PT1265928E

PT1265928E - Anticorpos neutralizantes com afinidade ultra-elevada

Info

Publication number: PT1265928E
Application number: PT01903352T
Authority: PT
Inventors: Leslie S Johnson; James F Young; Scott Koenig; William D Huse; Herren Wu; Jeffry D Watkins
Original assignee: Medimmune Llc
Priority date: 2000-01-27
Filing date: 2001-01-26
Publication date: 2010-09-30
Also published as: EP2289550A2; US20040131609A1; CA2398466A1; AU2010201090B2; EP2289550A3; US20100266614A1; ES2349348T3; WO2001055217A1; AU3118001A; JP2010180207A; US20020164326A1; US7740851B2; DE60142614D1; DK1265928T3; AU785038B2; AU2010201090A1; CY1111542T1; US20120135006A1; EP1265928A1; ATE474854T1

Description

ΡΕ1265928 1

DESCRIÇÃO "ANTICORPOS NEUTRALIZANTES COM AFINIDADE ULTRA-ELEVADA"

FUNDAMENTO DO INVENTO 0 presente invento está relacionado com novos anticorpos neutralizantes com afinidade ultra-elevada. A actual incidência de infecção causada por micróbios resistentes ou difíceis de controlar tem criado a necessidade de novas abordagens para o controlo de tais organismos, assim como para o tratamento dos já infectados.

Entre os agentes infecciosos mais difíceis de controlar e tratar encontram-se os vírus. Por exemplo, o vírus dos sincícios respiratórios ("RSV") é a principal causa de doença respiratória aguda em crianças de tenra idade que dão entrada nos hospitais e a principal causa de infecção das vias respiratórias inferiores em crianças de tenra idade. Um grande obstáculo à produção de uma vacina eficaz contra agentes tais como RSV tem sido a questão da segurança. Por outro lado, a utilização de imunoglobulinas contra tais agentes virais tem tido alguma importância. Por exemplo, existem estudos que mostraram que uma imuno-globulina de título elevado contra RSV é eficaz na profilaxia e na terapia de infecções por RSV em modelos animais. 2 ΡΕ1265928

Uma abordagem alternativa tem sido o desenvolvimento de anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais neutralizantes, com elevada actividade neutralizante especifica. Uma desvantagem desta via tem sido a necessidade de produzir anticorpos humanos em lugar dos de ratinho ou de rato e assim minimizar o desenvolvimento de respostas de anticorpos humanos anti-ratinho ou anti-rato que, potencialmente, resultam em patologia imune adicional.

Uma abordagem alternativa tem sido a produção de anticorpos quiméricos humano-murino em que os genes codificadores das regiões variáveis das cadeias pesada e leve de ratinho foram acoplados aos genes das regiões constantes das cadeias pesada e leve humanas para produzir anticorpos quiméricos ou híbridos.

Nalguns casos, as CDRs de ratinho foram enxertadas em regiões constantes e estruturais humanas, com alguns dos aminoácidos estruturais de ratinho substituídos pelos correspondentes aminoácidos humanos para proporcionar um anticorpo "humanizado". [Queen, Patente U.S. N° 5693761 e 5693762]. No entanto, tais anticorpos possuem regiões CDR de ratinho intactas e demonstraram eficácia mista, produzindo afinidades muitas vezes inferiores a 107 a ΙΟ8 ΝΓ1.

Um anticorpo anti-RSV humanizado com boa afinidade foi preparado e está actualmente a ser comercializado. [Ver: Johnson, Pat. U.S. N° 5824307]. 3 ΡΕ1265928 A produção de anticorpos de elevada afinidade será desejável do ponto de vista da capacidade de neutralização de tais anticorpos, assim como relativamente a aspectos mais práticos da necessidade de produzir menos anticorpo para se conseguir um grau desejável de eficácia clinica, cortando assim custos de produção e/ou permitindo um maior grau de eficácia clinica para o mesmo volume administrado.

BREVE SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento proporciona imunoglobulina isolada, neutralizante e de elevada afinidade, de acordo com a reivindicação 1 e composições de acordo com a reivindicação 26. 0 invento ainda proporciona utilizações das referidas composições, medicamentos e anticorpos para o tratamento ou prevenção de uma doença causada por RSV conforme detalhado nas reivindicações 27-39. 0 presente invento está relacionado com anticorpos neutralizantes de elevada afinidade e seus fragmentos activos apresentando constantes de afinidade de pelo menos IO10 M 1 e mesmo ΙΟ11 M_1, e mais especificamente com imunoglobulina monoclonal neutralizante, incluindo anticorpos e/ou fragmentos activos dos mesmos, em que o anticorpo e/ou fragmento possui regiões constantes humanas. 0 presente invento soluciona os problemas atrás 4 ΡΕ1265928 referidos ao proporcionar anticorpos neutralizantes de elevada afinidade, sem a presença de regiões CDR de ratinho intactas que causem reacções de anticorpos humanos anti-ratinho (HAMA) e com actividade neutralizante de elevada afinidade suficiente para reduzir o custo e a eficácia da produção global.

Um aspecto do presente invento está relacionado com anticorpos neutralizantes de elevada afinidade com constantes de afinidade de pelo menos ΙΟ10 ΝΓ1 e mesmo 1011 M 1 e com especificidade para determinantes antigénicos específicos, tais como os apresentados pelas proteínas expressas por vírus.

Um objectivo do presente invento é proporcionar tais anticorpos neutralizantes de elevada afinidade com especificidade para um antigénio F de RSV, como sejam os antigénios expressos por células animais infectadas por RSV num mamífero, especialmente um ser humano. A imunoglobulina neutralizante de elevada afinidade, incluindo anticorpos e/ou seus fragmentos activos, do presente invento é específica do antigénio F expresso pelo referido RSV e também expresso nas superfícies de células infectadas com RSV (a presença de tais antigénios na superfície celular causa fusão das células em sincícios).

Uma imunoglobulina neutralizante de elevada 5 ΡΕ1265928 afinidade, incluindo anticorpos e/ou seus fragmentos acti-vos, do presente invento liga-se ao mesmo epitopo de um antigénio F de RSV de forma semelhante ao anticorpo cuja região variável da cadeia leve tem a sequência SEQ ID N0:1 (mostrada na Figura IA) e cuja região variável da cadeia pesada tem a sequência SEQ ID NO:2 (mostrado na Figura 1B). É um objectivo do presente invento proporcionar anticorpos neutralizantes de afinidade ultra-elevada tendo substancialmente as regiões estruturais da imunoglobulina descrita na Figura 1 (com a mesma especificidade daquela imunoglobulina, a qual é uma estrutura de anticorpo anti-RSV) mas em que as imunoglobulinas, incluindo anticorpos e seus fragmentos activos, do presente invento possuem uma ou mais CDRs (regiões determinantes de complementaridade) cujas sequências de aminoácidos são independentes das do chamado anticorpo de referência, ainda que tais referidas sequências possam, nalguns casos, diferir em não mais de um aminoácido e isto possa estar limitado a uma diferença em apenas uma das referidas regiões CDR.

As novas imunoglobulinas do presente invento diferirão do anticorpo na Figura 1 (daqui em diante, o "anticorpo básico" ou "anticorpo de referência" ou "imunoglobulina de referência") apenas nas sequências de uma ou mais CDRs e, numa realização mais preferida, estas diferenças ocorrem apenas nas CDRs L2, L3, Hl e H3.

Realizações especialmente preferidas do presente 6 ΡΕ1265928 invento Figura cadeias possuem as sequências estruturais descritas na 1, possuindo assim as sequências variáveis das pesada e leve descritas nas Figuras 3, 4, 5, 6 e 7.

Numa realização, os anticorpos neutralizantes de elevada afinidade do invento incluem uma região constante humana.

Numa realização preferida, um anticorpo neutra-lizante de elevada afinidade para RSV do invento, incluindo os seus fragmentos activos, com uma constante de afinidade (Ka) de pelo menos IO10 M”1 e mesmo ΙΟ11 ΝΓ1, é uma imunoglobulina recombinante, como seja um anticorpo ou seu fragmento activo, que inclui uma região constante humana e regiões estruturais para as cadeias pesada e leve em que pelo menos uma porção da região estrutural deriva de um anticorpo humano (ou de uma sequência de consenso de uma região estrutural de anticorpo humano), um exemplo das referidas regiões estruturais descritas para as sequências de anticorpo da Figura 1.

Numa realização, todas as regiões estruturais derivam de um anticorpo humano (ou de uma sequência de consenso humana).

Numa outra realização altamente especifica, um anticorpo neutralizante de elevada afinidade para RSV, com uma afinidade de pelo menos IO10 M_1, é um anticorpo recombinante tendo uma região constante humana, uma ou mais 7 ΡΕ1265928 CDRs que derivam de um anticorpo não humano em que pelo menos um dos aminoácidos, em pelo menos uma das CDRs, está alterado e em que a totalidade ou uma porção da região estrutural deriva de um anticorpo humano (ou é uma sequência de consenso de uma região estrutural de anticorpo humano).

Numa realização separada, uma imunoglobulina neutralizante humanizada que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo básico ou de referência ou imunoglobulina cujas cadeias variáveis estão apresentadas na Figura 1 e que possui uma afinidade de pelo menos ΙΟ11 M_1, inclui pelo menos um dos aminoácidos que se seguem nas seguintes posições das CDRs: uma alanina na posição 2 de CDR Hl, uma fenilalanina na posição 6 de CDR H3, uma fenilalanina na posição 3 de CDR L2 e uma fenilalanina na posição 5 de CDR L3. Outras realizações compreendem outras substituições únicas de aminoácidos nestas posições.

Constitui um outro objectivo do presente invento proporcionar composições compreendendo as imunoglobulinas aqui descritas, em que as referidas estruturas são suspensas num diluente ou excipiente farmacologicamente aceitável.

Constitui ainda um outro objectivo do presente invento é proporcionar composições e medicamentos para a prevenção e/ou tratamento do virus dos sincicios respiratórios, em que a composição/medicamento se destina a 8 ΡΕ1265928 ser administrado a um doente em risco ou infectado pelo virus, a referida composição ou medicamento contendo uma imunoglobulina do invento, como as que possuem os referidos anticorpos com as propriedades de especificidade e afinidade aqui descritas para as imunoglobulinas do invento.

