BR112021006123A2 - anticorpos anti-sinucleína - Google Patents

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BR112021006123A2
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Constantin Adrian Apetri
Xinji LI
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Janssen Vaccines & Prevention B.V.
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Abstract

ANTICORPOS ANTI-SINUCLEÍNA. A presente invenção refere-se a anticorpos anti-alfa-sinucleína e seus fragmentos de ligação ao antígeno são descritos. Também são descritos ácidos nucleicos codificando os anticorpos, composições compreendendo os anticorpos e métodos de produção de anticorpos e uso dos anticorpos para tratar ou prevenir doenças definidas por corpos de Lewy ou agregação de alfa-sinucleína.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPOS ANTI-SINUCLEÍNA”.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos monocionais anti-alfa-sinucleína, ácidos nucleicos e vetores de expressão codifi- cando os anticorpos, as células recombinantes contendo os vetores, e as composições compreendendo os anticorpos. Métodos de produção de anticorpos e métodos de uso de anticorpos para diagnosticar e tra- tar doenças caracterizadas por corpos de Lewy ou agregação de alfa- sinucleína também são conferidos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] A doença de Parkinson (DP) é o segundo distúrbio neuro- degenerativo mais comum com sintomas incluindo tremor, rigidez, len- tidão de movimento e equilíbrio e coordenação prejudicados. Cerca de
50.000 pessoas são diagnosticadas com DP nos Estados Unidos a cada ano e cerca de meio milhão de pessoas tem a doença (folhetos do NIH, doença de Parkinson).
[0003] A marca neuropatológica da DP são os corpos de Lewy e os neuritos de Lewy, agregados de proteínas anormais que são princi- palmente compostos por filamentos de alfa-sinucleína (Goedert et al., 2013). DP, DP com demência e demência com corpos de Lewy são todas doenças de corpos de Lewy que afetam 5 milhões de pessoas em todo o mundo (Lashuel et a/., 2013). Atrofia de múltiplos sistemas (MSA) (Spillantini et a/., 1998) e algumas doenças de armazenamento lisossomal, TAL como a doença de Gaucher (Shachar et al., 2011), também exibem agregação de alfa-sinucleína. Além disso, 50% dos casos da doença de Alzheimer (DA) mostram patologia de Corpos de Lewy (Ditter e Mirra, 1987). Adicionalmente, a alfa-sinucleína regula a agregação de amiloide-B (Bachhuber et a/l., 2015) e tau (Guo et al., 2013), duas proteínas associadas à marca neuropatológica da DA.
[0004] A análise da patologia do corpo de Lewy sugere uma dis- seminação progressiva de agregados de alfa-sinucleína com progres- são da doença ou progressão clínica da DP, o que sugere que a dis- seminação de agregados de alfa-sinucleína é o motor da patologia da doença (Braak e Del Tredici, 2008).
[0005] A alfa-sinucleína é uma proteína intrinsecamente desorde- nada de 140 aminoácidos, principalmente composta por três regiões, isto é, um terminal amino responsável pela interação da membrana; uma extremidade carboxil-terminal desordenada e o motivo hidrofóbico (resíduos de aminoácidos 65-90); conhecida como componente 8 não- amiloide das placas amiloides da DA (NAC), que é crítica para a agre- gação de alfa-sinucleína. Mutações pontuais (ASOP, E46K, H500Q, G51D, AS53E e A53T) da proteína alfa-sinucleína e dosagem aumenta- da de SNCA, o gene que codifica a alfa-sinucleína, estão associadas à forma familiar da DP (Lashuel et a/., 2013; Wong e Krainc, 2017). Além disso, o estudo de associação ampla do genoma (GWAS) identificou SNCA como um dos mais importantes fatores de risco genético para a DP idiopática (Goedert et a/., 2013).
[0006] Imunizações passivas e ativas contra alfa-sinucleína foram analisadas em camundongos visando a alfa-sinucleína (Games et al., 2014; Masliah et a/., 2005; Masliah et a/., 2011; Spencer et al., 2017; Tran et a/., 2014). Por exemplo, Masliah et al. imunizaram ativamente um modelo de camundongo transgênico com proteína alfa-sinucleína recombinante (Masliah et a/., 2005). Os camundongos produziram an- ticorpos contra a proteína alfa-sinucleína levando a uma melhoria sig- nificativa da acumulação da proteína alfa-sinucleína (Masliah et al., 2005). A imunização passiva com anticorpos monoclonais contra o terminal C da alfa-sinucleína melhora os déficits comportamentais as- sociados à deposição de alfa-sinucleína em modelos de camundongos com sinucleinopatia (Bae et a/., 2012; Games et al., 2014; Masliah et al., 2011). Em camundongos injetados com fibrilas sintéticas de alfa- sinucleína, a injeção de um anticorpo contra o terminal N da o- sinucleína melhorou a patologia do corpo de Lewy e reduziu a neuro- degeneração (Tran et al., 2014).
