ES2349348T3 - Anticuerpos neutralizantes de rsv de ultra alta afinidad. - Google Patents

Abstract

Una inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad aislada que se une específicamente con una constante de afinidad (Ka) de al menos 10 10 M -1 , al mismo epítopo de un antígeno F de virus sincitial respiratorio (RSV, del inglés "Respiratory Syncytial Virus")como un anticuerpo compuesto de una región variable de la cadena pesada (VH) que tiene la secuencia de aminoácidos SEC. ID. Nº: 2 (Figura 1B) y una región variable de la cadena ligera (VL) que tiene la secuencia de aminoácidos SEC. ID. Nº: 1 (Figura 1A), donde la inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad comprende una o más sustituciones de residuo de aminoácidos en una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs, del inglés "Complementary Determining Regions") en comparación con un anticuerpo existente que comprende: (i) una VL que comprende las siguientes secuencias de CDR: (SEC. ID. Nº: 3), (SEC. ID. Nº: 4), y (SEC. ID. Nº: 5) y (ii) una VH que comprende las siguientes secuencias de CDR: (SEC. ID. Nº: 6), (SEC. ID. Nº: 7), y (SEC. ID. Nº: 8), en las que dichas sustituciones de residuos de aminoácidos se realizan en las posiciones enmarcadas, y dichas una o más sustituciones de aminoácidos tienen el efecto de producir un incremento en la Ka en comparación con el anticuerpo existente.

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a novedosos anticuerpos neutralizantes de ultra alta afinidad.

La frecuencia actual de infección causada por la resistencia o dificultad de controlar los microbios ha creado una necesidad de solicitudes más nuevas para controlar dichos organismos, así como para tratar aquellos ya infectados.

Entre los agentes infecciosos más difíciles de controlar y tratar están los virus. Por ejemplo, el virus sincitial respiratorio (RSV, del inglés “Respiratory Syncytial Virus”) es la principal causa de enfermedades

respiratorias

agudas en niños jóvenes ingresados en

hospitales

y la principal causa de infección de tracto

respiratorio

inferior en niños jóvenes. Un obstáculo

principal para producir una vacuna eficaz contra dichos agentes como RSV ha sido la cuestión de la seguridad. A la inversa, se ha demostrado algún valor en el uso de inmunoglobulinas contra dichos agentes víricos. Por ejemplo, los estudios han demostrado que la inmunoglobulina de RSV altamente titrada era eficaz tanto en profilaxis como en terapia para infecciones por RSV en modelos animales.

Una solicitud alternativa ha sido el desarrollo de anticuerpos, especialmente anticuerpos monoclonales neutralizantes, con alta actividad neutralizante específica. Otra desventaja a esta vía ha sido la necesidad de producir anticuerpos humanos más que aquellos de ratón o rata y minimizar así el desarrollo de repuestas a anticuerpo anti-ratón o anti-rata humano, lo cual potencialmente da como resultado otra patología inmune.

Una solicitud alternativa ha sido la producción de anticuerpos quiméricos de murina humanos en los cuales los

genes que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera de ratón se han acoplado a los genes para las regiones constantes de la cadena pesada y ligera humanas para producir anticuerpos quiméricos, o híbridos.

En algunos casos, se han injertado CDRs de ratón sobre regiones framework y constantes humanas con alguno de los aminoácidos framework de ratón que están sustituidos por aminoácidos humanos correspondientemente colocados para proporcionar un anticuerpo “humanizado”. [Queen, U.S. Pat. Nº 5.693.761 y 5.693.762]. Sin embargo, dichos anticuerpos contienen regiones CDR de ratón intactas y se han encontrado con eficacia mezclada, produciendo afinidades con frecuencia no mayores de 107 a 108 M-1

Se ha preparado un anticuerpo anti-RSV humanizado con buena afinidad y actualmente se está comercializando. [Véase: Johnson, U.S. Pat. Nº 5.824.307]

La producción de anticuerpos de ultra alta afinidad debería ser deseable desde el punto de vista de tanto la capacidad neutralizante de dicho anticuerpo así como de los aspectos más prácticos de necesidad de producir menos anticuerpo para alcanzar un grado deseable de eficacia clínica, de ese modo cortando los costes de producción y/o permitiendo un mayor grado de eficacia clínica para la administración en el mismo volumen.

BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad aislada de acuerdo con la reivindicación 1, y composiciones de acuerdo con la reivindicación 26. La invención además proporciona usos de dichas composiciones, medicamentos y anticuerpos para tratar o prevenir una enfermedad causada por RSV tal como se detalla en las reivindicaciones 27-39.

La presente invención se refiere a anticuerpos neutralizantes de alta afinidad y fragmentos activos de los mismos que presentan constantes de afinidad de al menos 1010 M-1, e incluso 1011 M-1, y más específicamente a dicha inmunoglobulina monoclonal neutralizante, incluyendo anticuerpos y/o fragmentos de los mismos, donde el anticuerpo y/o fragmento tiene regiones constantes humanas.

La presente invención resuelve los problemas anteriormente mencionados mediante la proporción de anticuerpos neutralizantes de alta afinidad sin la presencia de regiones CDR de ratón intactas que causan reacciones de anticuerpo anti-ratón humano (HAMA, del inglés “Human Anti-Mouse Antibody”) y con actividad neutralizante de suficientemente alta afinidad para reducir el coste y la eficacia de la producción total.

Un aspecto de la presente invención se refiere a anticuerpos neutralizantes de alta afinidad con constantes M-1

de afinidad de al menos 1010 M-1, e incluso 1011 , y con especificidad hacia determinantes antigénicos específicos, tal como los presentados por proteínas expresadas por virus.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar dichos anticuerpos neutralizantes de alta afinidad con especificidad hacia un antígeno F de RSV, tal como donde dichos antígenos se expresan mediante células infectadas por RSV en un mamífero, especialmente un ser humano.

La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad, incluyendo los anticuerpos y/o fragmentos activos de los mismos, de la presente invención, y fragmentos activos de los mismos, son específicos para el antígeno F expresado por dicho RSV y también expresado sobre las superficies de células infectadas con RSV (la presencia de

dicho antígeno sobre la superficie celular causa fusión de las células en el sincitio).

Una inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad, incluyendo los anticuerpos y/o fragmentos activos de los mismos, de la presente invención se une al mismo epítopo de un antígeno F de RSV como el anticuerpo cuya cadena variable de la cadena ligera tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 1 (mostrada en la Figura 1A) y cuya cadena variable de la cadena pesada tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 2 (mostrada en la Figura 1B).

Es un objetivo de la presente invención proporcionar anticuerpos neutralizantes de ultra alta afinidad que tienen básicamente las regiones framework de la inmunoglobulina descrita en la Figura 1 (con la misma especificidad de esa inmunoglobulina, la cual es una estructura anticuerpo anti-RSV) pero donde las inmunoglobulinas, incluyendo los anticuerpos y fragmentos activos de los mismos, de la presente invención contienen una o más CDRs (regiones determinantes de complementariedad) cuyas secuencias de aminoácidos son independientes de aquellas en el dominado anticuerpo de referencia, aunque dichas secuencias pueden, en algunos casos, diferir por no más de un aminoácido y este se puede limitar a una diferencia en únicamente una de dichas regiones CDR.

Las novedosas inmunoglobulinas de la presente invención diferirán del anticuerpo de la Figura 1 (más adelante en la presente memoria, el “anticuerpo básico” o “anticuerpo de referencia” o “inmunoglobulina de referencia”) únicamente en las secuencias de una o más de las CDRs y, en la realización más preferida estas diferencias ocurren únicamente en CDRs L2, L3, H1 y H3.

Las realizaciones especialmente preferidas de la presente invención tienen las secuencias framework descritas en la Figura 1, que tienen así las secuencias variables de la cadena pesada y ligera descritas en las Figuras 3, 4, 5, 6 y 7.

En una realización, los anticuerpos neutralizantes de alta afinidad de la invención incluyen una región constante humana.

En una realización preferida, un anticuerpo neutralizante de RSV de alta afinidad de la invención, incluyendo fragmentos activos de los mismos, con una constante de afinidad (Ka) de al menos tan alta como 1010 M1, e incluso 1011 M-1, es una inmunoglobulina recombinante, tal como un anticuerpo o fragmento activo del mismo, que incluye una región constante humana y regiones framework para las cadenas pesadas y ligeras en las que al menos una porción del framework se deriva de un anticuerpo humano (o a partir de una secuencia consenso de una framework de anticuerpo humano), un ejemplo de dichas regiones framework descritas para las secuencias del anticuerpo de la Figura

1. En una realización, toda la framework se deriva de un anticuerpo humano (o una secuencia consenso humana).

En otra realización altamente específica, un anticuerpo neutralizante de RSV de alta afinidad, con una afinidad de al menos 1010 M-1, es un anticuerpo recombinante que tiene una región constante humana, una o más CDRs que se derivan de un anticuerpo no humano en el cual se cambia al menos uno de los aminoácidos en al menos una de las CDRs y en el cual toda o una porción de la framework se deriva de un anticuerpo humano (o una secuencia consenso de una framework de anticuerpo humano).

En una realización separada, una inmunoglobulina neutralizante humanizada que se une al mismo epítopo como el anticuerpo básico o de referencia o inmunoglobulina cuyas cadenas variables se muestran en la Figura 1, y que tiene una afinidad de al menos 1011 M-1, incluye al menos uno de los siguientes aminoácidos en las siguientes posiciones de las CDRs: una alanina en la posición 2 de CDR H1, una fenilalanina en la posición 6 de CDR H3, una fenilalanina en la posición 3 de CDR L2 y una fenilalanina en la posición 5 de CDR L3. Otras realizaciones comprenden otras sustituciones sencillas de aminoácidos en estas localizaciones.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar composiciones que comprendan las inmunoglobulinas descritas en la presente memoria en las que dichas estructuras están en suspensión en un diluyente o excipiente farmacológicamente aceptable.

Es un objetivo aún adicional de la presente invención proporcionar composiciones y medicamentos para prevenir y/o tratar virus sincitiales respiratorios, donde se tiene la intención que la composición/medicamento se administre a un paciente en riesgo del mismo, o aquejado del mismo, conteniendo dicha composición o medicamento una inmunoglobulina de la invención, tal como donde dichos anticuerpos presentan las propiedades de especificidad y afinidad descritas en la presente memoria para las inmunoglobulinas de la invención.

DEFINICIONES

El término “antígeno” se refiere a una estructura, con frecuencia un polipéptido o proteína, presente sobre la superficie de un microorganismo, tal como un virus, para el cual un anticuerpo tiene afinidad y especificidad.

El término “determinante antigénico” se refiere a un sitio de unión específico sobre una estructura antigénica para el cual una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo, tiene especificidad y afinidad. Por tanto, una partícula, tal como un virus, puede representar un antígeno pero puede tener sobre su superficie un número de sitios antigénicos separados y diferentes, tal como donde el virus tiene un número de proteínas de superficie diferentes y cada uno representa un sitio de unión potencial distinto para una inmunoglobulina.

El término “inmunoglobulina” se refiere a una proteína

o polipéptido que tiene especificidad y afinidad para un antígeno o determinante antigénico. Este término incluye anticuerpos, comúnmente representados como tetraméricos, así como fragmentos activos de los mismos, teniendo dichos fragmentos especificidad y afinidad para antígenos o determinantes antigénicos. Por tanto, “inmunoglobulina” tal como se usa en la presente memoria incluye los anticuerpos y todos los fragmentos activos de los mismos.

El término “anticuerpo” se refiere a una proteína o polipéptido que tienen afinidad para un determinante antigénico, normalmente uno encontrado sobre la superficie de un microorganismo, especialmente un virus. Tal como un anticuerpo está comúnmente compuesto de 4 cadenas y es por tanto tetramérico.