DEFINIÇÕES 0 termo "antigénio" refere-se a uma estrutura, muitas vezes um polipéptido ou proteína, presente na superfície de um microrganismo, como seja um vírus, para o qual um anticorpo tem afinidade e especificidade. 0 termo "determinante antigénico" refere-se a um local de ligação específico numa estrutura antigénica, para a qual uma imunoglobulina, como seja um anticorpo, tem especificidade e afinidade. Assim, uma partícula, como seja um vírus, pode representar um antigénio mas pode ter na sua superfície uma série de locais antigénicos separados e diferentes, como acontece quando o vírus possui uma série de proteínas de superfície diferentes e cada um representa um potencial local de ligação distinto para uma imunoglobulina . 0 termo "imunoglobulina" refere-se a uma proteína ou polipéptido tendo especificidade e afinidade para um antigénio ou determinante antigénico. Este termo inclui anticorpos, normalmente descritos como tetraméricos, assim 9 ΡΕ1265928 como fragmentos activos dos mesmos, tais fragmentos tendo especificidade e afinidade para antigénios ou determinantes antigénicos. Assim, "imunoglobulina" como aqui usado inclui anticorpos e todos os seus fragmentos activos. 0 termo "anticorpo" refere-se a uma proteína ou polipéptido tendo afinidade para um determinante antigéni-co, geralmente um encontrado na superfície de um microrganismo, especialmente um vírus. Tal anticorpo é normalmente composto por 4 cadeias e é portanto tetramérico. 0 termo "imunoglobulina neutralizante" ou "anticorpo neutralizante" refere-se à capacidade das imunoglo-bulinas, incluindo anticorpos, do presente invento para reduzir a replicação de microrganismos, especialmente vírus, em organismos assim como em culturas celulares. Uma indicação de tal capacidade é os dados dos ensaios de microneutralização descritos abaixo. Tal estrutura possui regiões variáveis e constantes, pelo que as regiões variáveis são principalmente responsáveis pela determinação da especificidade do anticorpo e compreenderão regiões determinantes de complementaridade (CDRs). 0 termo "região determinante de complementaridade" ou "CDR" refere-se a regiões variáveis das cadeias H (pesada) ou L (leve) contendo as sequências de amino-ácidos capazes de se ligarem especificamente a alvos antigénicos. Estas regiões CDR são responsáveis pela especificidade básica do anticorpo para uma estrutura de 10 ΡΕ1265928 determinante antigénico particular. Tais regiões são também referidos como "regiões hipermutáveis". O termo "fragmento activo" refere-se a uma porção de um anticorpo que, por si só, possui afinidade elevada para um determinante antigénico e possui uma ou mais CDRs responsáveis por tal especificidade. Exemplos não limitantes incluem Fab, F(ab)2, dímeros das cadeias pesada-leve e estruturas de cadeia simples, como seja uma cadeia leve completa ou uma cadeia pesada completa. O termo "especificidade" refere-se à capacidade de um anticorpo para se ligar preferencialmente a um local antigénico versus um local antigénico diferente e não implica necessariamente afinidade elevada. O termo "afinidade" refere-se ao grau em que um anticorpo se liga a um antigénio de forma a desviar o equilíbrio de um antigénio e de um anticorpo no sentido da presença de um complexo formado pela sua ligação. Assim, sempre que um antigénio e um anticorpo são combinados em concentração relativamente igual, um anticorpo de elevada afinidade ligar-se-á ao antigénio disponível, de forma a desviar o equilíbrio no sentido de elevada concentração do complexo resultante. O termo "constante de afinidade" refere-se a uma constante de associação usada para medir a afinidade de um anticorpo para um antigénio. Quanto maior a constante de 11 ΡΕ1265928 afinidade, maior a afinidade da imunoglobulina para o antigénio ou determinante antigénico e vice-versa. Uma constante de afinidade é uma constante de ligaçao em unidades do inverso da molaridade. Tal constante é facilmente calculada a partir das constantes de velocidade para as reacções de associação-dissociação, conforme medido pela metodologia de cinéticas convencional para reacções com anticorpos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a sequência de aminoácidos das regiões variáveis das cadeias leve e pesada de um anticorpo anti-RSV em que as regiões CDR estão sublinhadas, enquanto os resíduos não sublinhados formam as regiões estruturais das regiões variáveis de cada cadeia. Neste anticorpo, as CDRs derivam de um anticorpo de ratinho anti-RSV, enquanto as regiões estruturais consistem essencialmente em sequências derivadas de um anticorpo humano. Para cada CDR, estão a negrito as posições em que as substituições de aminoácidos foram usadas para conseguir as CDRs de elevada afinidade e os anticorpos aqui descritos. De acordo com o que é descrito, tais substituições foram apenas nas CDRs L2, L3, Hl e H3. A Figura IA mostra a região variável da cadeia leve e a Figura 1B mostra a região variável das cadeias leve e pesada, respectivamente. As sequências da região constante não são apresentadas. Estas sequências estão presentes no clone básico (ver Tabela 2), designado IX-493 ao longo desta descrição (i.e., SWSG - significando 12 ΡΕ1265928 uma serina (S) na posição chave (ver Tabelas 1 e 3) da CDR Hl de elevada afinidade, um triptofano (W) na posição chave da CDR H3 de elevada afinidade, uma serina (S) na posição chave da CDR L2 de elevada afinidade e uma glicina (G) na posição chave da CDR L3 de elevada afinidade) . Para fins desta descrição, este é o "anticorpo de referência". A Figura 2 mostra as comparações das afinidades para uma série particular de clones úteis ou de elevada afinidade. As designações dos clones estão à esquerda da legenda à direita do desenho juntamente com as substituições indicadas nas CDRs Hl, H3, L2 e L3 mostradas à direita da legenda. As medições são por ELISA (DO a 560 nm mostradas no eixo da esquerda). 0 clone L1FR representa os resultados da estrutura do anticorpo de referência da Figura 1. A Figura 3 mostra as regiões variáveis das cadeias pesada e leve para a realização preferida do clone 1 (Tabela 2) do invento aqui descrita. As regiões CDR estão sublinhadas, enquanto as diferenças de aminoácidos relativamente ao anticorpo da Figura 1 estão indicadas a negrito. Assim, este anticorpo preferido (i.e., de elevada afinidade) possui várias das CDRs de elevada afinidade (Tabela 3) que dão origem a uma maior afinidade (cerca de IO10 RT1) relativamente ao anticorpo básico ou de referência. A Figura 4 mostra as regiões variáveis da cadeia 13 ΡΕ1265928 pesada e leve para a realização preferida do clone 2 (Tabela 2) do invento aqui descrito. As regiões CDR estão sublinhadas enquanto as diferenças de aminoácidos relativamente ao anticorpo da Figura 1 estão indicadas a negrito. Assim, este anticorpo preferido (i.e., de elevada afinidade) possui várias das CDRs de elevada afinidade (Tabela 3) que dão origem a uma maior afinidade (cerca de IO10 M_1) relativamente ao anticorpo básico ou de referência. A Figura 5 mostra as regiões variáveis da cadeia pesada e leve para a realização preferida do clone 3 (Tabela 2) do invento aqui descrito. As regiões CDR estão sublinhadas enquanto as diferenças de aminoácidos relativamente ao anticorpo da Figura 1 estão indicadas a negrito. Assim, este anticorpo preferido (i.e., de elevada afinidade) possui várias das CDRs de elevada afinidade (Tabela 3) que dão origem a uma maior afinidade (cerca de IO10 M 1) relativamente ao anticorpo básico ou de referência. A Figura 6 mostra as regiões variáveis da cadeia pesada e leve para a realização preferida do clone 22 (Tabela 4) do invento aqui descrito. As regiões CDR estão sublinhadas enquanto as diferenças de aminoácidos relativa-mente ao anticorpo da Figura 1 estão indicadas a negrito. Assim, este anticorpo mais preferido (i.e., com maior afinidade) possui várias das CDRs de elevada afinidade (Tabela 3) que dão origem a uma maior afinidade (cerca de ΙΟ11 ΝΓ1) relativamente ao anticorpo básico ou de referência. 14 ΡΕ1265928 A Figura 7 mostra as regiões variáveis da cadeia pesada e leve para a realização preferida do clone 23 (Tabela 4) do invento aqui descrito. As regiões CDR estão sublinhadas enquanto as diferenças de aminoácidos relativamente ao anticorpo da Figura 1 estão indicadas a negrito. Assim, este anticorpo preferido (i.e., anticorpo com maior afinidade) possui várias das CDRs de elevada afinidade (Tabela 3) que dão origem a uma maior afinidade (cerca de ΙΟ11 ΝΓ1) relativamente ao anticorpo básico ou de referência. A Figura 8 mostra os resultados de experiências de microneutralização com vários clones de anticorpos com afinidade ultra-elevada aqui descritos. Os aminoácidos presentes nas posições chave das regiões determinantes de complementaridade de afinidade ultra-elevada (ver Tabela 3) estão apresentados à direita pela ordem Hl, H3, L2 e L3 (como igualmente mostrado na Tabela 2 em que os clones estão simplesmente numerados, mas a tabela pode ser comparada com esta figura com base nos aminoácidos usados nas posições criticas como descrito na Tabela e na legenda à direita desta figura). Assim, para o clone 4D2-7, existe uma alanina (A) na posição chave da CDR Hl de elevada afinidade, uma fenilalanina (F) na posição chave da CDR H3 de elevada afinidade, uma fenilalanina (F) na posição chave de CDR L2 de elevada afinidade e uma fenilalanina (F) na posição chave da CDR L3 de elevada afinidade. Resumidamente, cerca de 25000 células HEp-2 foram adicionadas a 15 ΡΕ1265928 cada um dos alvéolos de uma placa de 96 alvéolos juntamente com RSV e uma determinada concentração do anticorpo (a concentração de anticorpo por alvéolo está apresentada no eixo das abcissas - Ver Exemplo 2 para detalhes exactos). Após 5 dias de crescimento, as células foram fixadas, tratadas com MAb anti-F biotinilado, depois ligadas ao complexo avidina-peroxidase e a capacidade da peroxidase ligada para reagir com o ácido tionitrobenzóico foi determinada através da medição da D.O. a 450 nm. A quantidade da proteína F presente foi um indicador do grau de replicação virai, resultando assim em mais reacção do substrato com a peroxidase e aumento da absorção. Assim, quanto mais baixo o valor da DO 450, maior a capacidade neutralizante da concentração indicada de determinado anticorpo. Aqui, IX-493 (SWSG- significando uma serina (S) na posição chave da CDR Hl de elevada afinidade, um triptofano (W) na posição chave da CDR H3 de elevada afinidade, uma serina (S) na posição chave da CDR L2 de elevada afinidade e uma glicina (G) na posição chave da CDR L3 de elevada afinidade) é o "anticorpo de referência" (também designado L1FR e IX493L1 FR). A Figura 9 mostra os resultados dos ensaios de microneutralização de vários anticorpos aqui descritos, mas em que apenas os fragmentos Fab foram empregues para a neutralização da replicação pelos anticorpos. Aqui, IX-493 (SWSG) é o fragmento Fab de referência e deriva do anticorpo Medi-493 (ver: Johnson et al., (1997) - ref. 23). 16 ΡΕ1265928 A Figura 10 mostra os resultados de microneu-tralização para um anticorpo especifico de RSV comparativamente com experiências semelhantes para os fragmentos Fab do mesmo anticorpo. Aqui, Medi 493 representa o anticorpo enquanto IX-493 LIFR representa o fragmento Fab deste anticorpo. As outras linhas são para os fragmentos Fab de vários dos anticorpos produzidos de acordo com o presente invento (dando várias designações do código letra-digito para identificação interna, mas não estando relacionado com a sua eficácia relativa como anticorpos neutralizantes).

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O presente invento é dirigido a anticorpos neutralizantes de elevada afinidade e seus fragmentos activos tendo constantes de afinidade de pelo menos IO10 M~ 2). Os fragmentos activos destes anticorpos são fragmentos contendo pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) de elevada afinidade.

Com o advento de métodos de biologia molecular e tecnologia recombinante, é agora possível produzir moléculas de anticorpo por meios recombinantes e assim gerar sequências que codificam sequências de aminoácidos específicas encontradas na estrutura polipeptídica dos anticorpos. Tais anticorpos podem ser produzidos através da clonagem das sequências dos genes codificadores das cadeias polipeptídicas dos referidos anticorpos ou por síntese 17 ΡΕ1265928 directa das referidas cadeias polipeptidicas, com montagem in vitro das cadeias sintetizadas para formar estruturas tetraméricas (H2L2) activas com afinidade para epitopos e determinantes antigénicos específicos. Isto permitiu a produção fácil de anticorpos, de diferentes espécies e fontes, tendo sequências características de anticorpos neutrali-zantes.

Independentemente da fonte de imunoglobulinas, ou como são construídas por via recombinante, ou como são sintetizadas, in vitro ou in vivo, usando animais transgénicos, tais como vacas, cabras e ovelhas, usando culturas celulares de escala laboratorial ou comercial, em bio-reactores ou por síntese química directa não empregando organismos vivos em qualquer fase do processo, todas as imunoglobulinas possuem uma estrutura tridimensional global semelhante. No caso de um anticorpo, esta estrutura é muitas vezes referida como H2L2 e refere-se ao facto de os anticorpos normalmente compreenderem 2 cadeias de amino-ácidos leves (L) e 2 cadeias de aminoácidos pesadas (H) . Ambas as cadeias possuem regiões capazes de interagir com um alvo antigénico estruturalmente complementar. As regiões que interagem com o alvo são referidas como regiões "variáveis" ou "V" e são caracterizadas por diferenças na sequência de aminoácidos entre anticorpos de diferente especificidade antigénica. A região variável das cadeias H ou L possui as sequências de aminoácidos capazes de especificamente se 18 ΡΕ1265928 ligarem aos alvos antigénicos. Dentro destas sequências encontram-se sequências mais pequenas designadas "hiper-variáveis" devido à sua extrema variabilidade entre anticorpos ou fragmentos activos de diferente especificidade. Tais regiões hipervariáveis são igualmente referidas como "regiões determinantes de complementaridade" ou regiões "CDR". Estas regiões CDR são responsáveis pela especificidade básica do anticorpo para uma estrutura determinante antigénica particular.

As CDRs representam segmentos de aminoácidos não contíguos dentro das regiões variáveis mas, independentemente das espécies, encontrou-se que as localizações destas sequências de aminoácidos críticas dentro das regiões variáveis das cadeias pesada e leve possuem localização semelhante dentro das sequências de aminoácidos das cadeias variáveis. As cadeias pesada e leve variável de todos os anticorpos canónicos possuem cada uma 3 regiões CDR, cada uma não contígua com as outras (designadas Ll, L2, L3, Hl, H2, H3) para as respectivas cadeias leve (L) e pesada (H) . As regiões CDR aceites foram descritas por Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977). O esquema de numeração está apresentado nas figuras, em que as CDRs estão sublinhadas e os números seguem o esquema de Kabat.

Em todas as espécies de mamífero, os polipéptidos de anticorpo possuem regiões constantes (i.e., altamente conservadas) e variáveis, e, nestas últimas, existem as CDRs e as chamadas "regiões estruturais" constituídas por 19 ΡΕ1265928 sequências de aminoácidos dentro da região variável da cadeia pesada ou leve, mas fora das CDRs.

As imunoglobulinas descritas de acordo com o presente invento conferem afinidade extremamente elevada (da ordem de IO10 M_1 e mesmo IO10 M_1, para a constante de afinidade ou Ka, definido como uma constante de associação que descreve a ligação do anticorpo e do antigénio como ligandos) para o antigénio F das proteínas do RSV expressas na superfície do RSV, assim como na superfície das células infectadas com RSV. Os anticorpos de elevada afinidade do presente invento são anticorpos neutralizantes e consequentemente reduzem a replicação do RSV em organismos assim como em culturas celulares, ao mesmo tempo mantendo homo-logia suficiente relativamente às sequências de aminoácidos do anticorpo do recipiente, de forma a evitar patologia imunológica adversa. Esta última característica é conseguida através da utilização de regiões constantes semelhantes aos do organismo recipiente, como seja um mamífero e mais especialmente um ser humano. Esta característica é também conseguida através da utilização de sequências de aminoácidos estruturais semelhantes, senão idênticas, às encontradas em anticorpos do organismo recipiente. Neste último caso, algumas substituições de aminoácidos podem ser nas sequências estruturais de forma a facilitar e manter a interacção de elevada afinidade entre as novas CDRs do presente invento e o antigénio para o qual os referidos anticorpos apresentam especificidade. 20 ΡΕ1265928

Como aqui usados, os termos tais como "anticorpo" e "fragmento activo" ou "fragmento" não devem ser considerados limitantes na determinação da amplitude do presente invento. Assim, o facto do termo "anticorpo" ser usado em lugar de "fragmento activo" ou "imunoglobulina" não deve ser considerado como uma limitação do invento ou da sua utilização, desde que as propriedades exigidas de especificidade e afinidade sejam apresentadas pela referida estrutura.

