KR100492452B1 - Mpl리간드유사체 - Google Patents

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KR100492452B1
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Abstract

상응하는 아미노산 수의 천연 산출 mpl 리간드 서열과 비교하여 한 개 이상의 변경된 글리코실화 부위를 갖는 mpl 리간드 유사체가 기재되어 있다. 본 발명은 또한 이러한 mpl 리간드 유사체를 코딩하는 DNA 서열, 유사체 발현을 위한 재조합 플라스미드 및 숙주 세포 및 이러한 유사체를 포함하는 치료용 조성물에도 관한 것이다.

Description

ＭＰＬ 리간드 유사체
본 발명은 하나 이상의 변형된 O- 또는 N-결합된 글리코실화 부위를 갖는 mpl 리간드 유사체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 mpl 리간드 유사체를 코딩하는 DNA 서열, 유사체를 발현하기 위한 재조합 플라스미드 및 숙주 세포에도 관한 것이다.
MGDF 또는 거핵구 성장 및 분화 인자는 최근에 클로닝된 시토킨으로서 순환 혈소판 수준의 주요 조절인자인 것으로 보여진다. 바틀리, 티.디. 일행, Cell 77: 1117-1124 (1994); 로크, 에스. 일행의 Nature 369: 565-568 (1994); 드 소베지, 에프. 제이. 일행, Nature 369: 533-538 (1994); 미야자케, 에이취. 일행, Exp. Hematol. 22: 838 (1994); 및 쿠터, 디. 제이. 일행, PNAS USA, 91: 11104-11108 (1998) 참고. 바틀리, 티. 디. 일행에 의해 Cell 77: 1117-1124 (1994)에 기재된 바와 같이 MGDF는 트롬보포이에틴(TPO), mpl 리간드 및 메가포이에틴으로 불린다. 여기서, 용어 "mpl 리간드"는 일반적으로 TPO 및 MGDF를 비롯한 mpl 리셉터를 활성화시키는 모든 폴리펩티드를 지칭하는 것으로 사용한다. mpl 리셉터는 세포 표면 단백질로서 활성화시에 거핵구 및 혈소판의 생산 및/또는 분화를 초래한다. WO 92/07074호 참조.
"mpl 리간드 유사체"는 탄화수소 결합 부위의 숫자, 위치 또는 유형에 영향을 주는 방식으로 천연 서열과 상이한 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 본 발명의 목적이기도 하다. 성숙한 천연의 사람 mpl 리간드는 총 332개의 아미노산을 갖는 단백질이다. 이 단백질의 서열 (21개 아미노산 길이의 리더 서열에 부착됨) 및 상응하는 cDNA를 도 1 (서열 1 및 2)에 도시한다.
CHO(Chinese Hamster Ovary) 및 대장균 세포 모두에서 생산된 재조합 mpl 리간드는 마우스, 쥐 및 원숭이 체내에서 거핵구 및/또는 혈소판을 특이적으로 자극하거나 증가시키는 생물학적 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예컨대 헌트, 피. 일행, Blood 84 (10): 390A (1994) 참조. 도 1의 아미노산 위치 22에서 부터 시작하여 151 아미노산 이상까지 계속되도록 절단된 사람의 mpl 리간드 분자 (사람의 cDNA에 의해 코딩되는 332개 아미노산 단백질과 비교하여)는 생체내에서 생물학적 활성을 갖는다. 도 2 (서열 3 및 4)는 성숙한 형태로서 174개 아미노산을 갖고 또 생물학적 활성을 갖는 절단된 mpl 리간드 분자의 일례를 제시한다. 도 2에서, 174개의 아미노산 길이의 단백질은 21개의 아미노산 N-말단 리더 서열에 부착되어 있다. 이 분자는 이하의 실시예에서 일부 mpl 리간드 유사체를 창제하기 위해 사용되었다. 다른 유사체들은 도 1의 아미노산 1-199, 1-191 및 1-183을 기본으로 한다. 성숙한 사람의 mpl 리간드 단백질 서열의 N-말단에서 처음의 6개 아미노산까지 제거할 수 있고 생물학적 활성을 유지할 수 있다. 그러므로 생물학적 활성은 도 1에 도시된 사람의 mpl 리간드의 성숙 아미노산 서열의 아미노산 7 내지 151 (포괄적)내에 존재함을 알 수 있다.
일반적으로, 많은 세포 표면 및 진핵 세포로 부터 생산된 분비 단백질은 하나 이상의 올리고다당류 기에 의해 개질된다. 글리코실화라고도 지칭되는 이러한 개질은 단백질의 물리적 특성에 현저한 영향을 주므로 단백질 안정성, 분비 및 세포내 위치에 있어서 중요할 수 있다. 적합한 글리코실화는 생물학적 활성에도 필수적일 수 있다. 사실상, 진핵 생물로 부터 얻은 일부 유전자는 단백질을 글리코실화하는 세포성 과정을 결여하는 세균(예컨대 대장균)에서 발현되는 경우 글리코실화의 결여로 인하여 활성을 거의 갖지 않거나 활성을 전혀 갖지 않은 단백질을얻는다.
글리코실화는 폴리펩티드 주쇄의 특정 위치 또는 부위에서 일어나며 통상 2개 유형이 있다: O-결합된 올리고당류는 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr) 잔기에 부착되는 반면에 N-결합된 올리고당류(사슬)는 이들이 Asn-X-Ser/Thr(이때, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다) 서열의 일부일 때, 아스파라긴(Asn) 잔기에 부착된다. X는 바람직하게는 프롤린을 제외한 천연의 19개 아미노산중의 하나이다. N-결합된 올리고당류 및 O-결합된 올리고당류의 구조 및 각 유형으로 결합된 당 잔기는 상이하다. 양쪽에서 흔히 발견되는 당류의 한가지 유형은 N-아세틸뉴라민산(이후, 시알산이라 칭함)이다. 시알산은 N-결합된 및 O-결합된 올리고당류의 말단 잔기로서 그의 음성 전하로 인하여 당단백질에 산성 특성을 부여할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 글리코실화 부위는 글리코실 잔기에 구조적으로 결합될 수 있는 아미노산 잔기이지만, 이러한 부위는 글리코실 잔기에 실질적으로 결합되거나 결합되지 않을 수 있다. 상술한 바와 같이, O-결합된 부위는 Ser 또는 Thr 잔기인 반면에 N-결합된 부위는 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr이고, 이때 X는 상기 정의한 바와 같이 Pro를 제외한 임의의 아미노산 (바람직하게는 천연 산출의 19개 아미노산중의 하나)으로 정의된다. 소정 위치가 글리코실 사슬에 의해 글리코실화되었는지 여부는 분자가 그 부위 주변의 아미노산 및 기타 인자들을 발현한 숙주 세포에 의해 결정된다.
본 명세서에서, 소정 mpl 리간드 유사체에 부착된 사슬의 수는 특정 숙주 세포에 의해 발현된 소정 mpl 리간드 분자에 결합된 탄화수소(즉, 글리코실) 사슬의 평균 개수일 것이다. 천연 및 상응하는 재조합 mpl 리간드에 대한 글리코실화 부위는 일반적으로 동일하지만, 그 사슬의 개수는 재조합 발현에 사용된 특정 세포 숙주가 글리코실 사슬을 천연 공급원과 비교하여 동일 부위에 부착하는지의 여부에 따라 다를 것이다. 재조합 및 천연 mpl 리간드 유사체를 비교할 때, 천연 공급원이 그 길이의 mpl 리간드 분자를 실질적으로 생산하는지 여부에 관계없이 동일한 개수의 아미노산을 비교한다. 따라서, "천연"이라는 말은 천연 공급원에서 실질적으로 발현된 분자의 길이를 의미하는 것이 아니라 특정 종(사람과 같은)에서 사용된 서열을 지칭한다.
천연 산출의 mpl 리간드는 글리코실화된 분자이다. 천연 mpl 리간드의 글리코실화 패턴은 mpl 리간드에서 발견되는 2개의 주요 도메인에 결부되어 있다. 제 1 서열은 성숙한 사람의 mpl 리간드의 활성 부분에 해당되는 것으로 약 151 아미노산이며 적혈구의 생산을 자극할 수 있는 시토킨인 에리쓰로포이에틴과 현저한 상동성을 가지므로 사람의 mpl 리간드의 "EPO 유사" 도메인으로 지칭한다. 천연 단백질의 나머지 아미노산은 소위 "N-결합된 탄화수소" 도메인을 구성하는데 이는 이들이 N-결합된 글리코실화의 천연의 부위의 전체는 아니더라도 대부분을 포함하기 때문이다. 사람의 mpl 리간드에서, N-결합된 글리코실화 도메인에 함유된 6개 N-결합된 글리코실화 부위 모두가 존재한다. 양 도메인은 O-결합된 글리코실화 부위를 함유한다. 분자중에는 추정된 12 내지 14개의 O-결합된 글리코실화 사슬이 존재한다. CHO 세포에서 재조합적으로 발현된 사람의 mpl 리간드 DNA를 사용한 실험은 EPO 유사 도메인에서 2개 이상의 O-결합된 부위가 위치 1 (Ser) 및 37 (Thr)에서 글리코실화됨을 나타낸다.
mpl 리간드와 같은 당단백질은 등전 포커싱(IEF)와 같은 수법을 이용하여 상이하게 하전된 형태로 분리될 수 있다. 예컨대 몇몇은 조 에리쓰로포이에틴 제제 및 부분적으로 정제된 에리쓰로포이에틴 제제의 IEF 연구를 보고하였다(루코프스키 일행, J. Biochem. 50: 909 (1972); 쉘톤 일행, Biochem. Med. 12: 45 (1975); Fuhr 일행, Biochem. Biophys. Res. Comm. 98: 930 (1981)).
상술한 mpl 리간드 분자의 글리코실화에 대한 정보에도 불구하고, 상이한 글리코실화 패턴을 갖고 또 향상된 생물학적 활성을 갖는 mpl 리간드 분자를 수득할 필요가 여전히 존재하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 mpl 리간드 유사체로 지칭되는 신규한 글리코실화된 mpl 리간드 분자를 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기한 분자를 함유하는 약제학적 조성물 및 본 발명의 mpl 리간드 유사체를 사용하여 mpl 리간드를 처리할 수 있는 처리방법을 제공하는 것이다.
발명의 요지
일개 구체예로서, 본 발명은 상응하는 천연 mpl 리간드 서열과 비교하여 하나 이상의 부가된, 하나 이상의 결실된 및/또는 하나 이상의 부가되고 또 결실된 글리코실화 부위를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 mpl 리간드의 유사체에 관한 것이다. 부가되거나 결실된 글리코실화 부위(들)는 상응하는 천연의 mpl 리간드 서열, 특히 사람의 mpl 리간드에 비하여 크거나 작은 수의 탄화수소 사슬 및 높거나 낮은 시알산 함량을 초래할 수 있다. 예컨대 유사체의 한 유형은 동일하거나 상이한 위치에서 1개 이상의 N- 또는 O-결합된 부위의 결실 및 1개 이상의 N- 또는 O-결합된 부위의 부가를 포함할 수 있다.
상술한 구체예의 다른 예로서, 본 발명은 하나 이상의 N- 또는 O-결합된 글리코실화 부위가 하나 이상의 비천연 산출 부위로써 대체된 아미노산 서열을 포함하는 mpl 리간드 유사체에 관한 것이다. 따라서 N-결합된 부위는 상이한 N-결합된 부위로 교체될 수 있고; N-결합된 부위는 O-결합된 부위로 교체될 수 있으며; O-결합된 부위는 상이한 O-결합된 부위로 교체될 수 있고; 또 O-결합된 부위는 N-결합된 부위로 교체될 수 있다.
상술한 변형의 조합도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명은 또한 이러한 mpl 리간드 유사체를 코딩하는 DNA 서열 및 유사체 발현을 위한 재조합 플라스미드 및 숙주 세포도 포함한다.
상술한 모든 경우에서, 글리코실화 부위에서의 변화는 생성한 mpl 리간드 유사체에서 글리코실 사슬의 개수, 양, 위치 또는 유형(N- 대 O-)의 변화를 초래하며 mpl 리간드의 생물학적 활성은 유지하는데, 즉 상기 유사체는 mpl 리셉터를 활성화시킬 수 있다. mpl 리셉터의 활성화는 거핵구 형성이 향상됨으로써 생체내에서 혈소판의 증가를 초래함을 의미한다.
도 1은 시그널 펩티드(아미노산 -21 내지 -1)를 포함하는 사람의 천연 mpl 리간드의 DNA 및 아미노산 서열과 성숙 아미노산 서열(1-332)을 도시한다.
도 2는 21개 아미노산 길이의 시그널 펩티드에 부착된 사람의 성숙 mpl 리간드 서열의 아미노산 1-174에 상응하는 mpl 리간드의 DNA 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 3은 대장균 및 CHO 발현된 mpl 리간드로 행한 웨스턴 블럿을 도시한다. MK는 대장균에서 발현하기 위하여 mpl 리간드의 N-말단에 부가된 Met-Lys를 의미하며, 카텝신 C와 같은 디펩티다제를 사용하여 분해될 수 있다. MK가 제거된 분자를 desMK로 칭한다. 글리코시다제 뉴라미니다제 및 O-글리카나제 처리도 표시되어 있다.
도 4는 정상 마우스에서 mpl 리간드를 발현한 대장균 및 CHO의 생체내 활성을 혈소판 개수로 나타낸다. 이 데이터는 글리코실화된 mpl 리간드(CHO 물질)가 글리코실화되지 않은(대장균) 물질에 비하여 훨씬 우수한 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 이것은 글리코실화된 물질에서 반감기가 증가된 결과일 수 있다. 예컨대 CHO 332는 CHO 세포에서 발현된 사람의 mpl 리간드 아미노산 1-332 (도 1)를 의미한다.
도 5는 사람의 제조합 mpl 리간드 및 유사체 4, 6, 7, 9, 10 및 11의 COS세포 상층액의 웨스턴 블럿 분석을 도시한다. 유사체의 작성은 실시예 4에 기재되어 있다. 유사체 4, 7, 10은 느린 겔 이동성으로 부터 알 수 있듯이 하나 이상의 추가의 탄화수소 사슬을 갖는다. 이 유사체 번호는 표 1에 제시된 유사체 번호와 동일하다(예컨대 11은 유사체 N11에 해당된다). 대조용은 표 1에서 N1이다.
도 6은 사람의 재조합 mpl 리간드 및 유사체 4, 5, 13, 14 및 15의 COS 세포 상층액의 웨스턴 블럿 분석을 도시한다. 유사체의 작성은 실시예 4에 기재되어 있다. 유사체 4, 13, 14 및 15는 느린 겔 이동성으로 부터 알 수 있듯이 하나 이상의 추가의 탄화수소 사슬을 갖는다.
도 7은 사람의 mpl 리간드 및 N-글리카나제로 처리한 후의 지시된 mpl 리간드 유사체의 COS 세포 상층액의 웨스턴 블럿 분석을 도시한다. 결과는 상기 유사체들이 상이한 글리코실화 패턴을 갖는다는 것을 나타낸다.
도 8은 mpl 리간드 유사체를 사용한 사람의 거핵구 성장 생체시험의 결과를 나타낸다. 패널 A와 D는 각각 양성 및 음성 대조용이다. 패널 A에 나타낸 웰은 37.5 pg의 야생형(즉, 천연 서열) mpl 리간드 1-174 COS-1 처리된 배지를 함유하는 것으로 실질적인 거핵구 성장을 나타낸다. 패널 D는 1.5 ㎕의 COS-1 바탕시험 처리된 배지를 함유하며 성장을 나타내지 않는다. 패널 B와 C는 각각 mpl 리간드 1-174 유사체 7 및 10이다. 패널 B는 9.0 pg의 mpl 리간드 COS-1 처리된 배지를 함유하는 반면에 패널 C는 27 pg을 함유하며 모두 우수한 거핵구 성장을 나타낸다.
