１ 図１のアミノ酸７〜１９１ ｍｐｌリガンド７〜１８３ 図１のアミノ酸７〜１８３ ｍｐｌリガンド７〜１７４ 図１のアミノ酸７〜１７４ ｍｐｌリガンド７〜１６３ 図１のアミノ酸７〜１６３ ｍｐｌリガンド７〜１５３ 図１のアミノ酸７〜１５３ ｍｐｌリガンド７〜１５２ 図１のアミノ酸７〜１５２ ｍｐｌリガンド７〜１５１ 図１のアミノ酸７〜１５１ 例えば、ｍｐｌリガンド１〜１８３、１〜１９１、７〜１８３および７〜１９ １は、より短い配列と比べて、そのＣ−末端に一つまたは二つの付加的天然グリ コシル化部位を有することに注目すべきである。前述の各場合において、そのＮ −末端にＭｅｔ−Ｌｙｓがさらに含まれ得る。 本明細書中で言うインビトロ比活性は、相対的なインビトロ比活性の測定値で あり、絶対的なインビトロ比活性の測定値で はない。この出願の目的において、比活性は、同じアッセイを用いて、同じ内部 標準を含む同じ条件を用いてアッセイされ、比活性等の計算に用いられる同じデ ータ解析を有するｍｐｌリガンド類似体の相対的活性の比較にのみ用いられる。 本明細書中で用いられる“ｍｐｌリガンドの類似体”または“ｍｐｌリガンド 類似体”という表現は、ｍｐｌリガンドのアミノ酸配列に一つ以上の変化を有し 、それにより炭水化物結合の部位の型（Ｎ−またはＯ−結合：結合炭水化物の量 に影響を与え得る）、数または位置が変化しているｍｐｌリガンドを示す。好ま しい実施態様において、グリコシル化部位の変化は、ｍｐｌリガンド分子に結合 しているグリコシル鎖の数の変化につながる。特に好ましい実施態様において、 グリコシル化部位の変化は、少なくとも一つ（通常１〜６、好ましくは１〜５、 特に好ましくは２〜４）のグリコシル鎖を付加し、最も好ましくは鎖はＮ−結合 を介して付加される。もう一つの特に好ましい実施態様において、ｍｐｌリガン ド類似体は、天然配列ｍｐ１リガンド（例えばヒトｍｐｌリガンド）と比べて少 なくとも同等のインビボ生物学的活性を維持し、生物学的活性のアッセイにおい て測定して、インビボにおいて実質的により高い活性 を有し得る。そのようなアッセイは、巨核球または血小板産生を検出するアッセ イを含む。 そのようなｍｐｌリガンドの類似体の製造のために、好ましくは、グリコシル 化に利用できる部位を付加、除去または変化させるアミノ酸残基の付加、欠失ま たは置換につながる部位特異的変異誘発により生成が行われる。“変化”という のは、一つの部位が欠失され、別の部位が欠失部位と同じかまたは別の位置にお いて付加されていることを示す。しかしながら、当業者が認めるように、他の方 法により同じアミノ酸配列をコードする遺伝子を得ることができ、そのような方 法も本明細書に含まれる。得られる類似体は、天然ヒト／組み換えｍｐｌリガン ドよりも少ないかまたは多い（好ましくは多い）結合炭水化物鎖を有し得る。 一つ以上の炭水化物（すなわちグリコシル）鎖のｍｐｌリガンドへの付加は、 本発明の一つの重要な目的である。対応する天然アミノ酸配列（例えば１〜３３ ２または１〜１７４、等）において見付かるよりも多くの炭水化物鎖を有するｍ ｐｌリガンド類似体は、実質的に生物学的活性を活性を低下させるような方法で 二次構造または三次構造を乱すことのないグリコシル 化部位を付加することにより生成される。本明細書中で用いられる“天然”ｍｐ ｌリガンドとは、特定の長さのｍｐｌリガンド種が実際に天然種で発現されなく とも、関連類似体に対応する数のアミノ酸を有するアミノ酸配列を意味する。有 利には、ｍｐｌリガンドの類似体は、Ｎ−グリコシル化またはＯ−グリコシル化 のための６個以下の付加的部位を有し、それにより１〜６個の付加的Ｎ−結合型 またはＯ−結合型炭水化物鎖（またはその組み合わせ）が付加される。 例えば、３０位におけるＰｒｏがＡｓｎにより置換され、３２位におけるＶａ ｌがＴｈｒにより置換されて、Ｎ−グリコシル化のための新しい部位として役立 つ配列Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒが得られる（以下の類似体Ｎ４；表１参照）。 突然変異を組み合わせることにより二つ以上の更なるＮ−結合鎖を有する類似 体も構築することができ；例えば、表１に記載された類似体Ｎ４とＮ１０とを組 み合わせて炭水化物付加のための二つの更なる部位を有する類似体を生成するこ とができる（すなわち表１の類似体Ｎ１５）。同様にして、三つ以上鎖が付加さ れた類似体を構築することができる。当業者に認められるように、本発明は、（ 部位の数、型または位置において） グリコシル化のための異なる部位を有するｍｐｌリガンドの多くの他の類似体を 含む。本発明のｍｐｌリガンド類似体は、全ての場合において特に好ましくはヒ トアミノ酸配列を有するｍｐｌリガンドに基づく（図１および２を参照）が、他 の種（例えば、イヌ、ブタ、サル、マウスまたはラット）からのｍｐｌリガンド 配列に基づく類似体も本明細書中で意図されている。 グリコシル化部位の形成のためにアミノ酸を挿入することも考えられる。例え ば、以下のように、５７位のＧｌｕがＴｈｒで置換され、Ａｓｎが５５位のＭｅ ｔの直後に挿入される。 これにより新しいグリコシル化部位が付加される（アミノ酸５５’、５６および ５７）。以下の類似体Ｎ２３を参照のこと。 本発明の類似体には、ｍｐｌリガンドのカルボキシ末端から伸びる一つ以上の アミノ酸を有し、カルボキシ末端の伸長により少なくとも一つの付加的炭水化物 部位が提供される類似体も 含まれる。ｍｐｌリガンドのカルボキシ末端は、使用するｍｐｌリガンド（例え ば、ｍｐｌリガンド１〜３３２アミノ酸、またはｍｐｌリガンド１〜１６３アミ ノ酸）の特定の型により変化するだろう。一つ以上のＮ−またはＯ−結合型グリ コシル化部位を含むアミノ酸をカルボキシ末端に付加することにより、ｍｐｌリ ガンド種のカルボキシ末端に更なる炭水化物部位を付加することができる。 表１および表６は、Ｎ−結合型炭水化物鎖のための更なる部位を有する幾つか の例としてのｍｐｌリガンド類似体を列挙する。類似体は、Ｎ−結合部位を形成 するためにヒトアミノ酸配列に基づくヒトｍｐｌリガンドポリペプチド鎖中の種 々の位置に含まれる配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを有する 。表４および表７は、ＳＤＳゲル上での糖タンパクの移動により検証される、少 なくとも一つの追加のＮ−結合炭水化物鎖を付加する類似体を列挙する（実施例 ６および図３、５、６、７、９、１０、１２および１３）。これらの表は、本明 細書で定義される“類似体”でない幾つかの切頭型種（すなわち、Ｎ１、Ｎ１６ 、Ｎ１７およびＮ３１）も含む。種々の切頭型種がいかに製造されたかを示すた めにこれらのものが表に列挙さ れている。 本明細書に開示されるｍｐｌリガンド類似体をコードするＤＮＡ配列、好まし くはＮ−結合鎖のための追加の部位を有する類似体をコードするものも本発明に 含まれる。炭水化物のための結合部位を形成、欠失および／または変更させる目 的でｍｐｌリガンドＤＮＡ配列に変化を導入するために用いられる手順が、実施 例４および１４に開示されている。 これらｍｐｌリガンド類似体は、外来性ＤＮＡ配列の発現産物である、すなわ ち組み換えＤＮＡ技術により製造することができ、それらは化学的に合成された 生成物であってもよいし、または組み合わせた方法により製造されてもよい。外 来性ＤＮＡ配列は、ｍｐｌリガンド類似体をコードするｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ 又は化学合成ＤＮＡを含む。そのような類似体の発現のために有用な真核生物宿 主細胞および組み換えＤＮＡプラスミドも提供される。発現ベクターは、真核生 物宿主細胞中においてクローン化ＤＮＡ配列を発現することのできる任意のベク ター、特にＣＯＳおよびＣＨＯ細胞中での発現に用いられるベクターを含む。そ のようなベクターの例は、プラスミドｐＤＳＲαおよびｐＤＳＲα２を含む（Ｍ ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． 第８巻：４６６〜４７２頁（１９８８年）；ＷＯ９１／１３１６０（１９９１年 ）；およびＷＯ９０／１４３６３（１９９０年）参照）。当業者に知られている 標準的手順により、ｍｐｌリガンド類似体を発現するＣＯＳおよびＣＨＯ宿主細 胞の培養を行った。 ｍｐｌリガンドに結合している炭水化物鎖の数、型、位置または量を変化させ ることにより、増加した溶解性、タンパク分解に対するより大きな抵抗性、低下 した免疫原性、増加した血清半減期、および増加したまたは変化した生物学的活 性のような有利な性質が付与され得る。 ｍｐｌリガンド類似体Ｎ２〜Ｎ１５（Ｎ１はヒトｍｐｌリガンド１〜１７４； 表２参照）を発現するＣＯＳ細胞からのならし培地を、インビトロ生物学的活性 について分析し、結果を表４に示す。 ｍｐｌリガンド類似体／切頭体Ｎ１５〜Ｎ４０を発現するＣＯＳ細胞からのな らし培地を、インビトロ生物学的活性について分析し、結果を表７に示す。 種々の型についてのインビボ生物学的活性の結果を図１１に示す（実施例１３ 参照）。 本発明の別の実施態様は、１分子当たり特定数を超えるシアル酸を有する、例 えば、真核生物細胞中において天然にまたは組み換えにより生成されるｍｐｌリ ガンド１〜３３２、１〜１９９、１〜１９１、１〜１８３、１〜１７４、１〜１ ６３、１〜１５３、１〜１５２または１〜１５１において見られるよりも多くを 有するｍｐｌリガンドまたはｍｐｌリガンド類似体を優先的に合成する哺乳動物 （例えば、チャイニーズハムスター卵巣：ＣＨＯ）宿主細胞に関する。 類似体Ｎ４およびＮ１５のインビトロ活性を、ＣＨＯ細胞中に発現される全長 および種々の切頭型種のインビトロ活性と共に表５に示す。 ｍｐｌリガンド分子のシアル酸含量は、そのインビボ生物学的活性に影響を与 え得る。例えば、テトラアンテナリィ（４分岐）Ｎ−結合型オリゴ糖は、最も一 般的に、シアル酸結合のための４つの可能な部位を提供し、一方アスパラギン結 合部位においてテトラアンテナリィ型に取って代わり得るバイアンテナリィおよ びトリアンテナリィオリゴ糖は、一般的に、せいぜい２つまたは３つの結合シア ル酸しか有さない。Ｏ−結合型オリゴ糖は一般的にシアル酸結合のための二つの 部位を提供する。 すなわち、Ｏ−結合型炭水化物に取って代わったＮ−結合型炭水化物を有するｍ ｐｌリガンド分子は、Ｎ−結合型オリゴ糖がテトラアンテナリィであるならば、 鎖当たり二つの追加のシアル酸を含み得る。テトラアンテナリィ鎖を選択的に組 み換えｍｐｌリガンドに付加し、それによりシアル酸結合部位の数を最大にする 細胞について培養哺乳動物細胞をスクリーニングした。 ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ ＣＨＯ）細胞が、組み換えｍｐｌリガンドを含む組み換え糖タンパクの生成のた めに一般的に用いられる宿主細胞である。 本発明の治療的に有効量のｍｐｌリガンド類似体を、ｍｐｌリガンド療法にお いて有用な適当な希釈剤、アジュバントおよび／または担体と共に含む組成物も また、本発明に含まれる。本明細書で用いられる“治療的に有効量”とは、所定 の条件および投与計画に治療的効果を提供する量を意味する。 本発明の組成物は、非経口的に全身的に投与することができる。あるいは、組 成物を静脈内または皮下に投与することができる。全身的に投与するときに、本 発明で用いられる治療組成物は、発熱因子を含まない非経口的に許容され得る水 溶液の形 態とし得る。ｐＨ、等張性、安定性等に関して薬学的に許容できるタンパク溶液 の調製は、当分野の技術内のことである。選択される特定の投与経路は、治療さ れる症状による。ｍｐｌリガンドまたはｍｐｌリガンド類似体の投与は、好まし くは、ヒト血清アルブミンのような適当な担体、緩衝塩溶液のような適当な希釈 剤、および／または適当なアジュバントを含む製剤の一部として行われる。必要 な投与量は、患者の血小板レベルを上昇させるのに充分な量であり、治療される 症状の重さ、および使用される投与方法等により変化する。 本発明の方法および組成物により治療すべき症状は、通常、存在する巨核球／ 血小板欠乏または将来の予想される巨核球／血小板欠乏（例えば、予定されてい る手術のために）を含むものである。