El término “inmunoglobulina neutralizante” o “anticuerpo neutralizante” se refiere a la capacidad de las inmunoglobulinas, incluyendo anticuerpos, de la presente invención para reducir la replicación de los

microorganismos,

especialmente virus, en organismos así

como

en cultivos celulares. Una indica ción de dicha

capacidad

son los datos de los ensayos de

microneutralización descritos a continuación en la presente

memoria. Dicha estructura normalmente tiene tanto regiones variables como constantes por lo cual las regiones variables son mayoritariamente responsables de determinar la especificidad del anticuerpo y comprenderán regiones determinantes de complementariedad(CDRs, del inglés “Complementarity Determining Regions”).

El término “región determinante de complementariedad”

o “CDR” se refiere a regiones variables de cadenas o bien H (pesadas) o L (ligeras) que contienen las secuencias de aminoácidos capaces de unirse específicamente a dianas antigénicas. Estas regiones CDR explican la especificidad básica del anticuerpo para una estructura determinante antigénica particular. Dichas regiones también se denominan “regiones hipervariables”.

El término “fragmento activo” se refiere a una porción de un anticuerpo que por sí mismo tiene alta afinidad para un determinante antigénico y contiene una o más CDRs que explican dicha especificidad. Ejemplos no limitantes incluyen Fab, F(ab)’2, dímeros de cadena pesada-ligera y estructuras de cadena sencilla, tal como una cadena ligera completa o cadena pesada completa.

El término “especificidad” se refiere a la capacidad de un anticuerpo de unirse con preferencia a un sitio antigénico contra un sitio antigénico diferente y no necesariamente implica alta afinidad.

El término “afinidad” se refiere al grado al cual un anticuerpo se une a un antígeno para cambiar el equilibrio de antígeno y anticuerpo hacia la presencia de un complejo formado por su unión. Por tanto, donde se combina un antígeno y anticuerpo en concentración relativamente igual, se unirá un anticuerpo de alta afinidad al antígeno disponible para cambiar el equilibrio hacia alta concentración del complejo resultante.

El término “constante de afinidad” se refiere a una constante de asociación usada para medir la afinidad de un anticuerpo por un antígeno. A mayor constante de afinidad mayor afinidad de la inmunoglobulina por el antígeno o determinante antigénico y viceversa. Una constante de afinidad es una constante de unión en unidades de molaridad recíproca. Dicha constante se calcula fácilmente a partir de las constantes de índice para las reacciones de asociación-disociación como las medidas por metodología cinética estándar para reacciones del anticuerpo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena ligera y pesada de un anticuerpo anti-RSV donde las regiones CDR están subrayadas mientras que los residuos no subrayados forman las regiones framework de las regiones variables de cada cadena. En este anticuerpo, las CDRs se derivan de un anticuerpo anti-RSV de ratón mientras que las regiones framework consisten mayoritariamente de secuencias derivadas de un anticuerpo humano. Para cada CDR, las localizaciones en las que se usaron las sustituciones de aminoácidos para conseguir las CDRs de alta afinidad y los anticuerpos descritos en la presente memoria están en negrita. De acuerdo con la descripción en la presente memoria, tales sustituciones estaban únicamente en las CDRs L2, L3, H1 y H3. La Figura 1A muestra la región variable de la cadena ligera y la Figura 1B muestra la región variable de la cadena pesada de las cadenas ligeras y pesadas, respectivamente. No se muestran las secuencias de la región constante. Estas secuencias están presentes en el clon básico (véase la Tabla 2), designado IX-493 a lo largo de esta descripción (es decir, SWSG-significando una serina (S) en la posición

clave (véase tablas 1 y 3) de CDR H1 de alta afinidad, un triptófano (W) en la posición clave de CDR H3 de alta afinidad, una serina (S) en la posición clave de CDR L2 de alta afinidad y una glicina (G) en la posición clave de CDR L3 de alta afinidad). Para los propósitos de esta descripción, este es el “anticuerpo de referencia”.

La Figura 2 muestra comparaciones de afinidad para un conjunto particular de clones beneficiosos o de alta afinidad. Las designaciones clonales están a la izquierda de la leyenda a la derecha del dibujo junto con las sustituciones indicadas en las CDRs H1, H3, L2 y L3 mostradas a la derecha de la leyenda. Las medidas son mediante ELISA (OD a 560 nm mostrada en el eje izquierdo). El clon L1FR representa los resultados para la estructura del anticuerpo de referencia de la Figura 1.

La Figura 3 muestra las regiones variables de la cadena pesada y ligera para la realización preferida del clon 1 (Tabla 2) de la invención descrita en la presente memoria. Las regiones CDR están subrayadas mientras que las diferencias de aminoácidos frente al anticuerpo de la Figura 1 están indicadas en negrita. Por tanto, este anticuerpo preferido (es decir, de alta afinidad) tiene varias de las CDRs de alta afinidad (Tabla 3) presentes que da lugar a mayor afinidad (por encima de 1010 M-1) que el anticuerpo básico o de referencia.

La Figura 4 muestra las regiones variables de la cadena pesada y ligera para la realización preferida del clon 2 (Tabla 2) de la invención descrita en la presente memoria. Las regiones CDR están subrayadas mientras que las diferencias de aminoácidos frente al anticuerpo de la Figura 1 están indicadas en negrita. Por tanto, este anticuerpo preferido (es decir, de alta afinidad) tiene varias de las CDRs de alta afinidad (Tabla 3) presentes que

dan lugar a mayor afinidad (por encima de 1010 M-1) que el anticuerpo básico o de referencia.

La Figura 5 muestra las regiones variables de la cadena pesada y ligera para la realización preferida del clon 3 (Tabla 2) de la invención descrita en la presente memoria. Las regiones CDR están subrayadas mientras que las diferencias de aminoácidos frente al anticuerpo de la Figura 1 están indicadas en negrita. Por tanto, este anticuerpo preferido (es decir, de alta afinidad) tiene varias de las CDRs de alta afinidad (Tabla 3) presentes que dan lugar a mayor afinidad (por encima de 1010 M-1) que el anticuerpo básico o de referencia.

La Figura 6 muestra las regiones variables de la cadena pesada y ligera para la realización más preferida del clon 22 (Tabla 4) de la invención descrita en la presente memoria. Las regiones CDR están subrayadas mientras que los cambios de aminoácidos frente al anticuerpo de la Figura 1 están indicados en negrita. Por tanto, este anticuerpo más preferido (es decir, de la más alta afinidad) tiene varias de las CDRs de alta afinidad (Tabla 3) presentes que dan lugar a mayor afinidad (por

encima

de 1011 M-1) que el anticuerpo básico o de

referencia).

La

Figura 7 muestra las regiones variables de la

cadena pesada y ligera para la realización preferida del clon 23 (Tabla 4) de la invención descrita en la presente memoria. Las regiones CDR están subrayadas mientras que los cambios de aminoácidos frente al anticuerpo de la Figura 1 están indicados en negrita. Por tanto, este anticuerpo preferido (es decir, de la más alta afinidad) tiene varias de las CDRs de alta afinidad (Tabla 3) presentes que dan

M-1)

lugar a mayor afinidad (por encima de 1011 que el anticuerpo básico o de referencia).

La Figura 8 muestra los resultados de los experimentos de microneutralización sobre varios de los clones de anticuerpo de ultra-alta afinidad descritos en la presente memoria. Los aminoácidos presentes en las posiciones clave de las regiones determinantes de complementariedad de alta afinidad (véase Tabla 3) se muestran a la derecha en orden H1, H3, L2 y L3 (tal como también se muestra en la Tabla 2 donde los clones están simplemente enumerados pero la tabla compara con esta figura contando con los actuales aminoácidos usados en las posiciones críticas tal como se describe en la Tabla y en la leyenda a la derecha de esta figura). Por tanto, para el clon 4D2-7, hay una alanina (A) en la posición clave de la CDR H1 de alta afinidad, una fenilalanina (F) en la posición clave de la CDR H3 de alta afinidad, una fenilalanina (F) en la posición clave de la CDR L2 de alta afinidad y una fenilalanina (F) en la posición clave de la CDR L3 de alta afinidad. En resumen, se añadieron aproximadamente 25.000 células HEp-2 a cada uno de los pocillos de una placa de 96 pocillos junto con RSV y una concentración dada del anticuerpo (la concentración de anticuerpo por célula se muestra en la abscisa-Véase el Ejemplo 2 para detalles exactos). Después de 5 días de crecimiento, se fijaron las células, se trataron con MAb anti-F biotinilado, a continuación se unieron al complejo avidina-peroxidasa y se determinó la capacidad de la peroxidasa unida a reaccionar con ácido tionitrobenzóico mediante la medición de O.D. a 450 nm. La cantidad de proteína F presente era un indicador del alcance de la replicación vírica de ese modo dando como resultado más reacción de substrato por peroxidasa y absorción incrementada. Por tanto, a menor valor de OD 450, mayor capacidad neutralizante de la concentración indicada del anticuerpo dado. En la presente memoria, IX-493 (SWSG

significando una serina (S) en la posición clave de la CDR H1 de alta afinidad, un triptófano (W) en la posición clave de la CDR H3 de alta afinidad, una serina (S) en la posición clave de la CDR L2 de alta afinidad y una glicina

(G) en la posición clave de la CDR L3 de alta afinidad) es el “anticuerpo de referencia” (también indicado como LIFR y IX493L1 FR).

La Figura 9 muestra los resultados para los ensayos de microneutralización de varios de los anticuerpos descritos en la presente memoria pero en los que únicamente se emplearon los fragmentos Fab para la neutralización de la replicación del anticuerpo. En la presente memoria, IX-493 (SWSG) es el fragmento Fab de referencia y se deriva del anticuerpo Medi-493 (véase: Johnson et al.(1997)-ref. 23).

La Figura 10 muestra los resultados de la microneutralización para un anticuerpo específico para RSV en comparación con experimentos similares para fragmentos Fab del mismo anticuerpo. En la presente memoria, Medi 493 representa el anticuerpo mientras que IX-493 LIFR representa el fragmento Fab de este anticuerpo. Las otras líneas son para fragmentos Fab de varios de los anticuerpos producidos de acuerdo con la presente invención (dados diversas designaciones de código de letra-dígito para la identificación interna pero no teniendo nada que hacer con su eficacia relativa como anticuerpos neutralizantes).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención está dirigida a anticuerpos neutralizantes de ultra alta afinidad y fragmentos activos de los mismos que tienen constantes de afinidad de al menos

M-1

1010 . Los fragmentos activos de estos anticuerpos son fragmentos que contienen al menos una región determinante de complementariedad (CDR) de alta afinidad.

Con la ventaja de los métodos de biología molecular y tecnología recombinante, en la actualidad es posible producir moléculas de anticuerpo mediante medios recombinantes y de ese modo generar secuencias de gen que codifiquen secuencias de aminoácidos específicos encontradas en la estructura de polipéptidos de los anticuerpos. Dichos anticuerpos se pueden producir o bien mediante clonación de las secuencias de gen que codifican las cadenas de polipéptidos de dichos anticuerpos o mediante síntesis directa de dichas cadenas de polipéptidos, con montaje in vitro de las cadenas sintetizadas para formar estructuras tetraméricas (H2L2) activas con afinidad para epítopos específicos y determinantes antigénicos. Esto ha permitido la producción fácil de los anticuerpos que tienen secuencias características de anticuerpos neutralizantes a partir de diferentes especies y fuentes.

Sin reparar en la fuente de las inmunoglobulinas, o

como

son construidas de manera recombinante, o como se

sintetizan,

in vitro o in vivo, usando animales

transgénicos,

tales como vacas, cabras y ovejas, usando

cultivos

celulares grandes de laboratorio o de tamaño

comercial, en bioreactores o mediante síntesis química directa empleando organismos no vivos en cualquier fase del proceso, todas las inmunoglobulinas tienen una estructura tridimensional completa similar. En el caso de un anticuerpo, con frecuencia esta estructura se da como H2L2 y se refiere al hecho de que los anticuerpos comúnmente comprenden 2 cadenas de aminoácidos ligeras (L) y 2 cadenas de aminoácidos pesadas (H). Ambas cadenas tienen regiones capaces de interactuar con una diana antigénica estructuralmente complementaria. Las regiones que interactúan con la diana se denominan regiones “variables”

o “V” y se caracterizan por diferencias en la secuencia de aminoácidos a partir de anticuerpos de diferente especificidad antigénica.