도 9는 CHO mpl 리간드 1-174 및 유사체 N4 및 N15의 웨스턴 블럿 분석을 도시한다(표 1 참조). 느린 겔 이동은 유사체 N4(4B)가 하나의 추가적인 올리고당류를 갖는 반면에 유사체 N15 (15-8)는 2개의 추가적인 올리고당류를 가짐을 나타낸다.
도 10은 N-글리카나제 처리를 실시하거나 실시하지 않은 CHO 세포 생산 mpl 리간드 유사체의 웨스턴 블럿을 도시한다. N-글리카나제 처리한 후 느린 겔 이동은 N-결합된 올리고당류가 존재함을 나타낸다.
도 11은 다양한 투여량으로 다양한 형태의 mpl 리간드를 처리한 마우스로 부터 혈소판 개수를 나타낸다. 이 데이터는 N- 및/또는 O-결합된 탄화수소량의 증가가 생체내 활성 증가를 초래함을 나타낸다.
도 12는 COS-생산 mpl 리간드 1-174와 유사체 N10, N15, N33, N39, N31, N35 및 N40의 웨스턴 블럿 분석을 도시한다. 부가된 N-결합된 글리코실 부위의 개수도 또한 나타낸다. 이 도면은 N-결합된 부위의 개수가 증가하면 N-결합된 탄화수소 량의 증가로 인하여 mpl 리간드의 이동성이 감소됨을 나타낸다.
도 13은 COS-생산 mpl 리간드 1-174와 유사체 N15, N29, N30 및 N38의 웨스턴 블럿 분석을 도시한다. N-결합된 글리코실 사슬의 개수도 또한 제시되어 있다.
본 발명은 상응하는 서열을 갖는 천연 mpl 리간드에 비하여 상이한 글리코실화 부위를 갖는 mpl 리간드를 제공한다. 바람직하게는, 생성한 분자는 포유류 세포(예컨대 COS, CHO 및 사람의 세포)에서 발현시 글리코실 사슬에 의해 점유된 추가적인 글리코실화 부위를 갖는 분자이다.
본 발명의 구체예로서, 본 발명은 상응하는 천연 서열 mpl 리간드와 비교하여 하나 이상의 부가되고, 하나 이상의 결실되며 및/또는 하나 이상의 부가되고 결실된 글리코실화 부위를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 mpl 리간드의 유사체에 관한 것이다. 부가되거나 결실된 글리코실화 부위는 상응하는 천연 서열의 mpl 리간드, 특히 사람의 mpl 리간드와 비교하여 다소의 탄화수소 사슬 및 다소의 시알산 함량을 초래할 수 있다. 한 개 부위의 결실과 다른 부위의 부가가 한꺼번에 존재하면 부위의 개수에는 아무런 변화가 없지만 부위의 위치 및/또는 유형에서는 변화를 초래할 것이다. 이러한 조합된 개질 유사체는 본 발명에 포함된다.
본 발명의 다른 구체예로서, 본 발명은 하나 이상의 N- 또는 O-결합된 글리코실화 부위를 하나 이상의 비 천연 산출성 부위로 교체하는 것을 비롯한 아미노산 서열을 포함하는 mpl 리간드 유사체에 관한 것이다. 따라서 N-결합된 부위는 상이한 N-결합된 부위로 교체될 수 있고; N-결합된 부위는 O-결합된 부위로 교체될 수 있으며; O-결합된 부위는 상이한 O-결합된 부위로 교체될 수 있고; 및/또는 O-결합된 부위는 N-결합된 부위로 교체될 수 있다. 실질적으로 동일 위치에서 한 개 부위가 다른 부위로 교체되는 것은 그 부위에서 글리코실화 효율을 증가시키거나 또는 다른 효과를 가질 수 있다. 예컨대 Ser 잔기를 대신한 Thr 잔기는 O-결합된 부위에서 글리코실화 효율을 증가시킬 수 있다는 증거가 제공된다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "mpl 리간드"는 천연 산출의 mpl 리간드, 천연 산출의 mpl 리간드가 절단된 것 뿐만 아니라 천연 산출의 mpl 리간드의 거의 2배정도의 아미노산 서열 및 글리코실화 효율을 가져서 거핵구 및/또는 혈소판의 성장, 분화 및/또는 생산을 특이적으로 자극하는 생물학적 활성을 갖는 비천연 산출 폴리펩티드를 포함한다. 도 1의 적어도 아미노산 7-151 내지 아미노산 1-332를 기본으로 하는 mpl 리간드 유사체가 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구체예로서, mpl 리간드는 진핵 숙주 세포로 형질감염된 외인성 DNA 서열의 발현 생성물, 즉 mpl 리간드는 "재조합 mpl 리간드"이다. 바람직한 진핵 숙주는 포유류, 특히 바람직하게는 CHO 세포이다. 재조합 mpl 리간드는 본 명세서에 기재된 방법 및 mpl 리간드의 클로닝과 발현에 관하여 본 명세서에서 인용한 문헌에 기재된 방법에 따라서 제조하는 것이 유리하다.
일부 추가적인 바람직한 mpl 리간드 분자는 도 1을 기준으로 하여 이하의 아미노산 서열을 갖는다:
mpl 리간드 1-332 도 1의 아미노산 1-332
mpl 리간드 1-199 도 1의 아미노산 1-199
mpl 리간드 1-191 도 1의 아미노산 1-191
mpl 리간드 1-183 도 1의 아미노산 1-183
mpl 리간드 1-174 도 1의 아미노산 1-174
mpl 리간드 1-163 도 1의 아미노산 1-163
mpl 리간드 1-153 도 1의 아미노산 1-153
mpl 리간드 1-152 도 1의 아미노산 1-152
mpl 리간드 1-151 도 1의 아미노산 1-151
mpl 리간드 7-332 도 1의 아미노산 7-332
mpl 리간드 7-199 도 1의 아미노산 7-199
mpl 리간드 7-191 도 1의 아미노산 7-191
mpl 리간드 7-183 도 1의 아미노산 7-183
mpl 리간드 7-174 도 1의 아미노산 7-174
mpl 리간드 7-163 도 1의 아미노산 7-163
mpl 리간드 7-153 도 1의 아미노산 7-153
mpl 리간드 7-152 도 1의 아미노산 7-152
mpl 리간드 7-151 도 1의 아미노산 7-151
예컨대 mpl 리간드 1-183, 1-191, 7-183 및 7-191은 그 보다 짧은 서열에 비하여 그의 C-말단에서 한개 또는 2개의 추가적인 천연 산출의 글리코실화 부위를 포함한다는 것을 알아야한다. 상기 경우, Met-Lys는 그의 N-말단에 추가로 포함될 수 있다.
여기서 지칭하는 생체내 비활성은 생체외에서 비활성의 상대적 측도이지만 생체외 비활성의 절대치는 아니다. 본 발명에서는 비활성은 동일 내부 기준를 포함한 동일 조건을 사용하고 비활성을 산출하기 위해 사용된 동일 분석 데이터를 갖는 동일 분석법을 이용하여 분석된 mpl 리간드 유사체의 상대적 활성을 비교하기 위해만 이용된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "mpl 리간드의 유사체" 또는 "mpl 리간드 유사체"는 mpl 리간드의 아미노산 서열에서 하나 이상의 변화를 가져서 탄화수소 부착용 부위의 유형 (부착된 탄화수소의 양에 영향을 줄 수 있는 N- 또는 O-결합), 개수 또는 위치의 변화를 초래할 수 있는 mpl 리간드를 지칭한다. 바람직한 구체예로서, 글리코실화 부위의 변화는 mpl 리간드 분자에 부착된 글리코실 사슬의 개수에서의 변화를 초래한다. 더욱 바람직한 구체예로서, 글리코실화 부위에서의 변화는 하나 이상(일반적으로 1 내지 6, 바람직하게는 1 내지 5, 특히 바람직하게는 2 내지 4)의 글리코실 사슬을 부가하고, 가장 바람직하게는 이 사슬은 N-결합을 통하여 부가된다. 특히 바람직한 구체예로서, mpl 리간드 유사체는 천연 서열의 mpl 리간드(예컨대 사람의 mpl 리간드)와 비교하여 동등 이상의 생물학적 활성을 보유하며 생물학적 활성 평가로 측정된 바와 같이 생체내에서 실질적으로 더 높은 활성을 가질 수 있다. 이러한 분석법은 거핵구 또는 혈소판 생산을 검출하는 방법을 포함한다.
이러한 mpl 리간드 유사체를 제조하기 위하여, 바람직하게는 이들은 글리코실화에 유용한 부위를 부가하거나, 제거하거나 또는 변경하는 아미노산 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 초래하는 부위 특이적 돌연변이에 의해 생성된다. "변경"된다는 것은 어떤 부위가 결실되는 반면에 결실된 부위와 동일하거나 다른 위치에서 다른 부위가 부가되는 것을 의미한다. 그러나, 이 기술분야의 기술자에게 공지된 바와 같이, 다른 방법도 동일 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 유도할 수 있으므로 이러한 방법도 본 발명에 포함된다. 생성한 유사체는 천연 사람/재조합 mpl 리간드에 비하여 다소(바람직하게는 보다 많은)의 부착된 탄화수소 사슬을 가질 수 있다.
하나 이상의 탄화수소(즉, 글리코실) 사슬을 mpl 리간드에 부가하는 것은 본 발명의 중요한 목적이다. 상응하는 천연 산출의 아미노산 서열(예컨대 1-332 또는 1-174 등)에서 발견되는 것에 비하여 많은 탄화수소 사슬을 갖는 mpl 리간드 유사체는 실질적으로 생물학적 활성을 감소시키지 않도록 이차 또는 삼차 구조에 영향을 주지 않는 글리코실화 부위를 부가함으로써 생성된다. 본 명세서에서 사용한 "천연 산출" mpl 리간드는 특정 길이의 mpl 리간드종이 천연 종에서 실질적으로 발현되지 않더라도 관련 유사체에서와 상응하는 숫자의 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 지칭한다. 유리하게는, mpl 리간드 유사체는 N-글리코실화 또는 O-글리코실화를 위한 6개 이하의 추가적인 부위를 가지므로 1 내지 6개의 추가적인 N-결합되거나 O-결합된 탄화수소 사슬(또는 이들의 조합물)의 부가를 초래한다.
예컨대 위치 30에서 Pro는 Asn으로 치환되고 위치 32의 Val은 Thr으로 교체되어 서열 Asn-Glu-Thr를 생성하며 이는 새로운 N-글리코실화 부위를 제공한다(이하의 유사체 N4; 표 1 참조).
2개 이상의 추가적인 N-결합된 사슬을 갖는 유사체들은 돌연변이를 조합함으로써 작성될 수 있고; 예컨대 표 1에 기재된 유사체 N4 및 N10은 조합되어 2개의 추가적인 탄화수소 부가 부위를 갖는 유사체(즉, 표 1중의 유사체 N15)를 수득할 수 있다. 마찬가지로 3개 이상의 부가 사슬을 갖는 유사체도 작성할 수 있다. 이 기술분야의 숙련자가 숙지하고 있는 바와 같이, 본 발명은 상이한 글리코실화 부위를 갖는 mpl 리간드의 많은 상이한 유사체(부위의 개수, 유형 또는 위치면에서)를 포함한다. 본 발명의 mpl 리간드 유사체는 모든 경우에서 특히 사람의 아미노산 서열(도 1 및 2 참조)을 갖는 mpl 리간드를 기본으로 한다. 그러나 다른 종(예컨대 개, 돼지, 원숭이, 마우스 또는 쥐)로 부터 얻은 mpl 리간드 서열을 기본으로 하는 유사체도 포함될 수 있다.
글리코실화 부위를 만들기 위하여 아미노산을 삽입하는 것도 포함된다. 예컨대 위치 57의 Glu는 Thr로 교체되고 또 위치 55의 Met 바로 뒤에 Asn을 삽입한다:
Figure pct00001
이는 새로운 글리코실화 부위(아미노산 55', 56 및 57)를 만든다. 이하의 유사체 N23 참조.
카르복시 말단 연장이 하나 이상의 추가적인 탄화수소 부위를 제공하는 mpl 리간드의 카르복시 말단 단부로 부터 연장된 하나 이상의 아미노산을 갖는 유사체도 본 발명의 유사체내에 포함된다. mpl 리간드의 카르복시 말단은 사용된 mpl 리간드의 특정 형태에 따라 상이할 것이다 (예컨대 mpl 리간드 1-332 아미노산, 또는 mpl 리간드 1-163 아미노산). 추가적인 탄화수소 부위는 하나 이상의 N- 또는 O-결합된 글리코실화 부위를 함유하는 아미노산을 카르복시 말단에 부가하는 것에 의해 mpl 리간드 종의 카르복시 말단에 부가될 수 있다.
표 1 및 6은 N-결합된 탄화수소 사슬에 대한 추가적인 부위를 갖는 mpl 리간드 유사체의 일부 예를 수록하고 있다. 이들 유사체는 사람의 아미노산 서열을 기본으로한 사람의 mpl 리간드 폴리펩티드 사슬의 다양한 위치에서 포함된 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 서열을 가져 N-결합된 부위를 생성한다. 표 4 및 7은 SDS 겔상에서 당단백질의 이동으로 알 수 있듯이 하나 이상의 추가적인 N-결합된 탄화수소 사슬이 부가된 유사체들을 수록하고 있다 (예컨대 실시예 6 및 도 3, 5, 6, 7, 9, 10, 12 및 13 참조). 이들 표는 본 명세서에서 정의된 유사체가 아닌 절단된 종(즉, N1, N16, N17 및 N31)도 포함하고 있다. 이들은 얼마나 다양한 절단된 종이 제조될 수 있는가를 나타내기 위하여 표에 수록한 것이다.
본 명세서에 기재한 mpl 리간드 유사체, 바람직하게는 N-결합된 사슬에 대하여 추가적인 부위를 갖는 유사체를 코딩하는 DNA 서열도 본 발명의 범위에 포함된다. 탄화수소에 대한 부착 부위를 만들고, 결실시키고 및/또는 변경시키기 위하여 mpl 리간드 DNA 서열에 변화를 도입하기 위해 사용된 방법은 실시예 4 및 14에 기재되어 있다.
이들 mpl 리간드 유사체들은 외인성 DNA 서열의 발현 생성물, 즉 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있으며, 이들은 화학적으로 합성될 수 있거나 또는 조합된 방법에 의해 제조될 수 있다. 외인성 DNA 서열은 mpl 리간드 유사체를 코딩하는 cDNA, 게놈 DNA 또는 화학적으로 합성된 DNA를 포함한다. 이러한 유사체의 발현에 유용한 재조합 DNA 플라스미드 및 진핵 숙주 세포도 제공된다. 발현 벡터는 클로닝된 DNA 서열을 진핵 숙주 세포에서 발현할 수 있는 벡터, 특히 COS 및 CHO 세포에서 발현하기 위해 사용되는 벡터를 포함한다. 이러한 벡터의 예는 플라스미드 pDSRα 및 pDSRα2를 포함한다. Mol. Cell. Biol. 8: 466-472 (1988); WO 91/13160 (1991); 및 WO 90/14363 (1990) 참조. mpl 리간드 유사체를 발현하는 COS 및 CHO 숙주 세포의 배양은 이 기술 분야의 숙련자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 실시하였다.
mpl 리간드에 부착된 탄화수소 사슬의 개수, 유형, 위치 또는 양을 변화시키면 용해도 증가, 단백질 분해효소에 대한 보다 큰 내성, 면역원성 감소, 혈청 반감기 증가 및 생물학적 활성의 증가 또는 변경과 같은 유리한 특성을 부여할 수 있따.
mpl 리간드 유사체 N2 - N15 (N1은 사람의 mpl 리간드 1-174; 도 2 참조)를 발현하는 COS 세포로 부터 처리 배지를 생체외 생물학적 활성에 대해 분석하고 그 결과를 하기 표 4에 수록하였다.
mpl 리간드 유사체/절단물 N15-N40을 발현하는 COS 세포로 부터 처리 배지를 생체외 생물학적 활성에 대해 분석하고 그 결과를 하기 표 7에 수록하였다.