そのような症状は、通常は、インビボにお ける活性ｍｐｌリガンドの欠乏（一時的または永久的）の結果である。血小板欠 乏の一般的用語は、血小板減少症であり、本発明の方法および組成物は、通常、 血小板減少症の治療に利用できる。 血小板減少症（血小板欠乏）は、化学療法、骨髄移植、種々の薬剤を用いる他 の療法、放射線治療、手術、事故による出血および他の特定の病状を含む種々の 理由に起因する。血小板減 少症を含み本発明により治療され得る特定の病状としては、例えば、再生不良性 貧血、突発性血小板減少症、血小板減少症につながる転移性腫瘍、全身性紅斑性 狼そう、巨脾腫、ファンコーニ症候群、ビタミン１２欠乏、葉酸欠乏、メイ−ヘ グリン異常、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、および発作性夜間血色素尿 症を含む。また、ＡＩＤＳのためのある治療は血小板減少症（例えばＡＺＴ）に つながる。特定の創傷の癒合障害も血小板数の増加により有利となる。 例えば将来の手術または将来の血小板減少症誘発治療による予想される血小板 欠乏に関して、本発明のｍｐｌリガンド類似体を、血小板が必要となる数日〜数 時間前に投与することができる。急性の状況、例えば、事故による大量の出血に 関して、ｍｐｌリガンド類似体を血液または精製血小板と共に投与することがで きる。 前記疾病の治療のための方法に含まれる投与計画は、薬剤の作用を変える種々 の因子、例えば、患者の年齢、症状、体重、性別および食事、感染の重さ、投与 時間、および他の臨床的因子を考慮して担当医により決められる。通常、一日の 投与量は、体重１ｋｇ当たりｍｐｌリガンド類似体０．０１〜１０００μ ｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり０．１〜１０μｇである。 本発明の治療法、組成物およびポリペプチドを、他の症状により特徴付けられ る病状および血小板欠乏の治療において、単独でまたは他のサイトカイン、可溶 性ｍｐｌ（すなわちｍｐｌリガンド）レセプター、造血因子、インターロイキン 、成長因子または抗体と組み合わせて用いることができる。ｍｐｌリガンド類似 体分子が、ＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦのような通常の造血刺激剤と組み合わせ て、ある状態の血小板減少症を治療するのに有用であることが明らかである。他 の巨核球刺激因子、すなわち、ｍｅｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病 抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、または巨核球刺激活性を有 する他の分子も、ｍｐｌリガンドと一緒に用いることができる。そのような同時 投与のためのサイトカインまたは造血因子の更なる例は、ＩＬ−１アルファ、Ｉ Ｌ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１ １、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激 因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロン−アルファ（ＩＮＦ−アルファ ）、ＩＮＦ−ベータ、またはＩＮＦ−ガンマを含む。巨核球がいったん成熟状態 に達 すると巨核球を血小板に断片化する効果を有すると思われる可溶性哺乳動物Ｍｐ ｌレセプターの有効量を同時にまたは連続的に投与するのが、さらに有用であり 得る。すなわち、ｍｐｌリガンド類似体を投与（成熟巨核球の数を増やすために ）し、続いて可溶性ｍｐｌレセプターを投与（類似体を不活性化し成熟巨核球か ら血小板を産生させるために）することは、血小板産生を刺激する特に有効な手 段であることが期待される。前述の投与量は、治療組成物中のそのような追加の 成分を補うように調整される。治療した患者の経過は、一般的方法によりモニタ ーすることができる。 例えば活性、安定性、半減期等を向上させるために本発明の類似体の更なる変 更を行うこともできる。例えば、タンパク上のアミノ基を介してまたは炭水化物 基を介してｍｐｌリガンド類似体にペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）（ポリまた はモノ）を付加することができる。また、脂肪酸または他のポリマーをタンパク または炭水化物基に結合することができる。 以下の実施例は、本発明をより詳しく説明するために提供されるが、本発明の 限定を意図するものではない。実施例で用いられるバイオアッセイで使用される ｍｐｌリガンド標準は、Ｅ． ｃｏｌｉ中に発現され、再び活性構造に折り畳まれ、精製された組み換えｍｐｌ リガンド標準である。すなわち、相対的比活性のみが測定される。 実施例１ Ｍｐｌリガンド１〜１７４の構築 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリー （バートレイ（Ｂａｒｔｌｅｙ）らのＣｅｌｌ第７７巻：１１１７〜１１２４頁 （１９９４年））から図２のアミノ酸１〜１７４（Ｓ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ａ．． からはじまる）をコードするヒトｍｐｌリガンド遺伝子を生成した。５’ＰＣＲ プライマーは、ヒトｍｐｌリガンドのアミノ末端、ＸｂａＩ部位および最適化Ｋ ｏｚａｋ配列をコードした。３’プライマーは、終止コドンおよびＳａｌＩ制限 部位を含んでいた。増幅したＤＮＡフラグメントをＸｂａＩおよびＳａｌＩで消 化し、次にＸｂａＩおよびＳａｌＩで切断したｐＤＳＲα２に連結した。得られ たプラスミドであるｐＤＳＲα２ｍｐｌリガンド１〜１７４を、哺乳動物細胞発 現のために用いた。得られる遺伝子（シグナルペプチドを含む）の配列を図２に 示す。 ｍｐｌリガンド１〜１７４を含むプラスミドＤＮＡをＸｂａ ＩおよびＳａｌＩ制限酵素で消化し、得られるＤＮＡフラグメントをアガロース ゲル電気泳動に付し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ^TMキットおよび製造者（ＢＩＯ １０ １社）により提供される手順を用いてゲルから６０５ｎｔ ｍｐｌリガンド１〜 １７４ＤＮＡフラグメントを単離した。ＷＯ９０／１４３６３（１９９０年）に 記載のプラスミドｐＤＳＲα２もＸｂａＩおよびＳａｌＩ制限酵素で消化し、ベ クターフラグメントを回収した。二つのフラグメントの連結によりｐＤＳＲα２ （ｍｐｌリガンド１〜１７４）が得られる。 実施例２ ＣＨＯ細胞中におけるｍｐｌリガンド１〜１７４の発現および 精製 ジヒドロ葉酸リダクターゼ欠乏（ＤＨＦＲ^-）チャイニーズハムスター卵巣（ ＣＨＯ）細胞をｐＤＳＲα２−ｍｐｌリガンド１〜１７４でトランスフェクショ ンした。ＣＨＯ Ｄ^-培地（ＤＭＥＭ、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン／ス トレプトマイシン／グルタミン、１％非必須アミノ酸（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ） 製）および１％ＨＴ助剤（ギブコ社製））中で成長させた１×１０⁶ＣＨＯ Ｄ ＨＦＲ^-細胞を、トランスフェクショ ンの前日に１００ｍｍ組織培養皿にプレーティングした。４つのトランスフェク ションを行った。４つの各トランスフェクションにおいて、ＰｖｕＩおよび緩衝 液Ｈ（ベーリンガーマンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ） 製）で消化することによりプラスミドＤＮＡ（５０μｇ）を線状化した。ＤＮＡ 沈殿物を形成し、哺乳動物細胞トランスフェクテョンキット（Ｓｐｅｃｉａｌｔ ｙ ｍｅｄｉａ）によりプレートに滴加した。組織培養培養器内で２４時間後、 培地を新しいＣＨＯＤ^-培地で置き換えた。２４時間後、ウエル当たりＣＨＯ選 択培地（Ｄ−ＭＥＭ、５％透析牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシ ン／グルタミン、１％非必須アミノ酸（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）製））１００μ ｌと共に細胞を９６ウエル組織培養プレートに分け、形質転換株を選択した。コ ロニーが出現するまで培地を１週間毎に変えた。２週間後、以下の３２Ｄ細胞増 殖アッセイ（実施例９参照）の使用についてｍｐｌリガンド発現をスクリーニン グした。１×１０⁵単位／ｍｌを越えて発現されるこれらのクローンを増やし、 凍結貯蔵器内で凍結した。一つのクローンをローラー瓶製造のために増やし、な らし培地約８リッターを製造した。 ｍｐｌリガンド１〜１７４ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＤＳＲα２を前述のよ うにＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中にトランスフェクションした。ｍｐｌリガンド１ 〜１７４を発現するＣＨＯ細胞を接種したローラー瓶からの血清非含有ＣＨＯ細 胞ならし培地（５０％Ｄ−ＭＥＭ、５０％ＨＡＭＳ−Ｆ１２、１％ペニシリン／ ストレプトマイシン／グルタミン、１％非必須アミノ酸（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ ）製）２リッターを、２Ｌアミコンモデル２０００攪拌セルおよび１００００ダ ルトン分子量カットオフ薄膜（ＹＭ１０、アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ）製）を用 いて１５倍に濃縮した。次に、濃縮したならし培地４５ｍｌを、ファーマシア社 （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製ＦＰＬＣを用いて流速０．４ｍｌ／分で４ｍｌ ｈｕ −ＭＰＬ−Ｘアフィニテイカラムに直接負荷した。アフィニテイカラムは、ファ ーマシア社製ＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）樹脂１ｍｌ当 たり１．５〜２．５ｍｇのＭｐｌ−Ｘ（ｍｐｌレセプターの可溶性細胞外ドメイ ン）を製造者に指示されるように結合することにより作製した。負荷後、カラム を燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ：１０ｍＭ Ｎａ・ＰＯ₄ ｐＨ６．８／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）１６ｍｌで洗い、次に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．０／１Ｍ ＮａＣｌの２４ｍｌで洗った。ｍｐｌリガンド（１〜１７４）を 、２０ｍＭ ＣＡＰＳ（３−[シクロヘキシルアミノ]−１プロパンスルホン酸） ｐＨ１０．５／１Ｍ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＣＨＡＰＳ（３−[（３−コルアミド プロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホネート）の４０ｍｌで６ ｍｌずつの分画量で溶離した。第２のフラクションは１４％ＳＤＳゲル上にシン グルバンドを形成した。この物質を濃縮し、０．９％ＮａＣｌの塩溶液で緩衝液 交換すると、インビトロ及びインビボで生物学的に活性であった。他の型のＣＨ Ｏ細胞発現ｍｐｌリガンドを同様にして精製した。 実施例３ 組み換えヒトｍｐｌリガンドのインビボ生物学的活性 種々の型のｍｐｌリガンドで処理したマウスからの血小板数を測定した。ＣＨ Ｏ由来ｍｐｌリガンド１〜３３２、１〜１７４、１〜１６３および１〜１５３を 製造し、Ｍｐｌレセプター親和性クロマトグラフィーにより精製した。Ｅ．