De acordo com o invento aqui descrito, as constantes de afinidade, que caracterizam as afinidades dos anticorpos neutralizantes de elevada afinidade e os seus fragmentos activos do presente invento, são constantes de associação e foram medidas pela cinética de formação do complexo antigénio-anticorpo, com a constante de velocidade de associação para formar o complexo sendo designada Kassoc ou Kon e a constante de dissociação sendo designada como Kdisg ou Koff. A medição de tais constantes está dentro das capacidades dos familiarizados com a matéria e os detalhes não serão aqui descritos, exceptuando a metodologia geral e as condições especificas, sempre que adequado, conforme descrito nos exemplos apresentados para melhores descrever o invento.

Os anticorpos de elevada afinidade do presente invento podem ser conseguidos, como já descrito, através da manipulação genética de sequências de genes de anticorpos adequados, i.e., sequências de aminoácidos, alterando as 21 ΡΕ1265928 sequências nucleotídicas adequadas e expressando-as numa linha celular adequada. Quaisquer sequências nucleotidicas pretendidas podem ser produzidas usando o método da muta-génese baseada em codões, como descrito, por exemplo, nas Pat. US Nos 5264563 e 5523388. Tais procedimentos permitem a produção de quaisquer frequências de resíduos de amino-ácidos em quaisquer posições de codões pretendidas dentro de um oligonucleótido. Isto pode incluir substituições completamente ao acaso de qualquer um dos 20 aminoácidos numa posição pretendida ou em qualquer sub-série específica destes. Como alternativa, este processo pode ser realizado de forma a conseguir um aminoácido particular numa posição pretendida dentro de uma cadeia de aminoácidos, tais como as novas sequências CDR de acordo com o invento. Resumindo, a sequência nucleotídica adequada para expressar qualquer sequência de aminoácidos pretendida pode ser facilmente conseguida e usando tais procedimentos as novas sequências CDR do presente invento podem ser reproduzidas. Isto resulta na capacidade de sintetizar polipéptidos, tais como anticorpos, com quaisquer sequências de aminoácidos pretendidas. Por exemplo, é agora possível determinar as sequências de aminoácidos de quaisquer domínios pretendidos de um anticorpo determinado e, facultativamente, preparar cadeias homólogas com um ou mais aminoácidos substituídos por outros aminoácidos pretendidos, de forma a obter uma gama de análogos substituídos.

Ao serem aplicados tais métodos, deve-se considerar que devido à degenerescência do código genético, 22 ΡΕ1265928 métodos tais como a síntese de oligonucleótidos ao acaso e a síntese de oligonucleótidos parcialmente degenerados incorporarão redundâncias para codões que especificam um resíduo de aminoácido particular numa determinada posição, ainda que tais métodos possam ser usados para proporcionar uma série principal de todas as sequências de aminoácidos possíveis e rastreio das que funcionem de forma óptima como estruturas de anticorpos ou para outros fins. Tais métodos estão descritos em Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 87:6378-6382 (1990) e Devlin et al., Science 249:404-406 (1990) .

De acordo com o invento aqui descrito, variantes de anticorpos melhoradas podem ser geradas através da combinação numa única estrutura polipeptídica de uma, duas ou mais novas sequências CDR de acordo com o invento, cada uma delas mostrando resultar independentemente numa maior actividade de ligação. Desta forma, várias novas sequências de aminoácidos podem ser combinadas num anticorpo, na mesma CDR ou em CDRs diferentes, para produzir anticorpos de elevada afinidade dentro do presente invento. Por exemplo, 3 dessas novas CDRs podem ser empregues e os anticorpos resultantes testados relativamente à afinidade para uma estrutura antigénica particular, como seja o antigénio F ou RSV. O resultado global será assim um processo iterativo de combinação de várias substituições de aminoácidos simples e, de forma gradual, rastreio dos anticorpos resultantes relativamente à afinidade antigénica. Tais métodos foram usados para preparar alguns dos anticorpos realizados de 23 ΡΕ1265928 acordo com o presente invento. Tais métodos também representam um meio conveniente, mas trabalhoso, de optimização das sequências de anticorpos do presente invento, especialmente as sequências das regiões CDR dos referidos anticorpos.

Usando as novas sequências e métodos do presente invento, tal abordagem evita o tempo e custo da obtenção e rastreio de todas as permutas e combinações possíveis da estrutura de anticorpo num esforço para encontrar o anticorpo com a eficiência máxima. Pelo contrário, a formação totalmente pelo acaso de uma única CDR de 10 resíduos de aminoácidos dará origem a mais de 10 triliões de variantes, um número virtualmente impossível de testar.

Este método iterativo pode ser usado para gerar substituições de aminoácidos duplas e triplas, num processo gradual, de forma a estreitar a pesquisa de anticorpos tendo uma maior afinidade.

Pelo contrário, deverá ser reconhecido que nem todas as posições dentro das sequências dos diferentes domínios de anticorpos poderão ser iguais. As substituições de qualquer tipo numa posição particular podem ser boas ou prejudiciais. Ainda, as substituições de determinados tipos de aminoácidos em determinadas posições podem igualmente ser positivas ou negativas conforme afectam a afinidade para o antigénio particular. Por exemplo, pode não ser necessário tentar todos os possíveis aminoácidos hidrofó- 24 ΡΕ1265928 bicos numa determinada posição. Pode acontecer que qualquer aminoácido hidrofóbico seja igualmente bom. Como alternativa, um aminoácido ácido ou básico numa determinada posição pode gerar grandes variações na afinidade medida. É assim necessário também aprender as "regras" da realização de tais substituições mas a determinação de tais "regras" pode não necessitar do estudo de todas as combinações e substituições possíveis - as tendências podem tornar-se aparentes após avaliação de menos do número máximo de substituições.

De acordo com o que foi dito, os anticorpos do presente invento são anticorpos de ultra-elevada afinidade, com especificidade contra o mesmo epitopo de RSV do anticorpo da Patente U.S. N° 5824307.

Ainda, as afinidades dos anticorpos de ultra-elevada afinidade do invento, tipicamente, são pelo menos 1010M_1. Devido a tais afinidades elevadas não serem facilmente mensuráveis, excepto pelo procedimentos aqui descritos, tal valor pode normalmente ser considerado como parte de uma gama e pode, por exemplo, estar dentro de 2 vezes 1010M_1 ou ser superior a 1010M_1 ou mesmo ser numericamente igual a 1010M^1. Em tais casos, a afinidade é expressa por uma constante de afinidade, a qual é uma constante de ligação, de forma a dar unidades do inverso da molaridade. Como tal, a afinidade do anticorpo para o antigénio é proporcional, ao valor desta constante (i.e., quanto maior a constante, maior a afinidade). Tal constante 25 ΡΕ1265928 é facilmente calculada a partir das constantes de velocidade para as reacções de associação-dissociação, conforme medido pela metodologia convencional das cinéticas para as reacções de anticorpos.

Numa realização especifica, os anticorpos neutra-lizantes de elevada afinidade do presente invento, possuem constantes de afinidade para os respectivos antigénios de pelo menos 1011M”1, nalguns casos sendo superior a este valor, uma gama no patamar superior da mensurabilidade.

Anticorpos neutralizantes de elevada afinidade e seus fragmentos activos podem, com vantagem, ser dirigidos contra quaisquer determinantes antigénicos pretendidos, tais como epitopos presentes em qualquer tipo de macromolécula, especialmente epitopos peptidicos presentes como parte da estrutura tridimensional de moléculas de proteína ou polipeptídicas. Tais epitopos peptidicos podem, normalmente, estar presentes nas superfícies ou, de outra forma, serem parte da estrutura de microrganismos e células, tais como células de cancro. Os microrganismos que expressam tais epitopos peptidicos incluem bactérias e vírus. Neste último caso, as proteínas e os polipeptídeos que apresentam epitopos peptidicos podem ser moléculas expressas nas superfícies dos vírus ou podem ser expressos pelas células infectadas com um vírus. Para fins de avaliação da eficácia das regras e métodos descritos de acordo com o presente invento, foi escolhido um vírus como fonte antigénica disponível para o desenvolvimento de 26 ΡΕ1265928 anticorpos no contexto do presente invento. 0 vírus escolhido para posterior análise foi o vírus dos sincícios respiratórios (RSV). Este último vírus foi escolhido por estar bem caracterizado relativamente ao seu ciclo replicativo, assim como relativamente aos determinantes antigénicos encontrados na sua superfície. Ainda, os antigénios conhecidos como sendo expressos pelas células infectadas com este vírus estão bem caracterizados. Assim, o vírus apresenta um antigénio de superfície G e um antigénio de superfície F, ambos proteínas. 0 antigénio G facilita a ligação do vírus às superfícies celulares e as proteínas F facilitam a fusão do vírus com as células. As células assim infectadas também expressam o antigénio F na sua superfície e este facto induz a fusão das células para formar um sincício, daí o nome do vírus. Ainda, este vírus é um bom alvo para análise nas linhas celulares facilmente infectadas por este vírus, as quais são bem conhecidas e estão bem caracterizadas, tornando-o um vírus fácil de replicar e cultivar in vitro. Ainda, os anticorpos disponíveis para o tratamento deste vírus são conhecidos e podem ser adquiridos comercialmente (por exemplo, os anticorpos descritos na Patente U.S. N° 5824307). Por estes motivos, o anticorpo descrito na referida patente possui as sequências de aminoácidos do "anticorpo de referência" descrito na Figura 1 e cujas sequências CDRs estão resumidas na Tabela 1. Assim, a disponibilidade de um produto anticorpo com sucesso comercial assim como as propriedades bem caracterizadas do RSV tornam esta uma combinação ideal para usar na testagem e optimização dos 27 ΡΕ1265928 anticorpos do presente invento e das regras aqui descritas para a produção de CDRs de elevada afinidade para usar na construção de tais anticorpos. Os métodos aqui descritos para a preparação de tais anticorpos podem, facilmente e vantajosamente, ser aplicados ao campo da tecnologia de anticorpos. Ainda, mesmo as realizações especificas proporcionadas pela presente descrição e que são anticorpos dirigidos especificamente contra determinantes antigénicos expressos por RSV e células infectadas com RSV, podem possuir elevada afinidade para outros epitopos, especialmente os presentes em virus relacionados. Assim, como aqui descrito o RSV e o anticorpo com sequências variáve, como se mostra na Figura 1, são apenas um sistema modelo conveniente, usado como um ponto de referência para o desenvolvimento e aplicação dos métodos da tecnologia de anticorpos aqui ensinados.

Um anticorpo de elevada afinidade de acordo com o presente invento, incluindo seus fragmentos activos, compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) de elevada afinidade em que a referida CDR possui uma sequência de aminoácidos seleccionada para resultar num anticorpo tendo uma constante de afinidade (Ka) de pelo menos 1010M_1. Em realizações preferidas, tal anticorpo, ou fragmento activo, compreende pelo menos 2 CDRs de elevada afinidade, ou pelo menos 3 CDRs de elevada afinidade ou mesmo pelo menos 4 CDRs de elevada afinidade. Em realizações altamente preferidas, tais anticorpos ou fragmentos activos compreendem 3 ou 4 CDRs de elevada 28 ΡΕ1265928 afinidade. Numa realização preferida, tal fragmento activo é um fragmento Fab.

Os anticorpos de elevada afinidade do presente invento normalmente compreendem uma região constante de mamífero, de preferência um ser humano, e uma região variável, a referida região variável compreendendo regiões estruturais das cadeias pesada e leve e CDRs das cadeias pesada e leve, em que as regiões estruturais das cadeias pesadas e leves derivam de um anticorpo de mamífero, de preferência um anticorpo humano, e em que as CDRs derivam de um anticorpo de uma espécie que não é a humana, de preferência de ratinho. Quando os aminoácidos estruturais também derivam de uma espécie não humana, esta é preferencialmente um ratinho.

Ainda, anticorpos de elevada afinidade do invento ligam-se ao mesmo epitopo do anticorpo de onde derivam as CDRs, em que pelo menos uma das CDRs do referido anticorpo de ultra-elevada afinidade possui substituições de aminoácidos e em que as referidas substituições compreendem a substituição de um ou mais aminoácidos nas regiões CDR por aminoácidos não idênticos, de preferência os aminoácidos das posições alinhadas correspondentes das regiões CDR do anticorpo humano que contribuem para os domínios estruturais e constantes.

As CDRs de elevada afinidade podem ser produzidas através das substituições de aminoácidos em CDRs de 29 ΡΕ1265928 afinidade não elevada para produzir tais CDRs de elevada afinidade ou as CDRs de elevada afinidade podem ser sintetizadas directamente para formar CDRs de elevada afinidade. Assim, os anticorpos neutralizantes de afinidade ultra-elevada do presente invento podem ter substituições de aminoácidos em apenas uma das regiões CDR, de preferência mais de uma região CDR e mais de preferência 3 ou mesmo 4 dessas regiões, com possivelmente até 5 ou mesmo as 6 CDRs contendo pelo menos um aminoácido substituído.