다양한 형태에 대한 생체내 생물학적 활성을 도 11에 나타낸다(실시예 13 참조).
본 발명의 다른 구체예는 mpl 리간드 또는 분자당 특정 개수 이상의 시알산을 갖는 mpl 리간드의 유사체, 예컨대 진핵 세포에서 천연적으로 또는 재조합적으로 생산된 mpl 리간드 1-332, 1-199, 1-191, 1-183, 1-174, 1-163, 1-153, 1-152 또는 1-151을 특이적으로 합성하는 포유동물(예컨대 CHO(Chinese Hamster Ovary))) 숙주 세포에 관한 것이다. CHO 세포에서 발현된 전체 길이 및 다양한 절단된 종과 함께 유사체 N4 및 N15의 생체외 활성은 표 5에 수록하였다.
mpl 리간드의 시알산 함량은 생체내 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있다. 예컨대 4 분지된 N-결합된 올리고당류는 가장 흔히 시알산 부착을 위한 4개의 가능한 부위를 제공하는 반면 아스파라긴-결합된 부위에서 4차 형태를 치환할 수 있는 이가 및 4가 올리고당류는 흔히 많아여 2개 또는 세 개의 부착된 시알산을 갖는다. O-결합된 올리고당류는 시알산 부착을 위한 2개의 부위를 제공한다. 따라서, O-결합된 탄화수소에 대하여 치환된 N-결합된 탄화수소를 갖는 mpl 리간드 분자는 사슬당 2개의 추가적인 시알산을 수용할 수 있고 단 N-결합된 올리고당류는 4 분지된다. 4분지된 사슬을 재조합 mpl 리간드에 특이적으로 부가하는 세포에 대해 포유 세포 배양물을 스크리닝함으로써 시알산 부착을 위한 부위의 개수를 최대화한다.
디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)가 부족한 CHO 세포는 재조합 mpl 리간드를 비롯한 재조합 당단백질의 생산을 위하여 흔히 사용되는 숙주 세포이다.
치료 유효량의 mpl 리간드 유사체와 함께 mpl 리간드 치료에 유용한 적합한 희석제, 보조제 및/또는 담체를 포함하는 조성물도 본 발명에 포함된다. 여기서 이용된 "치료 유효량"은 소정 조건 및 투여 범위에 대해 치료 효과를 제공하는 양을 지칭한다.
본 발명의 조성물은 전신에 비경구적으로 투여될 수 있다. 다르게는, 본 조성물은 정맥 또는 피하 투여될 수 있다. 전신 투여되면, 본 발명에 사용하기 위한 치료 조성물은 발열성 물질 없는, 비경구적으로 허용되는 수용액 형태일 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 단백질 용액의 제제는 pH, 등장성, 안정성 등의 면에서 본 발명의 기술분야 범위내에 존재한다. 특정 경로는 처리될 조건에 따라 다르다. mpl 리간드 또는 mpl 리간드 유사체의 투여는 사람의 혈청 알부민과 같은 적합한 담체, 완충 염수와 같은 적합한 희석제 및/또는 적합한 보조제를 함유하는 배합물의 일부로서 바람직하게 실시된다. 필요한 투여량은 환자의 혈소판 양을 증가시키기에 충분한 양이며 처리될 상태의 심각성, 투여방법 등에 따라 상이할 것이다.
본 발명의 방법 및 조성물에 의해 처리될 상태는 일반적으로 현존하는 거핵구/혈소판 결핍 또는 장래에 예상되는 거핵구/혈소판 결핍(예컨대, 예정된 수술 때문에)을 포함한다. 이러한 상태는 생체내에서 활성 mpl 리간드의 결핍(일시적 또는 영구적)의 결과일 것이다. 혈소판 결핍의 일반적 명칭은 혈소판감소증이며 본 발명의 방법과 조성물은 일반적으로 혈소판감소증을 처리하는데 유용하다.
혈소판감소증(혈소판 결핍)은 화학요법, 골수 이식 및 다양한 약물처리, 방사선 치료, 외과수술, 사고로 인한 혈액 손실 및 기타 특정 질병 상태를 비롯한 다양한 이유로 인하여 존재할 수 있다. 혈소판감소증을 포함한 본 발명에 따라 처리될 수 있는 특정 질병 상태의 예는 다음과 같다: 재생불량성 빈혈, 특발성 혈소판감소증, 혈소판 감소증을 초래하는 전이성 종양, 전신성 홍반성 낭창, 거비증, 판코니 신드롬, 비타민 B12 결핍증, 엽산 결핍증, 메이-헤그린 이상, 위스코트-알드리히 신드롬 및 발작성 야간 헤모글로빈뇨성. AIDS의 특정 처리도 또한 혈소판감소증(예컨대 AZT)을 초래한다. 특정의 상처 치료 장애도 혈소판 개수 증가로 효과를 볼 수 있다.
예컨대 장래의 수술 또는 장래의 혈소판감소증 유도성 요법으로 인하여 예상되는 혈소판 결핍에 관하여서, 본 발명의 mpl 리간드 유사체는 혈소판을 필요로 하기 수일전 내지 수시간전에 투여될 수 있다. 급성 상황, 예컨대 사고로 인한 대량 혈액 손실에 대하여는 mpl 리간드 유사체는 혈액 또는 정제 혈소판과 함께 투여될 수 있다.
상술한 상태를 치료하기 위한 방법에 관여되는 투여법은 약물의 작용을 변화시키는 다양한 인자, 예컨대 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 영양상태, 감염의 심각성, 투여 시기 및 기타 임상 요인을 고려한 의사의 소견에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 일일 투여량은 체중 kg당 0.01 내지 1000 mg의 mpl 리간드 유사체, 바람직하게는 체중 kg당 0.1 내지 10 mg이어야한다.
본 발명의 치료방법, 조성물 및 폴리펩티드는 단독으로 또는 기타 질병 뿐만 아니라 혈소판 결핍증을 특징으로 하는 질병 상태의 치료에 있어서 기타 시토킨, 용해성 mpl (즉, mpl 리간드) 리셉터, 조혈인자, 인터루킨, 성장인자 또는 항체와 조합되어 사용될 수 있다. mpl 리간드 유사체 분자는 IL-3 또는 MG-CSF와 같은 일반적 조혈 자극인자와 조합되어 일부 혈소판감소증 형태를 치료하는데 유용할 것으로 예상된다. 기타 거핵구 자극 인자, 즉 meg-CSF, 간세포 인자 (SCF), 백혈병 억제 인자 (LIF), 온코스타틴 M (OSM), 또는 거핵구 자극 활성을 갖는 기타 분자가 mpl 리간드와 함께 사용될 수 있다. 이러한 공동 투여를 위한 추가적인 시토킨 또는 조혈인자의 예는 IL-1 알파, IL-1 베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, 콜로니 자극 인자-1 (CSF-1), GM-CSF, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), EPO, 인터페론-알파(IFN-알파), IFN-베타, 또는 IFN-감마를 포함한다. 거핵구가 성숙 형태에 도달하면 거핵구를 혈소판으로 단편화 유발하는 효과를 갖는 것으로 보이는 유효량의 용해성 포유류 mpl 리셉터를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 성숙 거핵구의 개수를 증가시키기 위하여 mpl 리간드 유사체를 부가한 다음 용해성 mpl 리셉터(유사체를 불활성화시키고 성숙 거핵구가 혈소판을 생성하도록 하기 위해)를 투여하는 것이 혈소판 생산을 자극하는데 특히 효과적인 수단으로 보인다. 상술한 투여 형태는 치료 조성물에서 추가적인 성분을 보상하기 위해 조정될 것이다. 처리된 환자의 진행은 통상의 방법으로 제어할 수 있다.
활성, 안정성, 반감기 등을 증가시키기 위하여 본 발명의 유사체의 추가적인 변형을 실시할 수 있다. 예컨대 아미노기를 통하여 단백질상에 또는 탄화수소 기를 통하여 mpl 리간드 유사체에 페길화(폴리- 또는 모노-)를 부가할 수 있다. 또한 지방산 또는 기타 중합체는 단백질 또는 탄화수소 기에 부착될 수 있다.
이하의 실시예는 본 발명을 보다 자세하게 설명하기 위하여 제시된 것이지만, 발명의 범위를 한정하지 않는다. 실시예의 생체분석에 사용된 mpl 리간드 표준은 대장균에서 발현되고 활성 구조로 재생되며 정제되는 재조합 mpl 리간드 표준이다. 따라서 상대적 비활성만을 측정한다.
실시예 1
mpl 리간드 1-174의 작성
사람의 태아 간 cDNA 라이브러리 (바틀리 일행, Cell 77: 1117-1124 (1994))로 부터 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 도 2의 아미노산 1-174(S-P-A-P-P-A...로 시작)를 코딩하는 사람의 mpl 리간드 유전자를 작성하였다. 5' PCR 프라이머는 사람의 mpl 리간드의 아미노 말단, XbaI 부위, 및 최적화된 코자크(kozak) 서열을 코딩하였다. 3' 프라이머는 종결 코돈 및 SalI 제한 부위를 함유하였다. 증폭된 DNA 단편을 XbaI 및 SalI으로 분해시킨 다음 XbaI 및 SalI으로 분해된 pDSRα2에 결찰시켰다. 생성한 플라스미드, pDSRα2 mpl 리간드 1-174를 포유 세포 발현용으로 사용하였다. 생성한 유전자의 서열 (시그널 펩티드 포함)을 도 2에 나타낸다.
mpl 리간드 1-174를 함유하는 플라스미드 DNA를 XbaI 및 SalI 제한 효소로 분해시키고, 생성한 DNA 단편을 아가로오스 겔 전기영동처리시키며 또 605 nt mpl 리간드 1-174 DNA 단편을 GeneCleanTM 키트 및 제조자 (BIO 101, 인코포레이티드)가 제공한 공정을 이용하여 겔로 부터 단리하였다. WO 90/14363 (1990)호에 기재된 바와 같은 플라스미드 pDSRα2를 XbaI 및 SalI 제한 효소로 분해시키고 벡터 단편을 회수하였다. 2개 단편을 결찰시켜 pDSRα2 (mpl 리간드 1-174)를 수득하였다.
실시예 2
CHO 세포에서 mpl 리간드의 발현 및 정제
디히드로폴레이트 환원효소 결핍 (DHFR-) CHO 세포를 pDSRα2-mpl 리간드 1-174로써 형질감염시켰다. 형질감염시키기 바로 전날 100 mm 조직 배양 접시에 CHO D- 배지 (DMEM, 10% 우태아 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 1% 비필수 아미노산 (Gibco) 및 1% HT 보충물 (Gibco))에서 성장한 1 x 106 CHO DHFR- 세포를 접종하였다. 4번의 형질감염을 실시하였다. 각 감염의 경우, 플라스미드 DNA (50 ㎍)를 PvuI 및 완충액 H (베링거 만하임)으로 분해시키는 것에 의해 선형화시켰다. DNA 석출물을 형성시키고 포유동물 세포 형질감염 키트 (스페셜리티 미디아)에 대해 플레이트에 적가하였다. 조직 배양기에서 24시간 후, 배지를 신선한 CHO D-배지로 교체하였다. 24 시간 후 웰당 100 ㎕의 CHO 선택 배지 (D-MEM, 5% 투석된 우태아 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 1% 비필수 아미노산 (Gibco))을 갖도록 세포를 96개 웰 조직 배양 플레이트에 분배하고 형질전환체를 선택하였다. 콜로니가 나타날 때 까지 배지를 매주 바꾸었다. 2주후, 이하에 설명한(실시예 9 참조) 32D 세포 증식 분석법을 이용하여 mpl 리간드의 발현을 스크리닝하였다. 과량의 1 x 105 단위체/ml로 발현하는 클론을 희석시키고 저온단계에서 냉동시켰다. 1개 클론을 로울러 병 생산용으로 희석시키고 약 8리터의 처리된 배지를 생산하였다.
mpl 리간드 1-174 cDNA를 함유하는 플라스미드 pDSRα2는 상술한 바와 같이 DHFR-결핍 CHO 세포와 형질감염시켰다. mpl 리간드 1-174를 발현하는 CHO 세포로 접종된 로울러 병으로 부터 2리터의 무혈청 CHO 세포 처리 배지 (50% D-MEM, 50% HAMS-F12, 1% 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 1% 비필수 아미노산 (Gibco))를 2L 아미콘 모델 2000 교반되는 세포 및 10,000 달톤 분자량 컷오프 막(YM10, 아미콘)을 사용하여 15배 농축시켰다. 농축된 처리 배지 45 ml를 직접적으로 0.4 ml/분의 유동속도로 파마시아 FPLC를 이용하여 4 ml hu-MPL-X 친화성 칼럼에 걸었다. 이 친화성 칼럼은 제조자가 추천한 바와 같이 파마시아 CNBr 활성화된 세파로오스 수지 ml당 1.5 내지 2.5 mg의 Mpl-X (mpl 리셉터의 용해성인 세포외 도메인)을 커플링함으로써 작성하였다. 로딩후, 칼럼을 16 ml 포스페이트 완충 염수 (PBS; 10 mM Na.PO4 pH 6.8/150 mM NaCl)로 세척한 다음 24 ml의 10mM 트리스, pH 8.0/1M NaCl로 세척하였다. Mpl 리간드(1-174)를 40 ml의 20 mM CAPS (3-[시클로헥실아미노]-1-프로판술폰산) pH 10.5/1M NaCl/ 5mM CHAPS (3-[3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트)로써 6 ml 분획들로 용출시켰다. 제 2 분획은 14% SDS 겔상에서 단일 밴드를 나타내었다. 상기 물질을 농축시키고 0.9% NaCl 염수 용액으로 완충액 교환한 다음 생체외 및 생체내에서 생물학적 활성을 측정하였다. mpl 리간드를 발현한 다른 형태의 CHO 세포를 유사한 방식으로 정제하였다.
실시예 3
사람의 재조합 mpl 리간드의 생체내 생물학적 활성
다양한 형태의 mpl 리간드로 처리된 마우스로 부터 혈소판 개수를 측정하였다. CHO-유도 mpl 리간드 1-332, 1-174, 1-163 및 1-153을 제조하고 Mpl 리셉터 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 대장균 유도된 Met-Lys-mpl 리간드 1-332, Met-Lys-mpl 리간드 1-174, Met-Lys-mpl 리간드 1-163 및 Met-Lys-mpl 리간드 1-153을 제조하고 통상의 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
도 4는 다양한 형태의 CHO 세포 유도된 (짙은 선) 또는 대장균 유도된 (점선) 사람의 재조합 mpl 리간드로 처리된 마우스로 부터 얻은 혈소판 개수를 나타낸다. 보통, 자성 Balb/c 마우스에 소정 농도의 mpl 리간드를 5일 연속하여 피하 주사하였다. 마지막 주사한 지 24 시간 후 꼬리 정맥에서 절단된 소형 측부로 부터 시험 혈액을 수집하였다. 시스멕스 엘렉트로닉 혈액 세포 분석기 (박스터 다이아그노스틱스, 인코포레이티드 제조, 캘리포니아 어바인 소재)로써 혈액 세포 분석을 실시하였다. 4개 동물의 측정치의 평균, +/- 표준편차로 데이터를 나타낸다. 전체 백혈구 세포수 또는 적혈구 세포수와 같은 기타 혈액 세포 변수는 이들 처리에 의해 영향을 받지 않았다(데이터는 도시되지 않음).