ｃｏ ｌｉ由来Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−ｍｐｌリガンド１〜３３２、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−ｍｐｌ リガンド１〜１７４、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−ｍｐｌリガンド１〜１６３およびＭｅｔ −Ｌｙｓ−ｍｐｌリガンド１ 〜１５３を製造し、従来のクラマトグラフィーで精製した。 図４は、種々の型のＣＨＯ細胞由来（実線）またはＥ．ｃｏｌｉ由来（破線） 組み換えヒトｍｐｌリガンドで処理したマウスからの血小板数を示す。正常な雌 のＢａｌｂ／ｃマウスに示された濃度のｍｐｌリガンドを５日間連続して皮下注 射した。最後の注射から２４時間後に尾静脈の横の小さな切り口から試験血液を 採血した。シスメックス（Ｓｙｓｍｅｘ）電気血球分析機（カリフォルニア州ア ーヴィン在バックスター・ダイアグノスティクス社（Ｂａｘｔｅｒ Ｄｉａｇｎ ｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）製）を用いて血球分析を行った。データは、４匹の動 物の平均値に平均の＋／−標準誤差を付して表す。合計白血球数または赤血球数 のような他の血球パラメーターは、これらの処理により影響を受けなかった（デ ータは示さない）。 結果は、ＣＨＯ細胞発現型ｍｐｌリガンドが、Ｅ．ｃｏｌｉ中で製造した同じ 型のｍｐｌリガンドと比べて増加したインビボ活性を有することを示している。 実施例６において示されるように、ＣＨＯ細胞発現型ｍｐｌリガンドは全てＮ− および／またはＯ−結合型炭水化物を含み、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ｍｐｌリガンド型 のものはそのような炭水化物を含まない。これは、炭 水化物がｍｐｌリガンドのインビボ活性を高めることを示している。炭水化物に より付与された増加したインビボ活性は、増加した循環半減期、増加した安定性 または両者の組み合わせの結果であり得る。 実施例４ ｍｐｌリガンド類似体Ｎ２〜Ｎ１５の構築 ｍｐｌリガンドのための追加のグリコシル化部位を生成させる手順を以下に記 載する。 以下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成してインビトロ変異誘発に用いて 類似体Ｎ２〜Ｎ１４を製造した（これらの類似体の構造については表１参照）。 ｍ１３ｍｐ１８ ｍｐｌリガンド１〜１７４を構築するために、図２の遺伝子 を、ＸｂａＩおよびＳａｌＩ制限酵素消化ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ中に導入した。 クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）らのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１５ ４巻：３６７頁（１９８７年）およびメシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）のＭｅｔｈｏ ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１０１巻：２０頁（１９８３年）に記載されて いるようにして、ｍ１３ｍｐ１８（ｍｐｌリガンド１〜１７４）により感染され たＥ．ｃｏｌｉ菌株ＲＺ１０３２の上澄みから一本鎖ＤＮＡを回収した。インビ トロ変異誘発のために、一本鎖ＤＮＡ約０．５μｇおよび前記合成プライマーの 一つ０．１２５ｐｍｏｌｅを緩衝液（２５０ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ７．８、５０ｍ Ｍ ＭｇＣｌ₂、５０ｍ Ｍジチオスレイトールおよび１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ−ファーマシア社製 ））６μｌと混合した。プライマーを、添加前にＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオ チドキナーゼで予めキナーゼ処理した。プライマーを鋳型にアニーリングするた めに、反応容積を水で１０μｌに調節し、混合物を６５℃で５分間加熱し、次に 室温まで冷却した。伸長反応のために、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄ ＣＴＰの各２．５μｌとＡＴＰ１ｍｌを（全て１０μＭで）添加し、続いてＥ． ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）１μｌ（１単位）お よびＴ４ＤＮＡリガーゼ１μｌ（１単位）を添加した。次に混合物を１４℃で一 晩インキュベートし、それを用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ヤニッシュ−ペロ ン(Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ)らのＧｅｎｅ第３３巻：１０３頁(１９８５ 年)）を前述（前記メシング）のように形質転換した。 異なるハイブリッド化（differential hybridization）により突然変異クロー ンを同定するために、栄養寒天上のプラクをジーンスクリーンフィルター（ニュ ー・イングランド・ニュークリアー社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ ｒ）製）に移した。ＤＮＡを、ＵＶストラタリンカー（Ｓｔｒａｔａｌ ｉｎｋｅｒ）モデル１８００（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製） 内で自己架橋モードを用いて照射することによりフィルターに架橋させた。次に それらを、１％ＳＤＳを含む６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ／０．０９Ｍ Ｎ ａ・クエン酸塩）内において６０℃で１時間インキュベートした。ハイブリッド 化のために、前記オリゴヌクレオチドプライマー（８ｐｍｏｌｅ）の末端をＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ３２Ｐ−標識ＡＴＰで標識し、６×ＳＳＣ、 ０．５％ＳＤＳおよびニシン精子ＤＮＡ１２５μｇ／ｍｌ内でフィルターと一緒 に一晩インキュベートした。ハイブリッド化温度は、オリゴヌクレオチド融点の 推定値により選んだ。通常、ハイブリッド化温度は、融点より約１０℃低くした 。翌日、フィルターを、ハイブリッド化温度で６×ＳＳＣ／１％ＳＤＳにより２ 回洗い、続いてハイブリッド化温度で６×ＳＳＣにより２回洗い、オートラジオ グラフィーに付した。必要な場合、野生型ｍｐｌリガンドｃＤＮＡ配列を有する プラークへのハイブリッド化が殆どまたは全く検出されなくなるまで温度を上昇 させながらフィルターを６×ＳＳＣで洗った。これらの条件下に陽性のハイブリ ッド化シグナルを出すクローンを同定し、再度ＪＭ１０９中に トランスフェクションして純水なクローンを単離した。ジデオキシ鎖終止配列分 析は、突然変異が存在することを示した。 所望の変化を有する二本鎖ｍ１３ ｍｐｌリガンド１〜１７４ＤＮＡを、ＱＩ ＡＧＥＮキット（カリフォルニア州在チャッツワース社（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ）製）で製造社により提供された方法を用いて、トランスフェクションされたＪ Ｍ１０９細胞から回収した。ＤＮＡをＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化し、６０５ ｂｐ ｍｐｌリガンドＤＮＡフラグメントを単離した。ｐＤＳＲα２をＸｂａＩ およびＳａｌＩで消化した。ベクターフラグメントを単離し、前記ｍｐｌリガン ドフラグメントに結合させた。組み換えプラスミドを制限分析により同定した。 得られるプラスミド（ｍｐｌリガンド１−１７４−ＮＸ（ＮＸは類似体番号）と 表される）は、示された位置に変更されたアミノ酸残基を有するｍｐｌリガンド 類似体をコードするＤＮＡを含む。次に得られるプラスミドを再度配列決定して 所望突然変異の存在を確認する。 ３０位および１２０位に二つの追加のＮ−結合型グリコシル化部位を有する類 似体Ｎ１５を構築した。Ａｓｎ３０およびＴｈｒ３２突然変異を含むｐＤＳＲα ２ｍｐｌリガンド１７４ −Ｎ４を、ＸｂａＩおよびＰｓｔＩ制限酵素で消化し、約３８５ｎｔＤＮＡフラ グメントを単離した。Ａｓｎ１２０およびＴｈｒ１２２突然変異を含むｐＤＳＲ α２ｍｐｌリガンド１７４−Ｎ１０を、ＰｓｔＩおよびＳａｌＩ制限酵素で消化 し、約２２０ｎｔＤＮＡフラグメントを単離した。ｐＤＳＲα２を、ＸｂａＩお よびＳａｌＩで消化した。ベクターフラグメントを単離し、前記ｍｐｌリガンド フラグメントに連結した。これにより、Ａｓｎ３０、Ｔｈｒ３２、Ａｓｎ１２０ およびＴｈｒ１２２置換を含むｐＤＳＲα２ｍｐｌリガンド１７４−Ｎ１５が得 られる。 これらの一般的手順を用いて表１に示すｍｐｌリガンド類似体を構築した。各 々の類似体についてのＤＮＡ配列の変化を示す；あるいは変異誘発のために用い られるオリゴヌクレオチドプライマーがヒトｍｐｌリガンドの配列に相補的な配 列を有していた。 註：類似体Ｎ２〜Ｎ１５をここで同義的に類似体２〜１５と呼ぶ。さらに、本明 細書中で用いられているように、例えば、[Ａｓｎ²²]ｍｐｌリガンドは、好まし くは少なくとも図１のアミノ酸７〜１５１を有するヒト配列（先に示した好まし いヒトｍｐｌリガンド配列を含む）である、考慮される特定のｍｐｌリガンド種 中の２２位においてアミノ酸の代わりにアスパラギン酸が置換されていることを 示している。すなわち、ｍｐｌリガンド１〜１７４（ヒト配列）の２２位におい てロイシン残基の代わりにアスパラギン残基を置換することによって、[Ａｓｎ^{2 2} ]ｍｐｌリガンド１〜１７４により表され得るｍｐｌリガンド類似体が得られる 。 ｐＤＳＲα２ １−１７４−ＮＸ（ここでＮＸは類似体番号）と示されるプラ スミドは、ｍｐｌリガンドＤＮＡをｐＤＳＲα２に挿入することにより構築され た。発現ベクターｐＤＳＲα２は、ＷＯ９０／１４３６３（１９９０年）に一般 的に記載されている。ｐＤＳＲα２をＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化することに よりｐＤＳＲα２ ｍｐｌ^-リガンド１−１７４−ＮＸプラスミドを形成した。 ベクターフラグメントを単離し、所望の配列を含む約６０５ｂｐフラグメントに 連結する。 実施例５ ＣＯＳ細胞中におけるｍｐｌリガンドおよびｍｐｌリガンドＮ １〜Ｎ１５の発現 表１に記載されているｍｐｌリガンド類似体およびヒトｍｐｌリガンドのｃＤ ＮＡクローンを、電気穿孔法によりＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ− １６５０）中に移入した。ＣＯＳ−１細胞を半集密化した培養皿から採取し、培 地(１０％牛胎児血清および１％Ｌ−グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイ シン（アービン・サイエンティフィック社（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ ｃ）製）を含むダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の改良必須培地）で洗い、６× １０⁶細胞／ｍｌに再懸濁させた。細胞０．５ｍｌを０．２ｃｍ電気穿孔キュベ ット（バイオ−ラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）製）に移し、ＢＴＸ電気穿孔システ ムエレクトロセルマニピュレーター６００を用い、ｍｐｌリガンド類似体をコー ドするプラスミドＤＮＡ５０μｇで電圧を低く設定して、６５０μＦおよび１３ ０ボルトで電気穿孔した。電気穿孔細胞を、培地１０ｍｌ中で１００ｍｍ組織培 養皿にプレーティングした。