[0007] Ensaios clínicos de imunoterapia direcionados diretamente para a a-sinucleína incluem vacinas ativas PDO1A e PDO3A (Schnee- berger et al., 2016) ou imunoterapia passiva com anticorpos PRX002 (Schenk et a/., 2017) e BIIBO54 (Weihofen et al., 2016).
[0008] A incidência de DP aumenta com a idade e o custo para a sociedade aumenta sem um método eficaz para diagnosticar, prevenir e tratar a doença. Atualmente, a DP é diagnosticada quando a maioria das células nervosas dopaminérgicas já está perdida e nenhum dos métodos de tratamento pode abrandar significativamente a neurode- generação subjacente (folhetos do NIH, doença de Parkinson). A des- coberta de novos métodos de diagnósticos e terapêuticos para a DP e outras doenças do corpo de Lewy é crítica.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0009] A presente invenção refere-se a anticorpos monocionais isolados (mMAbs) ou seus fragmentos de ligação ao antigênio que se ligam à alfa-sinucleína humana.
[0010] São conferidos anticorpos monoclonais isolados ou seus fragmentos de ligação ao antígeno compreendendo uma região deter- minante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDRI1), HCDR2, HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências poli- peptídicas de: (a) SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 16, 17, e 18, respectivamente; (b) SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 19, 20, e 21, respectivamente; ou (c) SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 22, 23, e 24, respectivamente;
em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga especificamente à alfa-sinucleína, preferencialmente à alfa-sinucleína humana.
[0011] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variá- vel de cadeia pesada tendo uma sequência polipeptídica pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 1, 3 ou 5, ou uma região variável de ca- deia leve tendo uma sequência polipeptídica pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, 4 ou 6.
[0012] Em certas modalidades, o anticorpo monoclional isolado, ou o seu fragmento de ligação ao antígeno, compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada tendo a se- quência polipeptídica de SEQ ID NO: 1 e uma região variável de ca- deia leve tendo a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2; (b) uma região variável de cadeia pesada tendo a se- quência polipeptídica de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de ca- deia leve tendo a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 4; ou (c) uma região variável de cadeia pesada tendo a se- quência polipeptídica de SEQ ID NO: 5 e uma região variável de ca- deia leve tendo a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 6.
[0013] Também são conferidos anticorpos monoclonais isolados ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especifica- mente a um epítopo em um peptídeo de alfa-sinucleína compreenden- do a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28. Também são con- feridos anticorpos monoclionais isolados ou seus fragmentos de liga- ção ao antígeno que se ligam especificamente a um epítopo em um peptídeo de alfa-sinucleína compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 31.
[0014] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal ou seu fra- gmento de ligação ao antígeno reduz o nível de alfa-sinucleína.
[0015] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal ou seu fra- gmento de ligação ao antígeno previne reduz o nível de agregação de alfa-sinucleína.
[0016] Também são conferidas variantes funcionais dos anticorpos monoclonais ou seus fragmentos de ligação ao antígeno da invenção.
[0017] Em certas modalidades, são conferidos imunoconjugados compreendendo o anticorpo monoclional isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção e pelo menos um tratamento terapêu- tico e/ou agente detectável.
[0018] Também são conferidos ácidos nucleicos isolados codifi- cando os anticorpos monoclonais ou seu fragmento de ligação ao an- tígeno da invenção descritos no presente documento.
[0019] Também são conferidos vetores compreendendo os ácidos nucleicos isolados codificando os anticorpos monoclonais ou seus fra- gmentos de ligação ao antígeno da invenção.
[0020] Também são conferidas células hospedeiras compreen- dendo os vetores compreendendo os ácidos nucleicos isolados codifi- cando os anticorpos monoclonais ou seus fragmentos de ligação ao antígeno da invenção.
[0021] Em certas modalidades, é conferida uma composição far- macêutica compreendendo o anticorpo monoclonal isolado ou seu fra- gmento de ligação ao antígeno da invenção e um portador farmaceuti- camente aceitável.
[0022] Também são conferidos métodos de prevenção ou redução da agregação de alfa-sinucleína em um indivíduo com necessidade dos mesmos, compreendendo a administração ao indivíduo das com- posições farmacêuticas da invenção.