결과는 여러 형태의 mpl 리간드를 발현한 CHO 세포가 대장균에서 생산된 동일 형태의 mpl 리간드에 비하여 생체내 활성이 높다는 것을 나타낸다. 실시예 6에 제시한 바와 같이, 다양한 형태의 mpl 리간드를 발현한 CHO 세포는 모두 N 및 O-결합된 탄화수소를 함유하며 또 mpl 리간드 형태를 발현한 대장균은 그렇지 않다. 이는 탄화수소가 mpl 리간드의 생체내 활성을 향상시킴을 나타낸다. 탄화수소에 의해 부여되는 생체내 활성 증가는 증가된 순환 반감기, 증가된 안정성 또는 이들 모두의 결과일 수 있다.
실시예 4
Mpl 리간드 유사체 N2-N15의 작성
mpl 리간드의 추가적인 글리코실화 부위를 생성하는 방법은 이하에 설명한 바와 같다.
유사체 N2-N14를 제조하기 위해 생체외 돌연변이에 사용하기 위한 이하의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다(이들 유사체의 구조는 표 1 참조):
Figure pct00002
Figure pct00003
m13mp18 mpl 리간드 1-174를 작성하기 위하여, 도 2의 유전자를 XbaI 및 SalI 제한 효소로 분해된 m13mp18 DNA에 도입하였다. 쿤켈 일행, Methods in Enzymol. 154: 367 (1987) 및 Messing, Methods in Enzymol. 101: 20 (1983)에 기재된 바와 같이 m13mp18 (mpl 리간드 1-174)에 의해 감염된 대장균 균주 RZ1032의 상층액으로 부터 단일쇄 DNA를 회수하였다. 생체외 돌연변이를 위하여, 약 0.5 ㎍의 단일쇄 DNA 및 0.125 pmole의 상순한 합성 프라이머중의 하나를 6 ㎕의 완충액 (250 mM 트리스 pH 7.8, 50 mM MgCl2, 50 mM 디티오트레이톨 및 1% 소혈청 알부민 (BSA-파마시아))과 혼합하였다. 이 프라이머는 부가반응전에 ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 활성화된 것이었다. 프라이머를 주형에 어닐링하기 위하여, 반응 부피를 물로써 10 ㎕로 조정하고, 그 혼합물을 65℃5분간 가열한 다음 실온으로 냉각시켰다. 반응을 연장시키기 위하여, 2.5 ㎕의 각 dTTP, dATP, dGTP 및 dCTP 및 1 ml의 ATP (10 μM)를 부가한 다음 1 ㎕ (1 단위체)의 대장균 DNA 폴리머라제 (클레노 단편) 및 1 ㎕ (1 단위체)의 T4 DNA 리가제를 부가하였다. 상기 혼합물을 14℃에서 철야로 배양하고 메싱(상동)에 의해 기재된 바와 같이 대장균 JM 109 (야니쉬 페론 일행 , Gene 33, 103 (1985))를 형질전환하기 위하여 사용하였다. 감별 잡종형성법에 의해 돌연변이 클론을 확인하기 위하여, 영양 한천상의 플라크를 진 스크린 필터(Gene Screen filter) (뉴 잉글랜드 뉴클리어 제조)로 옮겼다. 오토 교차 결합 모드 (스트라타진 제조)를 이용하여 자외선 Stratalinker Model 1800으로 조사함으로써 DNA를 필터에 교차 결합시켰다. 이들을 60℃에서 1% SDS를 함유하는 6 x SSC (0.9M NaCl/0.09M Na.시트레이트)에서 1 시간 동안 배양하였다. 잡종형성하기 위하여, 상술한 올리고뉴클레오티드 프라이머 (8 pmole)에 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 γ 32P-표지된 ATP로써 말단 표지시키고 이 필터를 6 x SSC, 0.5% SDS 및 125 ㎍/ml의 청어 정액 DNA에서 철야로 배양하였다. 잡종형성 온도는 올리고뉴클레오티드의 추정 융점에 따라서 선택하였다. 일반적으로 잡종형성 온도는 융점 보다 약 10℃ 낮았다. 다음 날, 필터를 잡종 형성 온도에서 6 x SSC/1% SDS로써 2회 세척한 다음 잡종형성 온도에서 6 x SSC로써 2회 세척하고 자기방사성측정법으로 처리하였다. 필요에 따라서, 잡종형성이 더 이상 검출되지 않을 때 까지 온도를 증가시키면서 6 x SSC로써 필터를 세척하여 야생형 mpl 리간드 cDNA 서열을 갖는 플라크를 검출하였다. 이들 조건하에서 양성 잡종 형성 시그널을 갖는 클론을 확인하고 JM109에 재형질감염시켜 순수한 클론을 수득하였다. 디데옥시 사슬 종결 서열 분석은 돌연변이가 존재함을 나타낸다.
QIAGEN 키트 (Chatsworth CA. 제조)로써 형질감염된 JM109로 부터 제조자가 추천하는 방법을 이용하여 소망하는 변화를 갖는 이중쇄 m13 mpl 리간드 1-174 DNA를 회수하였다. 이 DNA를 XbaI 및 SalI 으로 분해시키고 605 bp mpl 리간드 DNA 단편을 단리하였다. pDSRα2를 XbaI 및 SalI으로 분해시켰다. 벡터 단편을 단리하고 상술한 mpl 리간드 단편에 결찰시켰다. 재조합 플라스미드를 제한 분석법으로 확인하였다. 생성한 플라스미드 (mpl 리간드 1-174-NX로 표시, NX는 유사체 번호)는 지시된 위치에서 변경된 아미노산 잔기를 갖는 mpl 리간드를 코딩하는 DNA를 함유한다. 생성한 플라스미드를 서열결정화하여 소망하는 돌연변이가 존재함을 확인하였다.
위치 30 및 120에서 2개의 추가적인 N-결합된 글리코실화 부위를 갖는 유사체 N15를 작성하였다. Asn30 및 Thr32 돌연변이를 갖는 PDSRα2 mpl 리간드 174-N4를 XbaI 및 PstI 제한 효소로 분해시키고 약 385 nt DNA 단편을 단리하였다. Asn120 및 Thr122 돌연변이를 함유하는 PDSRα2 mpl 리간드 174-N10을 PstI 및 SalI 제한 효소로 분해시켜 약 220 nt DNA 단편을 수득하였다. pDSRα2를 XbaI 및 SalI으로 분해하였다. 벡터 단편을 단리하여 상술한 mpl 리간드 단편에 결찰시켰다. 이로써 Asn30, Thr32, Asn120 및 Thr122 치환을 함유하는 PDSRα2 mpl 리간드 174-N15를 생성하였다.
이들 일반적 과정을 이용하여 표 1에 도시한 mpl 리간드 유사체를 작성하였다. 각 유사체의 DNA 서열 변화를 도시하며, 돌연변이에 사용된 나머지 올리고뉴클레오티드 프라이머는 사람의 mpl 리간드의 프라이머에 대하여 상보적인 서열을 가졌다.
[표 1]
Figure pct00004
주: 유사체 N2-N15는 동의어로 유사체 2-15로 나타낸다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 예컨대 [Asn22] mpl 리간드는 특정 mpl 리간드종, 바람직하게는 적어도 도 1의 아미노산 7-151을 갖는 사람의 서열을 고려할 때 위치 22에 있는 아미노산이 아스파라긴으로 치환된 것을 의미한다(상기 정의한 바람직한 사람의 mpl 리간드 서열을 포함). 따라서, mpl 리간드 1-174(사람의 서열)의 위치 22에서 로이신 잔기 대신 아스파라긴 잔기로 치환하면 [Asn22] mpl 리간드 1-174로 표시될 수 있는 mpl 리간드 유사체를 수득한다.
pDSRα 1-174-NX (이때, NX는 유사체 번호임)으로 표시되는 플라스미드는 mpl 리간드 DNA를 pDSRα2에 삽입함으로써 작성하였다. 발현 벡터 pDSRα2는 일반적으로 WO 90/14363 (1990)에 기재되어 있다. pDSRα2 mpl 리간드 1-174-NX 플라스미드는 pDSRα2를 XbaI 및 SalI으로 분해시킴으로써 제조하였다. 벡터 단편을 단리하고 결찰시켜 소망하는 서열을 함유하는 약 605 bp 단편을 수득하였다.
실시예 5
COS 세포에서 mpl 리간드 및 mpl 리간드 N1-N15의 발현
표 1에 기재된 사람의 mpl 리간드 및 mpl 리간드 유사체의 cDNA 클론을 엘렉트로포레이션에 의해 COS-1 세포 (ATCC No. CRL-1650)으로 형질전환시켰다. 반 융합성 접시로 부터 COS-1 세포를 수집하고 배지 (10% 우태아 혈청 및 1% L-글루타메이트/페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 둘베코 변성 필수 배지 (어빈 사이언티픽 제조))로 세척하고 6 x 106 세포/ml로 재현탁시켰다. 세포의 1/2 ml 를 0.2 cm 엘렉트로포레이숀 쿠베트 (바이오 라드 제조)로 전달하고 650 ㎌ 및 130 볼트의 저전압 설정으로 BTX 엘렉트로포레이숀 시스템 엘렉트로셀 마니풀레이터 600을 이용하여 mpl 리간드 유사체를 코딩하는 50 ㎍의 플라스미드 DNA로 엘렉트로포레이숀시켰다. 엘렉트로포레이숀된 세포를 10 ml 배지중의 100 mm 조직 배양 접시상에 플레이팅하였다. 플레이팅한 지 12 내지 24 시간후 배지를 10 ml의 신선한 배지로 교체하였다. 처리된 배지를 엘렉트로포레이숀한지 3 내지 5일 후 수집하였다.
실시예 6
Mpl 리간드 및 Mpl 리간드 N1-N15의 특징
A. 탄화수소 첨가의 측정
실시예 5에 기재된 바와 같이 mpl 리간드 유사체 cDNA로 형질감염된 COS 세포로 부터 약 30 내지 60 ng mpl 리간드 또는 mpl 리간드 유사체를 함유하는 다량의 상층액을 실온에서 토끼 항-mpl 리간드 폴리클로날 항체로써 철야로 면역침강시켰다. 발현이 낮은 일부 경우, 약 8 내지 9 ml의 최대 부피가 면역 침강에 사용되었다. 대장균으로 부터 발현되고 정제된 mpl 리간드 1-163에 대한 항체를 제조하였다. 0.1% 아지드화 나트륨을 함유하는 포스페이트 완충 염수 (PBS)중의 1:1 단백질 A-세파로오스 30 ㎕를 면역 침강물에 부가하고 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 샘플을 원심분리하고, PBS로 세척하며 또 SDS 샘플 완충액 (0.125 M 트리스-HCl pH 6.8/4% SDS/ 20% 글리세롤/ 10% β-메르캅토에탄올/ 0.001% 브로모페놀 블루)에 재현탁시켰다. 샘플을 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 분석하고, 니트로셀룰로오스로 전달하며 또 합성 mpl 리간드 펩티드(예컨대, 도 1의 아미노산 잔기 47-62에 상응)에 대해 제조된 마우스 항-mpl 리간드 모노클로날 항체를 사용하여 문헌(버네트 일행, Anal.Biochem. 112: 195-203 (1981); 엘리어트 일행, Gene 79: 167-180 (1989))에 기재된 바와 같이 웨스턴 블럿 시험처리하였다. ECL 키트 (아메르삼 제조)를 이용하여 밴드를 함유하는 mpl 리간드를 가시화하였다.
도 5는 유사체 N4, N7 및 N10 DNA로 형질감염된 세포로 부터 얻은 COS 세포 상층액이 사람의 서열 mpl 리간드 174 (N1)에 비하여 증가된 크기를 가짐을 나타낸다. 도 6은 유사체 N13, N14 및 N4 DNA로 형질감염된 세포로 부터 얻은 COS 세포 상층액이 사람의 서열 mpl 리간드에 비하여 증가된 크기를 가짐을 나타낸다. 이러한 크기 증가는 부가적인 N-결합된 탄화수소 사슬이 존재함을 나타낸다. N15는 2개의 부가적인 N-결합된 글리코실화 부위를 함유한다. 도 6은 유사체가 1개의 부가적인 N-결합된 글리코실화 부위를 함유하는 유사체에 비하여 훨씬 크기를 갖는 물질임을 나타낸다. 단백질의 크기는 공지된 분자량의 단백질 표준과 비교한 SDS-PAGE상에서 이들의 이동도로 부터 추정한다. 도 6으로 부터 계산된 보다 큰 밴드의 추정 크기를 표 2에 도시한다. 이 결과는 N15가 2개의 부가적인 N-결합된 사슬을 함유함을 나타낸다. 다른 선택된 유사체의 웨스턴 블럿 분석을 도 6에 나타낸다.
[표 2]
N-결합된 탄수화물 추정치
Mpl 리간드 유사체(1-174) 분자량(Da) 분자량 변화(Da)(천연서열에 대한) 가능한 N-결합된 사슬의 개수(@4 KDa/위치)
N1 (천연서열)N4N7N10N13N14N15 23500287002720027200267002870033500 05200370037003200520010000 0111112
Mpl 리간드 유사체의 크기 증가가 N-결합된 탄수화물에 기인함을 보이기 위하여 실험을 실시하였다. COS 세포로 처리되고 mpl 리간드를 함유하는 배지를 면역 침강시키고 상기와 같이 PBS로 세척하였다. 그리고 나서 각각의 시험관에 0.5 % SDS를 10 ㎕씩 첨가하고 각 샘플을 3 분 동안 가열하였다. 그리고 나서 하기 성분을 첨가하였다: 10.8 ㎕의 0.5 M NaPO4(pH 8.6), 5 ㎖의 7.5 % 노니데트 P40 및 3 ㎕의 250 단위/㎖ N-글리카나제[겐자임(Genzyme)]. N-글리카나제 처리로 N-결합된 탄수화물을 제거한다. 샘플은 37 ℃에서 6 시간 동안 배양하였다. SDS-PAGE 샘플 완충액을 첨가하여 반응을 중지시키고 나서 상기 항-mpl 리간드 단일클론 항체 및 항-마우스 ECL 웨스턴 분석 키트(아머샴사 제조)를 사용하여 SDS-PAGE 웨스턴 분석(12 % 아크릴아미드)을 실시하였다. 이 방법을 사용한 인간 mpl 리간드 및 mpl 리간드 유사체에 대한 N-결합된 사슬의 분석 결과는 도 7과 같다. N-글리카나제를 처리한 후 N4, N7 및 N10에 대한 웨스턴 블럿 상의 이동성이 N1의 수준으로 감소하였다. 예상한 바와 같이, N1에 대한 N-글리카나제의 처리는 N1에 N-결합된 글리코실화 부위가 없기 때문에 이동성에 아무 영향을 주지 않았다. 이들 결과에서 크기가 증가한 것은 N-결합된 탄수화물을 첨가하였기 때문이다.
B. mpl 리간드에 O-결합된 탄수화물의 분석
인간 mpl 리간드에 O-결합된 탄수화물의 영향을 분석하기 위하여, 상기 CHO 세포로 처리된 배지로부터 다양한 형태의 단백질을 정제하였다. 각각의 단백질은 O-글리카나제(글리코펩티드 α-N-아세틸갈락토스아미니다제, 옥스포드 글리코시스템스사 제조)로 처리 및 무처리하였다. O-글리카나제는 당단백질로부터 O-결합된 탄수화물을 제거하였다. 글리코실화되지 않은 대조구로서 각 형태의 대장균 발현형을 사용하였다. O-결합된 탄수화물에 의한 분자량 차이를 해결하기 위하여, 모든 N-결합된 탄수화물을 먼저 제거할 필요가 있다. 완전한 길이의 mpl 리간드 1-332가 N-결합된 탄수화물을 함유하기 때문에, N-글리카나제 처리가 철야 배양인 것을 제외하고는 상기 mpl 리간드 유사체를 발현하는 CHO 세포와 마찬가지로 완전한 길이의 샘플을 발현하는 CHO 세포를 N-글리카나제로 처리하였다.
