CN114617903B - 一种用于血浆冻干的组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于血浆冻干的组合物，所述的组合物包括冻干前的保护剂及冻干后的pH调节剂。本发明优化了冻干血浆的制备工艺，如制备温度、保护剂及pH调节剂的种类和浓度，使得冻干后血浆中总蛋白、纤维蛋白原以及大部分凝血因子的保持率维持在较高水平；本发明的冻干血浆有着良好的稳定性和安全性，具有保存时间长、便于运输、适于应急救援和战时使用方便的优点。
Description
技术领域
本发明涉及血浆制品领域，特别涉及一种用于血浆冻干的组合物及其应用。
背景技术
鉴于新鲜冰冻血浆在保存(-20℃)和运输(冷链)方面存在的一系列问题，无法满足特殊环境及边远地区紧急救护的需要，冻干血浆成为创伤休克复苏救治中新鲜冰冻血浆的理想替代品。与新鲜冰冻血浆相比，冻干血浆的基本成分与其相同(包括冻干后总蛋白、纤维蛋白原和大部分凝血因子)，冻干血浆可以在10℃以下保存，25℃以下运输，不需要庞大的低温冷链设备。在使用前冻干血浆复溶迅速，而新鲜冰冻血浆至少需要30分钟的融化时间，这将极大提高救治效率。在无法获得融化血浆的情况下，可以用于重大事故或自然灾害的紧急救护中。
但如何保护冻干血浆中的蛋白及凝血因子活性及pH值稳定也成为了亟待解决的问题。
专利01106637.7公开的冻干血浆的制备方法，加入了保护剂，冻干前需进行低温旋冻，纤维蛋白原和一些主要凝血因子的回收率达65％。
专利02103960.7公开的血浆冻干程序中在冻干前进行低温旋冻，总时长达100～120小时，且未对制备获得的冻干血浆中血浆蛋白活性进行描述。
现有技术无法保证在冻干后复溶血浆中的活性蛋白有着较高的保持率的同时，还能使血浆pH能够调整到合适的范围内，从而保证受血者的电解质和血气维持在稳定状态，并且现有技术中冻干血浆的制备方法一般需在冻干前进行低温旋冻，然而在冻干前进行旋冻一是增加操作难度，二是可能会产生外来病原体污染。
发明内容
本发明克服了现有技术的缺陷，提供了一种血浆的处理方法及保护剂和/或调节剂在冻干血浆中的应用。
本发明的第一方面提供了一种血浆的处理方法，所述的处理方法包括血浆的冻干处理步骤和冻干血浆的复溶处理步骤，所述血浆的冻干处理步骤包括向血浆中加入保护剂，所述的复溶处理步骤包括将冻干血浆与复性液混合得到混合溶液，用复性液调节混合溶液的pH值，所述的用复性液调节混合溶液的pH值指调节混合溶液的pH值为7.2～7.6，所述的复性液包括pH调节剂和纯水。
进一步地，所述的用复性液调节混合溶液的pH值指调节混合溶液的pH值为为7.3～7.5，优选为7.35～7.45。
进一步地，所述的保护剂为甘露醇，所述甘露醇在血浆中的浓度为0.02g/mL～0.1g/mL(如0.02g/mL、0.025g/mL、0.03g/mL、0.035g/mL、0.04g/mL、0.045g/mL、0.05g/mL、0.055g/mL、0.06g/mL、0.065g/mL、0.07g/mL、0.075g/mL、0.08g/mL、0.085g/mL、0.09g/mL、0.095g/mL、0.1g/mL)，优选地，所述甘露醇在血浆中的浓度为0.02g/mL～0.06g/mL，更优选地，所述的甘露醇浓度为0.025g/mL。
进一步地，所述的pH调节剂为磷酸盐缓冲对(PBS)。
进一步地，所述的复性液的浓度为32～38mg/mL(如32mg/mL、32.5mg/mL、33mg/mL、33.5mg/mL、34mg/mL、34.5mg/mL、35mg/mL、35.5mg/mL、36mg/mL、36.5mg/mL、37mg/mL、37.5mg/mL、38mg/mL)，优选为35.35mg/mL。
进一步地，所述的磷酸盐缓冲对(PBS)由下列成分组成：
氯化钠、氯化钾、磷酸一氢二钠、磷酸二氢钾。