プレーティングしてから１２〜２４時間後、培地を 新しい培地１０ｍｌで置き換えた。 ならし培地を、電気穿孔後３〜５日に採取した。 実施例６ ｍｐｌリガンドおよびｍｐｌリガンドＮ１〜Ｎ１５の特徴付け Ａ．炭水化物付加の測定 実施例５に記載のｍｐｌリガンド類似体ｃＤＮＡでトランスフェクションした ＣＯＳ細胞からのｍｐｌリガンド類似体またはｍｐｌリガンド約３０〜６０ｎｇ を含む上澄みを、ウサギ抗ｍｐｌリガンドポリクローナル抗体を用いて、室温で 一晩免疫沈殿させた。発現が低い場合、免疫沈殿において約８〜９ｍｌの最大体 積を用いた。抗体は、Ｅ．ｃｏｌｉから発現され精製されたｍｐｌリガンド１〜 １６３に対するものであった。０．１％アジ化ナトリウムを含む燐酸塩緩衝塩水 （ＰＢＳ）中の１：１タンパクＡ−セファロース３０μｌを免疫沈殿に添加し、 室温で１時間インキュベートした。サンプルを遠心分離し、ＰＢＳで洗い、ＳＤ Ｓサンプル緩衝液（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８／４％ＳＤＳ ／２０％グリセロール／１０％β−メルカプトエタノール／０．００１％ブロモ フェノールブルー）中に再び懸濁させた。そのサンプルを１２％ＳＤＳ−ポリア クリルアミドゲル電気泳動により分析し、ニトロセ ルロースに移し、合成ｍｐｌリガンドペプチド（例えば図１のアミノ酸残基４７ 〜６２に相当する）に対するマウス抗ｍｐｌリガンドモノクローナル抗体を用い て前記ウエスタン分析（ブルネット（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）らのＡｎａｌ．Ｂｉｏ ｃｈｅｍ．第１１２巻：１９５〜２０３頁（１９８１年）；エリオット（Ｅｌｌ ｉｏｔｔ）らのＧｅｎｅ第７９巻：１６７〜１８０頁（１９８９年））に付した 。バンドを含むｍｐｌリガンドをＥＣＬキット（アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈ ａｍ）製）を用いて視覚化した。 図５は、類似体Ｎ４、Ｎ７およびＮ１０ＤＮＡでトランスフェクションした細 胞からのＣＯＳ細胞上澄みがヒト配列ｍｐｌリガンド１７４（Ｎ１）と比べて寸 法（size）が大きくなっていることを示している。図６は、類似体Ｎ１３、Ｎ１ ４およびＮ４ＤＮＡでトランスフェクションした細胞からのＣＯＳ細胞上澄みも ヒト配列ｍｐｌリガンドと比べて寸法が大きくなっていることを示している。こ の寸法増加は、付加的Ｎ−結合型炭水化物鎖を示している。Ｎ１５は、二つの付 加的Ｎ−結合型グリコシル化部位を含む。図６は、ただ１つの付加的Ｎ−結合型 グリコシル化を含む類似体より大きな寸法を有する物質をこの 類似体が有することを示している。タンパクの寸法は、分子量が既知のタンパク 標準と比べた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での移動度から推定した。図６から計算され たより大きなバンドの推定寸法を表２に示す。この結果は、Ｎ１５が二つの付加 的Ｎ−結合鎖を含むことを示している。他の選択された類似体のウエスタンブロ ット分析を図６に示す。 ｍｐｌリガンド類似体の寸法増加がＮ−結合型炭水化物によることを示すため に実験を行った。ｍｐｌリガンドを含む ＣＯＳ細胞ならし培地を免疫沈殿させ、前述のようにＰＢＳで洗った。次に各チ ューブに０．５％ＳＤＳ１０μｌを加え、各サンプルを３分間沸騰させた。次に 以下の成分を添加した：１０．８μｌの０．５Ｍ ＮａＰＯ₄ ｐＨ８．６、５ ｍｌの７．５％ノニデット（ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０および３μｌの２５０単位 ／ｍｌ Ｎ−グリカナーゼ（ゲンザイム社（Ｇｅｎｚｙｍｅ）製）。Ｎ−グリカ ナーゼ処理はＮ−結合型炭水化物を除去する。サンプルを３７℃で６時間インキ ュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液の添加により反応を停止し、次 に、抗ｍｐｌリガンドモノクローナル抗体および前記抗マウスＥＣＬウエスタン 検出キット（アマーシャム社製）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタン分析（１ ２％アクリルアミド）に付した。この方法を用いるＮ−結合鎖の分析を、ヒトｍ ｐｌリガンドおよびｍｐｌリガンド類似体について図７に示した。Ｎ−グリカナ ーゼでの処理後、Ｎ４、Ｎ７およびＮ１０についてのウエスタンブロット上での 移動度はＮ１の移動度まで低下した。予想されるように、Ｎ１はＮ−結合型グリ コシル化部位を有さないのでＮ−グリカナーゼによるＮ１の処理は、移動度に影 響を与えなかった。これらの結果は、観察される寸法増加が Ｎ−結合型炭水化物の付加によるものであることを示している。 Ｂ．ｍｐｌリガンド上のＯ−結合型炭水化物の分析 Ｏ−結合型炭水化物のヒトｍｐｌリガンドへの寄与を分析するために、前述の ＣＨＯ細胞ならし培地から種々の型のタンパクを精製した。それぞれが、Ｏ−グ リカナーゼ（グリコペプチドアルファ−Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼ 、オックスフォード・グリコシステムズ（Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｙｓｔｅ ｍｓ）による＋／−処理を受けた。Ｏ−グリカナーゼは糖タンパクからＯ−結合 型炭水化物を除去する。それぞれの型のＥ．ｃｏｌｉ発現バージョンを、非グリ コシル化対照として用いた。Ｏ−結合型炭水化物に起因する分子量の相違を解決 するために、まずＮ−結合型炭水化物を除去する必要があった。全長バージョン であるｍｐｌリガンド１〜３３２はＮ−結合型炭水化物を含むので、Ｎ−グリカ ナーゼ処理が一晩のインキュベーションであること以外はＣＯＳ細胞発現ｍｐｌ リガンド類似体について前述したように、ＣＨＯ細胞発現全長サンプルに、Ｎ− グリカナーゼ（ペプチド−Ｎ４−（Ｎ−アセチル−ベータ−グルコサミニル）ア スパラギンアミダーゼ）処理を行った。 全長（１〜３３２）ｍｐｌリガンドについてＯ−グリカナー ゼ処理を進める前に、サンプルのｐＨ範囲を、１００ｍＭ酢酸１／１５容、ｐＨ ２．２を用いてｐＨ６．０〜７．０に調節した。ＳＤＳ中で３分間沸騰すること によりタンパク１μｇを変性し、１ｍＭ酢酸カルシウム、ｐＨ６．８中の１Ｕ／ ｍｌノイラミニダーゼ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅｆａｃｉｅｎｓ由来 のシアリダーゼ、ベーリンガーマンハイム社製）および２０ｍＭ燐酸ナトリウム 、ｐＨ６．８を用いて３７℃で６０分間インキュベートした。 次に、最終容量が１００μｌになるように５ｍＵの酵素を添加することにより Ｏ−グリカナーゼによる処理を行い、続いて３７℃で一晩インキュベートした。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミド）でタンパク（０．２μｇ／レーン） を分離した。０．２μｍのニトロセルロースに移し、抗ｍｐｌリガンドポリクロ ーナル抗体で一晩インキュベートした後、ｍｐｌリガンドタンパクを、抗ウサギ ＥＣＬウエスタン検出キット（アマーシャム社製）を用いて視覚化した。 図３は、４つの異なる型のヒトｍｐｌリガンドのウエスタンブロットを示す。 全長ｍｐｌリガンド１〜３３２をレーン１〜３に、ｍｐｌリガンド１〜１７４を レーン４〜６に、ｍｐｌリ ガンド１〜１６３をレーン７〜９に、およびｍｐｌリガンド１〜１５３をレーン １０〜１２に表す。レーン２、５、８および１１に示されるノイアミニダーゼお よびＯ−グリカナーゼでの処理は、レーン３、６、９および１２の非グリコシル 化物質より分子量を低下させた。全ての場合において、移動度が、Ｅ．ｃｏｌｉ 中に発現される非グリコシル化バージョンよりも増加した。これらの結果は、レ ーン１、４、７および１０のより大きな寸法のバンドがＯ−結合型炭水化物によ ることを示している。各バンドの分子量は、分子量の知られているタンパクの移 動度と比較することにより推定した。 異なるタンパクの推定分子量を示す表３に見られるように、移動度のみかけの シフトは、ｍｐｌリガンド１〜３３２について１４個ものＯ−結合型炭水化物鎖 （おそらく９５０ダルトン／鎖）、ｍｐｌリガンド１〜１７４について９個の鎖 、ｍｐｌリガンド１〜１６３について４個の鎖、およびｍｐｌリガンド１〜１５ ３について２個の鎖を説明できる。レーン２におけるサンプルランは全長ｍｐｌ リガンド１〜３３２である。おそらく３７℃でのグリコ酵素中での延長されたイ ンキュベーションのために、このタンパクが分解されたことが明らかである。従 って、レーン３におけるＥ．ｃｏｌｉ発現非グリコシル化バージョンを用いて、 ＣＨＯ細胞発現ｍｐｌリガンド１〜３３２に付加されたＯ−結合型炭水化物のお よその分子量を計算した。 これらの結果は、全てのＣＨＯ発現型の試験したｍｐｌリガンド上の炭水化物 の存在と一致する。単糖組成物の直接分析によりＣＨＯ細胞発現ｍｐｌリガンド １〜３３２、１〜１７４および１〜１６３についてＯ−結合型炭水化物の存在を 確認した。酸加水分解によりシアル酸、ＧａｌＮＡｃおよびＧａｌを糖タンパク から分離した。高速アニオン交換クロマトグラフィーおよびパルス電流滴定検出 により単糖を検出した。各型のｍｐｌリガンドにおいて全部で三つの糖を検出し た。この結果は、Ｏ−結合型炭水化物を含むシアル酸の存在を示している。この ータは、ＣＨＯ細胞発現型のｍｐｌリガンドが全て、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現され た対応する型よりもインビボでより活性である図４に見られるインビボデータと 相関する。すなわち、炭水化物の存在はｍｐｌリガンドのインビボ活性を高める 。 実施例７ ｍｐｌリガンドＥＬＩＳＡアッセイ ポリクローナル抗体の作製−−ニュージーランド白ウサギを、Ｅ．ｃｏｌｉ中 で製造された組み換えヒトｍｐｌリガンド１〜１６３を用いて３ケ月間、過免疫 化した。高抗体力価を示す６匹のウサギからの抗血清を貯留し、特異的抗ｍｐｌ リガンド抗体をアフィニティ精製した。 アフィニティ精製−−組み換えヒトｍｐｌリガンド１〜１６３を、製造者の指 示に従ってＡｃｔｉｇｅｌ−ＡＬＤ（ステロジーンバイオセパレーションズ社（ Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，ＩＮＣ）製）に共有結合 させた。ウサギ抗血清の一部をｍｐｌリガンドアフィニティゲルに添加し、スラ リーをロッカープラットフォームで一晩４〜８℃で穏やかに撹拌した。非結合血 清タンパクを、ゲル床からＰＢＳで洗い、次に特異的に結合した抗ｍｐｌリガン ド抗体をイムノピュアジェントルＡｇ／Ａｂ溶離緩衝液（ピアースケミカル社（ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）製）で溶離した。回収された抗体を 数回交換したＰＢＳで透析し、次に抗体溶液をアミコン撹拌セル限外濾過装置で 濃縮し、得られた抗体濃縮物を特異的抗ｍｐｌリガンド抗体の供給源として、続 いてウエル被覆および酵素結合体調製に用いた。 ＥＬＩＳＡ試薬−−イムロン４リムーブウエルストリップ（ダイナテックラボ ラトリーズ社（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）製） をアフィニティ精製したウサギ抗ｍｐｌリガンド抗体で被覆した。アフィニティ 精製抗体を０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ約８．２に新しく調製） で２．５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。各ウエルに１００μｌの抗体を入れ、密 閉し加湿したチャンバー内でプレートを室温で２４時間インキュベートした。次 に、ＴＥＮ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ７．