완전한 길이(1-322)의 mpl 리간드에 O-글리카나제를 처리하기 전에, 샘플의 pH 범위는 100 mM 아세트산(pH 2.2)을 1/15부피로 사용하여 pH 6.0∼pH 7.0로 조절하였다. 1 ㎍의 단백질을 SDS에서 3 분 동안 끓임으로써 변성시키고, 1 mM 칼슘 아세테이트(pH 6.8) 및 20 mM 인산 나트륨(pH 6.8) 중의 1 U/㎖ 뉴라미니다제[시알리다제, 아르트로박터 유레파시엔스(Arthrobacter urefaciens)로부터 추출, 뵈링거 만하임사 제조]를 사용하여 37 ℃에서 60 분 동안 배양하였다.
이어 100 ㎕의 최종 부피 내에 O-글리카나제 5 mU를 첨가하고 나서, 37 ℃에서 철야로 배양하였다. SDS-PAGE(15 %아크릴아미드)에 의해 단백질(0.2 ㎍/레인)을 분리하였다. 0.2 ㎛ 니트로셀룰로오스로 옮기고 항-mpl 리간드 단일클론 항체와 함께 철야 배양한 후, 항-토끼 ECL 웨스턴 분석 키트(아머샴사 제조)를 사용하여 mpl 리간드 단백질을 시각화하였다.
도 3은 네 가지 상이한 형태의 인간 mpl 리간드의 웨스턴 블럿을 나타낸다. 완전한 길이의 mpl 리간드 1-332는 레인 1∼3이며, mpl 리간드 1-174는 레인 4∼6, mpl 리간드 1-163은 레인 7∼9, 및 mpl 리간드 1-153은 레인 10∼12이다. 레인 2, 5, 8 및 11에 도시한 뉴라미니다제 및 O-글리카나제 처리는 분자량을 글리코실화되지 않은 재료 즉, 레인 3, 6, 9 및 12의 분자량으로 감소시켰다. 모든 경우에 있어서, 이동성은 대장균에서 발현된 글리코실화되지 않은 단백질의 수준으로 증가하였다. 이들 결과는 레인 1, 4, 7 및 10에서의 대형 밴드가 O-결합된 탄수화물에 기인한 것임을 나타낸다. 각 밴드의 분자량은 이들의 이동성과 공지된 분자량의 단백질을 비교하여 추정하였다.
상이한 단백질의 추정 분자량을 나타내는 하기 표 3에서 보는 바와 같이, 이동성의 뚜렷한 변화로부터 mpl 리간드 1-332인 경우 14개의 O-결합된 탄수화물 사슬(약 950 Da/사슬)이 있으며, mpl 리간드 1-174인 경우는 9개의 사슬, mpl 리간드 1-163인 경우 4개의 사슬, 및 mpl 리간드 1-153인 경우는 2개의 사슬이 있음을 알 수 있었다. 레인 2의 샘플은 완전한 길이의 mpl 리간드 1-332이다. 이 단백질은 37 ℃에서 장시간 동안 당효소에서 배양하였기 때문에, 분해된 것으로 보인다. 따라서, CHO 세포에서 발현된 mpl 리간드 1-332에 첨가된 O-결합된 탄수화물의 추정 분자량을 계산하기 위하여 레인 3에 있는 대장균에서 발현된 글리코실화되지 않은 것을 사용하였다.
이들 결과는 CHO에서 발현된 모든 형태의 시험 mpl 리간드 상에 탄수화물이 존재함을 나타낸다. O-결합된 탄수화물의 존재는 CHO 세포에서 발현된 mpl 리간드 1-332, 1-174 및 1-163의 단당류 조성을 직접 분석하여 확인하였다. 산 가수분해에 의해 당단백질로부터 시알산, GalNAc 및 Gal가 방출되었다. 단당류는 고압 음이온 교환 크로마토그래피 및 펄스형 암페로메트릭 검출(Pulsed amperometric detection)에 의해 검출되었다. 각 형태의 mpl 리간드에서 3가지 당이 모두 검출되었다. 이 결과는 O-결합된 탄수화물을 함유하는 시알산이 존재함을 나타낸다. 이 자료는 CHO 세포에서 발현된 모든 mpl 리간드가 대장균에서 발현된 상응하는 형태보다 생체 내 실험에서 더욱 활성이 있음을 나타내는 도 4의 생체 내 실험 자료와 일치한다. 따라서, 탄수화물의 존재는 mpl 리간드의 생체 내 활성을 향상시킨다.
[표 3]
O-결합된 탄수화물의 계산
mpl 리간드 형태 O-글리카나제 처리 (+/-) 분자량(Da) 분자량 변화(Da) 가능한 O-결합된 사슬의 개수(@950 Da/사슬)
1-332"1-174"1-163"1-153" -대장균의 효소-+-+-+ 5420040600246001600018400145001520012900 13600860039002300 14942
실시예 7
Mpl 리간드 ELISA 분석
다중클론 항체 생산: 대장균에서 생산된 재조합 인간 mpl 리간드 1-163으로 뉴질랜드 산 흰 토끼를 3 달 동안 과면역화 시켰다. 높은 항체 역가를 나타내는 6 마리의 토끼로부터 항혈청을 채집하여 특정 항-mpl 리간드 항체를 친화성에 의해 정제하였다.
친화성 정제: 재조합 인간 mpl 리간드 1-163을 Actigel-ALD(스테로젠 바이오세퍼레이션사 제조)에 제조자의 지시에 따라 공유결합시켰다. 토끼 항혈청의 분획을 mpl 리간드 친화성 겔에 첨가하고, 슬러리는 4∼8 ℃에서 교반기 위에서 하룻밤 천천히 교반시켰다. 결합되지 않은 혈청 단백질은 PBS를 사용하여 겔로부터 세척하고, 특이적으로 결합된 항-mpl 리간드 항체는 ImmunoPure Gentle 항원/항체 용출 완충액(피어스 케미칼사 제조)을 사용하여 용출시켰다. 회수된 항체는 PBS로 여러 번 투석시키고, 항체 용액은 Amicon 교반형 세포 한외여과 장치 안에서 농축시키며, 그 결과 얻어진 항체 농축물은 나중에 웰(well) 피복 및 요소 접합체 제조에 사용되는 특정 항-mpl 리간드 항체의 재료가 된다.
ELISA 시약: Immulon 4 Removawell Strips(다이나테크 연구소 제조)은 친화성에 의해 정제된 토끼 항-mpl 리간드 항체를 사용하여 피복하였다. 친화성에 의해 정제된 항체는 0.1 M 탄산수소나트륨(순수하게 제조됨, 약 pH 8.2)을 사용하여 2.5 ㎍/㎖의 농도로 희석시켰다. 각 웰에 100 ㎕의 항체를 담고, 이들 배양판을 밀폐된 실온의 습실에서 24 시간 동안 배양하였다. 그리고 나서, 1 %의 우 태아 혈청 및 5 %의 수크로오스가 함유된 TEN(50 mM 트리스 7.4/10 mM EDTA/150 mM NaCl) 200 ㎕의 차단 용액을 각 웰에 첨가하고, 이들 배양판을 밀폐된 실온의 습실에서 24 시간 동안 더 배양하였다. 결합된 피복 및 차단 용액을 웰로부터 제거하였다. 추가의 과피복/차단 단계를 실시하였다: PBS(피어스 케미칼사 제조) 중의 300 ㎕의 SuperBlock 차단 완충액을 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 약 5 분 동안 방치한 후, 상기 용액을 제거하고, 웰은 실온에서 24 시간 동안 건조시켰다. 피복된 웰은 mpl 리간드 ELISA에 사용될 때까지 4∼8 ℃에서 밀봉 플라스틱 봉지에 보관하였다.
토끼 항혈청액으로부터 친화성에 의해 정제된 항-mpl 리간드 항체는 신호 발생 항체로 사용하기 위하여 호오스래디쉬 과산화효소(HRPO)와 공유결합에 의해 커플링시켰다. 친화성에 의해 정제된 항체는 이미노티오란 HCl(플루카 케미칼사 제조)을 사용하여 유도하였다. 별도로, N-숙신이미딜 6-말레이미도카프로에이트(플루카 케미칼사 제조)를 사용하여 HRPO를 유도하였다. 상기 두 활성화된 단백질을 공유결합으로 커플링시켰다. 그리고 나서 반응 혼합물은 원하는 분자량(즉, 약 200 kD)의 항체:HRPO 접합체를 분리하기 위하여 FPLC 수페로오스 6(파마시아사 제조) 칼럼을 통한 크로마토그래피를 실시하였다. 원하는 접합체를 함유하는 분획을 모아서 Centricon 30(아미콘 디비젼, W.R.그레이스&Co.사 제조)으로 농축시키고, -20 ℃에서 50 % 글리세롤 용액으로 보관하였다. 상기 항-mpl 리간드 항체:HRPO 농축물은 ELISA에서 사용하기 위하여 PBS 내의 2 % 우 태아 혈청에 희석시켰다. ELISA에서 사용되는 접합체의 최종 농도는 250∼500 ng/㎖였다.
대장균에서 생산된 재조합 인간 mpl 리간드 1-163은 표준물의 제조에 사용되었다. 이 mpl 리간드는 방부제로서 0.05 % 티메로살을 함유하고 2 %의 우 태아 혈청을 함유하는 TEN 완충액으로 희석시켰다. 제조된 표준물은 1.0, 0.5, 0.25, 0.125 및 0.062 ng/㎖의 mpl 리간드를 함유하였다.
분석: 100 ㎕의 mpl 리간드 표준물 또는 샘플을 웰에 첨가하고 나서 밀폐된 실온의 습실에서 18∼24 시간 동안 배양하였다. 그리고 나서 웰 내용물 및 잔류 용액을 제거하고 웰은 세척 용액(TEN 완충액 중에 0.05 % Tween 20)으로 1 회 세척하였다. 항-mpl 리간드 항체:HRPO 접합체 용액(100 ㎕)을 각 웰에 첨가하고 나서 밀폐된 실온의 습실에서 2 시간 동안 배양하였다. 이어 웰 내용물을 제거하고 웰은 0.05 %의 Tween 20을 함유하는 TEN 완충액으로 4 회 세척하였다.
발색을 위하여, 100 ㎕의 TMB/과산화효소 기질 용액(Kirkegaard 및 Perry 용액 A와 B의 1:1 혼합액)을 첨가하여 실온에서 20 분 동안 배양하였다. 100 ㎕의 종료 용액(0.5 N 황산)을 첨가하여 반응을 중지시키고, 마이크로티터 플레이트 판독기 상에서 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 샘플 내의 mpl 리간드 농도는 곡선 표준화 프로그램을 사용하여 그린 표준 곡선으로부터 계산하였다.
실시예 8
단기 액체 배양 거핵구 분석에 있어서 Mpl 리간드 1-174 유사체의 생물학적 활성
상기와 같이 Mpl 리간드 1-174의 유사체를 제조하여 액체 배양시 거핵구의 성장 자극능에 대해 분석하였다. 인간의 백혈구반출 단위로부터 분리된 CD34 선택 세포를 2×105/㎖로 배양액(IMDM/1 % Pen-Strep 글루타민/1 % 비필수 아미노산/1 % MEM Na-피루베이트/1 % MEM 비타민/10 % 탈이온화 BSA/10 % 정상 인간 AB 혈장/10 μM α-티아실글리세롤/20 ㎍/㎖ L-아스파라긴)에 플레이트하였다. 또한, mpl 리간드(1-174) 또는 mpl 리간드 1-174 유사체를 함유하는 1.5 ㎕의 COS-1 처리 배지를 각 웰에 첨가하였다. 최종 부피는 테라사키(Terasaki)형 마이크로티터 조직 배양판(밴가드 인터내셔날사 제조)에서 15 ㎕였다. 이들 세포를 37 ℃, 5 % CO2의 습윤 용기 내에서 8 일 동안 배양하여, 1 % 글루타르알데히드를 갖는 배양 웰에 직접 고정시키고 나서, 항-GPIb, 항-GPIIb(바이오디자인사 제조) 및 항-GPIb(다코사 제조, 캘리포니아 카핀테리아 소재)로 구성된 단일클론 항체 칵테일(cocktail)과 함께 배양하였다. 면역 반응은 스트렙타비딘-β-갈락토시다제 검출 시스템(HistoMark, Kirkegaard 및 Perry)으로 실시하였다. 어두운 색(실제 사진에는 청색)으로 나타나는 거핵구는 도 8에 도시된다.
도 8의 패널 A 및 D는 각각 양성 및 음성 대조구이다. 패널 A의 웰은 37.5 pg의 야생형 mpl 리간드 1-174 COS-1 처리 배지를 포함하며 실질적인 거핵구의 성장을 나타낸다. 패널 D는 1.5 ㎕의 COS-1 모의 처리 배지를 포함하며, 성장을 나타내지 않았다. 도 8의 패널 B 및 C는 각각 mpl 리간드 1-174 유사체 N7 및 N10이다. 패널 B는 9.0 pg의 mpl 리간드 COS-1 처리 배지를 포함하는 반면, 패널 C는 27 pg을 포함하며, 둘 다 우수한 거핵구의 성장을 나타냈다.
본 실험은 검사된 mpl 리간드 유사체가 시험관 내에서 인간 거핵구의 성장을 자극할 수 있음을 나타낸다.
실시예 9
시험관 내 세포 증식 분석에 있어서 Mpl 리간드 1-174 유사체의 생물학적 활성
Mpl 리간드 1-174의 유사체를 상기와 같이 제조하고 32D-mpl 세포 증식을 자극하는 능력에 대하여 분석하였다. 32D-mpl 세포를 생산하기 위하여, 완전한 길이의 인간 mpl 리셉터 서열[I.비곤(Vigon) 일행, PNAS 89: 5640∼5644(1992)]을 몰로니 뮤린 사르코마 바이러스의 전사 프로모터를 함유하는 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 이 구조물 6 ㎍과 양영양성 레트로바이러스의 패키징 구조물[N.R.랜다우(Landau), D.R.리트만(Littman), Journal of Virology 66: 5110-5113 (1992)] 6 ㎍을 CaPO4 포유류 형질감염 키트(스트라타젠사 제조)를 사용하여 3×106개의 293 세포에 형질감염시켰다. 동일한 세포를 2 일 및 4 일 후에 다시 형질감염시켰다. 마지막 형질감염시킨 다음 날, 293 세포를 IL-3 의존성 쥐 세포주[32D, 클론 23; 그린버거(Greenberger) 일행, PNAS 80: 2931∼2936 (1983)]와 함께 배양하였다. 24 시간 후, 32D 세포를 회수하여 BSA 구배(Path-o-cyte; 마일즈사 제조)에 의해 밴드로 나타냈다. 이들 세포를 1 ng/㎖ 쥐 IL-3 중에서 풀고 나서 20 % APK9 혈청[바틀리(Bartley) 일행, Cell 77:1117∼1124 (1994)]에서 배양하기 위하여 선별하였다. 이들 세포는 다중클론 토끼 항펩티드(MPL) 혈청을 사용하여 FACS에 의해 세포 표면에서 발현되는 리셉터에 따라 분류하였다. 이들 시토킨 의존성 쥐 32D-mpl 세포는 mpl 리간드에 반응한다. 32D-MPL 세포는 10 % Fetal Clone II 혈청(Hyclone 연구소 제조) 및 1.0 ng/㎖ muIL3을 함유하는 MEM 배지에서 1×106세포/㎖의 세포 밀도로 배양하였다. 이들 세포를 원심분리(약 500XG)에 의해 채집하고, muIL3이 없는 성장 배지에서 2 회 세척하고 1×105세포/㎖로 다시 현탁시켰다.