进一步地，所述的复性液中含有的氯化钠的浓度为25～30mg/mL、氯化钾浓度为0.5～1.5mg/mL、磷酸一氢二钠浓度为2～8mg/mL、磷酸二氢钾0.5～1.5mg/mL，优选地，所述的复性液中含有的氯化钠的浓度为26～29mg/mL、氯化钾浓度为0.5～1.0mg/mL、磷酸一氢二钠浓度为3～7mg/mL、磷酸二氢钾0.6～1.2mg/mL，更优选地，所述的复性液中含有的氯化钠的浓度为28.6mg/mL、氯化钾浓度为0.7mg/mL、磷酸一氢二钠浓度为5.15mg/mL、磷酸二氢钾0.85mg/mL。
在本发明的一个实施方式中，所述的复性液的配制可以为：在200ml纯水中加入质量为7.07g的磷酸盐缓冲对用作复性液，所述的7.07g磷酸盐缓冲对由5.72g NaCl、0.14gKCl、1.03gNa2HPO4、0.17g KH2PO4构成。
进一步地，所述血浆的冻干处理步骤前还包括血浆的预处理步骤，所述的预处理步骤为：
(1)采集全血置于血袋中；
(2)在一定温度下，将步骤(1)所述的全血进行离心处理，使血液中的血浆与红血细胞分离，得到血浆。
进一步地，步骤(2)所述的温度为0～8℃，优选为2～5℃，更优选为4℃。
进一步地，所述血袋中含有红细胞保存液，所述的红细胞保存液包括枸橼酸、枸橼酸钠、葡萄糖、磷酸二氢钠、腺嘌呤、氯化钠、甘露醇。
进一步地，所述的红细胞保存液中枸橼酸的浓度为0.1～0.5mg/mL(如0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL)、枸橼酸钠的浓度为1.0～2.0mg/mL(如1.0mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.7mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL、2.0mg/mL)、葡萄糖的浓度为5.0～10.0mg/mL(如5.0mg/mL、5.5mg/mL、6.0mg/mL、6.5mg/mL、7.0mg/mL、7.5mg/mL、8.0mg/mL、8.5mg/mL、9.0mg/mL、9.5mg/mL、10.0mg/mL)、磷酸二氢钠的浓度为0.5～1.5mg/mL(如0.5mg/mL、0.55mg/mL、0.6mg/mL、0.65mg/mL、0.7mg/mL、0.75mg/mL、0.8mg/mL、0.85mg/mL、0.9mg/mL、0.95mg/mL、1.0mg/mL、1.05mg/mL、1.5mg/mL)、腺嘌呤的浓度为0.05～0.5mg/mL(如0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL、0.10mg/mL、0.11mg/mL、0.12mg/mL、0.13mg/mL、0.14mg/mL、0.15mg/mL、0.16mg/mL、0.17mg/mL、0.18mg/mL、0.19mg/mL、0.20mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL、0.35mg/mL、0.40mg/mL、0.45mg/mL、0.5mg/mL)、氯化钠的浓度为3.0～6.0mg/mL(如3.0mg/mL、3.5mg/mL、4.0mg/mL、4.5mg/mL、4.6mg/mL、4.7mg/mL、4.8mg/mL、4.9mg/mL、5.0mg/mL、5.1mg/mL、5.2mg/mL、5.3mg/mL、5.4mg/mL、5.5mg/mL、6.0mg/mL)、甘露醇的浓度为10.0～20.0mg/mL(如10.0mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、13.5mg/mL、14mg/mL、14.1mg/mL、14.2mg/mL、14.3mg/mL、14.4mg/mL、14.5mg/mL、14.6mg/mL、14.7mg/mL、14.8mg/mL、14.9mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL)，优选地，所述的红细胞保存液中枸橼酸的浓度0.2mg/mL、枸橼酸钠的浓度为1.5mg/mL、葡萄糖的浓度为7.93mg/mL、磷酸二氢钠的浓度为0.94mg/mL、腺嘌呤的浓度为0.14mg/mL、氯化钠的浓度为4.97mg/mL、甘露醇的浓度为14.57mg/mL。