Na aplicação dos métodos aqui descritos para produzir anticorpos do presente invento, o método de preparação de anticorpos não é um factor limitante. Assim, os anticorpos neutralizantes de elevada afinidade do presente invento podem ser preparados através da geração de sequências polinucleotídicas codificadoras dos polipéptidos dos anticorpos e usando vectores para inserir as referidas sequências polinucleotídicas em células permissivas, capazes de não só expressarem tais polipéptidos como também de os montarem em estruturas de anticorpos tetraméricas características que são então recuperadas das células ou culturas celulares, possivelmente sendo secretadas para o meio por tais células. As tecnologias para os procedimentos de produção são já conhecidas e estão patenteadas e não são essenciais para a realização do invento, [ver: Morrison et al., Patente U.S. N°5807715] . Ainda, as cadeias poli-peptídicas dos anticorpos do presente invento podem ser produzidas por síntese química, com ou sem a adição de enzimas, e depois ligadas quimicamente para formar 30 ΡΕ1265928 estruturas tetraméricas com a configuração usual H2L2. Assim, pode ser utilizado qualquer método de preparação de anticorpos aqui descrito. O presente invento é igualmente dirigido à formação de anticorpos neutralizantes de elevada afinidade, com as propriedades já enumeradas, tendo afinidade elevada predominantemente como resultado de terem sequências CDR de elevada afinidade. De acordo com o presente invento, as sequências CDR dos anticorpos aqui descritos foram optimizadas de forma a conferirem à molécula de anticorpo as afinidades ultra-elevadas caracteristicas dos anticorpos do presente invento. Tais sequências CDR, juntamente com as sequências estruturais aqui descritas, especialmente as descritas nas sequências das Figura 1, 3, 4, 5, 6 e 7 e, mais especialmente, quando usadas com as sequências da região constante características dos anticorpos do organismo que actua como recipiente dos anticorpos do presente invento quando usados como fármacos, produzem os anticorpos do presente invento nas suas realizações mais específicas. No entanto, os métodos do presente invento são mais especificamente dirigidos às sequências de aminoácidos CDR.

Para produzir imunoglobulinas, tais como os anticorpos e/ou seus fragmentos activos do presente invento, e.g., anticorpos neutralizantes de elevada afinidade, as regras descritas no presente invento são usadas com vantagem para produzir moléculas de anticorpo cujas estruturas incorporam as sequências das sequências 31 ΡΕ1265928 CDR de elevada afinidade descritas de acordo com o presente invento. Assim, os anticorpos neutralizantes de elevada afinidade do presente invento são, no essencial, não verdadeiramente anticorpos "monoclonais" como o termo é normalmente usado, uma vez que não têm de ser produzidos através da clonagem de algo. Como já mencionado, as sequências dos anticorpos do invento podem ser directamente sintetizadas e assim podem não ser idênticas a quaisquer sequências de anticorpos, especialmente a quaisquer sequências CDR presentemente conhecidas. As próprias sequências podem ser totalmente novas ab initio e não estarem exactamente representadas em qualquer anticorpo produzido por qualquer organismo vivo. Assim, as sequências CDR de elevada afinidade aqui descritas são encontradas, ou conseguidas, por optimização, como aqui descrito, e depois uma vez conhecidas as referidas sequências CDR de elevada afinidade, podem ser usadas para sintetizar moléculas de anticorpo totalmente funcionais, diméricas ou tetraméricas, bifuncionais ou monofuncionais, por qualquer um dos meios conhecidos na ciência.

De acordo com o que foi dito, e de forma a descrever melhor as sequências descritas de acordo com o invento, incluindo a sua optimização, as sequências das regiões variáveis das cadeias leve e pesada de um anticorpo de referência (aqui sendo o anticorpo anti-RSV da Patente U.S. 55824307) estão apresentadas na Figura IA (região variável da cadeia leve - SEQ ID NO:l) e Figura 1B (região variável da cadeia pesada - SEQ ID NO:2). Também de acordo com o invento, foram produzidas novas sequências com 32 ΡΕ1265928 diferenças nos aminoácidos apenas nas regiões CDR relativamente ao anticorpo de referência. Um meio utilizado para conseguir este resultado foi introduzir mutações nas regiões CDR das chamadas cadeias de partida ou de referência e depois testar os clones recombinatórios resultantes relativamente à afinidade para o antigénio (proteína F do RSV).

De acordo com o que foi dito, foram feitas alterações na primeira sequência CDR para optimizar essa sequência e determinar o resíduo "crítico", ou resíduos, a referida posição foi então optimizada através de uma série de substituições de aminoácidos limitadas àquela posição apenas. Cada uma das 6 CDRs do clone do anticorpo foi então individualmente estudada até as CDRs "críticas" serem determinadas (em que "CDRs críticas" significa CDRs tendo um efeito substancial na ligação do anticorpo, tais como as CDRs úteis ou de elevada afinidade da Tabela 3). Nem todas as CDRs são críticas. Para o anticorpo usado neste estudo particular, apenas as CDRs Hl, H3, L2 e L3 foram encontradas como sendo críticas mas os resultados podem ser diferentes para um anticorpo diferente. Uma vez determinada uma CDR de "elevada afinidade" (i.e., uma "CDR benéfica ou útil") então combinações das CDRs foram estudadas para optimizar a combinação das sequências CDR resultantes num anticorpo neutralizante de elevada afinidade do invento.

Como realização muito específica, o invento aqui descrito está relacionado com um anticorpo neutralizante de elevada afinidade contra o vírus dos sincícios respira- 33 ΡΕ1265928 tórios (RSV) tendo uma constante de afinidade de pelo menos 1010M_1, em que a referida constante de afinidade poderá estar dentro de pelo menos 2 vezes este valor, devido à variabilidade de tais determinações e à variabilidade da afinidade dos diferentes anticorpos clonados para o antigénio (aqui antigénio F do RSV) . Algumas das estruturas optimizadas resultantes dentro desta realização possuem Ka superior a ÍO^M-1 (por exemplo, os clones numerado 22 e 23 na Tabela 4).

Este anticorpo neutralizante de elevada afinidade é também um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo de RSV que o anticorpo cuja região variável da cadeia leve tem a sequência de SEQ ID N0:1 (Figura IA) e cuja região variável da cadeia pesada tem a sequência de SEQ ID NO: 2 (Figura 1B) .

Em geral, a abordagem usada para identificar os anticorpos do invento, baseada no exemplo especifico de anti-RSV descrito, foi para gerar sequências nucleotidicas para os genes que expressam as cadeias de anticorpo pretendidas e inserir estas em vectores posteriormente usados para transformar células de Escherichia coli segundo protocolos convencionais. As células foram crescidas em alvéolos e retiradas amostras do sobrenadante e medida a ligação ao antigénio usando técnicas de captura por ligação a membranas e de ELISA. [Ver: Watkins et al., (1997) Anal. Biochem. 253, 37-45; Watkins et al., (1998) Anal. Biochem. 256, 169-177. Estes polinucleótidos foram projectados de forma a proporcionarem substituições de aminoácidos simples 34 ΡΕ1265928 nas CDRs que podiam depois ser testadas relativamente ao aumento de afinidade, com as substituições benéficas (as que dão aumento de afinidade) a serem selectivamente combinadas para aumento da afinidade. Estas foram então testadas relativamente à afinidade de ligação ao antigénio F do RSV relativamente ao anticorpo básico ou de referência.

Usando este protocolo, os dados de ELISA indicaram que não houve substituições simples de aminoácidos nas CDRs Ll ο H2 que tenham produzido qualquer aumento na afinidade do clone de anticorpo relativamente ao epitopo usado como antigénio (aqui o antigénio F de RSV) . Assim, os anticorpos do presente invento possuem todos sequências CDR que diferem do anticorpo de referência apenas nas CDRs L2, L3, Hl e H3 (aqui o anticorpo de referência com as sequências na Figura 1 serviu apenas como referência útil contra o qual se testou os procedimentos de optimização da afinidade do anticorpo através do aumento de Ka e qualquer outro sistema poderá ser igualmente usado).

Os anticorpos assim descritos relativamente a RSV também possuem normalmente regiões estruturais derivadas de um anticorpo humano mas, quando não desta origem, de preferência de um ratinho.

Para as CDRs do anticorpo de referência, a sequência de aminoácidos de cada CDR (conforme apresentado nas sequências da Figura 1) está apresentada na Tabela 1. As posições dos resíduos de aminoácidos dentro das CDRs do 35 ΡΕ1265928

anticorpo básico ou de referência, que se substituídas por aminoácidos como ensinado pelo presente invento, após optimização, produziram sequências CDR de elevada afinidade (resultando em anticorpos neutralizantes de afinidade muito elevada) e desta forma deram um resultado benéfico (aumento de afinidade) estão indicadas a negrito e sublinhadas na Tabela 1 (tais sequências que dão um aumento de afinidade relativamente ao anticorpo de referência são designadas como "CDRs benéficas" ou "CDRs de elevada afinidade"). As CDRs do anticorpo básico ou de referência (Figura 1) são referidas aqui como "CDRs básicas ou de referência"). Assim, a Tabela 1 representa as sequências CDR descritas na Figura 1 (i.e., para o anticorpo de referência anti-RSV aqui usado para monitorizar optimização).

Tabela 1. Sequências de CDRs básicas ou de referência

CDR Comprimento Sequência SEQ ID NO. Ll 10 SASSSVGYMH 3 L2 7 DTSKLAS 4 L3 9 FQGSGYPFT 5 Hl 7 TSGMSVG 6 H2 16 DIWWDDKKDYNPSLKS 7 H3 10 SMITNWYFDV 8 Relativamente às sequências aqui descritas, as regiões CDR como definidas para fins do presente invento são os segmentos correspondentes aos resíduos 24-33 (CDR

Ll), 49-55 (CDR L2) e 88-95 (CDRL3) das regiões variáveis 36 ΡΕ1265928 da cadeia leve e os resíduos 31-37 (CDR Hl), 52-67 (CDR H2) e 100-109 (CDR H3) das regiões variáveis da cadeia pesada dos anticorpos aqui descritos.

Na produção dos anticorpos do presente invento, quer pela geração de clones quer pela clonagem das cadeias polipeptídicas que constituem os referidos anticorpos ou por síntese directa das sequências polipeptídicas, com ou sem a utilização de sequências polinucleotídicas codificadoras das mesmas, ou através de outro método escolhido pelo utilizador, uma vez que nenhum método de produção dos referidos anticorpos resulta numa limitação do que é descrito no presente invento, o anticorpo básico ou de referência (regiões variáveis da cadeia pesada e leve (CDRs mais regiões estruturais) mostrado na Figura 1) pode ser usado como "matriz" para a geração de novas sequências CDR dos anticorpos do presente invento e para fins de comparação das constantes de ligação, etc. Na caracterização e síntese de seis bibliotecas de CDRs com mutações simples foram usadas abordagens convencionais (ver Wu et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. 95:6037-6042 (1998)). A CDR alvo foi primeiro eliminada de cada uma das bibliotecas antes do emparelhamento dos nucleótidos. Para a síntese das bibliotecas, as CDRs foram definidas como na Tabela 1. Usou-se a mutagénese baseada em codões para a síntese de oligonucleótidos para se obter as sequências CDR do invento (como descrito atrás).

As bibliotecas foram inicialmente testadas por captura de ligação a membranas para identificar as variantes com maior afinidade. Subsequentemente, estes 37 ΡΕ1265928 clones foram ainda caracterizados por ELISA de captura e por titulação com o antigénio imobilizado. 0 DNA das variantes com afinidade mais elevada foi sequenciado para determinar a natureza das substituições benéficas ou de elevada afinidade. Após rastreio, foram identificadas oito substituições benéficas ou de elevada afinidade, ocorrendo em apenas quatro CDRs. Estas estão resumidas como as sequências CDR na Tabela 3, com diferenças relativamente às CDRs de referência ou básicas da Tabela 1 a negrito e sublinhadas. Assim, as sequências CDR da Tabela 3 podem ser consideradas uma biblioteca de CDRs de cassetes disponíveis para usar na produção de um anticorpo neutralizante de elevada afinidade do presente invento em que a especificidade é dirigida para o antigénio F do RSV. A análise dos dados indicou que a substituição de aminoácidos em localizações seleccionadas aumentou grandemente a ligação de epitopos, especialmente quando a natureza da substituição foi a inserção de um aminoácido seleccionado do grupo da fenilalanina, alanina, prolina, triptofano e tirosina, mais especialmente fenilalanina, todas essas substituições benéficas ou de elevada afinidade estando novamente em posições seleccionadas.

Para a experiência de optimização aqui descrita e empregando o sistema RSV/anti-RSV, o maior benefício das CDRs de elevada afinidade resulta de substituições de aminoácidos em 3 ou 4 das 6 CDRs e na globalidade de apenas 38 ΡΕ1265928 4 posições de aminoácidos. Assim, os anticorpos neutra-lizantes de elevada afinidade do presente invento possuem sequências de aminoácidos que diferem do anticorpo de base ou de referência apenas nas regiões determinantes de complementaridade ou em regiões como as regiões estruturais envolventes, ao contrário dos anticorpos produzidos pelo homem anteriormente conhecidos. Assim, os anticorpos do presente invento são anticorpos neutralizantes de elevada afinidade contendo uma ou mais sequências CDR seleccionadas de forma a produzir afinidade elevada na molécula de anticorpo. Na realização especifica usando RSV como alvo tais diferenças são encontradas apenas em L2 (ou CDRL2), L3 (ou CDRL3), Hl (ou CDRH1) e H3 (ou CDRH3) . Como referido, as maiores afinidades para este anticorpo ocorreram apenas em posições de aminoácidos seleccionadas destas CDRs e nalgumas das realizações do presente invento apenas um posição de aminoácido em cada CDR foi preferida para originar afinidade elevada.