확장된 12 점 mpl 리간드 표준 곡선은 mpl 리간드 1-163을 사용하여 준비하였으며 범위가 5000 내지 1 pg/㎖이었다. 100 ㎕의 표준 mpl 리간드 또는 분석 샘플의 희석액은 100 ㎕의 재현탁 세포(10,000 세포/웰)를 함유하는 96 웰 마이크로티터 조직 배양판의 웰에 첨가하고 37 ℃, 10 % CO2의 습윤 배양기에서 배양하였다. 48 시간 후, 40 ㎕의 MTS 시약(수성 비-방사성 세포 증식 키트, 프로메가사 제조)을 각각의 웰에 첨가하고 나서 14∼18 시간 후에 이들 판은 490 nM의 판독기 상에서 읽었다. 샘플의 시험관 내 활성은 각 샘플에 대한 투여 반응 곡선으로부터 계산하였다. 1 unit은 50 %의 최대 자극을 얻기 위하여 필요한 각 샘플 내의 mpl 리간드의 양을 의미한다. 비활성은 mpl 리간드 ELISA에 의해 결정된 바와 같이 생물학적 활성(units/㎖)을 mpl 리간드 농도(ng/㎖)로 나눔으로써 계산하였다
COS 세포에 형질감염시켜 발현된 mpl 리간드 유사체의 특정 생물학적 활성은 하기 표 4와 같다. 탄수화물 첨가에 대한 아미노산 치환의 영향도 또한 요약되어 있다. 정제된 인간 서열 mpl 리간드는 상기 분석에 의해 측정된 바와 같이 200∼300 unit/ng의 시험관 활성을 나타냈다. 표 4로부터 추가의 N-결합된 탄수화물을 함유하는 mpl 리간드 유사체는 부수적인 탄수화물 사슬 즉, N4 및 N10을 함유할 지라도(상기 실시예 6의 섹션 A에서 측정됨)천연 mpl 리간드 서열과 마찬가지로 발현됨이 분명하다. 이들 두 유사체 모두 완전한 시험관 내 생물학적 활성을 나타냈다. 따라서, N-결합된 탄수화물을 함유하는 mpl 리간드 유사체는 포유류 세포에서 정상적으로 발현될 수 있으며, 정상적인 또는 향상된 시험관 내 생물학적 활성을 나타낼 수 있다.
[표 4]
Mpl 리간드 형태(아미노산 길이) 서열 N-결합 사슬의 개수(a) Elisa(ng/㎖)(b) 시험관 내 활성(units/㎖)(c) 비활성(units/ng)(d)
모의시험N1 (174)N1 (174)N1 (174)N2 (174)N3 (174)N4 (174)N4 (174)N5 (174)N6 (174)N7 (174)N7 (174)N9 (174)N10 (174)N10 (174)N11 (174)N11 (174)N13 (174)N14 (174)N15 (174) 없음천연서열천연서열천연서열N22N25N30T32N30T32N38T40N86N82A83N82A83N92N120T122N120T122S36N38T40S36N38T40N53T55N58T60N30T32N120T122 0NA000NA11000 내지 10 내지 1011NA00 내지 10 내지 10 내지 2 <0.082531.431.75NA1.8538241.20.4464.710.520.433.7<0.6251.36717.926 <1053758800NANA6368830NA<10<1026603080197059439690<10<101800048506420 <125215280NANA344232NA<8<22443655188291288<16<8269271247
(a) 추가적인 N-결합된 사슬의 개수는 실시예 6에 기재된 바와 같이 SDS 겔에서 유사체 폴리펩티드의 이동성을 바탕으로 추정하였다.
(b) CHO 세포 상층액 내의 mpl 리간드 유사체의 양은 상기 실시예에 기재된 바와 같이 ELISA 분석으로 결정하였다.
(c) 시험관 내 활성은 mpl 리간드에 대한 성장 의존성 32D 세포에서 티미딘의 흡수 자극성을 측정하여 결정하였다.
(d) Mpl 리간드 ELISA에 의해 측정된 mpl 리간드 유사체의 양에 대한 세포 증식 분석에 의해 측정된 mpl 리간드 유사체의 시험관 내 활성의 비율.
N.A.: 측정되지 않음.
실시예 10
CHO 세포에서의 발현 및 Mpl 리간드 1-174, N4 및 N15의 정제
Mpl 리간드 1-174, N4 및 N15 cDNA를 함유하는 pDSRα2를 하기와 같이 변형된 실시예 2의 실험 계획을 사용하여 DHFR-결핍 CHO 세포 내로 형질감염시켰다.
각각의 유사체에 대하여 형질감염을 실시하였다. 형질감염 3 주 후, mpl 리간드 발현은 mpl 리간드 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 각 형태에 대하여 3 개의 발현 클론을 저온 저장고에서 냉동시켰다. 각 유사체에 대하여 최고의 발현 클론은 로울러 병에서 대량 생산하였다. N4용으로, 7.4 ℓ의 처리된 배지[50 % D-MEM, 50 % HAMS-F12, 1 % 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 1 % 비필수 아미노산(Gibco사 제조)]를 제조하고, N15용으로 4.6 ℓ의 처리된 배지를 제조하였다.
mpl 리간드 1-174(2.9 L), N4(7.4 L) 및 N15(4.4 L)를 발현하는 CHO 세포로 시딩된 로울러 병으로부터의 무혈청 CHO 세포로 처리된 배지는 S1Y10(분자량 컷오프치 10,000 D) 아미콘 스피랄(Amicon Spiral) 한외여과 카트리지를 사용하여 각각 12-, 19- 및 12-배 농축시켰다. 그리고 나서 150 ㎖의 처리된 농축 배지를 유속 0.3 ㎖/분으로 3.3 ㎖ hu-MPL-X(리셉터) 친화성 칼럼에 직접 로딩하였다. 친화성 칼럼은 제조업자에 의해 추천된 바와 같이 파마시아 CNBr-활성형 세파로오스 수지 1 ㎖ 당 1.0∼1.5 ㎎의 Mpl-X(Mpl 리셉터의 수용성 세포 밖 영역)를 커플링함으로써 제조되었다. 로딩한 후, 칼럼은 30 ㎖의 PBS(Phosphate Buffered Saline; 10 mM NaPO4 pH 6.8/150 mM NaCl)로 세척하고 나서, 60 ㎖의 10 mM 트리스 pH 8.0/1 M NaCl/1 mM CHAPS로 세척하였다. Mpl 리간드 1-174는 30 ㎖의 20 mM CAPS[3-(시클로헥실아미노)-1 프로판술폰산] pH 10.5/1 M NaCl/1 mM CHAPS{3-[(3-콜라미도프로필) 디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트}를 사용하여 용출시켰다.
용출된 각 분획에 0.6 ㎖의 1 M 트리스(pH 7.0)를 첨가하여 분획을 중화시켰다. SDS-PAGE 분석은 10 mM 트리스 pH 8.0/1M NaCl/1 mM CHAPS로 세척하는 동안 1-174 mpl 리간드의 분명한 "블리딩(bleeding)"을 보여 주었다. 용출 분획은 SDS-PAGE로 분석하였다. Mpl 리간드 1-174를 함유하는 이들 분획을 수집하였다. 그리고 나서 친화성 정제를 하기와 같이 변경하여 반복하였다: 0.5 ㎖/분의 로딩 및 용출, 및 10 mM 트리스 pH 8.0/1M NaCl/1 mM CHAPS 세척 생략.
하나의 mpl 리간드 밴드를 함유하는 모든 분획은 50 ㎖의 교반된 세포 내에서 센트리콘(centricon) 장치에 연결된 YM10(분자량 컷오프치 10,000 D) 막을 사용하여 농축시켰다. 상기 0.5 ㎖의 농축물은 PBS로 평형화시킨 파마시아 Superdex 200 HR 10/30 겔 여과 칼럼 상에 0.25 ㎖/분으로 직접 로딩하고, 0.25 ㎖ 분획씩 수집하였다. 하나의 mpl 리간드 밴드(SDS-PAGE 분석을 바탕으로)를 함유하는 모든 용출 분획을 모았다.
Mpl 리간드를 발현하는 다른 형태(N4 및 N5)의 CHO 세포를 유사한 방법(두 개의 친화성 정제를 모아서 하나의 Superdex 200 겔 여과 칼럼 상에 로딩함)으로 정제하였다.
실시예 11
CHO 세포에서 발현된 N4 및 N15에 대한 탄수화물의 첨가 여부 검사
CHO 세포에서 발현되는 mpl 리간드 형태에 N-결합된 탄수화물이 함유되어 있는지의 여부를 결정하기 위하여, 처리 배지를 실시예 6에 기재된 바와 같이 SDS-PAGE 웨스턴 블럿을 하기와 같이 변형하여 분석하였다.
로울러 병으로부터 얻은 CHO D-처리 배지를 사용하였다. 샘플을 Centricon-10 원심분리 농축기(아미콘사 제조, 매사추세츠 베버리 소재)에 로딩하여, 고정각 로터(JA 20.1)를 사용한 Beckman J2-HS 원심분리기 안에서 6000 rpm으로 1 시간 동안 회전시켰다. 약 100 ng의 mpl 리간드 유사체를 함유하는 농축 샘플을 SDS 샘플 완충액(실시예 6에 기재됨)과 함께 SDS-PAGE 겔 상에 로딩하였다. 또한 탄수화물이 함유되지 않고, 대장균에서 발현된 mpl 리간드 MK 1-174도 로딩하였다. 도 9는 탄수화물의 기대량과 일치하는 이동성의 차이를 나타낸다. 가장 빨리 이동하는 Met-Lys(1-174) 대장균 mpl 리간드에 이어, 1-174(CHO), N4(CHO) 및 N15(CHO)가 연속적으로 나타난다. 도 9를 참조한다. 글리코실화되지 않은 mpl 리간드에 비하여 상대적으로 크기가 증가하는 것에 대한 가장 그럴듯한 설명은 mpl 리간드 1-174(CHO) 상에 추가의 O-결합된 탄수화물이 있으며, N4(CHO) 상에는 추가의 O-결합된 탄수화물 및 하나의 추가적인 N-결합된 올리고당이 있으며, N15(CHO) 상에는 추가의 O-결합된 탄수화물 및 두 개의 추가적인 N-결합된 올리고당이 있다는 것이다.
분자량의 증가가 N-결합된 탄수화물 사슬의 첨가에 기인함을 확인하기 위하여, 이들 샘플을 실시예 6에 기재된 바와 같이 N-결합된 탄수화물을 제거하기 위하여 N-글리카나제로 처리하였다. 각 샘플은 처리된 배지로부터 정제된 약 100 ng의 mpl 리간드 유사체를 함유하였다.
N-글리카나제를 처리한 후에 N4(CHO) 및 N15(CHO)의 이동성은 mpl 리간드 1-174(CHO)의 수준으로 감소하였다. Mpl 리간드 MK 1-174(대장균) 또는 mpl 리간드 1-174(CHO)를 N-글리카나제로 처리해도 이들이 모두 N-결합된 탄수화물을 함유하지 않기 때문에 이동성에 영향을 주지 않았다. N-글리카나제를 처리한 것과 처리하지 않은 것을 비교하면 N4에 있어서의 크기 차이는 N-결합된 탄수화물 사슬의 크기와 일치하며, N15에 있어서의 크기 차이는 두 개의 탄수화물 사슬의 크기와 일치한다. 따라서 이들 두 mpl 리간드 형태에 대한 N-결합된 글리코실화 부위의 첨가는 이들 종이 CHO 세포에서 발현될 때 추가적인 N-결합된 탄수화물을 생산하였다. 도 10을 참조한다.
실시예 12
CHO 세포에서 생산된 mpl 리간드 유사체의 시험관 내 생물학적 활성
CHO 세포 또는 대장균에서 발현되어 정제된 mpl 리간드 및 유사체는 인자 의존성 세포주 32D-MPL 및 활성이 CHO 세포에서 생산된 mpl 리간드 1-332를 표준으로 사용하여 계산되는 것을 제외하고 실시예 9에 기재된 분석법을 사용하여 시험관 내 생물학적 활성을 분석하였다. 다양한 형태의 특정 시험관 내 생물학적 활성은 하기 표 5와 같다. 이 표로부터 CHO 세포에서 발현되는, 추가의 탄수화물을 함유하는 mpl 리간드 유사체가 시험관 내 생물학적 활성을 지님이 분명하다.
[표 5]
Mpl 리간드의 시험관 내 활성
Mpl 리간드 형태 N-결합 사슬의 개수 시험관 내 활성(U/㎎×10E6)
MK174(대장균)1∼163(CHO)1∼174(CHO)N4(CHO)N15(CHO)1∼332(CHO) 000126 138685609241
실시예 13
Mpl 리간드 유사체의 시험관 내 생물학적 활성
다양한 형태의 mpl 리간드로 처리된 마우스의 혈소판 개수를 측정하였으며 그 결과를 도 11에 나타낸다. CHO-유도성 mpl 리간드 1-332, 1-174, N4 및 N15를 생산하고, mpl-리셉터 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 대장균-유도성 Lys-mpl 리간드 1-174를 생산하고, 통상적인 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 각 형태의 지정된 농도를 정상적인 암컷 Balb/c 마우스에 5 일 동안 매일 피하에 투여하였다. 마지막 투여한 지 24 시간 후에 꼬리 정맥의 작은 측면 절개부로부터 검사 혈액을 채취하였다. 혈액 세포 분석은 Sysmex 전자 혈액 세포 분석기(Baxter Diagnostics사 제조, 캘리포니아 어빈 소재)를 사용하여 실시하였다. 자료는 4 마리 측정의 평균 및 +/- 표준 오차를 나타낸다. 기타 혈액 세포 변수 예컨대 백혈구 개수 또는 적혈구 개수는 이들 처리에 의해 영향을 받지 않았다(자료는 나타내지 않음).
모든 형태가 혈소판 개수를 증가시켰다. 그러나 각각의 활성은 다양하였다. 상대적인 시험관 내 활성은 다음과 같았다: Mpl 리간드 MK 1-174(대장균) < mpl 리간드 1-174(CHO) < N4(CHO) < mpl 리간드 1-332(CHO) < N15(CHO). 이들 결과는 비-천연적으로 발생하는 N-결합된 탄수화물을 첨가하면 생체 내 활성이 증가함을 나타낸다. 또한 탄수화물 양의 증가는 생체 내 활성의 비율적 증가를 나타낸다.
실시예 14
중첩 PCR에 의한 Mpl 리간드 유사체 및 절단물 N16-N40의 작성
유사체 N16 내지 N40(이들 유사체의 구조는 하기 표 6을 참조)은 쳉 일행[Cheng, PNAS 91, 5695 (1994)]으로부터 채택된 실험 계획을 사용하여 중첩 PCR(Polymerase chain reaction)에 의해 제조되었다. 통상 1 내지 2 돌연변이가 각 구조물에 도입되었다.