进一步地，所述的冻干处理步骤还包括将经保护剂处理过的血浆在大气压下首先按如下降温步骤进行降温：
首先降温至-5～5℃并维持20～40min；
之后降温至-10～-30℃并维持20～40min；
再降温至-60～-50℃并维持800～1000min；
再按如下升温步骤进行升温并同时进行抽真空步骤：
首先升温至-45～-35℃并维持400～600min；
再升温至-33～-25℃并维持900～1200min；
再升温至-20～-5℃并维持1200～1800min；
再升温至-3～3℃并维持1800～2200min；
再升温至5～12℃并维持800～1200min；
再升温至13～18℃并维持1300～1700min；
再升温至19～25℃并维持800～1200min；
抽真空后的真空度为0～5Pa(如0Pa、1Pa、2Pa、3Pa、4Pa、5Pa)，
优选地，所述的冻干处理步骤还包括将经保护剂处理过的血浆在大气压下首先按如下降温步骤进行降温：
首先降温至0℃并维持30min；
之后降温至-20℃并维持30min；
再降温至-55℃并维持900min；
再按如下升温步骤进行升温并同时进行抽真空步骤：
首先升温至-40℃并维持500min；
再升温至-30℃并维持1000min；
再升温至-10℃并维持1500min；
再升温至0℃并维持2000min；
再升温至10℃并维持1000min；
再升温至15℃并维持1500min；
再升温至20℃并维持1000min；
抽真空后的真空度为0～3Pa。
本发明第二方面提供了一种保护剂和/或pH调节剂在冻干血浆中的应用，所述的保护剂为甘露醇，所述的调节剂为为磷酸盐缓冲对(PBS)，所述的保护剂和/或pH调节剂可以使冻干后血浆中总蛋白(TP)的保持率达60g/L以上(如60g/L、61g/L、62g/L、63g/L、64g/L、64.5g/L、65g/L、66g/L、67g/L、68g/L、69g/L、70g/L)，使冻干后血浆中纤维蛋白原(FIB)的保持率达2.8g/L以上(如2.8g/L、2.85g/L、2.9g/L、2.95g/L、2.99g/L、3.0g/L)，使冻干后血浆中凝血因子Ⅴ(FⅤ)的保持率达88％以上(如88％、88.5％、89％、89.5％、89.7％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％)，使冻干后血浆中凝血因子Ⅷ(FⅧ)的保持率达82％以上(如82％、82.5％、83％、83.4％、83.5％、84％)。
本发明在冻干血浆的制备过程中加入了适量保护剂，提高了血浆中的蛋白及凝血因子在冷冻干燥和储存时的稳定性；在冻干血浆复溶的过程中还使用了pH调节剂作为复性液调节其酸碱度，有效解决了冻干血浆在冻干过程中二氧化碳气体从血浆中逸出导致的血浆pH偏高的问题；本发明优化了冻干血浆的制备工艺，如制备温度、保护剂及pH节剂的种类和浓度，使得冻干后血浆中总蛋白、纤维蛋白原以及大部分凝血因子的保持率维持在较高水平；本发明的冻干血浆有着良好的稳定性和安全性，具有保存时间长、便于运输、适于战备使用方便的优点。
附图说明
图1为不同浓度甘氨酸对冻干血浆蛋白的保护作用。
图2为不同浓度甘露醇对冻干血浆蛋白的保护作用。
图3为不同质量的pH调节剂对冻干血浆pH值的影响。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
以下实施例中所述的甘露醇D-M(macklin)的浓度，如1％、2.5％、5％等，对应地，具体指的是每100mL血浆中含有甘露醇1g、2.5g、5g，即0.01g/mL、0.025g/mL、0.05g/mL。