[0023] Também são conferidos métodos de tratamento de uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou agregação de alfa- sinucleína em um indivíduo com necessidade dos mesmos, compre-
endendo a administração ao indivíduo das composições farmacêuticas da invenção. Em certas modalidades, a doença caracterizada por cor- pos de Lewy ou agregação de alfa-sinucleína é selecionada a partir de qualquer sinucleinopatia. Em outras modalidades, a doença caracteri- zada por corpos de Lewy ou agregação de alfa-sinucleína é seleciona- da a partir do grupo consistindo em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia sistêmica múltipla, e doenças do armazenamento lisossomal.
[0024] Também são conferidos métodos de produção do anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção, compreendendo a cultura de uma célula compreendendo um ácido nu- cleico codificando o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno sob condições para produzir o anticorpo monoclonal ou frag- mento de ligação ao antígeno e recuperação do anticorpo monocional ou fragmento de ligação ao antígeno a partir da célula ou cultura.
[0025] Também são conferidos métodos de produção de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção, compreendendo a combinação do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antí- geno com um portador farmaceuticamente aceitável de forma a obter a composição farmacêutica.
[0026] Também são conferidos métodos para determinar um nível de alfa-sinucleína em um indivíduo. Os métodos compreendem (a) ob- ter uma amostra a partir do indivíduo; (b) colocar a amostra em contato com um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção; e (c) determinar o nível de alfa-sinucleína no indivíduo. Em certas modalidades, a amostra é uma amostra de tecido. A amostra de tecido pode, por exemplo, ser uma amostra de tecido cerebral. Em certas modalidades, a amostra é uma amostra de san- gue.
[0027] Em certas modalidades, são conferidos métodos de diag- nóstico de uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou agrega- ção de alfa-sinucleína. Os métodos compreendem (a) obter uma amostra a partir do indivíduo; (b) colocar a amostra em contato com um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antí- geno da invenção; e (c) detectar agregados de alfa-sinucleína no indi- víduo, em que a detecção de alfa-sinucleína é diagnóstico de o indiví- duo ter uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou agregados de alfa-sinucleína.
[0028] Também são conferidos kits compreendendo pelo menos um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antí- geno da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0029] O sumário precedente, bem como a seguinte descrição de- talhada de modalidades preferidas do presente pedido, serão melhor entendidos quando lidos em conjunção com os desenhos em anexo. No entanto, deve ser entendido que o pedido não está limitado às mo- dalidades precisas mostradas nos desenhos.
[0030] As FIGS. 1A-B mostram a análise de sequência de anticor- pos monoclonais anti-alfa-sinucleína recuperados. A FIG. 1A mostra o número de mutações somáticas em sequências de aminoácidos (aa) e de nucleotídeos (nt) das regiões variáveis de cadeia pesada (HC) e de cadeia leve (LC) de anticorpos isolados a partir de células B de memó- ria de pacientes com doença de Parkinson (DP) e sem doença de Par- kinson (sem DP). Mutações e identificação da linha germinativa mais próxima foram determinadas usando bancos de dados IgBlast. As li- nhas horizontais indicam a média. A FIG. 1B mostra a análise filogené- tica das regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo alfa- sinucleína recuperado usando o algoritmo de união de vizinhança (modelo Jukes Cantor) e ilustrado como um diagrama circular.
[0031] A FIG. 2 mostra perfis de associação (0-600 s) e de disso- ciação (600-1.200 s) para uma seleção representativa de anticorpos monoclonais anti-alfa-sinucleína (hanti-Asyn) humanos recuperados para sinucleína de comprimento total biotinilada, como determinado por interferometria de biocamada de Octet. Os dados correspondentes às variantes hanti-Asyn individuais são mostrados nas linhas corres- pondentes, como destacado na legenda da figura.
[0032] As FIGS. 3A-3C mostram o mapeamento de epítopo e es- pecificidade de hanti-Asyn-323.1, hanti-Asyn-336.1 e hanti-Asyn-338.1 como determinado por interferometria de biocamada de Octet. A espe- cificidade foi determinada para regiões peptídicas de alfa-sinucleína que abrangem os aminoácidos 1-25 (syn1-25), 18-44 (syn18-44), 40- 65 (syn40-65), 111-140 (syn111-140), 121-140 (syn121-140), e 111- 140 com uma serina fosforilada na posição 129 (syn11-140 (pS129)). A cinética de associação (0-600 s) e de dissociação (600-1.200 s) para a ligação de hanti-Asyn-323.1 (FIG. 3A), hanti-ASyn-336.1 (FIG. 3B) e hanti-ASyn-338.1 (FIG. 3C) para diferentes peptídeos de sinucleína são mostrados, e a ligação fora do alvo de mAbs anti-sinucleína contra peptídeos tau irrelevantes é mostrada no gráfico inferior de cada pai- nel.