하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하여 유사체 N16∼N40의 제조에 사용하였다:
Figure pct00005
Figure pct00006
F= 정방향
R= 역방향
하나의 새로운 글리코실화 부위를 도입하는 구조물은 연속적인 두 단계에 의해 제조되었다. 1 단계에서, 4 개의 상이한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 두 반응을 실시하였다. 이들 올리고는 5' 정방향 프라이머, 역 돌연변이성 프라이머, 정 돌연변이성 프라이머(통상 역 돌연변이성 프라이머에 대하여 상보적임) 및 역방향 3' 프라이머를 포함하였다. 역방향 3' 프라이머는 SalI 제한 부위 다음에 정지 코돈을 도입하는 서열을 함유하였다. 정지 코돈은 175, 184, 192 및 200 부위에 도입되었다. 따라서, 길이 1-174, 1-183(N16), 1-191(N17) 및 1-199(N31)의 형태가 제조될 수 있었다. PCR1은 주형 DNA(mpl 리간드 1-174 서열 또는 완전한 길이의 mpl 리간드 1-332 서열을 함유하는 pDSRα2), 5' 정방향 프라이머 및 역 돌연변이성 프라이머를 사용하였다. PCR2는 주형 DNA, 3' 역방향 프라이머 및 정 돌연변이성 프라이머를 사용하였다. 상기 두 PCR 반응을 실시하고 나서, 증폭된 DNA 단편은 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 올바른 크기의 DNA 단편을 함유하는 작은 아가로오스 조각을 겔로부터 잘라냈다.
PCR1 및 PCR2로부터 얻은 DNA 단편을 함께 결합시켜 3차 PCR 반응을 5' 정방향 및 3' 역방향 프라이머를 사용하여 실시하였다. 이로써 mpl 리간드에 삽입된 원하는 돌연변이를 함유하는 완전한 길이의 DNA 단편이 증폭되었다.
증폭된 단편은 다시 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리시키고, 올바른 크기의 DNA 단편을 GenecleanTM 장치(Bio 101사 제조)를 사용하여 제조자에 의해 제공된 방법에 따라 정제하였다. 정제된 DNA는 XbaI 및 SalI으로 절단한 후, GenecleanTM 장치를 사용하여 다시 정제하였다. 그리고 나서 상기 단편은 XbaI 및 SalI으로 절단한 pDSRα2에 결합시켰다. 결합된 DNA는 캐리어 tRNA의 존재하에서 0.3 M NaOAc(pH 5.2)가 함유된 에탄올 2 부피를 사용하여 침전시키고 대장균 내로 형질전환시켰다. 올바른 크기의 DNA 삽입물을 함유하는 클론을 확인하기 위하여 제한 분석 및 아가로오스 겔 전기영동에 의해 클론을 검사하였다. 그리고 나서 정제된 플라스미드 DNA를 제조하고 나서, 원하는 돌연변이의 존재를 확인하고 부수적인 아미노산 변화가 없음을 확실히하기 위하여 mpl 리간드 삽입물의 서열을 분석하였다.
몇몇 경우에 있어서, 두 개 이상의 돌연변이가 동시에 결합되었으며, 즉 N29, N33, N34, N35, N39 및 N40을 참조한다. 이것은 새로운 치환체를 이미 변화를 함유하고 있는 DNA 내로 도입함으로써 실시될 수 있다. 예컨대, N33은 N23 변화를 N15 내로 도입함으로써 제조되었다. 이 경우 상기 방법은 N23 돌연변이성 프라이머 및 N15 주형 DNA를 사용하여 실시되었다.
다른 방법으로는, 두 개의 변화가 주형 DNA 내로 동시에 도입될 수 있었다. 주형 DNA는 천연 서열을 함유하거나 또는 이미 변화를 함유하는 mpl 리간드 형태를 코딩하는 서열을 함유할 수 있다. 이 경우 단계 1은 3 회의 PCR 반응 및 6 개의 올리고가 관여하였다. 이들 올리고는 5' 정방향 프라이머, 2 쌍의 정 및 역 돌연변이성 프라이머, 및 역방향 3' 프라이머를 포함하였다. 각 쌍의 프라이머는 서로 상보적이며 하나의 새로운 글리코실화 부위를 도입하도록 고안된 서열을 함유하였다.
PCR1은 주형 DNA, 5' 정방향 프라이머 및 쌍 1의 역 돌연변이성 프라이머를 포함하였다. PCR2는 주형 DNA, 쌍 1의 정 돌연변이성 프라이머 및 쌍 2의 역 돌연변이성 프라이머를 포함하였으며, 쌍 2 프라이머는 3' → 쌍 1 프라이머이다. PCR3은 주형 DNA, 쌍 2의 정 돌연변이성 프라이머 및 역방향 3' 프라이머를 포함하였다.
각 PCR 반응으로부터 얻은 DNA 단편은 상기와 같이 아가로오스 겔 전기영동으로 분리시키고 나서 절단하였다. 그리고 나서 세 종류의 DNA 단편을 함께 결합시키고, 다시 5' 정방향 및 3' 역방향 프라이머를 사용한 PCR에 의해 증폭시켰다.
그리고 나서 두 개의 새로운 글리코실화 부위를 함유하는 서열과 함께 중요한 전체 유전자를 코딩하는 DNA 단편을 상기와 같이 정제하고, XbaI 및 SalI으로 절단하고, 및 XbaI 및 SalI으로 절단한 pDSRα2에 결합시켰다.
또한 이미 돌연변이를 함유하는 주형으로 PCR 반응을 실시하여 다중 돌연변이를 결합시킬 수 있었다. 예컨대, N39는 N36 및 N38 변화를 N15 주형 DNA에 도입함으로써 제조되었다. 이것은 N36[N36(1)]을 제조하기 위하여 사용된 것과는 상이한 종류의 프라이머[N36(2)]를 사용하여 실시되었다.
더 긴 mpl 리간드 형태도 또한 제조할 수 있었다. 따라서, N40은 PCR 3에서 3' 역방향 프라이머(단계 1) 및 단계 2에서 PCR 프라이머가 N31을 제조하는데 사용된 프라이머인 것을 제외하고 N39와 유사한 방법으로 제조되었다. 상기 프라이머는 SalI 제한 부위 다음의 부위 200에 정지 코돈을 도입한다. 또한, PCR 3에서 사용된 주형 DNA는 완전한 길이의 mpl 리간드(1-332)를 코딩하는 서열을 함유하였다.
통상적인 PCR 반응 혼합물은 다음을 함유하였다: 4 ㎕의 각 정방향 및 역방향 프라이머(5 pm/㎕), 1 ㎕의 주형(50 ng), 10 ㎕의 5X LP 완충액(100 mM 트리신 pH 8.7/25 % 글리세롤/425 mM KOAc), 10 ㎕의 dNTP 혼합물(dATP, dTTP, dCTP, dGTP 각각 1 mM), 0.8 ㎕ rtTh 중합효소(퍼킨 엘머사 제조; 2.5 U/㎕), 및 2 ㎕의 Vent 중합효소(NEB사 제조; 1X LP 완충액에서 1:100 회석 후 0.01 U/㎕). 물을 첨가하여 최종 부피를 50 ㎕로 하였다. 지시된 순서대로 모든 성분을 함께 첨가하고, 1 ㎕의 50 mM MgOAc를 첨가하여 첫 번째 사이클 동안의 온도가 60 ℃ 이상이 될 때 PCR이 시작되었다. 반응 조건은 다음과 같다: 2 사이클의 94 ℃, 10 초/45 ℃, 1 분/68 ℃, 5 분, 이어 25 사이클의 94 ℃, 10 초/55 ℃, 1 분/68 ℃, 5 분.
이들 일반적인 방법은 표 6에 명시된 mpl 리간드 유사체 및 절단체 N16 내지 N40을 제조하는데 사용되었다. 각 형태의 DNA 서열 변화가 명시되어 있다.
[표 6]
N-결합된 탄수화물의 사슬 부위를 갖는 mpl 리간드 유사체
Figure pct00007
Figure pct00008
상기 표에서 기호 "(i)"는 언급된 아미노산이 삽입된 것을 의미한다. 예컨대, Glu57→Asn55'(i), Thr57(표 6의 유사체 N23)은 57 부위의 Glu가 Thr로 치환되고, 또한 55 부위의 Met 바로 다음에 Asn이 삽입되고, 이후의 아미노산이 이전에 할당된 번호를 유지하도록 Asn은 55'로 정해짐을 의미한다.
이전 실시예의 모든 변화를 포함하는 실시예는 "+" 표시가 붙은 특정 유사체의 번호로 표시된다. 유사체 N35, N39 및 N40을 참조한다. 이들 유사체의 아미노산 사슬 길이는 괄호안에 표시되어 있다. 따라서, 유사체 N35는 N4, N23, N30 및 N31에 대한 모든 변화의 조합을 함유하였다. N31에서 표시된 이들 변화는 유사체 N35의 길이가 199 아미노산임을 의미한다. 표 6의 모든 유사체의 길이는 표시된 상이한 길이(또는, 아미노산이 삽입된 경우 총 길이는 삽입된 아미노산의 수만큼 증가할 것이다)를 제외하고 174 아미노산이었다.
실시예 15
Mpl 리간드 유사체 및 절단체 N16 내지 N40의 특성 분석
A. Mpl 리간드 유사체의 발현 수준 및 시험관 내 생물학적 활성의 측정
종 N16 내지 N40은 엘렉트로포레이숀(electroporation) 방법(실시예 5) 또는 CaPO4 방법(포유류 세포 형질감염 키트; 스페셜티 메디아사 제조)을 사용하여 COS 세포에 형질감염시켰다. 3∼4 일 후 세포가 없는 처리된 배지를 채집하여 분획한 후 -70 ℃에 보관하였다. 발현 수준은 상기 실시예 7에 기재된 바와 같이 ELISA 분석에 의해 측정하였다. 상층액도 또한 상기 실시예 9에 기재된 바와 같이 생물학적 활성을 측정하기 위하여 분석하였다. 이들 활성은 CHO 세포에서 발현된 정제된 mpl 리간드 1∼332를 표준으로 사용한 표준 곡선으로부터 계산하였다.
그 결과는 하기 표 7과 같다. 표 7에서 보는 바와 같이, 대부분의 mpl 리간드 유사체는 발현되어 분비되었다. 몇몇 유사체는 분비가 증가하였다. 이들 샘플에 대한 생물학적 분석에 의하면, 대부분의 비활성도 또한 변형되지 않은 형태와 유사하였다. 몇몇 유사체는 다중 N-결합된 탄수화물 사슬을 함유하였다.(하기 참조). 이것은 탄수화물 첨가가 유사체의 분비를 증가시키고 시험관 내의 정상적인 활성을 유도할 수 있음을 나타낸다.
[표 7]
Mpl 리간드 형태(아미노산 길이) 서열 N-결합된 사슬의 개수(a) Elisa(ng/㎖)(b) 시험관 내 활성(units/㎖)(c) 비활성(units/ng)(d)
N1 (174)N15 (174)N16 (183)N17 (191)N18 (174)N19 (174)N20 (174)N21 (174)N22 (174)N23 (174)N24 (174)N25 (174)N26 (174)N27 (174)N29 (174)N30 (174)N31 (199)N33 (174)N34 (174)N35 (199)N36 (174)N37 (174)N38 (174)N39 (174)N40 (199) 천연서열N30T32N120T1221∼1831∼191N23S25N37G38S39N39S41N54S56N52T54N55'(i)T57N57S59N81T83N118S120N119S121N30S32N120S122T163N1641∼1994+10+234+23+3034+31N55T57N56T163N164T166N4+N10+N36+N38N4+N10+N36+N38+N31 00∼20NA0NANA0∼10∼110NANA00∼20∼11 이상32 이상4 이상0∼110∼13 내지 45 이상 284585<0.32<0.3<0.3302115.30.220.94.51512815678112172483225127134 399170039276115NA<104380856105945812396338162715592190001005713536131125808450439041766119735 143156NANA2.5NANA14642896865591067510812212212912076121141156139147
(a) 추가적인 N-결합된 사슬의 개수는 SDS 겔에서 유사체 폴리펩티드의 이동성에 따라 추정하였다.
(b) CHO 세포 상층액 내의 mpl 리간드 유사체의 양은 EIA에 의해 결정되었다.
(c) 시험관 내 활성은 mpl 리간드에 대한 성장 의존성 32D-MPL 세포의 증식을 측정하여 결정하였다.
(d) Mpl 리간드 ELISA에 의해 측정된 mpl 리간드 유사체의 양에 대한 세포 증식 분석에 의해 측정된 mpl 리간드 유사체의 시험관 내 활성의 비율.
i : 삽입.
N.A.: 측정되지 않음.
B. 탄수화물 첨가량 측정
상기 실시예 6에 기재된 방법을 사용하여 N-결합된 탄수화물의 첨가 여부를 확인하기 위하여 표 6의 유사체를 검사하였다.
몇몇 유사체(N21, N22, N30, N33 및 N36)도 또한 변형된 방법을 사용하여 검사하였다. 웨스턴 블럿을 전개하는데 사용된 단일클론 항체가 아미노산 잔기 47 내지 62를 포함하는 펩티드에 대하여 생성되고, 표 6의 몇몇 유사체 예컨대, N21이 상기 항체와의 면역활성에 영향을 미치는 치환체를 함유하기 때문에 상기 방법이 필요하다. 그러므로, 이들 유사체를 분석하기 위하여, 대장균에서 발현된 mpl 리간드 1∼163에 대한 마우스에서 생산된 단일클론 항체를 사용하여 상층액을 면역 침강시켰다.
통상 50 ng의 mpl 리간드 유사체를 면역 침강시키기 위하여 15 ㎍의 항체를 사용하였다. 면역 침강시킨 물질을 사용한 웨스턴 블럿은 이들 블럿을 토끼 항-mpl 리간드 다중클론 항체(통상 1 ㎍/㎖; 대장균에서 발현된 mpl 리간드 1∼163에 대하여 생산됨)와 함께 배양시킴으로써 면역 침강된 밴드를 시각화하고 항-토끼 ECL 키트(아머샴사 제조)를 사용하는 것을 제외하고 상기 실시예 6에 기재된 바와 같이 실시되었다. 다양한 실험의 결과는 상기 표 7과 같다. 몇몇 유사체는 N-결합된 탄수화물의 존재를 나타내는 증가된 크기를 가졌다(N21, N22, N23, N29, N30, N31, N33, N34, N35, N36, N38, N39 및 N40). 이들 유사체 중 몇몇은, 예컨대 N29, N33, N34, N35, N39 및 N40은 하나 이상의 N-결합된 사슬을 가지고 있었다. 이들 유사체는 정상적으로 또는 더 높은 수준으로 분비되었으며 mpl 리간드 1∼174와 유사한 시험관 내 생물학적 활성을 가지고 있었다. 이것은 발현 또는 생물학적 활성에 대한 해로운 영향이 없이 다중 관능성 N-결합된 글리코실화 부위가 mpl 리간드 내에 도입될 수 있음을 나타낸다.
다중 올리고당 사슬이 mpl 리간드에 첨가될 수 있음을 증명하기 위하여, COS 세포에서 발현된 다양한 유사체를 상기 실시예 6에 기재된 바와 같이 웨스턴 블럿으로 분석하였다. 도 12는 첨가된 N-결합된 탄수화물 부위의 개수가 증가함에 따라 유사체의 이동성이 감소함을 나타낸다. 네 개의 새로운 부위를 갖는 유사체 N39 및 N40이 제조되었다. 가장 많은 N-결합된 부위를 갖는 유사체가 가장 느린 이동성을 나타냈다. 이 결과는 mpl 리간드 1∼174 및 1∼199 형태 모두에서 관찰되었다. 이것은 네 개 이상의 유사체가 함께 결합하여 다중 N-결합된 탄수화물 사슬을 갖는 새로운 유사체가 형성될 수 있음을 나타낸다.