实施例1
本发明利用Pilot3-6冷冻干燥机(博医康实验仪器，北京)开展中试化血浆冻干关键技术研究，经过不断调整冻干工艺，通过大量的实验研究，最终确定200ml每瓶冻干血浆冻干工艺如表1：
表1
即将经保护剂处理过的血浆在大气压下首先按如下降温步骤进行降温：
首先降温至0℃并维持30min；
之后降温至-20℃并维持30min；
再降温至-55℃并维持900min；
再按如下升温步骤进行升温并同时进行抽真空步骤：
首先升温至-40℃并维持500min；
再升温至-30℃并维持1000min；
再升温至-10℃并维持1500min；
再升温至0℃并维持2000min；
再升温至10℃并维持1000min；
再升温至15℃并维持1500min；
再升温至20℃并维持1000min。
在此冻干工艺下，申请人采用不同浓度甘氨酸(sigma)(0、15、30mM)作为保护剂对冻干血浆蛋白的保护作用进行研究，结果如图1，申请人发现三个不同浓度的甘氨酸对纤维蛋白原(Fib)、凝血因子Ⅴ(FⅤ)、凝血因子Ⅷ(FⅧ)的保护作用差异无统计学意义(p>0.05)。
申请人采用不同浓度甘露醇D-M(macklin)(2.5％、5％)作为保护剂继续在上述冻干工艺条件下对冻干血浆蛋白的保护作用进行研究，结果如图2，申请人发现5％D-M组在FⅧ保持率上，差异有统计学意义(p<0.05)，说明5％D-M对FⅧ在血浆冻干过程中有保护作用。
pH申请人采用将pH调节剂预先加入复性液中的方式，调节冻干后血浆pH。
申请人先后选择了柠檬酸(sigma)，盐酸(sigma)，抗坏血酸(sigma)和磷酸盐缓冲对PBS(biosharp)作为备选pH调节剂，经过实验研究发现，柠檬酸，盐酸，抗坏血酸均会导致血浆蛋白变形析出，形成絮状沉淀，对血浆蛋白保持率造成影响的同时也会极大地增加输注者形成血栓的风险，而磷酸盐缓冲对无此种现象发生，因此最终选择磷酸盐缓冲对作为pH调节剂。
申请人研究了不同添加量的pH调节剂对冻干后血浆pH的调节作用，设置四个添加了不同质量pH调节剂的实验组(control：0g、groupA：6.06g、groupB：7.07g、groupC：8.08g)，结果如图3所示，groupB组血浆pH被调整到正常范围(7.35-7.45)，因此，最终确定将7.07g磷酸盐缓冲对添加到200ml复性纯水中作为复性液，用以调节冻干后血浆pH到正常水平。
为研究冻干保护剂和pH调节剂之间可能存在的相互作用对血浆冻干过程中活性物质的影响，申请人设计了三个影响因素(制备温度、甘露醇浓度、磷酸盐缓冲对质量)进行正交设计，观察各因素对冻干后血浆活性蛋白保持率的影响，每个因素设置三个水平：温度(4℃、22℃、37℃)、甘露醇浓度(1％、2.5％、5％)、磷酸盐缓冲对质量(3.535g、7.07g、10.605g)，检测冻干后血浆中总蛋白(TP)、纤维蛋白原(FIB)、凝血因子Ⅴ(FⅤ)、凝血因子Ⅷ(FⅧ)的保持率，用正交表L9(34)进行3X3正交设计，确定最佳生产方案。表2～5为三种因素对血浆中总蛋白(TP)的影响；
表2
a.决定系数＝.800(校正决定系数＝.201)
表3
表4
表5
表6～9为三种因素对纤维蛋白原(FIB)的影响；
表6
表7
表8
表9
表10～13为三种因素对凝血因子V(FV)的影响；
表10
a.决定系数＝.960(校正决定系数＝.839)
表11
表12
表13
表14～17为三种因素对凝血因子VIII(FVIII)的影响。
表14
a.决定系数＝.912(校正决定系数＝.648)
表15
表16
表17
正交试验结果如表18：
表18.正交实验结果
从制备工艺的角度，申请人发现对TP的影响，A>B>C，最佳水平为A1B2C2；对FIB的影响，A>B>C，最佳水平为A1B2C3；对凝血因子Ⅴ(FⅤ)的影响，A>C>B,最佳水平为A1B2C1；对凝血因子Ⅷ(FⅧ)的影响，A>C>B，最佳水平为A1B2C2。