La región variable de las cadenas o bien H o L contiene las secuencias de aminoácidos capaces de unirse específicamente a dianas antigénicas. Dentro de estas secuencias son secuencias más pequeñas dobladas “hipervariables” debido a su variabilidad de extremo entre anticuerpos o fragmentos activos de especifidad que difiere. Dichas regiones hipervariables también se denominan “regiones determinantes de complementariedad” o

regiones

“CDR”. Estas regiones CDR explican la

especificidad

básica del anticuerpo para una estructura

determinante antigénica particular.

Las CDRs representan tramos no-contiguos de aminoácidos dentro de las regiones variables pero, sin reparar en las especies, las localizaciones posicionales de estas secuencias de aminoácidos críticas dentro de las regiones variables de la cadena pesada y ligera se han encontrado que tienen localizaciones similares dentro de las secuencias de aminoácidos de las cadenas variables. Las cadenas pesadas y ligeras variables de todos los anticuerpos canónicos tienen cada uno 3 regiones CDR, cada una no contigua con las otras (calificadas L1, L2, L3, H1, H2, H3) para las respectivas cadenas ligeras (L) y pesadas (H). Las regiones CDR aceptadas han sido descritas por Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977). En las figuras se muestra el esquema numérico, donde las CDRs están subrayadas y los números siguen el esquema de Kabat.

En todas las especies de mamíferos, los polipéptidos de anticuerpo contienen regiones constantes (es decir, altamente conservadas) y variables, y, dentro de las últimas, hay CDRs y las denominadas “regiones framework”

compuestas de secuencias de aminoácidos dentro de la región variable de la cadena pesada o ligera pero fuera de las CDRs.

Las inmunoglobulinas descritas de acuerdo con la presente invención proporcionan afinidad extremadamente alta (en el orden de 1010 M-1, e incluso 1011 M-1, para la constante de afinidad, o Ka, definida como una constante de asociación que describe la unión del anticuerpo y el antígeno como ligandos) para el antígeno F de proteínas de RSV expresadas en la superficie de RSV así como en las superficies de células infectadas con RSV. Los anticuerpos de alta afinidad de la presente invención son anticuerpos neutralizantes y por tanto reducen la replicación de RSV en organismos así como en cultivos celulares mientras que mantienen homología suficiente a las secuencias de aminoácidos del anticuerpo del recipiente para prevenir la patología inmunológica adversa. El último rasgo se consigue a través del uso de regiones constantes similares a aquellas del organismo recipiente, tal como un mamífero y lo más especialmente un ser humano. Este rasgo también se consigue a través del uso de secuencias de aminoácidos framework similares, si no idénticas, a aquellas encontradas en anticuerpos a partir del organismo recipiente. En el último caso, algunas sustituciones de aminoácidos se pueden realizar en las secuencias framework para facilitar y mantener la interacción de alta afinidad entre las CDRs novedosas de la presente invención y el antígeno para el cual dichos anticuerpos muestran especificidad.

Tal como se usa en la presente memoria, los términos tales como “anticuerpo” y “fragmento activo” o “fragmento” no se consideran limitantes en la determinación del completo alcance de la presente invención. Por tanto, el

hecho de que el término “anticuerpo” se usa más que “fragmento activo” o “inmunoglobulina” no se toma como una limitación sobre la invención o sus usos siempre que las propiedades requeridas de la especificidad y afinidad se presenten mediante dicha estructura.

De acuerdo con la invención descrita en la presente memoria, las constantes de afinidad que caracterizan las afinidades de los anticuerpos neutralizantes de alta afinidad, y fragmentos activos de los mismos, de la presente invención son constantes de asociación y se midieron mediante las cinéticas de formación del complejo antígeno-anticuerpo, con la constante de índice para la asociación para formar el complejo que se indica como Kassoc

o Kon y la constante de disociación que se indica Kdiss o Koff

La

medida de dichas constantes está bien dentro de la

habilidad

normal en la técnica y los detalles no se

describirán

más en la presente memoria excepto para la

metodología general y las condiciones específicas, donde sea apropiado, tal como se enumera en las ejemplos dados en la presente memoria para describir más la invención.

Se pueden conseguir los anticuerpos de alta afinidad de la presente invención, tal como ya se han descrito, a través de secuencias de gen de anticuerpo apropiado que se producen por ingeniería genética, es decir, secuencias de aminoácidos, mediante la colocación de las secuencias de nucleótidos apropiados y la expresión de estos en una línea celular adecuada. Se puede producir cualquiera de las secuencias de nucleótidos deseadas usando el método de mutagénesis basada en codón, tal como se ha descrito, por ejemplo, en los documentos de patentes U.S. Nº 5.264.563 y

5.523.388. Dichos procedimientos permiten la producción de cualquiera y todas las frecuencias de residuos de aminoácidos en cualquiera de las posiciones de codón

deseadas dentro de un oligonucleótido. Esto puede incluir completamente al azar sustituciones de cualquiera de los 20 aminoácidos en una posición deseada o en cualquier subconjunto específico de estos. Alternativamente, este proceso se puede llevar a cabo para conseguir una localización deseada de un aminoácido particular dentro de una cadena de aminoácidos, tal como las secuencias de CDR novedosas de acuerdo con la invención. En resumen, la secuencia de nucleótidos apropiada para expresar cualquier secuencia de aminoácidos deseada se puede conseguir fácilmente y usando tales procedimientos se pueden reproducir las secuencias de CDR novedosa de la presente invención. Esto da como resultado la capacidad de sintetizar polipéptidos, tales como anticuerpos, con cualquiera de las secuencias de aminoácidos deseadas. Por ejemplo, en la actualidad es posible determinar las secuencias de aminoácidos de cualquiera de los dominios deseados de un anticuerpo de elección y, opcionalmente, para preparar cadenas homólogas con uno o más aminoácidos sustituidos por otros aminoácidos deseados, para dar un intervalo de análagos sustituidos.

En la aplicación de dichos métodos, se aprecia que debido a la degeneración del código genético, dichos métodos como la síntesis de oligonucleótidos al azar y la síntesis de oligonucleótidos degenerados parciales incorporará redundancias para codones que especifican un residuo de aminoácidos particular en una posición particular, aunque dichos métodos se pueden usar para proporcionar un conjunto maestro de todas las secuencias de aminoácidos posibles y investigar estos para la función opcional como estructuras de anticuerpo o para otros propósitos. En Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

87:6378-6382 (1990) an Devlin et al., Science 249:404-406 (1990) se describen dichos métodos.

De acuerdo con la invención descrita en la presente memoria, se pueden generar variantes de anticuerpo aumentadas mediante la combinación en una estructura sencilla de polipéptido una, dos o más novedosas secuencias de CDR de acuerdo con la invención, cada una mostró que de manera independiente da como resultado actividad de unión aumentada. De esta manera, se pueden combinar varias novedosas secuencias de aminoácidos dentro de un anticuerpo, en las mismas o diferentes CDRs, para producir anticuerpos de alta afinidad dentro de la presente invención. Por ejemplo, se pueden emplear 3 de dichas novedosas secuencias de CDR e investigar los anticuerpos resultantes para la afinidad para una estructura antigénica particular, tal como el antígeno F o RSV. Por tanto, el resultado completo sería un proceso interactivo de combinación de diversas sustituciones sencillas de aminoácidos e investigación de los anticuerpos resultantes para la afinidad antigénica de una manera paso a paso. Se usaron tales métodos para preparar algunos de los anticuerpos plasmados dentro de la presente invención. Dichos métodos también representan una manera conveniente, si tediosa, de optimizar las secuencias de anticuerpo de la presente invención, especialmente las secuencias de las regiones CDR de dichos anticuerpos.

Usando las secuencias novedosas y los métodos de la presente invención, dicha solicitud evita el tiempo y el gasto de generar e investigar todas las permutaciones y combinaciones posibles de la estructura de anticuerpo en un esfuerzo de encontrar el anticuerpo con la máxima eficacia. A la inversa, la completa realización al azar de un único residuo CDR de 10 aminoácidos generará por encima de 10

trillones de variantes, un número virtualmente imposible para investigar.

Este método interactivo se puede usar para generar sustituciones de aminoácidos dobles y triples en un proceso en etapas para ampliar la investigación de anticuerpos que tienen mayor afinidad.

A la inversa, se debería reconocer que no todas las localizaciones dentro de las secuencias de los diferentes dominios del anticuerpo pueden ser iguales. Las sustituciones de cualquier tipo en una localización particular pueden ser útiles o perjudiciales. Además, las sustituciones de ciertos tipos de aminoácidos en ciertas localizaciones pueden ser asimismo más o menos como afecta la afinidad para el antígeno particular. Por ejemplo, no puede ser necesario tratar todos los posibles aminoácidos hidrofóbicos en una posición dada. Puede ser que también se hará cualquier aminoácido hidrofóbico. Alternativamente, un aminoácido ácido o básico en una localización dada puede proporcionar grandes cambios en afinidad medida. Por lo tanto, también es necesario aprender las “reglas” de la realización de dichas sustituciones pero la determinación de dichas “reglas” pueden no requerir el estudio de todas las posibles combinaciones y sustituciones-las tendencias pueden llegar a ser aparentes después de examinar menos que el número máximo de sustituciones.

De acuerdo con lo ya dicho, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos neutralizantes de ultra alta afinidad, con especificidad hacia el mismo epítopo de RSV como el anticuerpo del documento de Patente U.S. Nº

5.824.307. Además, las afinidades de los anticuerpos de ultra

alta afinidad de la invención generalmente son al menos de 1010 M-1

. Debido a que dichas altas afinidades no son

fácilmente medibles, excepto por los procedimientos descritos en la presente memoria, dicho valor comúnmente pueden ser considerado como parte de un intervalo y puede,

M-1

por ejemplo, estar dentro de 2 veces 1010 o ser mayor de 1010 M-1 M-1

o incluso puede ser numéricamente igual a 1010 . En dichos casos, la afinidad se indica mediante una constante de afinidad, la cual está en la naturaleza de una constante de unión para dar unidades de molaridad reciproca. Como tal, la afinidad del anticuerpo para el antígeno es proporcional al valor de esta constante (es decir, a mayor constante, mayor afinidad). Dicha constante fácilmente se calcula a partir de las constantes de índice para las reacciones de asociación-disociación tal como las medidas mediante metodología cinética estándar para las reacciones de anticuerpo.

En una realización específica, los anticuerpos neutralizantes de alta afinidad de la presente invención, tienen constantes de afinidad para sus respectivos antígenos de al menos 1011 M-1, siendo en algunos casos en exceso de este valor, un intervalo en la región muy superior de la capacidad de medición.