Assim, para CDR Hl, a substituição do aminoácido 2 da CDR (contando a partir do extremo amina da sequência CDR particular sublinhada da Figura 1B), especialmente através da substituição da serina situada na posição 2 da CDR Hl do anticorpo básico ou de referência com uma alanina ou uma prolina, foi encontrado como sendo o mais benéfico e portanto resultar em maior afinidade para o epitopo antigénico de RSV. Para CDR H3, a substituição da glicina na posição 6 da sequência CDR, especialmente por fenil-alanina ou triptofano, mais especialmente por fenilalalina, encontrou-se que resulta num aumento de afinidade para o 39 ΡΕ1265928 epitopo RSV. Para CDR L2, a substituição da serina na posição 3 da CDR, especialmente por fenilalanina ou por tiro-sina, resultou num aumento de afinidade para o antigénio F. Para CDR L3, a substituição da glicina na posição 5 da CDR, especialmente por fenilalanina, triptofano ou tirosina, resultou num aumento de afinidade para o epitopo RSV.

De acordo com o invento, através da combinação de tais substituições de aminoácidos, de forma a mais de uma ocorrer na mesma molécula de anticorpo, foi possível aumentar grandemente a afinidade dos anticorpos aqui descritos para o epitopo do antigénio F de RSV. A Tabela 2 mostra os resultados da utilização das novas sequências CDR (para Hl, H3, L2 e L3, respecti-vamente) de uma série de clones de acordo com o presente invento. Como se mostra na Tabela 2, um anticorpo particular pode ter incorporado nele 1, 2 ou 3 novas CDRs do invento relativamente às cadeias dos anticorpos básicos ou de referência mostradas nas Figura IA e 1B (para cadeia leve (L2 e L3) e pesada (Hl e H3), respectivamente) . Os efeitos das novas CDRs estão descritos em termos da avaliação da titulação do Antigénio (Ag) (ver abaixo), em que o anticorpo básico ou de referência está apresentado na parte superior e tem uma classificação de 0,1. As outras classificações estão indicadas relativamente a esta classificação de 0,1 das sequências do "anticorpo básico ou de referência". As identidades dos aminoácidos que dão as maiores afinidades nas respectivas posições (i.e., posição 2 para Hl, posição 6 para H3, posição 3 para L2 e posição 5 40 ΡΕ1265928 para L3) estão indicadas por baixo dos aminoácidos para o anticorpo básico ou de referência meramente para indicar a gama de mutações usadas para cada CDR. O número total de clones examinado nesta experiência foi de 37, com alguns duplicados (indicados pelo valor "n" entre parêntesis, por exemplo "n=4" para o clone n° 7 indica que foram examinados 4 duplicados de clones).

Em geral, os dados mostraram que existe uma correlação entre afinidade e o número de CDRs benéficas ou de elevada afinidade, com todas as variantes com afinidade mais elevada tendo mais de uma CDR benéfica ou de elevada afinidade. Ainda, todos os melhores clones tinham F (Fen) na posição 6 dentro da CDR H3. Igualmente, as CDRs benéficas ou de elevada afinidade foram aquelas em que um aminoácido hidrofóbico, especialmente um aromático, foi inserido no lugar do resíduo encontrado no anticorpo básico ou de referência. 0 ensaio de titulação de anticorpo empregou várias concentrações de anticorpo usando 500 ng do antigénio F de RSV para cada medição. Um gráfico de comparação de dados para uma série dos clones combinatórios da Tabela 2 está apresentado na Figura 2.

Resumindo, a Tabela 2 mostra uma série de clones avaliados pelos procedimentos aqui descritos juntamente com os aminoácidos naturais nas posições chave (sublinhado e a 41 ΡΕ1265928

negrito nas Tabelas 1 e 3) das CDRs Hl, H3, L2 e L3. A

Tabela também resume o número de diferenças entre as CDRs destes clones relativamente às correspondentes CDRs do anticorpo de referência (Ver Tabela 1 e Figura 1). 0 lado direito da Tabela mostra uma "Classificação de Ag" ou valor de ligação ao antigénio, a qual representa um valor arbitrário e qualitativo, variando entre 0 e 4 e representa uma estimativa qualitativa da capacidade de ligação relativa dos diferentes clones de anticorpos baseada nas respectivas curvas de titulação. Este valor é aqui proporcionado para comparações qualitativas dos diferentes anticorpos e não se destina a ser uma medida quantitativa da capacidade de ligação. A Tabela 2 também mostra o número de novas CDRs para cada clone de anticorpo (significando o número de CDRs no anticorpo com pelo menos uma aminoácido diferente relativamente à CDR correspondente do anticorpo de referência - ver a Tabela 1) . 0 número de novas CDRs é também o número de CDRs "benéficas" ou de "elevada afinidade" presente nessa molécula de anticorpo. As diferenças de aminoácidos na nova CDR poderão ocorrer na posição a negrito e sublinhada na Tabela 1 para o anticorpo de referência, de forma que o aminoácido a negrito e sublinhado na Tabela 1 foi substituído pelo aminoácido indicado para a respectiva CDR na Tabela 2 (usando designações de aminoácidos convencionais de uma única letra). 42 ΡΕ1265928

Tabela 2 . Sumário de dados dos clones Clone CDRs # Novas Classificaçao CDRs de Ag Hl H3 L2 L3 Básico S W S G 0 0, 1 simples A F F F P Y W Y 1 A F S F 3 4 2 A F s G 3 4 3 (n=3) P F F F 4 4 4 (n=3) P F F Y 4 3,5 5 (n=3) P F F W 4 3,5 6 P F Y F 4 3,5 II £ r- P F F G 3 3 8 P F F 9 3 + 3,5 9 (n=2) P F S w 3 3 10 P F S F 3 3 11 P W F W 3 3 12(n=2) P W F F 3 2,5 13(n=3) s F F F 3 2,5 14 s F F W 3 2,5 15(n=2) A F S G 2 2,5 16(n=2) P F S G 2 2 17 P W s W 2 2 18(n=2) s F F G 2 2 19 s F s w 2 2 20 s F s F 2 2 21 s W Y F 2 2 43 ΡΕ1265928

As novas CDRs representadas em cada um dos clones foram facilmente determinadas através da localização do clone na Tabela e fazendo corresponder o aminoácido indicado para cada CDR com o correspondente aminoácido para a mesma CDR a seguir ao clone básico ou de referência. Por conveniência, quando um aminoácido é diferente numa CDR particular de um dos clones, o novo aminoácido está indicado a negrito. Ainda, para todos os clones apresentados na Tabela, as substituições ocorrem apenas nas posições seleccionadas atrás descritas como dando uma nova CDR. Assim, todas as substituições em CDR Hl relativamente ao anticorpo básico ou de referência estão na posição 2 da CDR (significando, novamente, o segundo aminoácido do extremo N-terminal da CDR Hl conforme sublinhado e a negrito na Figura 1 e Tabelas 1 e 3), todas as substituições na CDR H3 estão na posição 6, todas as substituições na CDR L estão na posição 3 e todas as substituições na CDR L3 estão na posição 5, novamente todos relativamente ao anticorpo básico ou de referência. Deve-se ter em conta que o anticorpo básico ou de referência foi escolhido devido a ser conhecido como tendo uma afinidade muito elevada para epitopos de RSV. [Ver: Johnson et al., (1997) J. Infect Dis., 176, 1215-1224]. Assim, por exemplo, a tabela mostra que para o clone n° 1, para a CDR Hl benéfica ou de elevada afinidade, uma alanina é usada em lugar da serina na posição da CDR Hl do anticorpo básico ou de referência, conseguindo assim um aumento de afinidade para RSV e uma fenilalanina surge em lugar de triptofano na posição 6 da CDR H3, a serina na posição 3 da CDR L2 do anticorpo básico ou de referência foi usada e uma fenilalanina ocorreu na posição 5 de CDR L3 benéfica ou de elevada afinidade. 44 ΡΕ1265928

Assim, as CDRs mais benéficas de acordo com o presente invento (i . e., CDRs de elevada afinidade ou sequências CDR cuja presença no anticorpo básico ou de referência em lugar da correspondente CDR básica ou de referência serviu para aumentar grandemente a afinidade do referido anticorpo para o mesmo epitopo de RSV) as quais estão presentes nas estruturas de anticorpo produzidas nos sobrenadantes testados para os clones da Tabela 2 estão resumidas na Tabela 3. Em cada caso, o negrito indica como as CDRs do invento novas e benéficas, ou de elevada afinidade, diferem das CDRs correspondentes do anticorpo anti-RSV básico ou de referência.

Tabela 3. Sequências das CDRs de elevada afinidade

CDR

Sequência SEQ ID NO:

Hl Hl

TAGMSVG TPGMSVG 9 10 H3

SMITNFYFDV 11 L2 L2

DTFKLAS DTYKLAS 12 13 L3 L3 L3

FQGSFYPFT FQGSYYPFT FQGSWYPFT 14 15 16 45 ΡΕ1265928

Enquanto as sequências CDR da Tabela 3 representam as sequências para CDRs de elevada afinidade descritas de acordo com o invento, compreende-se que uma ou mais destas CDRs possa estar presente no mesmo anticorpo e as sequências da tabela indicam a série a partir da qual podem ser seleccionadas as sequências adequadas para cada uma das CDRs de elevada afinidade. Assim, como se mostra na Tabela 3, quando uma CDR Hl de elevada afinidade está presente num anticorpo neutralizante de elevada afinidade do invento aqui descrito possui uma sequência correspondente à sequência de SEQ ID NO:9 ou 10. Quando um anticorpo neutralizante do invento reivindicado possui uma CDR H3 de elevada afinidade, a referida CDR tem a sequência de SEQ ID NO:11. Quando um anticorpo neutralizante de elevada afinidade do invento possui uma CDR L2 de elevada afinidade, a referida CDR L2 de elevada afinidade possui uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo nas sequências de SEQ ID NO:12 e 13. Finalmente, quando um anticorpo neutralizante de elevada afinidade do presente invento possui uma CDR L3 de elevada afinidade, a referida CDR tem uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo nas sequências de SEQ ID NO: 14, 15 e 16.

Conforme já estabelecido, numa realização, os anticorpos neutralizantes de elevada afinidade são anticorpos que incluem uma região constante humana.

Assim, numa realização preferida, o anticorpo 46 ΡΕ1265928 neutralizante de elevada afinidade do invento, com uma afinidade de pelo menos 1010M_1 ou mesmo ΙΟ^ΝΓ1, é um anticorpo enxertado que inclui uma região constante humana e uma região estrutural para as cadeias pesada e leve, em que pelo menos uma porção da região estrutural deriva de um anticorpo humano (ou de uma sequência de consenso de uma região estrutural de anticorpo humano).

Numa outra realização, todas a região estrutural deriva de um anticorpo humano (ou de uma sequência de consenso humana).

Assim, um anticorpo neutralizante de RSV, com uma afinidade de pelo menos 1010M-1, é um anticorpo enxertado tendo uma região constante humana, uma ou mais CDRs que derivam de um anticorpo não humano em que pelo menos um dos aminoácidos em pelo menos uma das referidas CDRs está alterada e em que a totalidade ou uma porção da região estrutural deriva de um anticorpo humano (ou uma sequência de consenso de uma região estrutural de anticorpo humano).

Devido à combinação das sequências CDR de um anticorpo com regiões não CDR de um outro anticorpo resultar de uma forma de "enxerto" das CDRs na restante molécula, estas foram referidas como anticorpos com "enxerto de CDR". Actualmente, usando as técnicas de engenharia genética o mesmo produto pode ser obtido sem isolamento de quaisquer sequências dos anticorpos actuais. Desde que sejam conhecidas as sequências CDR pretendidas e ΡΕ1265928 -ΑΊΑ sequência constante e estrutural, os genes com as sequências pretendidas podem ser montados e, usando uma variedade de vectores, inseridos nas células adequadas para a expressão das moléculas de anticorpos tetraméricos funcionais. Acoplando a isto a metodologia já descrita permite a montagem de bibliotecas de mutações simples em que os anticorpos possuem as mesmas sequências dos anticorpos correspondentes enxertados e, portanto, a mesma estrutura e afinidade de ligação.

Os anticorpos de elevada afinidade do invento podem estar presentes numa forma relativamente pura ou isolada, assim como num sobrenadante retirado das células crescidas em alvéolos ou em placas. Tais sobrenadantes foram usados para gerar os dados da Tabela 1. Os anticorpos do invento podem assim também estar presentes na forma de uma composição compreendendo o anticorpo do invento e em que o referido anticorpo é suspenso num veiculo ou excipiente farmacologicamente aceitável. Os anticorpos do invento podem estar presentes numa composição numa concentração ou numa quantidade suficiente para ter um valor terapêutico ou farmacológico no tratamento de doenças, como seja RSV. Tais anticorpos podem também estar presentes numa composição numa forma mais diluída.

Consequentemente, o invento é igualmente dirigido à obtenção de composições e medicamentos para a prevenção e/ou tratamento de infecções pelo vírus dos sincícios respiratórios, em que a composição/medicamento se destina a 48 ΡΕ1265928 ser administrado a um doente em risco ou atingido por aquele vírus. 0 referido medicamento ou composição compreende a composição de anticorpo aqui descrita.

Uma realização preferida dos anticorpos de elevada afinidade do presente invento é o anticorpo cujas regiões CDRs da cadeia pesada e leve possuem as sequências como se segue: CDR Hl tem a sequência SEQ ID NO: 9, CDR H3 tem a sequência SEQ ID NO:11, CDR L2 tem a sequência SEQ ID NO:4 (sem alteração da CDR L2 da sequência de referência da Figura IA) e a CDR L3 tem a sequência SEQ ID NO: 14 (ver Tabela 3). Nesta realização preferida, a constante de afinidade é cerca de 6,99 x IO10 (ou cerca de 14,3 pM como uma constante de dissociação) como se mostra na Tabela 4 (clone 1) . As regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo compreendendo esta realização, juntamente com as sequências estruturais, estão descritas na Figura 3.