申请人从制备工艺的角度，，选择了活性蛋白保持率最高的组合确定为最终的中试化生产标准，因此，选择A1B2C2组为最终生产标准，即血浆在4℃下制备，添加2.5％D-M后冻干；200ml纯水加入7.07g磷酸盐缓冲对作为复性液。
Claims (5)
1.一种血浆的处理方法，其特征在于，所述的处理方法包括血浆的冻干处理步骤和冻干血浆的复溶处理步骤，所述血浆的冻干处理步骤包括向血浆中加入保护剂，所述的复溶处理步骤包括将冻干血浆与复性液混合得到混合溶液，用复性液调节混合溶液的pH值，所述的复性液包括pH调节剂和纯水；
所述的保护剂为甘露醇；
所述的甘露醇在血浆中的浓度为0.02g/mL~0.06g/mL；
所述的冻干处理步骤还包括将经保护剂处理过的血浆在大气压下首先按如下降温步骤进行降温：
首先降温至-5~5℃并维持20~40min；
之后降温至-10~-30℃并维持20~40min；
再降温至-60~-50℃并维持800~1000min；
再按如下升温步骤进行升温并同时进行抽真空步骤：
首先升温至-45~-35℃并维持400~600min；
再升温至-33~-25℃并维持900~1200min；
再升温至-20~-5℃并维持1200~1800min；
再升温至-3~3℃并维持1800~2200min；
再升温至5~12℃并维持800~1200min；
再升温至13~18℃并维持1300~1700min；
再升温至19~25℃并维持800~1200min；
抽真空后的真空度为0~5Pa；
所述的pH调节剂由下列成分组成：氯化钠、氯化钾、磷酸一氢二钠、磷酸二氢钾；
所述的复性液中含有的磷酸一氢二钠浓度为3~7mg/mL、磷酸二氢钾浓度为0.6~1.2mg/mL；
所述血浆的冻干处理步骤前还包括血浆的预处理步骤，所述的预处理步骤为：
(1)采集全血置于血袋中；
(2)在一定温度下，将步骤(1)所述的全血进行离心处理，使血液中的血浆与红血细胞分离，得到血浆；步骤(2)所述的温度为2～5℃。
2.权利要求1所述的一种血浆的处理方法，其特征在于，所述甘露醇在血浆中的浓度为0.025g/mL。
3.权利要求1所述的一种血浆的处理方法，其特征在于，所述复性液中含有的磷酸一氢二钠浓度为5.15 mg/mL、磷酸二氢钾浓度为0.85 mg/mL。
4.权利要求1所述的一种血浆的处理方法，其特征在于，所述冻干处理步骤还包括将经保护剂处理过的血浆在大气压下首先按如下降温步骤进行降温：
首先降温至0℃并维持30min；
之后降温至-20℃并维持30min；
再降温至-55℃并维持900min；
再按如下升温步骤进行升温并同时进行抽真空步骤：
首先升温至-40℃并维持500min；
再升温至-30℃并维持1000min；
再升温至-10℃并维持1500min；
再升温至0℃并维持2000min；
再升温至10℃并维持1000min；
再升温至15℃并维持1500min；
再升温至20℃并维持1000min；
抽真空后的真空度为0~3Pa。
5.一种保护剂和pH调节剂在提高冻干后血浆中总蛋白和纤维蛋白原保持率的应用，所述的保护剂为甘露醇，所述的pH调节剂由下列成分组成：5.72g氯化钠、0.14g氯化钾、1.03g磷酸一氢二钠、0.17g磷酸二氢钾，所述的甘露醇在血浆中的浓度为0.025g/mL，血浆在4℃下制备，添加0.025g/mL甘露醇后冻干；200ml纯水加入所述的pH调节剂作为复性液；所述的保护剂和pH调节剂使冻干后血浆中总蛋白的保持率达60g/L以上，使冻干后血浆中纤维蛋白原的保持率达2.8g/L以上，使冻干后血浆中凝血因子Ⅴ的保持率达88%以上，使冻干后血浆中凝血因子Ⅷ的保持率达82%以上。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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