４／１０ｍＭ ＥＤＴＡ／１５０ｍＭ Ｎ ａＣｌ）中の１％牛胎児血清５％スクロースからなるブロッキング溶液２００μ ｌを各ウエルに添加し、密閉し加湿したチャンバー内でプレートを室温でさらに ２４時間インキュベートした。併せた被覆およびブロッキング溶液をウエルから 除去した。さらなる過被覆／ブロッキング工程はＰＢＳ中スーパーブロックブロ ッキング緩衝液（ピアースケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ ．）製）３００μｌを各ウエルに添加することを含んだ。室温で約５分間放置し た後、この溶液を除去し、ウエルを室温で２４時間風乾させた。ｍｐｌリガンド ＥＬＩＳＡで使用するまで、被覆ウエルを密封プラスチック袋内に４〜８℃で貯 蔵した。 貯留ウサギ抗血清からのアフィニティ精製抗ｍｐｌリガンド抗体を西洋ワサビ ペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）に共有結合させてシグナル発生抗体として用いた 。アフィニティ精製抗体を、イミノチオレーンＨＣｌ（フルカケミカル社（Ｆｌ ｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）製）で誘導体化した。別途、ＨＲＰＯを、Ｎ− スクシンイミジル６−マレイミドカプロエート（フルカケミカル社（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）製）で誘導体化した。二つの活性化タンパク を併せて共有結合させた。次に反応混合物をクロマトグラフィーにかけてＦＰＬ Ｃスパロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）６（ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 製）カラム内を流下させて、所望の分子量（すなわち約２００ｋＤ）の抗体：Ｈ ＲＰＯ結合体を単離した。所望の結合体を含むフラクションを併せ、セントリコ ン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）３０（グレース社（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ ＆ ｃｏ． ）アミコン部製）中で濃縮し、−２０℃で５０％グリセロール溶液として貯蔵し た。この抗ｍｐｌリガンドＡｂ：ＨＲＰＯ濃縮物をＰＢＳ中２％牛胎児血清中に 希釈してＥＬＩＳＡで使用した。ＥＬＩＳＡで使用した結合体の最終濃度は２５ ０〜５００ｎｇ／ｍｌであった。 Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中で製造した組み換えヒトｍｐｌリガンド１〜１６３を標準 の調製に用いた。このｍｐｌリガンドを、防腐剤として０．０５％チメロサール を含むＴＥＮ緩衝液中の２％牛胎児血清（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈ ｅｍｉ ｃａｌ Ｃｏ．）製）中に希釈した。調製した標準は１．０、０．５、０．２５ 、０．１２５および０．０６２ｎｇ／ｍｌのｍｐｌリガンドを含んでいた。 アッセイ−−ｍｐｌリガンド標準又はサンプル１００μｌをウエルに添加し、 次に密封し加湿したチャンバー中で室温で１８〜２４時間インキュベートした。 次にウエルの内容物と残留溶液を除去し、ウエルを洗浄溶液（ＴＥＮ緩衝液中０ ．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で一度洗浄した。抗ｍｐｌリガンドＡｂ：ＨＲＰＯ結 合体溶液（１００μｌ）を各ウエルに添加し、次に密封した加湿チャンバー中で 室温で２時間インキュベートした。ウエルの内容物を除去し、次にＴＥＮ緩衝液 中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。 発色のために、ＴＢＳ／過酸化物基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅ ｒｒｙ溶液Ａ＆Ｂ混合１：１）１００μｌを添加し、室温で２０分インキュベー トした。停止溶液１００μｌ（０．５Ｎ硫酸）を添加することにより反応を停止 し、マイクロタイタープレートリーダーにより４５０ｎｍで吸光度を読んだ。曲 線適合プログラムを用いて作成した標準曲線からサンプル中のｍｐｌリガンド濃 度を計算した。 実施例８ 短時間液体培養巨核球アッセイにおけるｍｐｌリガンド１〜 １７４類似体の生物学的活性 前述のようにしてｍｐｌリガンド１〜１７４の類似体を調製し、液状培養中で の巨核球の成長を刺激する能力を検定した。ヒト白血球搬出装置（ニコル（Ｎｉ ｃｈｏｌ）らのＳｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ第１２巻：４９４〜５０５頁（１９９４年 ））から単離したＣＤ３４選択細胞を培地（ＩＭＤＭ／１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ グルタミン／１％非必須アミノ酸／１％ＭＥＭピルビン酸ナトリウム／１％ＭＥ Ｍビタミン／１０％脱イオンＢＳＡ／１０％正常ヒトＡＢ血漿／１０μＭアルフ ァ−チアシルグリセロール／２０μｇ／ｍｌ Ｌ−アスパラギン）に２×１０⁵ ／ｍｌでプレーティングした。さらに、ｍｐｌリガンド（１〜１７４）またはｍ ｐｌリガンド１〜１７４類似体を含むＣＯＳ−１ならし培地１．５μｌを各ウエ ルに添加した。最終容積は、テラサキ型マイクロタイター組織培養プレート（ヴ ァンガードインターナショナル社（Ｖａｎｇａｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ ｌ）製）中で１５μｌとした。細胞を、５％ＣＯ₂中加湿箱内で３７℃にて８日 間培養し、１％グルタルアルデヒドで 培養ウエルに直接固定し、次に、抗−ＧＰＩｂ、抗−ＧＰＩＩｂ（バイオデザイ ン社（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）製）および抗−ＧＰＩｂ（カリフォルニア州カルピ ンテリア在ダコ社（Ｄａｋｏ）製）からなるモノクローナル抗体カクテルと一緒 にインキュベートした。ストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ検出装置（ ＨｉｓｔｏＭａｒｋ、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ）を用いて免 疫反応を発色させた。より濃い色（実際の写真では青色）で確認された巨核球が 図８に見られる。 図８のパネルＡおよびＤは、それぞれ陽性および陰性の対照である。パネルＡ に示すウエルには、３７．５ｐｇの野生型ｍｐｌリガンド１〜１７４ＣＯＳ−１ ならし培地を入れ、実質的な巨核球成長を示す。パネルＤには、１．５μｌのＣ ＯＳ−１ｍｏｃｋならし培地を入れたが、成長を示さない。図８のパネルＢおよ びＣは、それぞれｍｐｌリガンド１〜１７４類似体Ｎ７およびＮ１０である。パ ネルＢには、９．０ｐｇのｍｐｌリガンドＣＯＳ−１ならし培地を入れ、パネル Ｃには２７ｐｇを入れ、両者は優れた巨核球成長を示す。 この実験は、試験したｍｐｌリガンドの類似体がインビトロでのヒト巨核球の 産生を刺激することができることを示してい る。 実施例９ インビトロ細胞増殖アッセイにおけるｍｐｌリガンド１〜１７ ４類似体の生物学的活性 前述のようにｍｐｌリガンド１〜１７４の類似体を調製し、３２Ｄ−ｍｐｌ細 胞の増殖を刺激する能力を検定した。３２Ｄ−ｍｐｌ細胞を構築するために、全 長ヒトｍｐｌレセプター配列（ヴィゴン（Ｖｉｇｏｎ，Ｉ．）らのＰＮＡＳ第８ ９巻：５６４０〜５６４４頁（１９９２年）製）をモロニーマウス肉腫ウイルス の転写プロモーターを含む発現ベクターにサブクローニングした。この構築物６ μｇおよび両栄養性レトロウイルスパッケージング構築物（ランドー(Ｌａｎｄ ａｕ，Ｎ．Ｒ．)、リットマン（Ｌｉｔｔｍａｎ，Ｄ．Ｒ．）のＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第６６巻：５１１０〜５１１３頁（１９９２年））６ μｇを、ＣａＰＯ₄哺乳動物トランスフェクションキット（ストラタジーン社（ ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製）を用いて３×１０⁶２９３細胞中にトランスフェク ションした。２日後に同じ細胞をトランスフェクションし、４日後に再度トラン スフェクションした。最後のトランスフェクション の後日、ＩＬ−３依存性マウス細胞系（３２Ｄ、クローン２３；グリーンバーガ ー（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ）らのＰＮＡＳ第８０巻：２９３１〜２９３６頁（ １９８３年））を用いて２９３細胞を共培養した。２４時間後、３２Ｄ細胞を取 り出し、ＢＳＡグラジエント（Ｐａｔｈ−ｏ−ｃｙｔｅ；マイルス社（Ｍｉｌｅ ｓ Ｉｎｃ．）製）中でバンド形成した。１ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−３中で細胞 を増やし、次に、２０％ＡＰＫ９血清（バートレイ（Ｂａｒｔｌｅｙ）らのＣｅ ｌｌ第７７巻：１１１７〜１１２４頁（１９９４年））中での成長により選択し た。ポリクローナルウサギ抗ペプチド（ＭＰＬ）血清を用いるＦＡＣＳによりレ セプターの細胞表面発現について細胞を分類した。これらのサイトカイン依存性 マウス３２Ｄ−ｍｐｌ細胞はｍｐｌリガンドに反応性がある。１０％胎児クロー ンＩＩ血清（ハイクローンラボラトリーズ社（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ）製）および１．０ｎｇ／ｍｌｍｕＩＬ３を１×１０⁶細胞／ｍｌの 細胞密度となるように含むＭＥＭ培地において３２Ｄ−ＭＰＬ細胞を成長させた 。細胞を遠心分離（約５００ＸＧ）により収集し、ｍｕＩＬ３を欠く成長培地で ２回洗浄し、１×１０⁵細胞／ｍｌで再懸濁させた。 ｍｐｌリガンド１〜１６３を用いて５０００〜１ｐｇ／ｍｌにわたる、１２点 におよぶｍｐｌリガンド標準曲線を作成した。標準ｍｐｌリガンドまたはアッセ イサンプルの各希釈液１００μｌを、再懸濁細胞１００μｌ（１００００細胞／ ウエル）を含む９６ウエルマイクロタイター組織培養プレートの適当なウエルに 添加し、３７℃および１０％ＣＯ₂の条件下に加湿培養器内で培養した。４８時 間後、ＭＴＳ試薬（水性非放射性細胞増殖キット、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ ）製）４０μｌを各ウエルに添加し、１４〜１８時間後に、プレートリーダーで ４９０ｎＭにてプレートを読んだ。サンプル中のインビトロ活性を、各サンプル についての用量応答曲線から計算した。１単位は、最大刺激の５０％を提供する のに必要な各サンプル中のｍｐｌリガンドの量と定義される。比活性は、ｍｐｌ リガンドＥＬＩＳＡにより決められるｍｐｌリガンド濃度（ｎｇ／ｍｌ）で生物 学的活性（単位／ｍｌ）を割ることにより計算した。 トランスフェクションされＣＯＳ細胞中で発現されるｍｐｌリガンド類似体の 比生物学的活性を表４に示す。炭水化物付加に対するアミノ酸置換の効果も要約 する。精製ヒト配列ｍｐｌリガンドは、前記アッセイにより決定される２００〜 ３００単 位／ｎｇであるインビトロ活性を有する。表４から、付加的炭水化物鎖（実施例 ６のセクションＡで決められる）、例えばＮ４およびＮ１０を含んでいても、さ らなるＮ−結合型炭水化物を含むｍｐｌリガンド類似体、ならびに天然型配列ｍ ｐｌリガンドが発現されることが明らかである。これらの類似体はともに、イン ビトロ生物学的活性も完全に維持していた。従って、Ｎ−結合型炭水化物を含む ｍｐｌリガンド類似体が哺乳動物細胞において正常に発現され、それらは正常な または高められたインビトロ生物学的活性を有し得る。 注釈 （ａ）実施例６に記載されているようにＳＤＳゲル中での類似体ポリペプチドの 移動度に基づき、付加的Ｎ−結合鎖の数を推定した。 （ｂ）実施例に記載されているようにＥＬＩＳＡアッセイにより、ＣＨＯ細胞上 澄み中のｍｐｌリガンド類似体の量を決めた。 （ｃ）成長についてｍｐｌリガンドに依存する３２Ｄ細胞中でのチミジン取り込 みの刺激を測定することによりインビトロ活性を測定した。 （ｄ）（増殖アッセイにより測定されるｍｐｌリガンド類似体のインビトロ活性 ）対（ｍｐｌリガンドＥＬＩＳＡにより測定されるｍｐｌリガンド類似体の量） の比。 Ｎ．Ａ．：入手せず。 実施例１０ ＣＨＯ細胞中での発現およびｍｐｌリガンド１〜１７４、Ｎ４ およびＮ１５の精製 ｍｐｌリガンド１〜１７４、Ｎ４およびＮ１５ｃＤＮＡを含むｐＤＳＲα２を 、実施例２に記載のプロトコールを用い、以下の変更を加えてＤＨＦＲ−欠損Ｃ ＨＯ細胞中にトランスフェクションした。 各類似体について一回のトランスフェクションを行った。トランスフェクショ ンから３週間後、ｍｐｌリガンドＥＬＴＳＡによりｍｐｌリガンド発現をスクリ ーニングした。各型について三つの発現クローンを凍結貯蔵した。各類似体につ いての最も高い発現クローンをローラー瓶製造のため増殖した。Ｎ４について、 ならし培地（５０％Ｄ−ＭＥＭ、５０％ＨＡＭＳ−Ｆ１２、１％ペニシリン／ス トレプトマイシン／グルタミン、１％非必須アミノ酸（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ） 製））７．４リッターを製造し、Ｎ１５について、ならし培地４．６リッターを 製造した。 ｍｐｌリガンド１〜１７４（２．９Ｌ）、Ｎ４（７．４Ｌ）、Ｎ１５（４．４ Ｌ）を発現するＣＨＯ細胞を接種したローラー 瓶からの血清非含有ＣＨＯ細胞ならし培地を、Ｓ１Ｙ１０（１００００ダルトン 分子量カットオフ）アミコン螺旋限外濾過カートリッジを用いて、それぞれ１２ −、１９−、および１２−倍に濃縮した。次に、濃縮したならし培地１５０ｍｌ を、０．３ｍｌ／分の流速で３．３ｍｌ ｈｕ−ＭＰＬ−Ｘ（レセプター）アフ ィニティカラムに直接負荷した。アフィニティカラムは、製造者により勧められ るように、ファーマシア製ＣＮＢｒ活性化セフアロース樹脂１ｍｌ当たりＭｐｌ −Ｘ（Ｍｐｌレセプターの可溶性細胞外ドメイン）１．０〜１．５ｍｇを結合さ せることにより構築した。負荷後、カラムを燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ：１０ｍＭ ＮａＰＯ₄ ｐＨ６．８／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）３０ｍｌで洗浄し、次に１ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０／１Ｍ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＣＨＡＰＳ６０ｍｌ で洗浄した。ｍｐｌリガンド１〜１７４を、２０ｍＭ ＣＡＰＳ（３−[シクロ ヘキシルアミノ]−１ プロパンスルホン酸） ｐＨ１０．５／１Ｍ ＮａＣｌ ／１ｍＭ ＣＨＡＰＳ（３−[(３−コルアミドプロピル)ジメチルアモニオ]−１ −プロパンスルホネート）３０ｍｌで溶離した。 各溶離フラクションに１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０の０．６ ｍＬを添加することによりフラクションを中和した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０／１Ｍ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＣＨＡＰＳでの洗 浄中に、１〜１７４ｍｐｌリガンドの明らかな「溶出（bleeding）」を示した。 溶離フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ｍｐｌリガンド１〜１７４を 含むこれらのフラクションを貯留した。このアフィニティ精製を改良し、以下の 変更を加えて繰り返した：０．５ｍＬ／分での負荷および溶離、１０ｍＭ Ｔｒ ｉｓ、ｐＨ８．０／１Ｍ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＣＨＡＰＳ洗浄での除去。 一本のｍｐｌリガンドバンドを含む全てのフラクションを、５０ｍＬ撹拌セル 中のYM１０（１００００ドルトン分子量カットオフ）膜を用いてかつセントリコ ン装置に切り換えて濃縮した。この濃縮物０．５ｍＬを、０．２５ｍＬ／分でＰ ＢＳ平衡ファーマシアスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ＨＲ１０／ ３０ゲル濾過カラムに直接添加して、フラクションを０．２５ｍＬずつ集めた。 一本のｍｐｌリガンドバンド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づく）を含む全ての溶 離フラクションを貯留した。 他の型（Ｎ４およびＮ１５）のＣＨＯ細胞発現ｍｐｌリガン ドを同様に（二つのアフィニティ精製物を貯留し、一本のスーパーデックス２０ ０ゲル濾過カラムを通した）精製した。 実施例１１ ＣＨＯ細胞発現Ｎ４およびＮ１５についての炭水化物付加の測 定 ＣＨＯ細胞中に発現されたｍｐｌリガンド中にＮ−結合型炭水化物が含まれる かどうか決定するために、実施例６に記載の方法で、以下の変更を加えてＳＤＳ −ＰＡＧＥウエスタンブロットによりならし培地を分析した。 ローラー瓶からのＣＨＯ Ｄ−ならし培地を用いた。サンプルを、セントリコ ン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−１０遠心分離濃縮器（マサチューセッツ州ビバリー 在アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ）製）に添加し、固定角ローター（ＪＡ２０．１） を用いるベックマンＪ２−ＨＳ遠心分離器で６０００ｒｐｍにて１時間回転させ た。ｍｐｌリガンド類似体約１００ｎｇを含む濃縮サンプルを、ＳＤＳサンプル 緩衝液（実施例６に記載）と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載置し、炭水化物を含 まないＥ．ｃｏｌｉ発現ｍｐｌリガンドＭＫ１〜１７４も載置した。図９は、予 想された量の炭水化物と相関する移動度の差異を示している。 最も早い移動度の種であるＭｅｔ−Ｌｙｓ（１〜１７４）Ｅ．ｃｏｌｉｍｐｌリ ガンドの後に、ｍｐｌリガンド１〜１７４（ＣＨＯ）、Ｎ４（ＣＨＯ）およびＮ １５（ＣＨＯ）の順に続いた。図９参照のこと。非グリコシル化ｍｐｌリガンド に対する寸法増加の最も可能性の高い説明は、ｍｐｌリガンド１〜１７４（ＣＨ Ｏ）上の付加的Ｏ−結合型炭水化物、Ｎ４（ＣＨＯ）上の付加的Ｏ−結合型炭水 化物および一つの付加的Ｎ−結合型オリゴ糖、およびＮ１５（ＣＨＯ）上の付加 的Ｏ−結合型炭水化物および二つの付加的Ｎ−結合型オリゴ糖である。 分子量の増加が本当にＮ−結合型炭水化物鎖の付加によるものであることを立 証するために、実施例６に記載のＮ−結合型炭水化物を除去するためにＮ−グリ カナーゼでサンプルを処理した。各サンプルは、ならし培地から精製されたｍｐ ｌリガンド類似体約１００ｎｇを含んでいた。 Ｎ−グリカナーゼでの処理後に、Ｎ４（ＣＨＯ）およびＮ１５（ＣＨＯ）の移 動度はｍｐｌリガンド１〜１７４（ＣＨＯ）のものまで低下した。Ｎ−グリカナ ーゼでｍｐｌリガンドＭＫ１〜１７４（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはｍｐｌリガンド１ 〜１７４（ＣＨＯ）を処理することは、いずれの型のものもＮ−結合型 炭水化物を含むことが予想されないので、移動度に影響を与えなかった。Ｎ−グ リカナーゼ処理を無処理に対して比較すると、Ｎ４についての寸法の差異は一本 のＮ−結合型炭水化物鎖の寸法に対応し、Ｎ１５についての寸法差異は二本の炭 水化物鎖の寸法に対応することが示される。すなわち、これらの二つのｍｐｌリ ガンド型についてのＮ−結合型グリコシル化部位の付加は、これらの種がＣＨＯ 細胞中に発現されたときに追加のＮ−結合型炭水化物を生じさせる。図１０参照 のこと。 実施例１２ ＣＨＯ細胞中に形成されたｍｐｌリガンド類似体のインビトロ 生物学的活性 発現されＣＨＯ細胞またはＥ．ｃｏｌｉ細胞から精製された精製ｍｐｌリガン ドおよび類似体を、標準としてＣＨＯ細胞中に産生されたｍｐｌリガンド１〜３ ３２を用いて得た曲線から活性を算出した以外は実施例９に記載のアッセイおよ び因子依存性細胞系３２Ｄ−ＭＰＬを用いて、インビトロ生物学的活性について 分析した。種々の型のインビトロ生物学的比活性を表５に示す。この表から、Ｃ ＨＯ細胞中に発現される付加的炭水化物を含むｍｐｌリガンド類似体がインビト ロ生物学的活性を 有することが明らかである。 実施例１３ ｍｐｌリガンド類似体のインビボ生物学的活性 種々の型のｍｐｌリガンドで処理したマウスからの血小板数を測定し、結果を 図１１に示す。ＣＨＯ由来ｍｐｌリガンド１〜３３２、１〜１７４、Ｎ４および Ｎ１５を製造し、ｍｐｌレセプターアフィニティクロマトグラフィーにより精製 した。Ｅ．ｃｏｌｉ由来Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−ｍｐｌリガンド１〜１７４を製 造し、従来のクロマトグラフィーにより精製した。示された濃度の各型のものを 、正常な雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに一日一回、５日間皮下投与した。最後の注射か ら２４時間後に尾静脈の横の小さな切り口からの試験血液を採血した。シスメッ クス（Ｓｙｓｍｅｘ）電気血球分析機（カリフォルニア州アーヴィン在バックス ター・ダイアグノスティクス社（Ｂａｘｔｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎ ｃ．）製）を用いて血球分析を行った。データは、４匹の動物の平均測定値に平 均の＋／−標準誤差を付して表す。総白血球数または赤血球数のような他の血球 パラメーターは、これらの処理により影響を受けなかった（データは示さない） 。 全ての型のものが血小板数の増加を刺激した。しかしながら、異なる型のもの の活性は異なった。相対インビボ活性は、ｍｐｌリガンドＭＫ１〜１７４（Ｅ． ｃｏｌｉ）＜ｍｐｌリガンド１〜１７４（ＣＨＯ）＜Ｎ４（ＣＨＯ）＜ｍｐｌリ ガンド１〜３３２（ＣＨＯ）＜Ｎ１５（ＣＨＯ）であった。結果は、非天然Ｎ− 結合型炭水化物の付加によりインビボ活性が増加することを示している。さらに 、炭水化物の量の増加がインビボ活性を比例的に増加させることが示されている 。 実施例１４ オーバーラップＰＣＲによるｍｐｌリガンド類似体および切頭 型Ｎ１６〜Ｎ４０の構築 類似体Ｎ１６〜Ｎ４０（これらの類似体の構造については表６参照のこと）を 、チェン（Ｃｈｅｎｇ）らのＰＮＡＳ第９１巻：５６９５頁（１９９４年）に記 載のプロトコールを用いて、オーバーラップＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に より構築した。各構築において一般的に一つまたは二つの突然変異が導入された 。 以下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成して、類似体Ｎ１６〜Ｎ４０の調 製に用いた： 一つの新しいグリコシル化部位を導入する構築、二つの連続工程で行った。工 程１において、４つの異なるオリゴヌクレオチドを用いて二つの反応を行った。 これらのオリゴ化合物は、５’正方向プライマー、逆方向変異誘発プライマー、 正方向変 異誘発プライマー（通常、逆方向変異誘発プライマーに相補的である）および逆 方向３’プライマーを含んでいた。逆方向３’プライマーは、停止コドンを導入 し続いてＳａｌＩ制限部位を導入する配列を含んでいた。停止コドンは、１７５ 、１８４、１９２および２００位において導入された。すなわち、長さ１〜１７ ４、１〜１８３（Ｎ１６）、１〜１９１（Ｎ１７）および１〜１９９（Ｎ３１） の型のものを製造することができた。ＰＣＲ１は、鋳型ＤＮＡ（ｍｐｌリガンド １〜１７４配列または全長ｍｐｌリガンド１〜３３２配列を含むｐＤＳＲα２） 、５’正方向プライマーおよび逆方向変異誘発プライマーを使用した。