Los anticuerpos neutralizantes de alta afinidad y los fragmentos de los mismos, pueden estar dirigidos de manera ventajosa a cualquiera de los determinantes antigénicos deseados, tales como los epítopos presentes sobre cualquier tipo de macromolécula, especialmente epítopos de péptido presentes como parte de la estructura tridimensional de moléculas de proteína y polipéptido. Dichos epítopos de péptido comúnmente pueden estar presentes sobre las superficies, o por otro lado ser parte de la estructura de, microorganismos y células, tales como células de cáncer. Los microorganismos que expresan dichos epítopos de péptido incluyen bacterias y virus. En el último caso, las

proteínas y los polipéptidos que presentan epítopos de péptido pueden ser moléculas expresadas sobre las superficies de los virus o se pueden expresar por células infectadas con un virus. Con propósito de evaluar la eficacia de las reglas y los métodos descritos de acuerdo con la presente invención, se eligió un virus como una fuente antigénica disponible para desarrollar anticuerpos dentro de la presente invención. El virus elegido para el análisis adicional era el virus sincitial respiratorio (RSV). Se eligió este último virus debido a que está bien caracterizado con respecto a su ciclo replicativo así como con respecto a los determinantes antigénicos encontrados sobre su superficie. Además, los antígenos conocidos a expresar por células infectadas con este virus están bien caracterizados. Por tanto, el virus presenta tanto un antígeno G de superficie como un antígeno F de superficie, ambas proteínas. El antígeno G facilita la unión del virus a superficies celulares y las proteínas F facilitan la fusión del virus con células. Las células así infectadas también expresan el antígeno F sobre sus superficies y el último resultado induce la fusión de las células para formar un sincitio; de ahora en adelante el nombre del virus. Además, el virus es un sujeto conveniente para el análisis en el sentido de que esas líneas celulares fácilmente infectadas por este virus son bien conocidas y bien caracterizadas, realizando de ese modo un virus fácil para crecer y cultivar in vitro. Además, se conocen los anticuerpos disponibles para el tratamiento de este virus y están comercialmente disponibles (por ejemplo, los anticuerpos descritos en el documento de Patente U.S. Nº 5.824.307). Por estas razones, el anticuerpo descrito en dicha patente contiene las secuencias de aminoácidos del “anticuerpo de referencia” descrito en la Figura 1 y cuyas

secuencias de CDR se resumen en la Tabla 1. Por tanto, la disponibilidad de un producto de anticuerpo comercialmente exitoso así como las propiedades bien caracterizadas de RSV hicieron de esto una combinación ideal para usar en el ensayo y optimización de los anticuerpos de la presente invención y las reglas descritas en la presente memoria para producir CDRs de alta afinidad para usar en la construcción de dichos anticuerpos. Los métodos descritos en la presente memoria para preparar dichos anticuerpos, se aplican de manera fácil y ventajosa generalmente en el campo de la tecnología de anticuerpo. Además, incluso las realizaciones específicas proporcionadas por la presente descripción y los cuales son anticuerpos dirigidos específicamente a determinantes antigénicos expresados mediante RSV, y células infectadas con RSV, pueden tener alta afinidad para otros epítopos, especialmente aquellos presentes sobre los virus relacionados. Por lo tanto, tal como se describe en la presente memoria RSV, y el anticuerpo con las secuencias variables tal como se muestra en la Figura 1, son simplemente un sistema modelo conveniente usado como punto de referencia para el desarrollo y la aplicación de los métodos de la tecnología de anticuerpo enseñada en la presente memoria.

Un anticuerpo neutralizante de alta afinidad de acuerdo con la presente invención, incluyendo fragmentos activos de los mismos, comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) de alta afinidad en la que dicha CDR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada para dar como resultado un anticuerpo que tiene una constante de afinidad (ka) de al menos 1010 . En realizaciones preferidas, dicho anticuerpo, o fragmento activo, comprende al menos 2 CDRs de alta afinidad, o al menos 3 CDRs de alta afinidad o incluso al menos 4 CDRs de

alta afinidad. En realizaciones altamente preferidas, dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos comprenden 3 ó 4 CDRs de alta afinidad. En una realización preferida, dicho fragmento activo es un fragmento Fab.

Los anticuerpos de alta afinidad de la presente invención comúnmente comprenden una región constante de mamífero, preferiblemente de ser humano, y una región variable, comprendiendo dicha región variable regiones framework de la cadena pesada y ligera y CDRs de la cadena pesada y ligera, en las que las regiones framework de la cadena pesada y ligera se derivan de un anticuerpo de mamífero, preferiblemente un anticuerpo humano, y donde las CDRs se deriva de un anticuerpo de algunas especies más que de humano, preferiblemente de ratón. Donde los aminoácidos de framework también se derivan de no humano, el último es preferiblemente de ratón.

Además, los anticuerpos de alta afinidad de la invención se unen al mismo epítopo que el anticuerpo a partir del cual se derivan las CDRs, y donde al menos una de las CDRs de dicho anticuerpo de ultra alta afinidad contiene sustituciones de aminoácidos, y donde dichas sustituciones comprenden la sustitución de uno o más aminoácidos en las regiones CDR mediante aminoácidos no idénticos, preferiblemente los aminoácidos de las posiciones correspondientemente alineadas de las regiones CDR del anticuerpo humano que contribuyen al framework y a los dominios constantes.

Las CDRs de alta afinidad se pueden producir mediante sustituciones de aminoácidos en CDRs de no alta afinidad para producir dichas CDRs de alta afinidad o dichas CDRs de alta afinidad se pueden sintetizar directamente para formar dichas CDRs de alta afinidad. Por tanto, los anticuerpos neutralizantes de ultra alta afinidad de la presente

invención pueden tener sustituciones de aminoácidos en únicamente una de las regiones CDR, preferiblemente más de una región CDR y lo más preferiblemente 3 o incluso 4 de dichas regiones, con posiblemente tantas como 5 o incluso todas las 6 de las CDRs que contienen al menos un aminoácido sustituido.

En la aplicación de los métodos descritos en la presente memoria para producir anticuerpos de la presente invención, el método de preparación de los anticuerpos no es un factor limitante. Por tanto, los anticuerpos neutralizantes de alta afinidad de la presente invención se pueden preparar mediante la generación de secuencias de polinucleótidos que codifican los polipéptidos de los anticuerpos y usando vectores para insertar dichas secuencias de polinucleótidos dentro de las células permisivas capaces de no solamente expresar dichos polipéptidos sino también de montarlos dentro de las estructuras tetraméricas características de anticuerpo que a continuación se recupera a partir de las células o cultivos celulares, posiblemente siendo secretadas dentro del medio por dichas células. Las tecnologías para dichos procedimientos de producción son ya conocidas y están patentados y no son esenciales para la práctica de la presente invención. [véase: Morrison et al. U.S. Patent Nº 5.807.715]. Además, las cadenas de polipéptidos de los anticuerpos de la presente invención se pueden sintetizar químicamente, con o sin la adición de enzimas, y a continuación juntarse químicamente para formar estructuras tetraméricas de la configuración habitual H2L2. Por tanto, se puede utilizar cualquier método de preparación de los anticuerpos descritos en la presente memoria.

La presente invención también está dirigida a la formación de anticuerpos neutralizantes de alta afinidad,

con las propiedades ya enumeradas, que tienen alta afinidad como resultado predominantemente de tener secuencias de CDR de alta afinidad. De acuerdo con la presente invención, las secuencias de CDR de los anticuerpos descritos en la presente memoria se han optimizado para conferir sobre la molécula de anticuerpo la característica de ultra alta afinidades de los anticuerpos de la presente invención. Dichas secuencias de CDR, junto con las secuencias framework descritas en la presente memoria, especialmente aquellas enseñadas por las secuencias de las Figuras 1, 3, 4, 5, 6 y 7, y lo más específicamente cuando se usan con secuencias de región constante características de los anticuerpos del organismo que actúa como recipiente de los anticuerpos de la presente invención cuando se usa de manera terapeútica, producen los anticuerpos de la presente invención en sus realizaciones más específicas. Sin embargo, los métodos de la presente invención están más específicamente dirigidos a las secuencias de aminoácidos de CDR.

Para producir inmunoglobulinas, dichos anticuerpos y/o fragmentos de los mismos, dentro de la presente invención, por ejemplo, anticuerpos neutralizantes de alta afinidad, las reglas enseñadas por la presente invención se usan de manera ventajosa para producir moléculas de anticuerpo cuyas estructuras incorporan las secuencias de las secuencias de CDR de alta afinidad descritas de acuerdo con la presente invención. Por tanto, los anticuerpos neutralizantes de alta afinidad de la presente invención son, en esencia, no verdaderamente anticuerpos “monoclonales” tal como ese término se usa comúnmente, ya que no tienen que ser producidos por clonación de cualquiera. Tal como ya se ha mencionado, las secuencias de los anticuerpos de la invención se pueden sintetizar

directamente y, por tanto, no pueden ser idénticos a ninguna de las secuencias de anticuerpo, especialmente no a ninguna de las secuencias de CDR, conocidas actualmente. Las secuencias en sí mismas pueden ser completamente novedosas ab initio y no estar representadas exactamente en ningún anticuerpo producido por cualquier organismo viviente. Por tanto, las secuencias de CDR de alta afinidad descritas en la presente memoria se encuentran, o se alcanzan, mediante optimización, tal como se describe en la presente memoria, y a continuación, una vez se conozcan dichas secuencias de CDR de alta afinidad, se pueden usar para sintetizar completamente las moléculas de anticuerpos funcionales, tanto diméricas como tetraméricas, bifuncionales o monofuncionales, mediante cualquiera y todos los medios conocidos por la ciencia.

De acuerdo con lo ya conocido, y para describir mejor las secuencias descritas de acuerdo con la invención, incluyendo su optimización, la secuencia de las regiones variables de la cadena ligera y pesada de un anticuerpo de referencia (en la presente memoria, el anticuerpo anti-RSV del documento de Patente Nº 5, 5.824.307) se muestran en la Figura 1A (región variable de la cadena ligera-SEC. ID Nº: 1) y en la Figura 1B (región variable de la cadena pesada- SEC. ID Nº: 2). También de acuerdo con la invención, se produjeron las secuencias novedosas con diferencias de aminoácidos únicamente en las regiones CDR relativas al anticuerpo de referencia. Un medio utilizado para efectuar este resultado era introducir mutaciones en las regiones CDR de las denominadas cadenas de inicio o de referencia y a continuación ensayar los clones recombinatorios resultantes para la afinidad de antígeno (proteína F de RSV).

De acuerdo con lo ya conocido, los cambios se realizaron primero en una secuencia de CDR para optimizar esa secuencia y determinar el residuo “crítico”, o residuos, que dichas posiciones se optimizaron a través de una serie de sustituciones de aminoácidos limitadas a esa posición sola. Se estudiaron cada una de las 6 CDRs del clon de anticuerpo en turno hasta que se determinaron las CDRs “críticas” (donde “CDRs críticas” significa CDRs que tienen un efecto sustancial sobre la unión de anticuerpo, tal como las CDRs beneficiosas o de alta afinidad de la Tabla 3). Se encontró que no todas las CDRs eran críticas. Para el anticuerpo usado en este estudio particular, se encontró que únicamente las CDRs H1, H3, L2 y L3 eran críticas pero los resultados pueden ser diferentes para un anticuerpo diferente. Una vez que se determinó una CDR de “alta afinidad” (es decir, una “CDR beneficiosa”) a continuación se estudiaron combinaciones de las CDRs para optimizar la combinación de secuencias CDR dando como resultado un anticuerpo neutralizante de alta afinidad de la invención.

Tal como una realización muy específica, la invención descrita en la presente memoria se refiere a un anticuerpo neutralizante de alta afinidad contra virus sincitial respiratorio (RSV) que tiene una constante de afinidad de al menos 1010 M-1, donde dicha constante de afinidad podría estar dentro de al menos 2 veces este valor debido a la variabilidad de dichas determinaciones y a la variabilidad de la afinidad de los anticuerpos clonados diferentes para el antígeno (en la presente memoria, el antígeno F de RSV). Algunas de las estructuras optimizadas resultantes dentro

1011 M-1

de esta realización tenían Ka mayor de (por ejemplo, clones numerados 22 y 23 en la Tabla 4).

Este anticuerpo neutralizante de alta afinidad es también un anticuerpo que se une al mismo epítopo sobre RSV como el anticuerpo cuya región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 1 (Figura 1A) y cuya región variable de la cadena pesada tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 2 (Figura 1B).

En general, la solicitud usada para identificar anticuerpos de la invención, basada en el ejemplo específico de anti-RSV ya descrito, era para generar secuencias de nucleótidos para los genes que expresan las cadenas de anticuerpo deseadas e insertar estos dentro de vectores usados a continuación para transformar células de Escherichia coli mediante protocolos estándar. Se hicieron crecer las células en pocillos y el sobrenadante se muestreó y midió para la unión a antígeno usando técnicas “lift” y ELISA de captura. [Véase: Watkins et al., (1997) Anal. Biochem. 253, 37-45; Watkins et al. (1998) Anal. Biochem. 256, 169-177. Estos polinucleótidos se diseñaron para proporcionar sustituciones sencillas de aminoácidos en las CDRs que a continuación se podrían investigar para la afinidad incrementada, con sustituciones beneficiosas (las cuales producen afinidad incrementada) combinándose selectivamente para afinidad incrementada. A continuación,

estos

se investigaron para la afinidad de unión para

antígeno

F de RSV frente al anticuerpo básico o de

referencia.