Uma outra realização preferida dos anticorpos de elevada afinidade do presente invento é o anticorpo cujas regiões CDRs da cadeia pesada e leve possuem as sequências como se segue: CDR Hl tem a sequência SEQ ID NO: 9, CDR H3 tem a sequência SEQ ID NO:11, CDR L2 tem a sequência SEQ ID NO: 12 e CDR L3 tem a sequência SEQ ID N0:5 (ver Tabela 2, clone 2 - sem diferença relativamente à sequência de referência de CDR L3 da Figura IA). Nesta realização preferida, a constante de afinidade é cerca de 7,30 x IO10 (ou cerca de 13,7 pM como constante de dissociação) como se mostra na Tabela 4 (clone 2). As regiões variáveis das 49 ΡΕ1265928 cadeias pesada e leve de um anticorpo compreendendo esta realização, juntamente com as sequências estruturais, estão apresentadas na Figura 4.

Uma outra realização preferida dos anticorpos de elevada afinidade do presente invento é o anticorpo cujas regiões CDRs das cadeias pesada e leve possuem as sequências como se segue: CDR Hl possui a sequência SEQ ID NO: 10, CDR H3 tem a sequência SEQ ID NO: 11, CDR L2 tem a

sequência SEQ ID NO: 12 e CDR L3 tem a sequência SEQ ID NO: 14 (ver Tabela 3 para as sequências CDR) cujo clone é designado pelo número 3 na Tabela 2. Nesta realização preferida, a constante de afinidade é cerca de 8,13 x IO10 (ou cerca de 12,3 pM como uma constante de dissociação) como se mostra na Tabela 4 (clone 3). As regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo compreendendo esta realização, juntamente com sequências estruturais, estão apresentadas na Figura 5.

Uma realização mais preferida dos anticorpos de elevada afinidade do presente invento é o anticorpo cujas regiões CDRs das cadeias pesada e leve possuem as sequências como se segue: CDR Hl tem a sequência SEQ ID NO: 9, CDR H3 tem a sequência SEQ ID NO: 11, CDR L2 tem a sequência SEQ ID NO: 12 e CDR L3 tem a sequência SEQ ID NO:14 (ver Tabela 3). Nesta realização preferida, a constante de afinidade é cerca de 3,6 x 1011 (ou cerca de 2,8 pM como constante de dissociação) como se mostra na Tabela 4 (clone 22). As regiões variáveis das cadeias 50 ΡΕ1265928 pesada e leve de um anticorpo compreendendo esta realização, juntamente com as sequências estruturais, estão apresentadas na Figura 6.

Uma outra realização mais preferida do presente invento é o anticorpo cujas regiões CDR das cadeias pesada e leve incluem as seguintes sequências: CDR Hl tem a sequência SEQ ID NO:9, CDR H3 tem a sequência SEQ ID NO:11, CDR L2 tem a sequência SEQ ID NO: 12 e CDR L3 tem a sequência SEQ ID NO:15 (ver Tabela 3). Nesta última realização preferida, a constante de afinidade é cerca de 4 x 1011 (cerca de 2,5 pM como uma constante de dissociação) como se mostra na Tabela 4 (clone 23). As regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo compreendendo esta realização, juntamente com sequências estruturais, estão apresentadas na Figura 7.

Em realizações particularmente preferidas, os anticorpos do presente invento terão as regiões estruturais das sequências descritas para as regiões estruturais mostradas nas Figuras 1, 3, 4, 5, 6 e 7 (cada uma contem as mesmas regiões estruturais e diferem apenas nas sequências CDR). Estas realizações mais preferidas incluem o anticorpo neutralizante em que a região variável da cadeia leve tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:17 e a região variável da cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:18; o anticorpo neutralizante em que a região variável da cadeia leve tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:19 e a região variável da cadeia pesada tem a sequência de 51 ΡΕ1265928 aminoácidos SEQ ID NO:20; o anticorpo neutralizante em que a região variável da cadeia leve tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:21 e a região variável da cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:22; o anticorpo neutralizante em que a região variável da cadeia leve tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:23 e a região variável da cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:24; o anticorpo neutralizante em que a região variável da cadeia leve tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:25 e a região variável da cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:26.

Deverá ser tido em conta que ainda que os anticorpos neutralizantes de elevada afinidade do presente invento possam ser montados a partir de regiões CDR e regiões não CDR derivadas de anticorpos neutralizantes através de "splicing" de segmentos de aminoácidos em conjunto (e os anticorpos assim montados estejam dentro do âmbito do invento aqui descrito) os anticorpos do presente invento são convenientemente preparados através de manipulação genética adequada de sequências de genes para introdução em vectores, os quais podem ser transfectados em linhas celulares adequadas para eventual expressão das moléculas de anticorpo montadas pelas células manipuladas. De facto, tais procedimentos recombinantes foram empregues para preparar os anticorpos aqui descritos. Ainda, devido às sequências das cadeias dos anticorpos de elevada afinidade serem conhecidas a partir desta descrição, tais anticorpos poderão ser montados por síntese directa das 52 ΡΕ1265928 cadeias adequadas e depois deixadas a auto-montarem-se em estruturas de anticorpos bivalentes tetraméricos (H2L2) . 0 método de preparação de anticorpos neutrali-zantes de elevada afinidade do invento envolveu a criação de uma biblioteca combinatória que foi usada para preparar clones produtores de anticorpos, compreendendo as CDRs benéficas do invento, que poderão ser então testados relativamente à afinidade para epitopos RSV (por exemplo, Figura 2). EXEMPLO 1

Análise cinética de Mabs humanizados para RSV por

BIAcoreTM A cinética de interacção entre os Mabs anti-RSV de elevada afinidade e a proteína F de RSV foi estudada por ressonância de plasmões de superfície usando um bio-sensor Pharmacia BIAcore TM. Um baculovírus recombinante expressando a proteína F truncada no extremo C proporcionou uma fonte abundante de antigénio para os estudos de cinética. 0 sobrenadante, o qual continha a proteína F secretada, foi enriquecido em aproximadamente 20 vezes por cromatografia sucessiva em colunas de concanavalina A e Q-sepharose. As fracções reunidas foram dialisadas contra citrato de sódio 10 mM (pH 5,5) e concentradas para aproximadamente 0,1 mg/ml. Numa experiência típica, uma 53 ΡΕ1265928 amostra da proteína F (100 ml) foi acoplada através de amina ao chip sensor BIAcore. A quantidade imobilizada deu um sinal de aproximadamente 2000 unidades de resposta (Rmax) quando saturada com os anticorpos monoclonais de ratinho H1129 ou H1308F (preparado na Patente U.S. 5824307, cuja descrição é aqui incluída como referência). Isto indicou que existe um número igual de locais antigénicos "A" e "C" na preparação de proteína F após o procedimento de acoplagem. Dois Mabs irrelevantes não relacionados (RVFD 4D4 e CMV H758) não mostraram interacção com a proteína F imobilizada. Um estudo típico de cinética envolveu a injecção de 35 ml do Mab em diferentes concentrações (25-300 nM) em tampão PBS contendo 0,05% Tween-20 (PBS/Tween). A velocidade do fluxo foi mantida a 5 ml/min, dando uma fase de ligação de 7 min. Após a injecção do Mab, o fluxo foi alterado com tampão PBS/Tween durante 30 minutos para determinar a velocidade de dissociação. O chip sensor foi regenerado entre ciclos com um pulso de 2 min de HC1 10 mM. O passo de regeneração causou uma perda mínima da capacidade de ligação da proteína F imobilizada (4% de perda por ciclo). Este pequeno decréscimo não alterou os valores calculados das constantes de velocidade para ligação e dissociação (também designado Kon e KQff, respectivamente) .

Mais especificamente, para a medição de Kassoc (ou Kon)t a proteína F foi directamente imobilizada pelo método EDC/NHS (EDC = N-etil-N'-[3-dietilaminopropil]carbodiimida; NHS = N-hidroxi-succinimida) com a proteína F a ser 54 ΡΕ1265928 injectada sobre o chip sensor activado com EDC/NHS. Resumidamente, preparou-se 4 μρ/ιηΐ da proteína F em NaOAc 10 mM, pH 4,0 e uma injecção de cerca de 30 μΐ deu cerca de 500 RU (unidades de resposta) da proteína F imobilizada nas condições atrás referenciadas. A célula do fluxo do branco (superfície de CM-dextrano com VnR imobilizado) foi subtraída para análise da cinética. A coluna poderá ser regenerada usando HC1 100 mM (com 72 segundos de tempo de contacto necessário para a regeneração completa). Este tratamento removeu Fab totalmente sem danificar o antigénio imobilizado e pode ser usado em mais de 40 regenerações. Para as medições de Kon, as concentrações de Fab foram de 12,5 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM e 400 nM. A fase de dissociação foi analisada entre os 230 segundo (30 segundos após o início da fase de dissociação) e os 900 segundos. As cinéticas foram analisadas por ajuste de Langmuir 1:1 (ajuste global). As medições foram feitas em tampão HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,005% (v/v) de Tensioactivo P20.

Para as medições de clones combinatórios, como aqui discutido, kon e koff foram medidos em condições que foram as mesmas dos clones de mutações simples e foram analisados de forma semelhante.

Para a medição de kdiss0c (ou kQff) foram empregues as condições que se seguem. Resumidamente, 4100 RU da proteína F foram imobilizadas (como atrás) com CM-dextrano 55 ΡΕ1265928 usado como branco. Aqui, foram ligadas 3000 RU de Fab (com Fab dissociado suficientemente elevado para compensar a flutuação da máquina) . HBS mais proteína F 5 nM (cerca de 350-2000 vezes mais elevado que kdiSS0C ou kd - a constante de dissociação em equilíbrio) foi usado como tampão. A fase de dissociação foi de 6 - 15 horas a um fluxo de 5 μΐ/min. Nas condições aqui usadas, a re-ligação de Fab dissociado foi mínima. Para outros detalhes, ver o manual que acompanha o bio-sensor. A ligação dos anticorpos anti-RSV de elevada afinidade contra a proteína F ou contra outros locais epitópicos em RSV, aqui descritos foi calculada a partir da razão entre a constante de velocidade de primeira ordem para a dissociação e a constante de velocidade de segunda ordem para a ligação ou associação (kd = kdissoc/kassoc) · O valor de kasSoc foi calculado com base na seguinte equação de velocidades:

dR/dt— kassoc [Mab] Rmax (kassoc [M&b] + kdiss) R em que R e Rmax são as unidades de resposta no tempo t e infinito, respectivamente. Uma representação gráfica de dr/dt em função de R dá um declive de (kassoc [Mab] + kdiss) . Uma vez que estes declives estão linearmente relacionados com [Mab] , o valor de kassoc pode ser derivado de uma nova representação dos declives em função de [Mab]. O declive da nova linha é igual a kassoc. Apesar do valor de kdiss poder ser extrapolado a partir da intercepção nos Y, um valor 56 ΡΕ1265928 mais preciso foi determinado através da medição directa de kdiss· Após a fase de injecção do Mab, tampão PBS/Tween flui através do chip sensor. A partir deste ponto, [Mab]=0. A equação atrás descrita para dR/dt assim reduz-se a: dr/dt = k ou dR/R = kdiss dt A integração desta equação dá então:

In (Ro/Rt) — kdiss t em que (Ro/Rt) são as unidades de resposta no tempo 0 (início da fase de dissociação) e t, respectivamente. Finalmente, a representação gráfica de In(R0/Rt) em função de t dá um declive de kdíSS.

Na realização preferida, os valores numéricos de tais variantes de anticorpo foram como se segue:

Tabela 4. Sumário das constantes cinéticas dos anticorpos de afinidade ultra-elevada.

Clone ID CDRs KassocíM^seg"1) Kdiss (seg-1) Ka (M1) 1 AFSF 1,13xl05 1,62xl(T6 6,98xl010 2 AFFG 1,33xl05 1,82xl(T6 7,31xl010 3 PFFF 1,10xl05 1,35xlCT6 8,15xl010 22 AFFF 1,34xl05 3, 70xlCT7 3,62x1o11 23 AFFY 1,22xl05 3,03x1 CT7 4, 03x1o11 57 ΡΕ1265928

Aqui, as CDRs representam os aminoácidos que substituem os aminoácidos de referência nas posições chave (ou posições criticas) das CDRs apresentadas na Tabela 1 (a negrito e sublinhado) para um anticorpo de referência. Assim, por exemplo, o clone 22 tem uma alanina na posição 2 de CDR Hl (resíduo 32 da região variável da cadeia pesada -SEQ ID NO:24) em vez da serina apresentada naquela posição na Tabela 1 (SEQ ID N0:6), uma fenilalanina na posição 6 da CDR H3 (resíduo 105 da região variável da cadeia pesada - SEQ ID NO: 24) em vez do triptofano apresentado naquela posição na Tabela 1 (SEQ ID NO:8), uma fenilalanina na posição 3 da CDR L2 (resíduo 51 da região variável da cadeia leve - SEQ ID NO: 23) em vez da serina apresentada naquela posição na Tabela 1 (SEQ ID NO: 4) e uma fenilalanina na posição 5 da CDR L3 (resíduo 92 da região variável da cadeia leve - SEQ ID NO: 23) em vez da glicina apresentada naquela posição na Tabela 1 (SEQ ID NO:5).