ＰＣＲ２ は、鋳型ＤＮＡ、３’逆方向プライマーおよび正方向変異誘発プライマーを使用 した。次に、二つのＰＣＲ反応を行い、増幅ＤＮＡフラグメントをアガロースゲ ル電気泳動により分離した。正しい寸法のＤＮＡフラグメントを含むアガロース の小片をゲルから切り出した。 ＰＣＲ１およびＰＣＲ２からのＤＮＡフラグメントを一緒にし、５’正方向お よび３’逆方向プライマーのみを用いて第３のＰＣＲ反応を実施した。すなわち 、ｍｐｌリガンドに挿入された所望の突然変異を含む全長ＤＮＡセグメントを増 幅した。 アガロースゲル電気泳動により、増幅したフラグメントを再び分離し、正しい 寸法のＤＮＡフラグメントを、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ^TMキットおよび製造者（ＢＩ Ｏ １０１社）により提供される手順を用いて精製した。精製したＤＮＡをＸｂ ａＩおよびＳａｌＩで消化し、次に再びＧｅｎｅＣｌｅａｎ^TMキットを用いて精 製した。次にフラグメントをＸｂａＩおよびＳａｌＩで切断したｐＤＳＲα２内 に連結した。連結ＤＮＡを、キャリアｔＲＮＡの存在下に０．３Ｍ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．２中エタノール２容を用いて沈殿させ、Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換し た。クローンを制限分析およびアガロースゲル電気泳動により試験して、これら が正しい寸法のＤＮＡ挿入物を含むことを確認した。次に精製プラスミドＤＮＡ を調製し、ｍｐｌリガンド挿入体を配列決定して、所望の突然変異の存在を確認 し、更なるアミノ酸変化が導入されていないことを確認した。 幾つかの場合において、二つ異常の突然変異が同時に組み合わされた：すなわ ちＮ２９、Ｎ３３、Ｎ３４、Ｎ３５、Ｎ３９およびＮ４０を参照されたい。これ は、新しい置換を、既に変化を含んでいるＤＮＡに導入することにより行うこと ができる。例えば、Ｎ１５中にＮ２３変化を導入することによりＮ３３を 製造した。この場合、Ｎ２３変異誘発プライマーおよびＮ１５鋳型ＤＮＡを用い て前記手順を行った。 もう一つの方法において、鋳型ＤＮＡ中に二つの変化を同時に導入することが できる。鋳型ＤＮＡは天然型配列を含むことができるか、または既に変化を含む ｍｐｌリガンド型をコードする配列を含むことができる。これらの場合、工程１ は三つのＰＣＲ反応と６つのオリゴ化合物を含んでいた。オリゴ化合物は、５’ 正方向プライマー、２対の正方向および逆方向変異誘発プライマー、および逆方 向３’プライマーを含んでいた。プライマーの各対は互いに相補的であり、一つ の新しいグリコシル化部位を導入するように設計された配列を含んでいた。 ＰＣＲ１は、鋳型ＤＮＡ、５’正方向プライマーおよび逆方向変異誘発プライ マー（pair１からのもの）を含んでいた。ＰＣＲ２は、鋳型ＤＮＡ、正方向変異 誘発プライマー（pair１からのもの）および逆方向変異誘発プライマー（pair２ からのもの）（ここでpair２プライマーはpair１プライマーに対して３’である ）を含んでいた。ＰＣＲ３は、鋳型ＤＮＡ、正方向変異誘発プライマー（pair２ からのもの）および逆方向３’プライマーを含んでいた。 各ＰＣＲ反応からのＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により分 離し、前述のように切り出した。次に、三つのＤＮＡグラグメントを一緒にし、 ５’正方向および３’逆方向プライマーのみを用いて再びＰＣＲにより増幅した 。 次に、二つの新しいグリコシル化部位を含む配列を有する意図する遺伝子全体 をコードするＤＮＡセグメントを精製し、ＸｂａＩおよびＳａｌＩで切断し、前 述のようにＸｂａＩおよびＳａｌＩ切断ｐＤＳＲα２内に連結した。 既に突然変異を含む鋳型においてＰＣＲ反応を行うことにより複数の突然変異 を組み合わせることもできる。例えば、Ｎ３９を、Ｎ１５鋳型ＤＮＡにＮ３６お よびＮ３８変化を導入することにより製造した。これは、Ｎ３６の製造に用いた もの（Ｎ３６（１））とは異なる組み合わせのプライマー（Ｎ３６（２））を用 いて行った。前記プライマーを参照のこと。両方の組み合わせのプライマーが同 じ突然変異を導入した。 より長いｍｐｌリガンド型を製造することもできた。すなわち、ＰＣＲ３にお ける３’逆方向プライマー、（工程１）および工程２のＰＣＲプライマーがＮ３ １の製造に用いられたプライマーであること以外はＮ３９と同様の方法によりＮ ４０を製 造した。このプライマーは、ＳａｌＩ制限部位に続く２００位に停止コドンを導 入した。さらに、ＰＣＲ３に用いられる鋳型ＤＮＡは、全長ｍｐｌリガンド（１ 〜３３２）をコードする配列を含んでいた。 典型的ＰＣＲ反応混合物は、正方向および逆方向プライマー（５ｐｍ／μｌ） の各４μｌ、鋳型（５０ｎｇ）１μｌ、５×ＬＰ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｃ ｉｎｅ ｐＨ８．７／２５％グリセロール／４２５ｍＭ ＫＯＡｃ）１０μｌ、 ｄＮＴＰストック（各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）１０ μｌ、ｒｔＴｈポリメラーゼ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ）製；２．５Ｕ／μｌ）０．８μｌ、およびＶｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ；１ ×ＬＰ緩衝液中１：１００の新しい希釈後に０．０１Ｕ／μｌ）２μｌを含んで いた。Ｈ₂Ｏを添加して最終容量を５０μｌにした。全ての成分を示す順番で一 緒に添加し、最初のサイクル中の温度が６０℃を越えたときに５０ｍＭ ＭｇＯ Ａｃ １μｌを添加することによりＰＣＲを開始した。反応条件：９４℃、１０ 秒／４５℃、１分／６８℃、５分の２サイクル、続いて９４℃、１０秒／５５℃ 、１分／６８℃、５分の２５サイクル。 これらの一般的手順を用いて、表６に示すｍｐｌリガンド類似体および切頭型 Ｎ１６〜Ｎ４０を構築した。各型についてのＤＮＡ配列の変化を示す。 前記表中の、符号（ｉ）は記載のアミノ酸を挿入していることを示す。例えば 、Ｇｌｕ⁵⁷→Ａｓｎ^55'(i)、Ｔｈｒ⁵⁷（表６中の類似体Ｎ２３）は、５７位のＧ ｌｕがＴｈｒで置換されており、さらに、５５位においてＭｅｔの直後にＡｓｎ が挿入されており、その後のアミノ酸がその前に付された番号を維持するように Ａｓｎは５５’と番号が付けられた。 先の実施例からの全ての変化を含む実施例は、「＋」の符号で結合された特定 の類似体番号により示される。Ｎ３５、Ｎ３９およびＮ４０を参照のこと。これ らの類似体のアミノ酸鎖の長さを括弧内に示す。すなわち、類似体Ｎ３５は、類 似体Ｎ４、Ｎ２３、Ｎ３０およびＮ３１についての全ての変化を組み合わせて含 む。Ｎ３１について示される変化は、類似体Ｎ３５が１９９アミノ酸長であるこ とを示す。表６中の全ての類似体は、異なる長さであることを示す場合を除いて １７４アミノ酸長である（あるいは、アミノ酸が挿入されている場合、合計の長 さは挿入されたアミノ酸の数により増加する）。 実施例１５ ｍｐｌリガンド類似体および切頭型Ｎ１６〜Ｎ４０の特徴付け Ａ．ｍｐｌリガンド類似体の発現レベルおよびインビトロ生物学的活性の測定 種Ｎ１６〜Ｎ４０を、電気穿孔法（実施例５）またはＣａＰＯ₄法（哺乳動物 細胞トランスフェクションキット；Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ ｍｅｄｉａ）を用いて ＣＯＳ細胞中にトランスフェクションした。３〜４日後、細胞非含有ならし培地 を採取し、アリコートを取り−70℃で貯蔵した。実施例７に記載されているよう に発現レベルをＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。上澄みも、実施例９に記載 の方法で一つの変更を加えて、生物学的活性について検定した。活性は、標準と して精製ＣＨＯ細胞発現ｍｐｌリガンド１〜３３２を用いて標準曲線から算出し た。 結果を表７に示す。表７に示すように、大部分のｍｐｌリガンド類似体は発現 し分泌された。類似体の一部は、分泌が増加しているようであった。これらのサ ンプルのバイオアッセイは、大部分のものの比活性が非改変型のものにも匹敵す ることを示した。類似体の一部は、複数のＮ−結合型炭水化物鎖を含んでいた（ 以下参照のこと）。これは、炭水化物付加が類似体の分泌および正常インビトロ 活性の増加につながり得ることを示している。 注釈 （ａ）ＳＤＳゲル中での類似体ポリペプチドの移動度に従って、付加的Ｎ−結合 鎖の数を推定した。 （ｂ）ＥＩＡアッセイにより、ＣＯＳ細胞上澄み中のｍｐｌリガンド類似体の量 を決めた。 （ｃ）成長についてｍｐｌリガンドに依存する３２Ｄ−ＭＰＬ細胞の増殖を測定 することによりインビトロ活性を測定した。 （ｄ）（増殖アッセイにより測定されるｍｐｌリガンド類似体 のインビトロ活性）対（ｍｐｌリガンドＥＬＩＳＡにより測定されるｍｐｌリガ ンド類似体の量）の比。 ｉ− 挿入 Ｎ．Ａ． 入手せず Ｂ．炭水化物付加の測定 表６に示す類似体を、実施例６に記載の手順を用いてＮ−結合型炭水化物を付 加しているか試験した。 一部の類似体（Ｎ２１、Ｎ２２、Ｎ３０、Ｎ３３およびＮ３６）を、変更した 手順を用いても試験した。この試験は必要である。なぜなら、ウエスタンブロッ トを行うために用いたモノクローナル抗体がアミノ酸残基４７〜６２を含むペプ チドに対するものであり、表６に記載の類似体の一部がこの抗体（例えばＮ２１ ）との免疫反応性に影響を与える置換を含むからである。従って、これらの類似 体を分析するために、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞発現ｍｐｌリガンド１〜１６３に対する マウスモノクローナル抗体を用いて上澄みを免疫沈殿させた。 典型的に、ｍｐｌリガンド類似体５０ｎｇを免疫沈殿させるために抗体１５μ ｇを使用した。ウサギ抗ｍｐｌリガンドポリ クローナル抗体（典型的に１μｇ／ｍｌ；Ｅ．ｃｏｌｉ細胞発現ｍｐｌリガンド １〜１６３に対する抗体）および抗ウサギＥＣＬキット（アマーシャム社（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ）製）を用いてブロットをインキュベートすることにより免疫沈殿 バンドを視覚化する以外は実施例６に記載の方法により、免疫沈殿材料を用いて ウエスタンブロットを行った。種々の実験の結果を表７に示す。一部の類似体は 、Ｎ−結合型炭水化物（N２１、N２２、N２３、N２９、N３０、N３１、N３３、N ３４、N３５、N３６、N３８、N３９および N４０）の存在を示す寸法増加を示し た。これらの類似体のサブセットは二つ以上のＮ−結合鎖を有していた：例えば N２９、N３３、N３４、N３５、N３９および N４０。これらの類似体は正常また はより高いレベルで分泌され、ｍｐｌリガンド１〜１７４に匹敵するインビトロ 生物学的活性を有していた。このことは、発現または生物学的活性のいずれにも 悪影響を与えることなく多機能性Ｎ−結合型グリコシル化部位をｍｐｌリガンド に導入し得ることを示している。 複数のオリゴ糖鎖をｍｐｌリガンドに付加し得ることを示すために、ＣＯＳ細 胞中に発現した種々の類似体を実施例６に記載のようにしてウエスタンブロット により分析した。図１２は、 付加したＮ−結合型グリコシル化部位の数の増加につれて類似体の移動度が低下 することを示している。４つの新しい部位を有する類似体Ｎ３９およびＮ４０が 示される。最もＮ−結合部位を有する類似体は移動度が最も低い。この結果は、 １〜１７４および１〜１９９の両方の型のｍｐｌリガンドについて観察される。 このことは、少なくとも４つの類似体を組み合わせて複数のＮ−結合型炭水化物 鎖を有する新しい類似体を得ることができることを示している。 