Usando este protocolo, los datos de ELISA indicaron que no sustituciones de aminoácidos sencillas en las CDRs L1 o H2 no producían ningún incremento en la afinidad de clon de anticuerpo para el epítopo usado como antígeno (en la presente memoria, el antígeno F de RSV). Por lo tanto, los anticuerpos de la presente invención contienen todos secuencias CDR que difieren del anticuerpo de referencia

únicamente en las CDRs L2, L3, H1 y H3 (en la presente memoria, el anticuerpo de referencia con secuencias en la Figura 1 era meramente una referencia útil frente al cual se ensayan procedimientos para la optimización de la afinidad de anticuerpo mediante el incremento de Ka y cualquier otro sistema se podría usar igualmente bien).

Los anticuerpos así descritos en la presente memoria con respecto a RSV también comúnmente tienen regiones framework derivadas de un anticuerpo humano pero, donde no así derivadas, preferiblemente de ratón.

Para las CDRs del anticuerpo de referencia, en la Tabla 1 se muestra la secuencia de aminoácidos de cada CDR (tal como la dada en las secuencias de la Figura 1). Las localizaciones del residuo de aminoácidos dentro de las CDRs del anticuerpo básico o de referencia, las cuales, si se sustituye por aminoácidos como los enseñados por la presente invención, seguido de la optimización, producían secuencias CDR de alta afinidad (dando como resultado anticuerpos neutralizantes de muy alta afinidad) y de ese modo un resultado beneficioso (incremento en afinidad), están indicadas en negrita y subrayadas en la Tabla 1 (dando dichas secuencias afinidad incrementada sobre el anticuerpo de referencia que se indica como “CDRs beneficiosas” o “CDRs de alta afinidad”). Las CDRs del anticuerpo básico o de referencia (Figura 1) se denominan en la presente memoria “CDRs básicos o de referencia”). Por tanto, la Tabla 1 representa las secuencias de CDR representadas en la Figura 1 (es decir, para el anticuerpo de referencia anti-RSV usado en la presente memoria para la optimización del control).

Tabla 1. Secuencias de CDRs Básicas o de Referencia

CDR

Longitud Secuencia SEC.ID.Nº

L1

10 3

L2

7 imagen1 4

L3

9 imagen1 5

H1

7 imagen1 6

H2

16 imagen1 7

H3

10 imagen1 8

Con respecto a las secuencias descritas en la presente memoria, las regiones CDR tal como se definen para los propósitos de la presente invención son aquellos segmentos

5 que corresponden a los residuos 24-33 (CDR L1), 49-55 (CDR L2) y 88-95 (CDR L3) de las regiones variables de la cadena ligera y los residuos 31-37 (CDR H1), 52-67 (CDR H2) y 100109 (CDR H3) de las regiones variables de la cadena pesada de los anticuerpos descritos en la presente memoria.

10 En la producción de los anticuerpos de la presente invención, tanto por generación de clones como por clonación de las cadenas de polipéptidos que componen dichos anticuerpos, o mediante síntesis directa de las secuencias de polipéptidos, con o sin el uso de las

15 secuencias de polinucleótidos que las codifican, o mediante cualquier método que el usuario pueda elegir, ya que no método de producción de dichos anticuerpos da como resultado una limitación de la enseñanza de la presente invención, se puede usar el anticuerpo básico o de

20 referencia (regiones variables de la cadena pesada y ligera (CDRs más Framework) mostradas en la Figura 1) como “plantilla” para generar las secuencias de CDR novedosas de los anticuerpos de la presente invención y con el propósito de comparar las constantes de unión, etc. Se usaron

25 solicitudes estándar para caracterizar y sintetizar las seis bibliotecas de CDR de mutaciones sencillas (véase Wu

et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6037-6042 (1998)). Primero la CDR diana se sometió a delección para cada una de las librerías antes de templar los nucleótidos. Para las síntesis de las bibliotecas, se definieron las CDRs como en la Tabla 1. Se empleó la mutagénesis basada en codón para la síntesis de oligonucleótido para producir las secuencias CDR de la invención (tal como se describe a continuación).

Inicialmente se investigaron las librerías mediante “lift” de captura para identificar las variantes de la más alta afinidad. Posteriormente, estos clones se caracterizaron más usando ELISA de captura y mediante titración sobre antígeno inmovilizado.

Se secuenció el ADN a partir de las variantes de la más alta afinidad para determinar la naturaleza de las sustituciones beneficiosas o de alta afinidad. Después de la investigación, se determinó que se habían observado ocho sustituciones beneficiosas o de alta afinidad, que se dan en únicamente cuatro de las CDRs. Estas se resumen como las secuencias CDR en la Tabla 3 con diferencias frente a las CDRs de referencia o básicas de la Tabla 1 que están en negrita y subrayadas. Por tanto, las secuencias CDR de la Tabla 3 se pueden considerar una librería de CDR de casetes disponibles para usar en la producción de un anticuerpo neutralizante de alta afinidad de la presente invención donde la especificidad está dirigida hacia el antígeno F de RSV.

El análisis de los datos indicaron que la sustitución de los aminoácidos en las localizaciones seleccionadas habían incrementado enormemente la unión a epítopo, especialmente donde la naturaleza de la sustitución era la inserción de un aminoácido seleccionado a partir del grupo de fenilalanina, alanina, prolina, triptófano y tirosina, lo más especialmente fenilalanina, estando de nuevo todas

estas sustituciones beneficiosas y de alta afinidad en las posiciones seleccionadas.

Para el experimento de optimización descrito en la presente memoria y que emplea el sistema RSV/anti-RSV, se encontró que la más beneficiosa de las CDRs de alta afinidad resultaba de sustituciones de aminoácidos en 3 ó 4 de las 6 CDRs, y en justo 4 localizaciones de aminoácidos en su totalidad. Por tanto, los anticuerpos neutralizantes de alta afinidad de la presente invención contienen secuencias de aminoácidos que difieren de esa del anticuerpo base o de referencia únicamente en regiones determinantes de complementariedad, o en dichas regiones así como en las regiones framework circundantes, a diferencia de los anticuerpos realizados por el hombre previamente conocidos. Por tanto, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos neutralizantes de alta afinidad que contienen una o más secuencias CDR seleccionadas para producir alta afinidad en la molécula de anticuerpo. En la realización específica que usa RSV como la diana de dichas diferencias se encuentran únicamente en L2 (o CDRL2), L3 (CDRL3), H1 (o CDRH1) y H3 (o CDRH3). Tal como se indica, las mayores afinidades para este anticuerpo se dieron únicamente en las posiciones de aminoácidos seleccionadas de estas CDRs, y en algunas de las realizaciones de la presente invención se prefería justo una localización de aminoácidos en cada CDR para dar alta afinidad.

Por tanto, para CDR H1, se encontró que la sustitución en el aminoácido 2 de la CDR (contando a partir del extremo terminal amino de la secuencia de CDR subrayada particular de la Figura 1B), especialmente mediante sustitución de la serina localizada en la posición 2 de CDR H1 del anticuerpo básico o de referencia con o bien una alanina o una

prolina, era la más beneficiosa y por lo tanto daba como resultado mayor afinidad para el epítopo del antígeno RSV. Para CDR H3, se encontró que la sustitución de la glicina en la posición 6 de la secuencia de CDR, especialmente o bien una fenilalanina o triptófano, lo más especialmente por fenilalanina, daba como resultado afinidad incrementada para el epítopo RSV. Para CDR L2, la sustitución de la serina en la posición 3 de la CDR, especialmente o bien una fenilalanina o una tirosina, dio como resultado afinidad incrementada para el antígeno F. Para CDR L3, la sustitución de la glicina en la posición 5 de la CDR, especialmente mediante fenilalanina, triptófano o tirosina, dio como resultado afinidad incrementada para el epítopo RSV.

De acuerdo con la invención, al combinar dichas sustituciones de aminoácidos de manera que más de uno se daba en la misma molécula de anticuerpo, era posible incrementar enormemente la afinidad de los anticuerpos descritos en la presente memoria para el epítopo del antígeno F de RSV.

La Tabla 2 muestra los resultados del uso de las secuencias de CDR novedosas (para H1, H3, L2 y L3, respectivamente) de un número de clones de acuerdo con la presente invención. Tal como se muestra en la Tabla 2, un anticuerpo particular puede haber incorporado en la presente memoria tantas como 1, 2 o 3 CDRs novedosas de la invención frente a las cadenas de anticuerpo básicas o de referencia mostradas en las Figuras 1A y 1B (para cadena ligera (L2 y L3) y pesada (H1 y H3), respectivamente). Los efectos de las CDRs novedosas se describen en términos o marca de titración de Antígeno (Ag) (véase a continuación), donde se muestra el anticuerpo básico o de referencia en la parte superior y tiene una marca (“score”) de 0,1. Otros

marcadores se indican en relación a esta marca 0,1 de las secuencias de “anticuerpo básico o de referencia”. Las identidades de los aminoácidos que dan las más altas afinidades en las respectivas localizaciones (es decir, la posición 2 para H1, posición 6 para H3, posición 3 para L2 y la posición 5 para L3) se indican a continuación los aminoácidos para el anticuerpo básico o de referencia simplemente para indicar el intervalo de mutaciones usadas para cada CDR.

El número total de clones examinados en este experimento era de 37, con algunos duplicados (indicados por el valor “n” en paréntesis, por ejemplo, “n=4”para el clon Nº 7 indica que se examinaron 4 clones duplicados).

En general, los datos mostraron que hay una correlación entre la afinidad y el número de CDRs beneficiosas o de alta afinidad, con todas las variantes de mayor afinidad que tienen más de una CDR beneficiosa o de alta afinidad. Además, todos los mejores clones tenían una F (Phe) en la posición 6 dentro de CDR H3. También, las CDRs beneficiosas o de alta afinidad eran aquellas en las que se insertaron un aminoácido hidrofóbico, especialmente un aromático, en lugar del residuo encontrado en el anticuerpo básico o de referencia.

El ensayo de titración de anticuerpo empleó concentraciones variantes del anticuerpo usando 500 ng de antígeno F de RSV para cada medida. En la Figura 2 se muestra una gráfica de datos de comparación para un número de los clones combinatorios de la Tabla 2.

En resumen, la Tabla 2 muestra un número de clones evaluados mediante los procedimientos descritos en la presente memoria junto con los aminoácidos que se dan en las localizaciones clave (subrayados y en negrita en las Tablas 1 y 3) de las CDRs H1, H3, L2 y L3. La Tabla también

resume el número de diferencias entre las CDRs de estos clones frente a las correspondientes CDRs del anticuerpo de referencia (Véase Tabla 1 y Figura 1). El lado derecho de la Tabla muestra un “Marca de Ag” o valor de unión a 5 antígeno, lo cual representa un valor arbitrario y cualitativo, que oscila ente 0-4 y representa una estimación cualitativa de la capacidad de unión relativa de los diferentes clones de anticuerpo basada en sus respectivas curvas de titración. Este valor se proporciona

10 en la presente memoria únicamente para comparaciones cualitativas aproximadas de los diferentes anticuerpos y no se tiene la intención como una medida cuantitativa de la capacidad de unión. La Tabla 2 también muestra el número de las CDRs

15 novedosas para cada clon de anticuerpo (significando el número de CDRs en el anticuerpo con al menos una diferencia de aminoácidos con respecto a la correspondiente CDR del anticuerpo de referencia-véase Tabla 1). El número de CDRs novedosas es también el número de CDRs “beneficiosas” o “de

20 alta afinidad” presentes en esa molécula de anticuerpo. Las diferencias de aminoácidos en la novedosa CDR se darían en la posición en negrita y subrayada en la Tabla 1 para el anticuerpo de referencia de manera que el aminoácido en negrita y subrayado en la Tabla 1 se ha sustituido por el

25 aminoácido indicado para la respectiva CDR en la Tabla 2 (usando designaciones de aminoácido de letra única estándar).