Certamente, na formação de tais clones, a Tabela 3 representa um conjunto de potenciais CDRs a partir das quais as CDRs de elevada afinidade dos anticorpos do presente invento deverão ser desenhados. Por exemplo, o clone 23 da Tabela 4 usa as mesmas CDRs do clone 22 com a excepção da CDR L3, a qual tem uma tirosina na posição 5 da CDR L3 (Tabela 3 - SEQ ID NO: 15) em lugar da glicina apresentada na Tabela 1 (SEQ ID NO:5). As substituições nas posições críticas correspondentes estão igualmente apresentadas na Tabela 2. ΡΕ1265928 58 EXEMPLO 2

Ensaio de microneutralização A neutralização dos anticorpos do presente invento foi determinada pelo ensaio de microneutralização. Este ensaio de microneutralização é uma modificação dos procedimentos descritos por Anderson et ai. (1985). As diluições de anticorpos foram feitas em triplicado usando uma placa de 96 alvéolos. Dez TCID50 de virus dos sincicios respiratórios (RSV - estirpe Long) foram incubados com diluições seriadas do anticorpo (ou Fabs) a ser testado durante 2 horas a 37°C nos alvéolos de uma placa de 96 alvéolos. Células HEp-2 susceptiveis a RSV (2,5 x 104) foram então adicionadas a cada alvéolo e cultivadas durante 5 dias a 37°C em 5% de CO2. Após 5 dias, o meio foi aspirado e as células foram lavadas e fixadas às placas com 80% de metanol e 20% de PBS. A replicação de RSV foi então determinada por expressão da proteína F. As células fixadas foram incubadas com um anticorpo monoclonal anti-proteína F conjugado com biotina (MAb 133-1H específico para o local C da proteína pan F), lavadas e avidina conjugada com peroxidase de rábano silvestre foi adicionada aos alvéolos. Os alvéolos foram novamente lavados e a alteração da cor do substrato TMB (ácido tionitrobenzóico) foi medida a 450 nm. O título neutralizante foi expresso como a concentração de anticorpo que causou pelo menos 50% de redução na absorvância a 450 nm (a DO450 nm) relativamente às células controlo com apenas vírus. Os resultados de vários 59 ΡΕ1265928 anticorpos do presente invento estão apresentados no gráfico na Figura 8 enquanto os resultados que usam os fragmentos Fab estão descritos no gráfico da Figura 9.

Fundamento e Referências Citadas: 1. Hall, C. B., Douglas, R. G., Geiman, J. M. et al., N.Engl.J.Med. 293:1343, 1975. 2. Hall, C. B., McBride, J. T., Walsh, E. E. et al., N.Engl.J.Med. 308:1443, 1983. 3. Hall, C. B., McBride, J. T., Gala, C. L. et al., JAMA 254:3047, 1985. 4. Wald, E. R., et al., J.Pediat. 112:154, 1988. 5. Kapikian, A. Z., Mithcell, R. H., Chanock, R. M. et al., Am.J.Epidemiol. 89:405, 1969. 6. Prince, G. A., Hemming, V. G., Horswood, R. L. et al., Virus Res. 3:193, 1985. 7. Hemming, V. G., Prince, G. A., Horswood, R. L. et al., J.Infect.Dis. 152:1083, 1985. 8. Wright, P. F., Belshe, R. B., et al., Infect.Immun. 37:397, 1982. 9. Conrad, D. A., Christenson, J. C., et al.,

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Proc.Nat1.Acad. Sei. 85:4852, 1988. 12. Boulianne, G. L., Hozumi, N., Shulman, M. J. Nature 312:643, 1984. 13. Sun, L. K., Curtis, P., Rakowicz-Szulczynska, E. et al., Proc.Nat1.Acad. Sei. 84:214, 1987. 14. Liu, A. Y., Mack, P. W., Champion, C. I., Robinson, R. R., Gene 54:33, 1987. 15. Morrison, S. L., Johnson, M. J., Hersenber, L. A., Oi, V. T. Proc.Nat1.Acad. Sei. 81:6851, 1984. 16. Morrison, S. L. Science 229:1202, 1985. 17. Sahagan, B. G., Dorai, H., Saltzgaber-Muller, J. et al., J.Immunol. 137:1066, 1986. 18. Taked, S., Naito, T., Hama, K., Noma, T., Honjo, T. Nature 314:452, 1985. 19. Carson, D. A., Freimark, B. D., Adv. Immunol. 38:275, 1986. 20. Beeler, J. A., et al., J.Virol. 63:2941-2950, 1989. 21. Coelingh, et al., Virology, 143:569-582, 1985. 22. Anderson et al. Microneutralization test for respiratory syncytial virus based o an enzyme immunoassay, J. Clin. Microbiol. (1985) 22:1050-1052. 23. Johnson et al., Development of a humanized monoclonal antibody (MEDI-493) with potent in vitro and in vivo activity against respiratory syncytial virus, J Infectious Diseases (1997) 176: 1215-1224. ΡΕ1265928 61

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Young, James F.

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<210> 1 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: região variável da cade leve de anticorpo quimérico ratinho-humano <400>1

Asp 1 Ile Gin Thr 5 Gin Ser Pro Ser Thr 10 Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 Asp Arg Vai Thr 20 lie Thr Cy& Ser Ala 25 Ser Ser Ser vai Gly 30 Tyr Met His Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile Tyr Asp Thr 50 Ser Lys Leu Ala S«r SS Gly Vai Pro Ser Arg 60 Pha Ser Gly Ser Gly 65 Ser Gly Thr Glu Phe 70 Thr Leu Thr Ile Ser 75 Ser Leu Gin Pro Asp ao Asp Phe Ala Thr- Tyr $5 Tyr Cys Phe Gin Gly 90 Ser Gly Tyr Pro phe 95 Thr Phe Gly Gly Gly 100 Thr Lys Vãl Giu Ile 105 Lys

<210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial 62 ΡΕ1265928 < 2 2 Ο > <223> Descrição da sequência artificial: região variável da cadeia pesada de anticorpo quimérico ratinho-humano <400> 2

Gin 1 Vai Thr Leu Arg 5 Glu. Ser Gly pro Ala 10 Leu Vai Lys pro Thr 15 Gin Thr Leu Thr Leu 20 Thr Cys Thr Phe Ser 25 Gly Phe Ser Leu Ser 30 Thr Ser Gly Met Ser 35 Vai Gly Trp lie Arg 40 Gin Pro p.ro Gly Lys 45 Ala Leu Glu Trp Leu 50 Ala Aap lie Trp Trp 55 ASp Asp Lys Lys Asp Tyr 60 Asn Pro Ser Leu 65 Lys Ser Arg Leu Thr 70 Ile Ser Lys Asp Thr 75 Ser Lys Asn 61b Vai 8 0 Vai Leu Lys Vai Thr 85 Asn Met Asp Pro Ala 9ϋ Asp Thr Ala Thr Tyr S5 Tyr Cys Ala Arg Ser 100 Met Ile Thr Asn. Trp 105 Tyr Phe Asp Vai Trp 110 Gly Gin Gly Thr Thr 115 Vai Thr Vai Ser Ser 120

<210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>

<223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade de LI do anticorpo de referência anti-RSV <400> 3

Ser Ala Ser ser Ser vai Gly Tyr Met His 1 5 10

<210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>

<223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade de L2 do anticorpo de referência anti-RSV <400> 4

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser I 5 63 ΡΕ1265928

<210> 5 <211> 9 <212 > PRT <213> Sequência artificial <220>

<223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade de L3 do anticorpo de referência anti-RSV <400> 5 phe Gin Gly Ser Sly Tyr Pro Phe Thr i s

<210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>

<223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade de Hl do anticorpo de referência anti-RSV <400> 6 Tíir Ser Gly Met Ser Vai Gly α s

<210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>

<223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade de H2 do anticorpo de referência anti-RSV <400> 7 Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 S 10 15 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos

região determinante de complementaridade de H3 do anticorpo de referência anti-RSV <400> 8

Ser Met Xle Thr Asn Trp Tyr Phe Asp vai — 64 — ΡΕ1265928 15 10

<210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade de elevada afinidade dos anticorpos do invento. <400> 9

Thr Ala Gly Met Ser vai Gly 1 s

<210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade de elevada afinidade dos anticorpos do invento. <400> 10

Thr Pr o Gly Met Ser Vál Gly 1 5

<210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade de elevada afinidade dos anticorpos do invento. <400> 11

Ser Met He Thr Asa Phe Tyr The Asp Vai

1 5 1Q

<210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade de elevada afinidade dos anticorpos do invento. <400> 12 65 ΡΕ1265928

Asp Thr Phe Lys l»eu Ala Ser 1 S

<210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade de elevada afinidade dos anticorpos do invento. <400> 13

Asp Thr Tyr Lys heu Ala Ser 1 s

<210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade de elevada afinidade dos anticorpos do invento. <400> 14

Phe Gin Gly Ser Phe Tyr Prc Phe Thr 1 5

<210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade de elevada afinidade dos anticorpos do invento. <400> 15

Phe Gin Gly Ser Tyr Tyr Pro Phe Thr 1 5

<210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade de elevada afinidade dos anticorpos do invento. 66 ΡΕ1265928 <400> 16

Phe Gin Gly Ser Trp Tyr Pro Phe Thr 1 5

<210> 17 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do clone 1 da Figura 3a. <400> 17

Asp 1 Xle Gin Mtet Thr 5 Gin Ser Pro- Ser Thr 10 Leu Ser Ala Ser Vai 15 Gly ASp Arg Vãl Thr 20 ile Thr Cys Ser Ala 25 Ser Ser Ser vai Gly 30 Tyr Met Hls Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly Lys 40 Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile Tyr ASp Thr Ser 50 Lys Leu Ala Ser 55 Gly Vai Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly ser Gly 65 Ser Gly Thr Glu Phe 70 Thr Leu Thr Ile Ser 75 Ser Leu Gin Pro Asp 80 Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Phe Gin Gly 30 Ser Phe Tyr Pro· Thr Phe Gly Gly Gly 100 Thr LyS Vai Glu Ile 105 Lys

<210> 18 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do clone 1 da Figura 3a. <400> 18

Gin Vai Thr Leu Arg Gin Ser Gly Pr o Ala Leu Vâl Lys Pro Thr Gin 1 S 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly phe Ser Leu Ser Thr Ale 20 25 30

Gly «et Ser Vai Gly Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 3S 40 45

Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser 67 ΡΕ1265928 5 Ο 55

Leu Lys Ser Arg Leu Thr ile Ser 65 70

Vai Leu Lys Vai Thr Asti Met Asp 85

Cys Ala Arg Ser Met ile Thr Aau 100 60 lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Vai 75 80

Fro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 50 95

Phe Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin IQS 110

Gly Thr Thr Vai Thr vai ser Ser 115 120

<210> 19 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do clone 2 da Figura 4A. <400> 19 Âsp 1 11« Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Thr 10 Leu Ser Ala Ser val 15 Gly Asp Arg Vai Thr 20 Xle Thr Cys Ser Ala 25 Ser Ser Ser Vai. Gly Tyr 30 Met His Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile Tyr Asp Thr 50 Phe Lys Leu Ale Ser 5.5 Gly Vai Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly Ser Gly 65 Ser Gly Thr Slu Phe 70 Thr Leu Thr x'1 e Ser 75 ser Leu Gin Pro Asp 80 Asp Phe Thr Tyr Tyr 85 Cys Phe Gin. Gly 90 Ser Gly Tyr Pro Phe 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys 100 105

<210> 20 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do clone 2 da Figura 4B. <400> 20 68 ΡΕ1265928

Gin Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly l s

Thr Leu Thr Leu Thr Cyn Thr Phe 20

Gly «et ser Val Gly Trp Xle Arg 35 40

Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr βία 10 15

Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala 25 3 0

Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 45

Trp Leu Ala Asp Xle Trp Trp Aep Asp Lys Lys Asp Tyr As» Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val 65 70 75 &0

Val Leu Lys Val Thr Asn Me* Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 50 95

Cys Ala Arg Ser Het lie Thr Asn Phe Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Vai Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 21 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do clone 3 da Figura 5A. <400> 21

Asp Xle Gin Met Thr tí H 0 Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 S 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser ser Val Gly Tyr «et 20 25 30 His Trp Tyr Gl» Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Phe Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Phe Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu Ile Lys 100 105 <210> 22 69 ΡΕ1265928

<211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do clone 3 da Figura 5B. <400> 22

Gin Vai. Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pm Ale Leu Vai Lyss Pro Thr Gin l S 10 1:5

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ph® Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Pro 20 25 30

Gly Met Ser vai Gly Trp XIe Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu GLu 35 40 45

Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser 50 55 €0

Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin. Vai 55 ?0 75 60

Tyr Tyr 95

Gin

Vai Leu Lys Vai Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr 85 90

Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asa The Tyr Phe Asp Vai Trp 100 105 110

Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 23 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do clone 22 da Figura 6A. <400> 23

Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gla Ser Pro Asp Arg Vai Thr 20 Ile Thr Cys Ser His Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly 40 Asp Thr 50 Phe Lys Leu Ala Ser 55 Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu

Ser Thr 10 Leu Ser Ale Ser Vai 15 Gly Ala 25 Ser Ser Ser Vai Gly 30 Tyr Met Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile Tyr Vai Pro ser Arg «0 Phe Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Asp 70 ΡΕ1265928 65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys phe (31¾ Gly Ser Phe Tyr Pro Phe Thr 65 90 m

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai 01¾ He Lys 100 105

<210> 24 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do clone 22 da Figura 6B. <400> 24

Gin val Thr leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala leu Vai lys Pro Thr Gin. 15 10 15