実施例１６ Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒを含むグリコシル化部位とＡｓｎ−Ｘ−Ｔ ｈｒを含む部位との比較 Ｎ−結合型グリコシル化部位は、Ａｓｎ−Ｘ−ＴｈｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅ ｒ（ＸはＰｒｏ以外の２０個の天然アミノ酸のうちの任意の一つであり得る）を 含む。第３の位置においてＳｅｒまたはＴｈｒのいずれが好ましいかを決めるこ とが望まれる。従って、第３の位置にＳｅｒまたはＴｈｒを含むｍｐｌリガンド グリコシル化類似体をそれぞれが含む２組の類似体を試験して、Ｎ−結合型グリ コシル化部位の占有率％への影響があるかどうか調べた。Ｎ１５は二つのＡｓｎ −Ｘ−Ｔｈｒ部位 を含み、Ｎ２９は正確に同じ位置に二つのＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ部位を含む。同様 に、Ｎ３０は一つのＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ部位を含み、Ｎ３８は同じ位置に一つの Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ部位を含む。 これらの２組の類似体を比較するために、それらをＣＯＳ細胞中に発現させ、 分泌ｍｐｌリガンドを実施例６に記載のようにウエスタンブロットに付した。図 １３は結果を示す。Ｎ１５は、Ｎ２９と比べて大きく増加した割合でグリコシル 化ｍｐｌリガンドを有する。対照的に、Ｎ３０とＮ３８とを比較した場合、グリ コシル化と非グリコシル化ｍｐｌリガンドの割合には差異がほとんど無かった。 これらの結果は、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒとＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒの両方をｍｐｌリガ ンド中に導入することができ、両者がＮ−結合型炭水化物付加のための部位とし て作用し得ることを示している。さらに、ある場合には、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ列 が好ましい（すなわち、より効果的にグリコシル化される）。 本発明を、その好ましい実施態様と考えられるものについて説明したが、開示 された実施態様に限定されるものではなく、それどころか、添付の請求の範囲の 思想および範囲内に含まれ る種々の変更および均等物が包含され、請求の範囲は、そのような変更および均 等物を含むように最も広く解釈されるべきものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＢＹ // Ｃ１２Ｐ 21/02 37/66 Ｇ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ， ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも一つの付加された、少なくとも一つの欠失された、または少な くとも一つの変更されたグリコシル化部位を含有するアミノ酸配列を含むｍｐｌ リガンド類似体。 ２．グリコシル化部位がＮ−結合型炭水化物鎖のためのものである請求項１に 記載の類似体。 ３．グリコシル化部位がＯ−結合型炭水化物鎖のためのものである請求項１に 記載の類似体。 ４．真核生物中で発現された少なくとも一つの結合された付加的炭水化物鎖を 有する請求項１に記載の類似体。 ５．炭水化物鎖がＮ−結合型炭水化物鎖である請求項４に記載の類似体。 ６．炭水化物鎖がＯ−結合型炭水化物鎖である請求項４に記載の類似体。 ７．真核生物中での外来性ＤＮＡ配列の発現生成物である請求項１に記載の類 似体。 ８．下記のものからなる群より選択される請求項５に記載の類似体： ［Ａｓｎ³⁰、Ｔｈｒ³²］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ⁸²、Ａｌａ⁸³］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ⁸⁷、Ｔｈｒ⁸⁹］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ⁵³、Ｔｈｒ⁵⁵］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ⁵⁸、Ｔｈｒ⁶⁰］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ³⁰、Ｔｈｒ³²、Ａｓｎ¹²⁰、Ｔｈｒ¹²²］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ³⁷、Ｇｌｙ³⁸、Ｓｅｒ³⁹］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ³⁹、Ｓｅｒ⁴¹］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ⁵⁴、Ｓｅｒ⁵⁶］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ⁵²、Ｔｈｒ⁵⁴］ｍｐｌリガンド； ［ｓｎ^55'(f)、Ｔｈｒ⁵⁷］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ⁸¹、Ｔｈｒ⁸³］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ¹¹⁸、Ｓｅｒ¹²⁰］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ³⁰、Ｓｅｒ³²、Ａｓｎ¹²⁰、Ｓｅｒ¹²²］ｍｐｌリガンド； ［Ｔｈｒ¹⁶³、Ａｓｎ¹⁶⁴］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ³⁰、Ｔｈｒ³²、Ａｓｎ¹²⁰、Ｔｈｒ¹²²、 Ａｓｎ^55'(i)、Ｔｈｒ⁵⁷］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ³⁰、Ｔｈｒ³²、Ａｓｎ^55'(i)、Ｔｈｒ⁵⁷、Ｔｈｒ¹⁶³、Ａｓｎ¹⁶⁴］ｍｐ ｌリガンド； ［Ａｓｎ⁵⁵、Ｔｈｒ⁵⁷］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ⁵⁶］ｍｐｌリガンド； ［Ｔｈｒ¹⁶³、Ａｓｎ¹⁶⁴、Ｔｈｒ¹⁶⁶］ｍｐｌリガンド；および ［Ａｓｎ³⁰、Ｔｈｒ³²、Ａｓｎ¹²⁰、Ｔｈｒ¹²²、Ａｓｎ⁵⁵、Ｔｈｒ⁵⁷、Ｔｈｒ^{16 3} 、Ａｓｎ¹⁶⁴、Ｔｈｒ¹⁶⁶］ｍｐｌリガンド。 ９．ｍｐｌリガンドが下記のものからなる群より選択されるアミノ酸配列を有 する請求項１に記載の類似体： ｍｐｌリガンド１〜３３２ 図１のアミノ酸１〜３３２ ｍｐｌリガンド１〜１９９ 図１のアミノ酸１〜１９９ ｍｐｌリガンド１〜１９１ 図１のアミノ酸１〜１９１ ｍｐｌリガンド１〜１８３ 図１のアミノ酸１〜１８３ ｍｐｌリガンド１〜１７４ 図１のアミノ酸１〜１７４ ｍｐｌリガンド１〜１６３ 図１のアミノ酸１〜１６３ ｍｐｌリガンド１〜１５３ 図１のアミノ酸１〜１５３ ｍｐｌリガンド１〜１５２ 図１のアミノ酸１〜１５２ ｍｐｌリガンド１〜１５１ 図１のアミノ酸１〜１５１ ｍｐｌリガンド７〜３３２ 図１のアミノ酸７〜３３２ ｍｐｌリガンド７〜１９１ 図１のアミノ酸７〜１９１ ｍｐｌリガンド７〜１９９ 図１のアミノ酸７〜１９９ ｍｐｌリガンド７〜１８３ 図１のアミノ酸７〜１８３ ｍｐｌリガンド７〜１７４ 図１のアミノ酸７〜１７４ ｍｐｌリガンド７〜１６３ 図１のアミノ酸７〜１６３ ｍｐｌリガンド７〜１５３ 図１のアミノ酸７〜１５３ ｍｐｌリガンド７〜１５２ 図１のアミノ酸７〜１５２ ｍｐｌリガンド７〜１５１ 図１のアミノ酸７〜１５１。 １０．下記のものからなる群より選択されるヒトｍｐｌリガンド類似体： ［Ａｓｎ²²］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ²⁵］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ³⁸、Ｔｈｒ⁴⁰］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ⁸⁶］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ⁹²］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ¹²⁰、Ｔｈｒ¹²²］ｍｐｌリガンド； ［Ｓｅｒ³⁶、Ａｓｎ³⁸、Ｔｈｒ⁴⁰］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ⁸⁸、Ｔｈｒ⁹⁰］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ²³、Ｓｅｒ²⁵］ｍｐｌリガンド； ［Ａｓｎ⁵⁷、Ｓｅｒ⁵⁹］ｍｐｌリガンド；および ［Ａｓｎ¹¹⁹、Ｓｅｒ¹²¹］ｍｐｌリガンド。 １１．前記ｍｐｌリガンドが下記のものからなる群より選択される請求項１０ に記載のヒトｍｐｌリガンド類似体： ｍｐｌリガンド１〜３３２ 図１のアミノ酸１〜３３２ ｍｐｌリガンド１〜１９９ 図１のアミノ酸１〜１９９ ｍｐｌリガンド１〜１９１ 図１のアミノ酸１〜１９１ ｍｐｌリガンド１〜１８３ 図１のアミノ酸１〜１８３ ｍｐｌリガンド１〜１７４ 図１のアミノ酸１〜１７４ ｍｐｌリガンド１〜１６３ 図１のアミノ酸１〜１６３ ｍｐｌリガンド１〜１５３ 図１のアミノ酸１〜１５３ ｍｐｌリガンド１〜１５２ 図１のアミノ酸１〜１５２ ｍｐｌリガンド１〜１５１ 図１のアミノ酸１〜１５１ ｍｐｌリガンド７〜３３２ 図１のアミノ酸７〜３３２ ｍｐｌリガンド７〜１９９ 図１のアミノ酸７〜１９９ ｍｐｌリガンド７〜１９１ 図１のアミノ酸７〜１９１ ｍｐｌリガンド７〜１８３ 図１のアミノ酸７〜１８３ ｍｐｌリガンド７〜１７４ 図１のアミノ酸７〜１７４ ｍｐｌリガンド７〜１６３ 図１のアミノ酸７〜１６３ ｍｐｌリガンド７〜１５３ 図１のアミノ酸７〜１５３ ｍｐｌリガンド７〜１５２ 図１のアミノ酸７〜１５２ ｍｐｌリガンド７〜１５１ 図１のアミノ酸７〜１５１。 １２．真核生物中での外来性ＤＮＡ配列の発現生成物である請求項８〜１１の いずれかに記載の類似体。 １３．前記真核生物細胞が哺乳動物細胞である請求項１２に記載の類似体。 １４．真核生物中での外来性ＤＮＡ配列の発現生成物である［Ａｓｎ³⁰、Ｔｈ ｒ³²、Ａｓｎ¹²⁰、Ｔｈｒ¹²²、Ａｓｎ^55'(i)、Ｔｈｒ⁵⁷、Ｔｈｒ¹⁶³、Ａｓｎ¹⁶⁴ 、Ｔｈｒ¹⁶⁶］ｍｐｌリガンド１〜１７４、または ［Ａｓｎ³⁰、Ｔｈｒ³²、Ａｓｎ¹²⁰、Ｔｈｒ¹²²、Ａｓｎ^55'(i)、Ｔｈｒ⁵⁷、Ｔｈ ｒ¹⁶³、Ａｓｎ¹⁶⁴、Ｔｈｒ¹⁶⁶］ｍｐｌリガンド１〜１９９ である請求項１に記載の類似体。 １５．前記真核生物細胞が哺乳動物細胞である請求項１４に 記載の類似体。 １６．前記哺乳動物細胞がＣＨＯである請求項１５に記載の類似体。 １７．（ａ）ｍｐｌリガンド中の任意のＯ−結合型炭水化物部位の、Ｎ−結合 型炭水化物部位による置換； （ｂ）ｍｐｌリガンド中の任意のＮ−結合型炭水化物部位の、Ｏ−結合型炭水化 物部位による置換； （ｃ）ｍｐｌリガンド中の任意のＯ−結合型炭水化物部位の、異なるＯ−結合型 炭水化物部位による置換；または （ｄ）ｍｐｌリガンド中の任意のＮ−結合型炭水化物部位の、異なるＮ−結合型 炭水化物部位による置換 を含有するアミノ酸配列を含むｍｐｌリガンド類似体。 １８．少なくとも一つの付加された、少なくとも一つの欠失された、または少 なくとも一つの変更されたグリコシル化部位を含むｍｐｌリガンド類似体をコー ドするＤＮＡ配列。 １９．請求項１〜１１および１３〜１７のいずれかに記載のｍｐｌリガンド類 似体をコードするＤＮＡ配列。 ２０．宿主細胞にｍｐｌリガンド類似体を発現させるように請求項１９に記載 のＤＮＡ配列でトランスフェクションされた 真核生物宿主細胞。 ２１．薬学的に許容できる希釈剤、アジュバントまたは担体と共に、請求項１ 〜１１および１３〜１７のいずれかに記載のｍｐｌリガンド類似体を治療的に有 効な量で含む組成物。