Tabla 2. Resumen de los Datos de Clon

Clon

CDRs Nº CDRs Novedosas Marca de Ag

H1

H3 L2 L3

Básico

S W S G 0 0,1

Sencillo

A F F F

P

Y W

Y

1

A F S F 3 4

2

A F F G 3 4

3(n=3)

P F F F 4 4

4(n=3)

P F F Y 4 3,5

5(n=3)

P F F W 4 3,5

6

P F Y F 4 3,5

7(n=4)

P F F G 3 3

8

P F F ¿ 3+ 3,5

9(n=2)

P F S W 3 3

10

P F S F 3 3

11

P W F W 3 3

12(n=2)

P W F F 3 2,5

13(n=3)

S F F F 3 2,5

14

S F F W 3 2,5

15(n=2)

A F S G 2 2,5

16(n=2)

P F S G 2 2

17

P W S W 2 2

18(n=2)

S F F G 2 2

19

S F S W 2 2

20

S F S F 2 2

21

S W Y F 2 2

Las CDRs novedosas representadas en cada uno de los clones se determinan fácilmente al localizar el clon en la tabla, y emparejando el aminoácido indicado para cada CDR con el correspondiente aminoácido para el mismo CDR próximo al clon básico o de referencia. Por conveniencia, donde un aminoácido es diferente en una CDR particular de uno de los

clones, el nuevo aminoácido está indicado en negrita. Además, para todos los clones mostrados en la tabla, las sustituciones se dan únicamente en las localizaciones seleccionadas enumeradas a continuación al producir una CDR novedosa. Por tanto, todas las sustituciones en CDR H1 relativas al anticuerpo básico o de referencia están en la posición 2 de la CDR (significando, de nuevo, el segundo aminoácido a partir del extremo N terminal de la CDR H1 como el subrayado y en negrita en la Figura 1 y las Tablas 1 y 3), todas las sustituciones en CDR H3 están en la posición 6, todas las sustituciones en CDR L2 están en la posición 3 y todas las sustituciones en CDR L3 están en la posiciones 5, de nuevo todas con referencia al anticuerpo básico o de referencia. Se debería mantener en mente que se eligió el anticuerpo básico o de referencia porque ya se sabía que tenía una muy alta afinidad para los epítopos de RSV. [Véase: Johnson et al., (1997) J. Infect. Dis., 176, 1215-1224]. Así, por ejemplo, la tabla muestra que para el clon Nº 1, para la CDR H1 beneficiosa o de alta afinidad, se usa una alanina en lugar de la serina en la posición 2 de la CDR H1 del anticuerpo básico o de referencia, de ese modo consiguiendo una afinidad incrementada para RSV, y una fenilalanina se da en lugar del triptófano en la posición 6 de la CDR H3, la serina en la posición 3 de la CDR L2 del anticuerpo básico o de referencia se usó y una fenilalanina se dio en la posición 5 de la CDR L3 beneficiosa o de alta afinidad.

Por tanto, en la Tabla 3 se resumen las CDRs novedosas y beneficiosas de acuerdo con la presente invención (es decir, CDRs de alta afinidad o secuencias de CDR cuya presencia en el anticuerpo básico o de referencia en lugar de la correspondiente CDR básica o de referencia servían para incrementar enormemente la afinidad de dicho

anticuerpo para el mismo epítopo de RSV) las cuales están presentes en las estructuras de anticuerpo producidas en los sobrenadantes ensayados para los clones de la Tabla 2. En cada caso, en negrita indica como las CDRs novedosas y beneficiosas, o de alta afinidad, de la invención difieren de las correspondientes CDRs del anticuerpo anti-RSV básico

o de referencia.

Tabla 3. Secuencias para CDRs de Alta Afinidad

CDR

Secuencia SEC.ID.Nº

H1

imagen1 9

H1

imagen1 10

H3

11

L2

12

L2

imagen1 13

L3

14

L3

15

L3

16

10 Mientras las secuencias de CDR de la Tabla 3 representan las secuencias para las CDRs de alta afinidad descritas de acuerdo con la invención, se entiende que una

o más de estas CDRs pueden estar presentes en el mismo 15 anticuerpo y las secuencias de la tabla indican el conjunto a partir del cual se pueden seleccionar secuencias apropiadas para cada una de las CDRs de alta afinidad. Por tanto, tal como se muestra en la Tabla 3, cuando una H1 CDR de alta afinidad está presente en un anticuerpo 20 neutralizante de alta afinidad de la invención descrita en

la presente memoria se tiene una secuencia correspondiente a la secuencia de SEC. ID. Nº: 9 ó 10. Si un anticuerpo neutralizante de la invención reivindicada contiene una CDR H3 de alta afinidad, dicha CDR tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 11. Si un anticuerpo neutralizante de alta afinidad de la invención contiene una CDR L2 de alta afinidad, dicha CDR L2 de alta afinidad tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de SEC. ID. Nº: 12 y 13. Finalmente, si un anticuerpo neutralizante de alta afinidad de la presente invención contiene una CDR L3 de alta afinidad, dicha CDR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de SEC. ID. Nº: 14, 15 y 16.

Tal como ya se ha expuesto, en una realización, los anticuerpos neutralizantes de alta afinidad son anticuerpos que incluyen una región constante humana.

Por tanto, en una realización preferida, el anticuerpo neutralizante de alta afinidad de la invención, con una M-1

afinidad de al menos 1010 M-1, o incluso al menos 1011 , es un anticuerpo injertado que incluye una región constante humana y una framework para las cadenas pesadas y ligeras en las que al menos una porción de la framework se deriva de un anticuerpo humano (o a partir de una secuencia consenso de una framework de anticuerpo humana).

En otra realización, todas las framework se derivan de un anticuerpo humano (o una secuencia consenso humano). Por tanto, un anticuerpo neutralizante de RSV, con una M-1

afinidad de al menos 1010 , es un anticuerpo injertado que tiene una región constante humana, una o más CDRs que se derivan de un anticuerpo no humano en el cual al menos uno de los aminoácidos en al menos una de dichas CDRs está cambiada y en las cuales toda o una porción de la framework

se deriva de un anticuerpo humano (o una secuencia consenso de una framework de anticuerpo humano).

Debido a la combinación de secuencias de CDR de un anticuerpo con regiones no CDR de otro anticuerpo resulta de una forma de “injerto” de las CDRs sobre el resto de la molécula, estas se han denominado anticuerpos de “injertados de CDR ”. Hoy en día, se puede formar el mismo

producto

usando las técnicas de ingeniería genética sin

aislar

ninguna de las secuencias a partir de los

anticuerpos

actuales. Siempre que se conozcan las

secuencias de CDR deseadas y la secuencia framework y constante, se pueden ensamblar los genes con las secuencias deseadas y, usando una diversidad de vectores, injertar en células apropiadas para la expresión de las moléculas de anticuerpo tetraméricas funcionales. Acoplando esto con la metodología ya descrita permite el ensamblaje de las librerías de mutación sencilla en las que los anticuerpos poseen las mismas secuencias que los anticuerpos injertados correspondientes y, por lo tanto, la misma estructura y afinidades de unión.

Los anticuerpos de alta afinidad de la invención se pueden presentar en forma relativamente pura o aislada así como en un sobrenadante extraído a partir de las células crecidas en pocillos o en placas. Dichos sobrenadantes se usaron para generar los datos de la Tabla 1. Por tanto los anticuerpos de la invención también pueden estar presentes en forma de una composición que comprenda el anticuerpo de la invención y en la que dicho anticuerpo esté en suspensión en un vehículo farmacológicamente aceptable, o excipiente. Los anticuerpos de la invención pueden estar presentes en dicha composición en una concentración, o en una cantidad, suficiente para ser de valor terapéutico o farmacológico en el tratamiento de enfermedades, tales como

RSV. Dichos anticuerpos también pueden estar presentes en una composición de una forma más diluida.

Por consiguiente, la invención también está dirigida a proporcionar composiciones y medicamentos para prevenir y/o tratar infecciones de virus sincitial respiratorio donde se tiene la intención de administrarse la composición/medicamento a un paciente en riesgo de la misma, o aquejado con la misma. Dicho medicamento o composición comprende la composición de anticuerpo descrita en la presente memoria.

Una realización preferida de los anticuerpos de alta afinidad de la presente invención es el anticuerpo cuyas regiones CDR de la cadena pesada y ligera tienen secuencias tal como siguen: CDR H1 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 9, CDR H3 tiene la secuencia SEC. ID. Nº: 11, CDR L2 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº 4 (no cambio desde CDR L2 de la secuencia de referencia de la Figura 1A) y CDR L3 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº 14 (véase Tabla 3). En esta realización preferida, la constante de afinidad es aproximadamente de 6,99 X 1010 (o aproximadamente 14,3 pM como una constante de disociación) tal como se muestra en la Tabla 4 (clon 1). En la Figura 3 se muestran las regiones variables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo que comprende esta realización, junto con las secuencias framework.

Otra realización preferida de los anticuerpos de alta afinidad de la presente invención es el anticuerpo cuyas regiones CDR de la cadena pesada y ligera tienen las secuencias que siguen: CDR H1 tiene la secuencia SEC. ID. Nº: 9, CDR H3 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 11, CDR L2 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 12, y CDR L3 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 5 (véase Tabla 2, clon 2-sin diferencia a partir de la secuencia de referencia de CDR L3

de la Figura 1A). En esta realización preferida, la constante de afinidad es de aproximadamente 7,30 X 1010 (o aproximadamente 13,7 pM como constante de disociación) tal como se muestra en la Tabla 4 (clon 2). En la Figura 4 se muestran las regiones variables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo que comprende esta realización, junto con las secuencias de framework.

Una realización preferida adicional de los anticuerpos de alta afinidad de la presente invención es el anticuerpo cuyas regiones CDR de la cadena pesada y ligera tiene las secuencias que sigue: CDR H1 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 10, CDR H3 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 11, CDR L2 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 12 y CDR L3 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 14 (véase la Tabla 3 para las secuencias de CDR) cuyo clon se designa con el número 3 en la Tabla 2. En esta realización preferida, la constante de afinidad es aproximadamente de 8,13 X 1010 (o aproximadamente 12,3 pM como constante de disociación) tal como se muestra en la Tabla 4 (clon 3). En la Figura 5 se muestra las regiones variables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo que comprende esta realización, junto con las secuencias framework.

Una realización muy preferida de los anticuerpos de alta afinidad de la presente invención es el anticuerpo cuyas regiones CDR de la cadena pesada y ligera tienen las secuencias que siguen: CDR H1 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 9, CDR H3 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 11, CDR L2 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 12 y CDR L3 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 14 (véase Tabla 3). En esta realización preferida, la constante de afinidad es aproximadamente de 3,6 X 1011 (o aproximadamente 2,8 pM como constante de disociación) tal como se muestra en la Tabla 4 (clon 22). En la Figura 6 se muestra las regiones

variables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo que comprende esta realización, junto con las secuencias framework.

Otra realización muy preferida de la presente invención es el anticuerpo cuyas regiones CDR de la cadena pesada y ligera incluyen las siguientes secuencias: CDR H1 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 9, CDR H3 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 11, CDR L2 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 12 y CDR L3 tiene la secuencia de SEC. ID. Nº: 15 (véase Tabla 3). En esta última realización preferida, la constante de afinidad es aproximadamente de 4 X 1011 (aproximadamente 2,5 pM como constante de disociación) tal como muestra en la Tabla 4 (clon 23). En la Figura 7 se muestran las regiones variables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo que comprende esta realización, junto con las secuencias de framework.

En las realizaciones particularmente preferidas, los anticuerpos de la presente invención tendrán las regiones framework de las secuencias representadas para las regiones framework en las Figuras 1, 3, 4, 5, 6 y 7 (cada una contiene las mismas regiones framework y difieren únicamente en las secuencias de CDR). Estas realizaciones muy preferidas incluyen el anticuerpo neutralizante en el que la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 17 y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 18; el anticuerpo neutralizante en el que la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos SEC. ID. Nº: 19 y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 20; el anticuerpo neutralizante en el que la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 21 y la región

variable de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 22; el anticuerpo neutralizante en el que la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 23 y la región variable de la cadena variable tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 24; el anticuerpo neutralizante en el que la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 25 y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 26.