실시예 16
Asn-X-Ser과 Asn-X-Thr을 함유하는 글리코실화 부위의 비교
N-결합된 글리코실화 부위는 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr을 포함하며, X는 Pro를 제외한 20개의 천연 아미노산 중 하나일 수 있다. Ser 또는 Thr이 세 번째 부위에 바람직한지를 확인하길 원했다. 따라서, N-결합된 글리코실화 부위의 %점유도에 대한 영향을 알아보기 위하여 각 세트가 시퀀(sequon)의 세 번째 부위에 Ser 또는 Thr를 함유하는 mpl 리간드 글리코실화 유사체를 갖는 두 세트의 유사체를 검사하였다. N15는 두 개의 Asn-X-Thr 부위를 함유하는 반면 N29는 정확하게 동일한 부위에 두 개의 Asn-X-Ser 부위를 함유하였다. 비슷하게도, N30은 하나의 Asn-X-Ser 부위를 함유한 반면 N38은 동일한 부위에 하나의 Asn-X-Thr 부위를 함유하였다.
이들 두 세트의 유사체를 비교하기 위하여, 이들을 COS 세포에서 발현시키고, 분비된 mpl 리간드를 상기 실시예 6에 기재된 바와 같이 웨스턴 블럿으로 분석하였다. 도 13은 이들 결과를 나타낸다. N15는 N29에 비하여 상당히 증가된 비율로 글리코실화된 mpl 리간드를 지녔다. 이와 반대로, N30과 N38을 비교할 때는 글리코실화된 mpl 리간드와 글리코실화되지 않은 mpl 리간드의 비율에 있어서 거의 차이가 없었다. 이들 결과는 Asn-X-Ser과 Asn-X-Thr 둘 다 mpl 리간드에 도입될 수 있으며, 모두 N-결합된 탄수화물 첨가에 대한 부위로서 작용할 수 있음을 나타낸다. 또한, 몇몇 경우에 있어서 Asn-X-Thr 시퀀이 바람직할 수 있다(즉, 이것이 더 효율적으로 글리코실화될 수 있다).
본 발명은 바람직한 구체예로 생각되는 형태로 기재되었지만, 개시된 구체예에 국한되지 않으며, 이와는 반대로, 첨부된 청구항의 정신 및 범위 내에 포함된 다양한 변형체 및 동등체를 망라하고자 하며, 상기 범위는 모든 이들 변형체 및 동등체를 포함하도록 광범위한 해석과 일치되어야 한다.
서열표
(1) 일반 정보:
(i) 출원인: 엘리어트, 스티븐 지.
(ii) 발명의 명칭: Mpl 리간드 유사체
(iii) 서열의 개수: 56
(iv) 연락처 주소:
(A) 수신인: 암겐 인코포레이티드
(B) 거리: 드하빌랜드 드라이브 1840
(C) 도시: 싸우전드 오우크스
(D) 주: 캘리포니아
(E) 국가: 미합중국
(F) 우편번호: 91320-1789
(v) 컴퓨터 판독가능한 형태:
(A) 매체 형태: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: Patent In Release #1.0, 버전 #1.30
(vi) 현 출원 자료:
(A) 출원 번호:
(B) 출원일:
(C) 분류:
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1342 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: cDNA
(ix) 특성:
(A) 명칭/키(key): CDS
(B) 위치: 36..1094
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: sig_펩티드
(B) 위치: 1..98
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: mat_펩티드
(B) 위치: 99..1094
(xi) 서열 기술:
[서열 1]
Figure pct00009
Figure pct00010
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 353 아미노산
(B) 종류: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 단백질
(xi) 서열 기술:
[서열 2]
Figure pct00011
Figure pct00012
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 600 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: cDNA
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 위치: 12..596
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: sig_펩티드
(B) 위치: 12..74
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: mat_펩티드
(B) 위치: 75..96
(xi) 서열 기술:
[서열 3]
Figure pct00013
Figure pct00014
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 195 아미노산
(B) 종류: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 단백질
(xi) 서열 기술:
[서열 4]
Figure pct00015
Figure pct00016
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 5]
Figure pct00017
(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 6]
Figure pct00018
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 7]
Figure pct00019
(2) 서열 8에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 25 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 8]
Figure pct00020
(2) 서열 9에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 9]
Figure pct00021
(2) 서열 10에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 10]
Figure pct00022
(2) 서열 11에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 11]
Figure pct00023
(2) 서열 12에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 12]
Figure pct00024
(2) 서열 13에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 25 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 13]
Figure pct00025
(2) 서열 14에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 14]
Figure pct00026
(2) 서열 15에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 25 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 15]
Figure pct00027
(2) 서열 16에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 23 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 16]
Figure pct00028
(2) 서열 17에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 25 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 17]
Figure pct00029
(2) 서열 18에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 38 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 18]
Figure pct00030
(2) 서열 19에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..28)
(xi) 서열 기술:
[서열 19]
Figure pct00031
(2) 서열 20에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..29)
(xi) 서열 기술:
[서열 20]
Figure pct00032
(2) 서열 21에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..29)
(xi) 서열 기술:
[서열 21]
Figure pct00033
(2) 서열 22에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 22]
Figure pct00034
(2) 서열 23에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..29)
(xi) 서열 기술:
[서열 23]
Figure pct00035
(2) 서열 24에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 33 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 24]
Figure pct00036
(2) 서열 25에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 33 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..33)
(xi) 서열 기술:
[서열 25]
Figure pct00037
(2) 서열 26에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 26]
Figure pct00038
(2) 서열 27에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..31)
(xi) 서열 기술:
[서열 27]
Figure pct00039
(2) 서열 28에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 28]
Figure pct00040
(2) 서열 29에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..31)
(xi) 서열 기술:
[서열 29]
Figure pct00041
(2) 서열 30에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 30]
Figure pct00042
(2) 서열 31에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..32)
(xi) 서열 기술:
[서열 31]
Figure pct00043
(2) 서열 32에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 32]
Figure pct00044
(2) 서열 33에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..32)
(xi) 서열 기술:
[서열 33]
Figure pct00045
(2) 서열 34에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 34]
Figure pct00046
(2) 서열 35에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..31)
(xi) 서열 기술:
[서열 35]
Figure pct00047
(2) 서열 36에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 36]
Figure pct00048
(2) 서열 37에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..32)
(xi) 서열 기술:
[서열 37]
Figure pct00049
(2) 서열 38에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 38]
Figure pct00050
(2) 서열 39에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..31)
(xi) 서열 기술:
[서열 39]
Figure pct00051
(2) 서열 40에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 40]
Figure pct00052
(2) 서열 41에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..31)
(xi) 서열 기술:
[서열 41]
Figure pct00053
(2) 서열 42에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 42]
Figure pct00054
(2) 서열 43에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..24)
(xi) 서열 기술:
[서열 43]
Figure pct00055
(2) 서열 44에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 44]
Figure pct00056
(2) 서열 45에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..24)
(xi) 서열 기술:
[서열 45]
Figure pct00057
(2) 서열 46에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 46]
Figure pct00058
(2) 서열 47에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..27)
(xi) 서열 기술:
[서열 47]
Figure pct00059
(2) 서열 48에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 33 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..33)
(xi) 서열 기술:
[서열 48]
Figure pct00060
(2) 서열 49에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 49]
Figure pct00061
(2) 서열 50에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..31)
(xi) 서열 기술:
[서열 50]
Figure pct00062
(2) 서열 51에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 51]
Figure pct00063
(2) 서열 52에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..26)
(xi) 서열 기술:
[서열 52]
Figure pct00064
(2) 서열 53에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 53]
(2) 서열 54에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..31)
(xi) 서열 기술:
[서열 54]
Figure pct00066
(2) 서열 55에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(xi) 서열 기술:
[서열 55]
Figure pct00067
(2) 서열 56에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 종류: 기타 핵산
(A) 서술: /desc="핵산"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: -
(B) 위치: 상보 가닥(1..27)
(xi) 서열 기술:
[서열 56]
Figure pct00068

Claims (9)

  1. 하기로 구성된 군으로 부터 선택된 mpl 리간드의 유사체:
    [Asn30, Thr32] mpl 리간드;
    [Asn82, Ala83] mpl 리간드;
    [Asn87, Thr89] mpl 리간드;
    [Asn53, Thr55] mpl 리간드;
    [Asn58, Thr60] mpl 리간드;
    [Asn30, Thr32, Asn120, Thr122] mpl 리간드;
    [Asn37, Gly38, Ser39] mpl 리간드;
    [Asn39, Ser41] mpl 리간드;
    [Asn54, Ser56] mpl 리간드;
    [Asn52, Thr54] mpl 리간드;
    [Asn55'(i), Thr57] mpl 리간드;
    [Asn81, Thr83] mpl 리간드;
    [Asn118, Ser120] mpl 리간드;
    [Asn30, Ser32, Asn120, Ser122] mpl 리간드;
    [Thr163, Asn164] mpl 리간드;
    [Asn30, Thr32, Asn120, Thr122, Asn55'(i), Thr57] mpl 리간드;
    [Asn30, Thr32, Asn55'(i), Thr57, Thr163, Asn164] mpl 리간드;
    [Asn55, Thr57] mpl 리간드;
    [Asn56] mpl 리간드;
    [Thr163, Asn164, Thr166] mpl 리간드;
    [Asn30, Thr32, Asn120, Thr122, Asn55, Thr57, Thr163, Asn164, Thr166] mpl 리간드;
    [Asn22] mpl 리간드;
    [Asn25] mpl 리간드;
    [Asn38, Thr40] mpl 리간드;
    [Asn86] mpl 리간드;
    [Asn92] mpl 리간드;
    [Asn120, Thr122] mpl 리간드;
    [Ser36, Asn38, Thr40] mpl 리간드;
    [Asn88, Thr90] mpl 리간드;
    [Asn23, Ser25] mpl 리간드;
    [Asn57, Ser59] mpl 리간드; 및
    [Asn119, Ser121] mpl 리간드.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 mpl 리간드가 하기로 구성된 군으로 부터 선택되는 mpl 리간드의 유사체:
    mpl 리간드 1-332 도 1의 아미노산 1-332
    mpl 리간드 1-199 도 1의 아미노산 1-199
    mpl 리간드 1-191 도 1의 아미노산 1-191
    mpl 리간드 1-183 도 1의 아미노산 1-183
    mpl 리간드 1-174 도 1의 아미노산 1-174
    mpl 리간드 1-163 도 1의 아미노산 1-163
    mpl 리간드 1-153 도 1의 아미노산 1-153
    mpl 리간드 1-152 도 1의 아미노산 1-152
    mpl 리간드 1-151 도 1의 아미노산 1-151
    mpl 리간드 7-332 도 1의 아미노산 7-332
    mpl 리간드 7-199 도 1의 아미노산 7-199
    mpl 리간드 7-191 도 1의 아미노산 7-191
    mpl 리간드 7-183 도 1의 아미노산 7-183
    mpl 리간드 7-174 도 1의 아미노산 7-174
    mpl 리간드 7-163 도 1의 아미노산 7-163
    mpl 리간드 7-153 도 1의 아미노산 7-153
    mpl 리간드 7-152 도 1의 아미노산 7-152
    mpl 리간드 7-151 도 1의 아미노산 7-151.
  3. 제 1항에 있어서, 진핵생물 세포에서 외인성 DNA 서열의 발현 생성물인 [Asn30, Thr32, Asn120, Thr122, Asn55, Thr57, Thr163, Asn164, Thr166] mpl 리간드 1-174; 또는 [Asn30, Thr32, Asn120, Thr122, Asn55, Thr57, Thr163, Asn164, Thr166] mpl 리간드 1-199인 유사체.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 진핵생물 세포가 포유류인 유사체.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 포유류 세포가 CHO인 유사체.
  6. (a) mpl 리간드중의 O-결합된 탄화수소 부위가 N-결합된 탄화수소 부위로 치환되거나; (b) mpl 리간드중의 N-결합된 탄화수소 부위가 O-결합된 탄화수소 부위로 치환되거나; (c) mpl 리간드중의 O-결합된 탄화수소 부위가 상이한 O-결합된 탄화수소 부위로 치환되거나; 또는 (d) mpl 리간드중의 N-결합된 탄화수소 부위가 상이한 N-결합된 탄화수소 부위로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 mpl 리간드의 유사체.
  7. 제 1항, 제 2항 및 제 3항 내지 제 6항중 어느 하나에 따른 mpl 리간드의 유사체를 코딩하는 DNA 서열.
  8. 숙주 세포가 mpl 리간드의 유사체를 발현하도록 제 7항에 따른 DNA 서열로 형질감염된 진핵생물 숙주 세포.
  9. 제 1항, 제 2항 및 제 3항 내지 제 6항중 어느 하나에 따른 치료 유효량의 mpl 리간드 유사체 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 보조제 또는 담체를 포함하는 혈소판감소증 치료용 조성물.
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US08/591,070 1996-02-09
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6066318A (en) * 1995-10-05 2000-05-23 G.D. Searle & Co. Multi-functional hematopoietic fusion proteins between sequence rearranged C-MPL receptor agonists and other hematopoietic factors
US20030228666A1 (en) * 1998-06-30 2003-12-11 Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd. Novel human thrombopoietin mutein
CA2382547A1 (en) * 1999-09-21 2001-03-29 Stephen R. Hanson Methods and compositions for treating platelet-related disosders
US20040028661A1 (en) * 2002-08-07 2004-02-12 Bartelmez Stephen H. Expansion of cells using thrombopoietin and anti-transforming growth factor-beta
EP1670821A4 (en) * 2003-10-09 2006-11-29 Daewoong Co Ltd PROCESS FOR THE PURIFICATION OF HUMAN THROMBOPOIETIN WITH A HIGH SIALIC ACID CONTENT
AU2006295340B2 (en) * 2005-08-05 2010-11-11 Amgen Inc. Stable aqueous protein or antibody pharmaceutical formulations and their preparation
US7879318B2 (en) * 2006-01-23 2011-02-01 Mcw Research Foundation, Inc. Method of reducing the effects of ischemia by administration of a thrombopoietin receptor ligand

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH101995A (ja) * 1996-07-04 1998-01-06 Nippon Soda Co Ltd トイレ排水管のスケール防止方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5218092A (en) * 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
US5217881A (en) * 1989-04-25 1993-06-08 Immunex Corporation Hyperglycosylated cytokine conjugates
KR100263845B1 (ko) * 1989-10-13 2000-08-16 스튜어트 엘.왓트 에리트로포이에틴 동형체와 그의 제조방법 및 그를 포함하는제약학적 조성물
ZA946122B (en) * 1993-08-17 1995-03-20 Amgen Inc Erythropoietin analogs
SG47030A1 (en) * 1994-01-03 1998-03-20 Genentech Inc Thrombopoietin
DE19500030A1 (de) * 1994-01-03 1995-07-06 Genentech Inc Thrombopoietin
SG79882A1 (en) * 1994-02-14 2001-04-17 Kirin Brewery Protein having tpo activity
WO1995021919A2 (en) * 1994-02-14 1995-08-17 Kirin Brewery Company, Limited Protein having tpo activity
CN1148408A (zh) * 1994-02-14 1997-04-23 津莫吉尼蒂克斯公司 血细胞生成蛋白及其制造材料和方法
EE9600121A (et) * 1994-03-31 1997-04-15 Amgen Inc. Megakarüotsüütide kasvu ja diferentseerumist stimuleerivad kompositsioonid ja meetodid
AU4163196A (en) * 1994-11-30 1996-06-19 Zymogenetics Inc. Low molecular weight thrombopoietin
EP0807181A1 (en) * 1995-02-03 1997-11-19 G.D. Searle & Co. NOVEL c-MPL LIGANDS

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH101995A (ja) * 1996-07-04 1998-01-06 Nippon Soda Co Ltd トイレ排水管のスケール防止方法

Also Published As

Publication number Publication date
US7399833B1 (en) 2008-07-15
TW420688B (en) 2001-02-01
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TW480272B (en) 2002-03-21
US5696250A (en) 1997-12-09
US5756083A (en) 1998-05-26

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