Thr leu Thr Leu Thr Cys Thr phe Ser Gly Pbe Ser leu Ser Thr Ala 2:0 25 30

Gly Mete Ser Vai Gly Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala teu Glti 35 40 4S

Trp Leu Ala Asp He Trp Trp Asp Asp Lys lys Asp Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg leu Thr He Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Vai Ê5 70 75 80

Vai leu Lys Vai Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Ser Met He Thr Asn Phe Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 220

<210> 25 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do clone 23 da Figura 7A. <400> 25

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 lô 15 71 ΡΕ1265928 asp Arg Vâl Thr Xle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Vai Gly Tyr Hefc 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Xle Tyr 35 40 45

Asp Thr Phe Lys Leu Alã Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Xle ser Ser Leu Gin pro Asp 65 70 75 80

Asp Phe Ala Thx Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Tyr Tyr Pro Phe Thr 85 90 $5

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Xle Lys 100 105 <210> 26 <211> 120

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do clone 23 da Figura 7B. <400> 26

Gin 1 Vai Thr Leu Arg o 5 Glu Ser Gly Pro Ala 10 Leu Val Lys Pro Thr 15 Gin Thr Leu Thr Leu 20 Thr cys Thr Phe Ser Gly 25 Phe Ser Leu Ser 3© Thr Ala Gly Díet Ser 35 Vai Gly Trp Xle Arg 40 Gin Pro Pro Gly Lys 45 Ala Leu Glu Trp Leu 50 Ala Asp Xle Trp Trp Asp Asp 55 Lys Lys Asp 60 Tyr Asn Pro Ser Leu 65 Lys Ser Arg Leu Thr 70 Xle Ser Lys Asp Thr Ser 75 Lys Asn Gin Val so Vai Leu Lys Vai Thr 85 Asa Met Asp pro Ala 70 Asp Thr Ala Thr Tyr &5 Tyr Cys Ala Arg Ser 100 Met He Thr Asn Phe 105 Tyr Phe Asp Val Trp 110 Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Val Ser Ser 115 120

Lisboa, 23 de Setembro de 2010

Claims

ΡΕ1265928 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma imunoglobulina neutralizante, isolada, de elevada afinidade que, especificamente, se liga com uma constante de afinidade (Ka) de pelo menos ΙΟ^ΝΓ1 ao mesmo epitopo de um antigénio F do virus dos sincicios respiratórios (RSV) que um anticorpo composto por uma região variável da cadeia pesada (VH) tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 (Figura 1B) e uma região variável da cadeia leve (VL) tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N0:1 (Figura IA) , em que a imunoglobulina neutralizante de elevada afinidade compreende uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos numa ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) comparativamente com um anticorpo existente compreendendo: (i) uma VL compreendendo as seguintes sequências CDR: VL CDR1 SASSSVGYMH {SEQ ID NO: 3) r VL CDE2 DtSkLAS (SEQ 1D NO: 4 e VL CDRS FQGS§YPFT (SEQ ID NO: 5] (ii) uma VH compreendendo as seguintes sequências CDR: VH CDR ! tSgMSVG (SEQ ID NO: 6) wi f VH CDR2 DlWWDDKKDYNPSLKS (SEQ Ώ NO: 7) VH CDE3 SMfTNgYFDV (SEQ ID NO: 8; 2 ΡΕ1265928 em que as referidas substituições de um ou mais aminoácidos são feitas nas posições assinaladas e as referidas uma ou mais substituições de aminoácidos possuem o efeito de produzirem um aumento no Ka comparativamente com o anticorpo existente.
2. A imunoglobulina neutralizante de elevada afinidade da reivindicação 1 tendo uma constante de afinidade (Ka) de pelo menos 10ηΜ_1.
3. A imunoglobulina neutralizante de elevada afinidade da reivindicação 1 ou 2, em que a imunoglobulina neutraliza RSV conforme medido pelo ensaio de microneutralização descrito no Exemplo 2.
4. A imunoglobulina neutralizante de elevada afinidade de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a imunoglobulina compreende uma VH CDR1 com a sequência de aminoácidos TAGMSVG (SEQ ID NO:9) ou TPGMSVG (SEQ ID NO:10). neutralizante de qualquer em que a imunoglobulina sequência de aminoácidos neutralizante de qualquer em que a imunoglobulina sequência de aminoácidos
5. A imunoglobulina uma das reivindicações 1 a 3, compreende uma VH CDR3 com a SMITNFYFGV (SEQ ID NO:ll).
6. A imunoglobulina uma das reivindicações 1 a 3, compreende uma VL CDR2 com a DTFKLAS (SEQ ID NO:12) ou DTYKLAS (SEQ ID NO:13). 3 ΡΕ1265928
7. A imunoglobulina neutralizante de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a imunoglobulina compreende uma VL CDR3 com a sequência de aminoácidos FQGSFYPFT(SEQ ID NO:14), FQGSYYPFT (SEQ ID NO:15) OU FQGSWYPFT (SEQ ID NO:16).
8. A imunoglobulina neutralizante de elevada afinidade da reivindicação 1 ou 2, em que a referida imunoglobulina compreende: a. uma VH CDR1 com a sequência de aminoácidos TAGMSVG (SEQ ID NO:9); b. uma VH CDR2 com a sequência de aminoácidos DIWWDDKKDYNPSLKS (SEQ ID NO:7); c. uma VH CDR3 com a sequência de aminoácidos SMITNFYFDV (SEQ ID NO:11); d. uma VL CDR1 com a sequência de aminoácidos SASSSVGYMH (SEQ ID NO:3); e. uma VL CDR2 com a sequência de aminoácidos DTFKLAS (SEQ ID NO:12); e f. uma VL CDR3 com a sequência de aminoácidos FQGSFYPFT (SEQ ID NO:14)ou FQGSYYPFT (SEQ ID NO:15).
9. A imunoglobulina neutralizante de elevada afinidade da reivindicação 1, em que a referida imunoglobulina compreende uma VH CDR1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9; uma VH CDR3 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:11; uma VL CDR2 com a sequência de ΡΕ1265928 4 aminoácidos de aminoácidos de 10. afinidade da imunoglobulina aminoácidos de aminoácidos de aminoácidos de de aminoácidos 11. afinidade da imunoglobulina aminoácidos de aminoácidos de aminoácidos de de aminoácidos 12. afinidade da imunoglobulina aminoácidos de aminoácidos de aminoácidos de de aminoácidos 13 . afinidade da SEQ IDN0:4; e uma VL CDR3 com a sequência de SEQ ID NO:14. A imunoglobulina neutralizante de elevada reivindicação 1, em que a referida compreende uma VH CDR1 com a sequência de SEQ ID NO:9; uma VH CDR3 com a sequência de SEQ ID NO:11; uma VL CDR2 com a sequência de SEQ IDNO:12; e uma VL CDR3 com a sequência de SEQ ID NO:5. A imunoglobulina neutralizante de elevada reivindicação 1, em que a referida compreende uma VH CDR1 com a sequência de SEQ ID NO:10; uma VH CDR3 com a sequência de SEQ ID NO:11; uma VL CDR2 com a sequência de SEQ IDNO:12; e uma VL CDR3 com a sequência de SEQ ID NO:14. A imunoglobulina neutralizante de elevada reivindicação lou 2, em que a referida compreende uma VH CDR1 com a sequência de SEQ ID NO:9; uma VH CDR3 com a sequência de SEQ ID NO:11; uma VL CDR2 com a sequência de SEQ IDN0:12; e uma VL CDR3 com a sequência de SEQ ID NO:14. A imunoglobulina neutralizante de elevada reivindicação 1 ou 2, em que a referida ΡΕ1265928 5 imunoglobulina aminoácidos de aminoácidos de aminoácidos de de aminoácidos compreende uma VH CDR1 com a sequência de SEQ ID NO:9; uma VH CDR3 com a sequência de SEQ ID NO:11; uma VL CDR2 com a sequência de SEQ IDN0:12; e uma VL CDR3 com a sequência de SEQ ID NO:154.
14. A imunoglobulina neutralizante de elevada afinidade da reivindicação 1, em que a referida imunoglobulina compreende: a. uma VH CDR1 com a sequência de aminoácidos TAGMSVG (SEQ ID NO:9); b. uma VH CDR2 com a sequência de aminoácidos DIWWDDKKDYNPSLKS (SEQ ID NO:7); c. uma VH CDR3 com a sequência de aminoácidos SMITNFYFDV (SEQ ID NO:11); d. uma VL CDR1 com a sequência de aminoácidos SASSSVGYMH (SEQ ID NO:3); e. uma VL CDR2 com a sequência de aminoácidos DTSKLAS (SEQ ID NO:4); e f. uma VL CDR3 com a sequência de aminoácidos FQGSFYPFT (SEQ ID NO:14).
15. A imunoglobulina neutralizante de elevada afinidade da reivindicação 1, em que a referida imunoglobulina compreende: a. uma VH CDR1 com a sequência de aminoácidos TAGMSVG (SEQ ID NO:9); 6 ΡΕ1265928 b. uma VH CDR2 com a sequência de aminoácidos DIWWDDKKDYNPSLKS (SEQ ID NO:7); c. uma VH CDR3 com a sequência de aminoácidos SMITNFYFDV (SEQ ID NO:11 ); d. uma VL CDR1 com a sequência de aminoácidos SASSSVGYMH (SEQ ID NO:3) r e. uma VL CDR2 com a sequência de aminoácidos DTFKLAS (SEQ ID NO:12); e f. uma VL CDR3 com a sequência de aminoácidos FQGSFYPFT (SEQ ID NO:14) • 16 . A imunoglobulina neutralizante de elevada afinidade da reivindicação 1, em que a referida imunogl-obulina compreende: a. uma VH CDR1 com a sequência de aminoácidos TPGMSVG (SEQ ID NO:10); b. uma VH CDR2 com a sequência de aminoácidos DIWWDDKKDYNPSLKS (SEQ ID NO:7); c. uma VH CDR3 com a sequência de aminoácidos SMITNFYFDV (SEQ ID NO:11); d. uma VL CDR1 com a sequência de aminoácidos SASSSVGYMH (SEQ ID NO:3); e. uma VL CDR2 com a sequência de aminoácidos DTFKLAS (SEQ ID NO:12) ; e f. uma VL CDR3 com a sequência de aminoácidos FQGSFYPFT (SEQ ID NO:14)ou FQGSFYPFT (SEQ ID NO:14).
17. A imunoglobulina neutralizante de elevada 7 ΡΕ1265928 afinidade de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a imunoglobulina é um anticorpo tetramérico, um fragmento Fab, um F(ab)f2, um dimero das cadeias pesada e leve ou uma estrutura de cadeia simples.
18. A imunoglobulina de elevada afinidade de qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que a imunoglobulina é um anticorpo monoclonal.
19. A imunoglobulina neutralizante de elevada afinidade de qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que a imunoglobulina é um anticorpo humanizado.
20. A imunoglobulina neutralizante de elevada afinidade de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a imunoglobulina compreende as sequências estruturais descritas na Figura 1, 3, 4, 5, 6 ou 7.
21. A imunoglobulina neutralizante de elevada afinidade da reivindicação 1, em que a imunoglobulina compreende uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18.
22. A imunoglobulina neutralizante de elevada afinidade da reivindicação 1, em que a imunoglobulina compreende uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e uma região 8 ΡΕ1265928 variável da cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:20.
23. A imunoglobulina neutralizante de elevada afinidade da reivindicação 1, em que a imunoglobulina compreende uma região variável da cadeia leve com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável da cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:22.
24. A imunoglobulina neutralizante de elevada afinidade da reivindicação 1 ou 2, em que a imunoglobulina compreende uma região variável da cadeia leve com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável da cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:24.
25. A imunoglobulina neutralizante de elevada afinidade da reivindicação 1 ou 2, em que a imunoglobulina compreende uma região variável da cadeia leve com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e uma região variável da cadeia pesada com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:26.
26. Uma composição compreendendo a imunoglobulina de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida imunoglobulina é suspensa num veiculo farmacolo-gicamente aceitável. 9 ΡΕ1265928
27. A composição da reivindicação 26, para usar como um medicamento.
28. A composição da reivindicação 26, para usar na prevenção de uma doença causada por RSV num doente em risco de tal doença.
29. A composição da reivindicação 26, para usar no tratamento de uma doença causada por RSV num doente num doente atingido pela doença.
30. Utilização da composição da reivindicação 26, para a produção de um medicamento para a prevenção de uma doença causada por RSV num doente em risco de tal doença.
31. Utilização da composição da reivindicação 26, para a produção de um medicamento para o tratamento de uma doença causada por RSV num doente atingido pela doença.
32. A imunoglobulina de qualquer uma das reivindicações 1 a 25 para usar como medicamento.
33. A imunoglobulina da reivindicação 32, para usar na prevenção de uma doença causada por RSV num doente em risco de tal doença.
34. A imunoglobulina da reivindicação 32, para usar no tratamento de uma doença causada por RSV num doente atingido pela doença. 10 ΡΕ1265928
35. Utilização da imunoglobulina de qualquer uma das reivindicações 1 a 25 para a produção de um medicamento para a prevenção de uma doença causada por RSV num doente em risco de tal doença.
36. Utilização da imunoglobulina de qualquer uma das reivindicações 1 a 25 para a produção de um medicamento para o tratamento de uma doença causada por RSV num doente atingido pela doença.
37. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 30, 31, 35 ou 36, em que o doente é um ser humano.
38. A composição da reivindicação 28 ou 29, em que o doente é um ser humano.
39. A imunoglobulina da reivindicação 33 ou 34, em que o doente é um ser humano. Lisboa, 23 de Setembro de 2010