Se debería tener en mente que mientras los anticuerpos neutralizantes de alta afinidad de la presente invención se puedan ensamblar a partir de las regiones CDR y no-CDR derivadas de los actuales anticuerpos neutralizantes mediante corte y empalme (“splicing”) de segmentos de aminoácidos juntos (y anticuerpos así ensamblados estarían dentro de la invención descrita en la presente memoria) los anticuerpos de la presente invención son los más convenientemente preparados mediante secuencias de gene apropiadas realizadas por ingeniería genética dentro de los vectores que a continuación se pueden transferir dentro de líneas celulares adecuadas para la expresión eventual de las moléculas de anticuerpo ensambladas por células sometidas a ingeniería. De hecho, se emplearon dichos procedimientos recombinantes para preparar los anticuerpos descritos en la presente memoria. Además, debido a que las secuencias de las cadenas de los anticuerpos de alta afinidad se conocen a partir de la descripción en la presente memoria, dichos anticuerpos también se podrían ensamblar mediante síntesis directa de las cadenas apropiadas y, a continuación, permitir el auto-ensamblaje dentro de las estructuras de anticuerpo bivalentes tetraméricas (H2L2).

El método de preparación de los anticuerpos neutralizantes de alta afinidad de la invención implicó la creación de una librería combinatoria la cual se usó para preparar clones que producen anticuerpos que comprenden las CDRs beneficiosas de la invención que, a continuación, se podrían investigar para la afinidad para epítopos de RSV (por ejemplo, la Figura 2).

EJEMPLO 1 Análisis cinético de Mabs de RSV humanizadas mediante BIAcoreTM

Se estudiaron las cinéticas de interacción entre Mabs de anti-RSV de alta afinidad y la proteína F de RSV mediante resonancia de plasmon de superficie usando un biosensor de Pharmacia BIAcoreTM. Un baculovirus recombinante que expresa una proteína F truncada C-terminal proporcionó una fuente abundante de antígeno para los estudios cinéticos. El sobrenadante, el cual contenía la proteína F secretada, se enriqueció aproximadamente 20 veces mediante cromatografía sucesiva sobre concanavalina A y columnas de Q-sefarosa. Las fracciones agrupadas contra citrato de sodio 10 mM (pH 5,5) se sometieron a diálisis, y se concentraron a aproximadamente 0,1 mg/ml. En un experimento normal, se acopló por amina una alícuota de la proteína F (100 ml) al chip sensor BIAcore. La cantidad inmovilizada dio aproximadamente 200 unidades de respuesta (Rmax) de señal cuando se saturó con los anticuerpos H1129 o H1308F monoclonales de ratón (preparados tal como en el documento de Patente U.S. 5.824.307, cuya descripción está incorporada en la presente memoria por referencia). Esto indicó que había un número igual de sitios antigénicos “A” y “C” sobre la preparación de proteína F seguido del procedimiento de acoplamiento. Dos Mabs irrelevantes no

relacionadas (RVFV 4D4 y CMV H758) mostraron no interacción con la proteína F inmovilizada. Un estudio cinético típico implicó la inyección de 35 ml de Mab a concentraciones variantes (25-300 nM) en tampón PBS que contiene Tween-20 al 0,05% (PBS/Tween). Se mantuvo el índice de flujo a 5 ml/min, dando una fase de unión de 7 min. Seguido de la inyección de Mab, el flujo se intercambió con tampón PBS/Tween durante 30 min para determinar el índice de disociación. Se regeneró el chip sensor entre ciclos con un pulso de 2 min de HCl 10 mM. La etapa de regeneración causó una pérdida mínima de capacidad de unión de la proteína F inmovilizada (4% de pérdida por ciclo). Este pequeño descenso no cambió los valores calculados de las constantes de índice para la unión y disociación (también denominadas Kon y Koff, respectivamente).

Más específicamente, para la medida de Kassoc(o Kon), se inmovilizó directamente proteína F mediante el método EDC/NHS (EDC=N-etil-N’-[3-dietilamino-propil]carbodiimida; NHS=N-hidroxisuccinimida) con la proteína F que se inyecta sobre el chip sensor activado por EDC/NHS. En resumen, se preparó 4 µg/ml de proteína F en NaOAc 10 mM, pH 4,0 y aproximadamente una inyección de 30 µl dio aproximadamente 500 RU (unidades de respuesta, siglas del inglés “Response Units”) de proteína F inmovilizada bajo las condiciones anteriormente referidas. La celda de flujo blanco (superficie inmovilizada con CM-dextrano de VnR) se sustrajo por análisis cinético. La columna se pudo regenerar usando HCl 100 mM (con 72 segundos de tiempo de contacto que se requirieron para la regeneración completa). Este tratamiento extrajo Fab unida completamente sin dañar el antígeno inmovilizado y se pudo usar durante por encima de 40 regeneraciones. Para las medidas de Kon, las concentraciones de Fab fueron de 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100

nM, 200 nM y 400 nM. Se analizó la fase de disociación desde 230 segundos (30 segundos después del empiece de la fase de disociación) hasta 900 segundos. Se analizaron las cinéticas mediante la prueba Langmuir 1:1 (prueba global). Se realizaron las medidas en tampón HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, surfactante P20 al 0,005% (v/v)).

Para las medidas de los clones combinatorios, tal como se describen en la presente memoria, se midieron Kon y Koff separadamente, Se midió la Kon en condiciones que eran las mismas que aquellas para los clones de mutación sencilla y se analizaron de manera similar.

Para medir la Kdissoc(o Koff), se emplearon las siguientes condiciones. En resumen, se inmovilizaron 4100 RU de proteína F (tal como anteriormente) con CM-dextrano usado como blanco. En la presente memoria, se unieron 3000 RU de Fab (con Fab disociada lo suficiente alta para compensar la fluctuación de la máquina). Se usó como tampón HBS más proteína F 5 nM (aproximadamente 350-2000 veces mayor que la Kdissoc o Kdt.la constante de equilibrio de disociación). La fase de disociación fue de 6-15 horas en un índice de flujo de 5 µl/min. Bajo las condiciones usadas en la presente memoria, la reunión de la Fab disociada fue mínima. Para más detalles, véase el manual con el biosensor.

Se calculó la unión de los anticuerpos anti-RSV de alta afinidad a la proteína F, u otros sitios epitópicos sobre RSV, descritos en la presente memoria, a partir de la razón de la constante de índice de primer orden para la disociación a la constante de índice de segunda orden para la unión o asociación (Kd=Kdiss/Kassoc). Se calculó el valor de kassoc en base a la siguiente ecuación de índice:

imagen1

en la que R y Rmax son las unidades de respuesta en el tiempo t e infinidad, respectivamente. Una representación gráfica (“plot”) de dr/dt como función de R da una pendiente de [Kassoc [Mab]+Kdiss). Ya que estas pendientes 5 están relacionadas linealmente con la [Mab], se puede derivar el valor kassoc de una actualización de la representación grafica (“replot”) de las pendientes frente a [Mab]. La pendiente de la nueva línea es igual a Kassoc. Aunque el valor de Kdiss se puede extrapolar de la 10 intersección con el eje “y”, se determinó un valor más exacto mediante medida directa de Kdiss. Seguido de la fase de inyección del Mab, el tampón PBS/Tween fluye a través del chip sensor. A partir de este punto, [Mab]=0. Por tanto, la ecuación anteriormente indicada para dR/dt se

15 reduce a:

imagen1

A continuación, la integración de esta ecuación da:

In (R0/Rt)= kdisst

en la que R0/R1 son las unidades de respuesta en tiempo 0

20 (empiece de la fase de disociación) y t, respectivamente. Por último, la representación gráfica (“plotting”) de In(R0/Rt) como función de t da una pendiente de Kdiss.

En la realización preferida

en la presente memoria,

los

valores numéricos a partir de dichas variantes de

anticuerpo fueron los siguientes: 25

Tabla 4. Resumen de las Constantes Cinéticas a partir de Anticuerpos de Ultra-alta Afinidad.

ID Clon

CDRs kassoc (M-1sec-1) kdiss (sec-1) Ka (M-1)

1

AFSF 1,13 X 105 1,62 X 10-6 6,98 X 1010

2

AFFG 1,33 X 105 1,82 X 10-6 7,31 X 1010

3

PFFF 1,10 X 105 1,35 X 10-6 8,15 X 1010

22

AFFF 1,34 X 105 3,70 X 10-7 3,62 X 1010

23

AFFY 1,22 X 105 3,03 X 10-7 4,03 X 1010

En la presente memoria, las CDRs representan los aminoácidos que sustituyen los aminoácidos de referencia en las posiciones clave (o posiciones críticas) de las CDRs

5 mostradas en la Tabla 1 (en negrita y subrayadas) para un anticuerpo de referencia. Por tanto, por ejemplo, el clon 22 tiene una alanina en la posición 2 de CDR H1 (residuo 32 de la región variable de la cadena pesada-SEC. ID. Nº: 24) en lugar de la serina mostrada en la posición en la Tabla

10 1(SEC. ID. Nº: 6), una fenilalanina en la posición 6 de la CDR H3 (residuo 105 de la región variable de la cadena pesada-SEC. ID. Nº: 24) en lugar del triptófano mostrado en esa posición en la Tabla 1 (SEC. ID. Nº: 8), una fenilalanina en la posición 3 de la CDR L2 (residuo 51 de

15 la región variable de la cadena ligera-SEC. ID. Nº:23) en lugar de la serina mostrada en esa posición en la Tabla 1 (SEC. ID. Nº:4), y una fenilalanina en la posición 5 de la CDR L3 (residuo 92 de la región variable de la cadena ligera-SEC. ID. Nº: 23) en lugar de la glicina mostrada en

20 esa posición en la Tabla 1 (SEC. ID. Nº: 5). De acuerdo, en la formación de dichos clones, la Tabla 3 representa un conjunto de CDRs potenciales a partir de las cuales las CDRs de alta afinidad de los anticuerpos de la presente invención se extraen. Por ejemplo, el clon 23

25 de la Tabla 4 usa las mismas CDRs como el clon 22 con la excepción de CDR L3, la cual tiene una tirosina en la posición 5 de la CDR L3 (Tabla 3-SEC. ID. Nº: 15) en lugar de la glicina mostrada en esa posición en la Tabla 1 (SEC. ID. Nº: 5). Así mismo en la Tabla 2 se muestran las

30 sustituciones en las posiciones críticas correspondientes.

EJEMPLO 2 Ensayo de Microneutralización

Se determinó la neutralización de los anticuerpos de la presente invención mediante ensayo de microneutralización. Este ensayo de microneutralización es una modificación de los procedimientos descritos por Anderson et al. (1985). Se realizaron las diluciones de anticuerpo en triplicado usando una placa de 96 pocillos. Se incubaron 10 TCID50 de virus sincitial respiratorio (RSV-cepa “long”) con diluciones seriales del anticuerpo (o Fabs) a ensayar durante 2 horas a 37ºC en los pocillos de una placa de 96 pocillo. A continuación, se añadieron células HEp-2 susceptibles a RSV (2,5 x 104) a cada pocillo y se cultivaron durante 5 días a 37ºC en CO2 al 5%. Después de 5 días, se aspiró el medio y se lavaron las células y se fijaron a las placas con metanol al 80% y PBS al 20%. A continuación, se determinó la replicación de RSV mediante la expresión de proteína F. Se incubaron células fijadas con un anticuerpo monoclonal anti proteína F conjugado con biotina (proteína F pan, Mab 133-1H específica a sitio C) se lavaron y se añadió avidina conjugada con peroxidasa de rábano a las células. De nuevo se lavaron los pocillos y se midió la renovación del sustrato TMB (ácido tionitrobenzoico) a 450 nm. Se expresó el título (“titer”) neutralizante como la concentración de anticuerpo que causó al menos una reducción del 50% en absorbancia al 450 nm (la OD450) de las células control de únicamente virus. Mediante el gráfico en la Figura 8 se muestran los resultados para diversos anticuerpos de la presente invención mientras que los resultados que usan los fragmentos Fab están representados en la gráfica de la Figura 9.

Antecedentes y Referencias Citadas:

imagen1

LISTADO DE SECUENCIAS

<110>Young, James F. Koenig, Scott Johnson, Leslie S. Huse, William D. Wu, Herren Watkins, Jeffry D.

<120>Anticuerpos Neutralizantes de Ultra Alta Afinidad <130>469201-520

<140>

<141>

<150>60/178,426 <151>27-01-2000 <160>26

<170>PatentIn Ver. 2.1

<210>1 <211>106

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena variable de la cadena ligera de anticuerpo quimérico humano ratón

<400>1

imagen1

<210>2

<211>120

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena variable de la cadena pesada de anticuerpo quimérico humano ratón

<400>2

imagen1

<210>3 <211>10

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de aminoácido de la región determinante de complementariedad L1 del anticuerpo anti-RSV de referencia

<400>3

imagen1

<210>4 <211>7

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de aminoácido de la región determinante de complementariedad L2 del anticuerpo anti-RSV de referencia

imagen2

<210>5 <211>9

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de aminoácido de la región determinante de complementariedad L3 del anticuerpo anti-RSV de referencia

<400>5

imagen1

<210>6 <211>7

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de aminoácido de la región determinante de complementariedad H1 del anticuerpo anti-RSV de referencia

<400>6

imagen1

<210>7 <211>16

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de aminoácido de la región determinante de complementariedad H2 del anticuerpo anti-RSV de referencia

<400>7

imagen1

<210>8 <211>10

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de aminoácido de la región determinante de complementariedad H3 del anticuerpo anti-RSV de referencia

imagen1

<400>8

<210>9 <211>7 <212>PRT <213>Secuencia Artificial

<220> <223>Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia aminoácido presente en regiones determinantes complementariedad de alta afinidad de los anticuerpos de invención

de de la

<400>9

imagen1

<210>10 <211>7 <212>PRT <213>Secuencia Artificial

<220> <223>Descripción de aminoácido presente complementariedad de invención

la Secuencia Artificial: Secuencia en las regiones determinantes alta afinidad de los anticuerpos de de de la

<400>10

imagen1

<210>11 <211>10 <212>PRT <213>Secuencia Artificial

<220> <223>Descripción de aminoácido presente complementariedad de invención

la Secuencia Artificial: Secuencia en las regiones determinantes alta afinidad de los anticuerpos de de de la

<400>11

imagen1

<210>12 <211>7 <212>PRT <213>Secuencia Artificial

<220> <223>Descripción de aminoácido presente complementariedad de invención

la Secuencia Artificial: Secuencia en las regiones determinantes alta afinidad de los anticuerpos de de de la

<400>12

imagen1

<210>13 <211>7 <212>PRT <213>Secuencia Artificial

<220> <223>Descripción de aminoácido presente complementariedad de invención

la Secuencia Artificial: Secuencia en las regiones determinantes alta afinidad de los anticuerpos de de de la

<400>13

imagen1

<210>14 <211>9 <212>PRT <213>Secuencia Artificial

<220> <223>Descripción de aminoácido presente complementariedad de invención

la Secuencia Artificial: Secuencia en las regiones determinantes alta afinidad de los anticuerpos de de de la

<400>14

imagen1

<210>15

<211>9

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción

de la Secuencia Artificial: Secuencia de

aminoácido

presente en las regiones determinantes de

complementariedad de alta afinidad de los anticuerpos de la invención

<400>15

imagen1

<210>16 <211>9 <212>PRT <213>Secuencia Artificial

<220> <223>Descripción de aminoácido presente complementariedad de invención

la Secuencia Artificial: Secuencia en las regiones determinantes alta afinidad de los anticuerpos de de de la

<400>16

imagen1

<210>17 <211>106

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de aminoácido de la región variable de la cadena ligera del clon 1 de la Figura 3A

<400>17

imagen1

<210>18 <211>120

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de aminoácido de la región variable de la cadena pesada del clon 1 de la Figura 3B

<400>18

imagen1

<210>19 <211>106

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de aminoácido de la región variable de la cadena ligera del clon 2 de la Figura 4A

<400>19

imagen1

<210>20 <211>120

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de aminoácido de la región variable de la cadena pesada del clon 2 de la Figura 4B

<400>20

imagen1

<210>21 <211>106

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de aminoácido de la región variable de la cadena ligera del clon 3 de la Figura 5A

<400>21

imagen1

<210>22 <211>120

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de aminoácido de la región variable de la cadena pesada del clon 3 de la Figura 5B

<400>22

imagen1

<210>23 <211>106

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de aminoácido de la región variable de la cadena ligera del clon 22 de la Figura 6A

<400>23

imagen1

<210>24 <211>120

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de aminoácido de la región variable de la cadena pesada del clon 22 de la Figura 6B

<400>24

imagen1

<210>25 <211>106

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de aminoácido de la región variable de la cadena ligera del clon 23 de la Figura 7A

<400>25

imagen1

<210>26 <211>120

<212>PRT

<213>Secuencia Artificial

<220>

<223>Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de aminoácido de la región variable de la cadena pesada del clon 23 de la Figura 7B

<400>26

imagen1

Claims (39)

1. REIVINDICACIONES

   1.Una inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad aislada que se une específicamente con una constante de afinidad (Ka) de al menos 1010 M-1, al mismo epítopo de un antígeno F de virus sincitial respiratorio (RSV, del inglés “Respiratory Syncytial Virus”) como un anticuerpo compuesto de una región variable de la cadena pesada (VH) que tiene la secuencia de aminoácidos SEC. ID. Nº: 2 (Figura 1B) y una región variable de la cadena ligera (VL) que tiene la secuencia de aminoácidos SEC. ID. Nº: 1 (Figura 1A), donde la inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad comprende una o más sustituciones de residuo de aminoácidos en una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs, del inglés “Complementary Determining Regions”) en comparación con un anticuerpo existente que comprende:

   (i) una VL que comprende las siguientes secuencias de

   CDR: (SEC. ID. Nº: 3),

   imagen1

   imagen1 (SEC. ID. Nº: 4), y

   imagen1 (SEC. ID. Nº: 5) y

   (ii) una VH que comprende las siguientes secuencias de CDR:

   imagen1 (SEC. ID. Nº: 6), (SEC. ID. Nº: 7), y

   imagen1

   imagen1 (SEC. ID. Nº: 8),

   en las que dichas sustituciones de residuos de aminoácidos se realizan en las posiciones enmarcadas,

   y dichas una o más sustituciones de aminoácidos tienen el efecto de producir un incremento en la Ka en comparación con el anticuerpo existente.
2. 2.La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de la reivindicación 1 que tiene una constante de afinidad (ka) de al menos 1011 M-1 .
3. 3.La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de la reivindicación 1 ó 2, en la que la inmunoglobulina neutraliza RSV tal como se mide mediante el ensayo de microneutralización descrito en el Ejemplo 2.
4. 4.La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la inmunoglobulina comprende una VH CDR 1 que tiene la secuencia de aminoácidos

   imagen1 (SEC. ID. Nº: 9) o (SEC. ID. Nº: 10).

   imagen1
5. 5.La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en las que la inmunoglobulina comprende una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 11).

   imagen1
6. 6.La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en las que la inmunoglobulina comprende una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 12)ó (SEC. ID. Nº: 13).

   imagen1
7. 7.La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en las que la inmunoglobulina comprende una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos

   imagen1 (SEC. ID. Nº: 14), (SEC. ID. Nº: 15) ó

   imagen1 (SEC. ID. Nº: 16).

   imagen1
8. 8.La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha inmunoglobulina comprende:

   a.

   Una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 9);

   b.

   Una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 7);

   c.

   Una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 11);

   d.

   Una VL CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 3);

   e.

   Una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 12); y

   f.

   Una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 14) o

   imagen1

   imagen1

   imagen1

   imagen1 (SEC. ID. Nº: 15).

   imagen1
9. 9.La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de la reivindicación 1, en la que la inmunoglobulina comprende una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 9, una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 11; una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 4; y una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 14.

10. 10.

    La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de la reivindicación 1, en la que la inmunoglobulina comprende una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 9; una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 11; una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 12; y una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 5.

11. 11.

    La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de cualquiera de la reivindicación 1, en la que la inmunoglobulina comprende una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 10; una VH

    CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 11; una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 12; y una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 14.

12. 12.

    La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de la reivindicación 1 ó 2, en la que la inmunoglobulina comprende una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 9; una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 11; una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 12; y una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 14.

13. 13.

    La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de la reivindicación 1 a 2, en la que la inmunoglobulina comprende una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 9; una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 11; una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 12; y una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 15.

14. 14.

    La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de la reivindicación 1, en la que dicha inmunoglobulina comprende:

    a.

    Una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 9);

    b.

    Una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 7);

    c.

    Una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 11);

    d.

    Una VL CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 3);

    e.

    Una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 4); y

    f.

    Una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 14).

15. 15.

    La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de la reivindicación 1, en la que dicha inmunoglobulina comprende:

    a.

    Una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 9);

    b.

    Una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 7);

    c.

    Una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 11);

    d.

    Una VL CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 3);

    e.

    Una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 12); y

    f.

    Una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 5)

16. 16.

    La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de la reivindicación 1, en la que dicha inmunoglobulina comprende:

17. 17.

    La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la inmunoglobulina es un anticuerpo tetramérico, un fragmento Fab, un F(ab)’2, un dímero de cadena pesada-ligera o una estructura de cadena sencilla.

18. 18.

    La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que la inmunoglobulina es un anticuerpo monoclonal.

19. 19.

    La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que la inmunoglobulina es un anticuerpo humanizado.

20. 20.

    La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la inmunoglobulina comprende las secuencias framework descritas en la Figura 1, 3, 4, 5, 6 ó 7.

21. 21.

    La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de la reivindicación 1, en la que la inmunoglobulina comprende una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 17 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 18.

22. 22.

    La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de la reivindicación 1, en la que la inmunoglobulina comprende una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 19 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 20.

23. 23.

    La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de la reivindicación 1, en la que la inmunoglobulina comprende una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 21 y

    una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 22.

24. 24.

    La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de la reivindicación 1 ó 2, en la que la inmunoglobulina comprende una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 23 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 24.

25. 25.

    La inmunoglobulina neutralizante de alta afinidad de la reivindicación 1 ó 2, en la que la inmunoglobulina comprende una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 25 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. Nº: 26.

26. 26.

    Una composición que comprende la inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha inmunoglobulina está en suspensión en un vehículo farmacológicamente aceptable.

27. 27.

    La composición de la reivindicación 26, para usar como medicamento.

28. 28.

    La composición de la reivindicación 26, para usar en la prevención de una enfermedad causada por RSV en un paciente en riesgo de dicha enfermedad.

29. 29.

    La composición de la reivindicación 26, para usar en el tratamiento de una enfermedad causada por RSV en un paciente aquejado con dicha enfermedad.

30. 30.

    El uso de la composición de la reivindicación 26, para la producción de un medicamento para prevenir una enfermedad causada por RSV en un paciente en riesgo de dicha enfermedad.

31. 31.

    El uso de la composición de la reivindicación 26, para la producción de un medicamento para tratar una enfermedad causada por RSV en un paciente afligido con dicha enfermedad.

32. 32.

    La inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 para usar como medicamento.

33. 33.

    La inmunoglobulina de la reivindicación 32, para usar en la prevención de una enfermedad causada por RSV en un paciente en riesgo de dicha enfermedad.

34. 34.

    La inmunoglobulina de la reivindicación 32, para usar en el tratamiento de una enfermedad causada por RSV en un paciente aquejado con dicha enfermedad.

35. 35.

    El uso de la inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 para producir un medicamento para prevenir una enfermedad causada por RSV en un paciente en riesgo de dicha enfermedad.

36. 36.

    El uso de la inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 para producir un medicamento para tratar una enfermedad causada por RSV en un paciente aquejado con dicha enfermedad.

37. 37.

    El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 30, 31, 35 ó 36, en la que el paciente es un humano.

38. 38.

    La composición de las reivindicaciones 28 ó 29, en la que el paciente es un humano.

39. 39.

    La inmunoglobulina de las reivindicaciones 33 ó 34, en la que el paciente es un humano.