[0033] A FIG. 4 mostra a atividade funcional para uma seleção re- presentativa de anticorpos monoclionais hanti-Asyn testados em um ensaio de semeadura de sinucleína in vitro. O ensaio mede a capaci- dade de cada mAb anti-sinucleína para inibir a formação de agregados de sinucleína em células que expressam transitoriamente alfa-sinucle- ína de comprimento total marcadas com V5 e HA e tratadas com ou sem agregados (sementes) de alfa-sinucleína recombinante de 10 upg/mL. Cada anticorpo é testado a 500 ug/mL na presença ou ausên- cia de sementes de sinucleína e a atividade inibidora é representada graficamente como uma porcentagem de partículas positivas quanto a
APC. Cada anticorpo foi testado em quadruplicados em duas experi- ências independentes. As barras de erro indicam o desvio padrão (DP).
[0034] As FIGS. 5A-5C mostram ligação de afinidade de anticor- pos anti-sinucleína humanos para proteína sinucleína de comprimento total, como determinado por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A FIG. 5A mostra medições de afinidade de ligação para o anticorpo anti-alfa-sinucleína humano 323.1 (hantiAsyn-323.1). A FIG. 5B mostra medições de afinidade de ligação para o anticorpo anti-alfa-sinucleína humano 336.1 (hantiAsyn-336.1). A FIG. 5C mostra medições de afini- dade de ligação para o anticorpo anti-alfa-sinucleína humano 338.1 (hantiAsyn-338.1). Os parâmetros termodinâmicos e as constantes de dissociação de equilíbrio, Kd, foram determinados mediante o ajuste dos dados ITC a um modelo assumindo um conjunto único de locais de ligação correspondentes a um modelo de ligação de anticorpo: si- nucleína (1:2). As linhas contínuas representam o melhor ajuste dos dados experimentais, assumindo um conjunto único de locais de liga- ção. As experiências foram realizadas em PBS. As constantes de dis- sociação de equilíbrio (Kd) são mostradas nos gráficos individuais.
[0035] A FIG. 6 mostra imuno-histoquímica de detecção de alfa- sinucleína em tecido cerebral de Doença de Parkinson (DP). A imuno- histoquímica foi realizada no mesencéfalo de um caso de DP. O painel A mostra a detecção com o mAb anti-sinucleína de controle, LB509; o painel B mostra a detecção com hantiAsyn-336.1; o painel C mostra a detecção com hantiAsyn-338.1; e o painel D mostra a detecção com hantiAsyn-323.1. No painel B, o asterisco indica um corpo de Lewy (à esquerda de *, não corado com DAB). A barra de escala representa 50 um.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0036] Várias publicações, artigos e patentes são citados ou des-
critos nos antecedentes e ao longo do relatório descritivo; cada uma dessas referências é incorporada no presente documento por referên- cia na sua totalidade. A discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou similares que foram incluídos no presente rela- tório descritivo se destina ao propósito de fornecer contexto para a in- venção. Tal discussão não é uma admissão de que qualquer uma ou todas essas matérias fazem parte da técnica precedente no que diz respeito a quaisquer invenções descritas ou reivindicadas.
[0037] A não ser que definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por um perito comum na téc- nica à qual esta invenção pertence. Caso contrário, determinados ter- mos usados no presente documento têm os significados como apre- sentados no relatório descritivo.
[0038] Deve ser notado que, como usadas neste documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" inclu- em referências no plural a menos que o contexto determine claramen- te de outro modo.
[0039] A não ser que afirmado de outro modo, quaisquer valores numéricos, tais como uma concentração ou uma gama de concentra- ções descrita neste documento, devem ser entendidos como estando modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Assim, um valor numérico inclui tipicamente + 10% do valor apresentado. Por exemplo, uma concentração de 1 mg/mL inclui 0,9 mg/mL até 1,1 mg/mL. Do mesmo modo, uma gama de concentrações de 1% até 10% (p/v) inclui 0,9% (p/v) até 11% (p/v). Como usado neste documento, o uso de uma gama numérica inclui expressamente todas as possíveis subgamas, todos os valores numéricos individuais dentro dessa gama, incluindo números inteiros dentro de tais gamas e frações dos valores a não ser que o contexto indique claramente de outro modo.
[0040] A menos que indicado de outro modo, o termo "pelo me- nos" precedendo uma série de elementos é para ser entendido como se referindo a todos os elementos na série. Os peritos na técnica irão reconhecer, ou ser capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades espe- cíficas da invenção descritas no presente documento. Tais equivalen- tes são destinados a ser englobados pela invenção.
[0041] Como usado no presente documento, os termos "compre- ende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "tem", "tendo", "contém" ou "contendo", ou qualquer outra variação dos mesmos, serão enten- didos como implicando a inclusão de um número inteiro ou grupo de números inteiros mencionado, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros, e pretendem ser não ex- clusivos ou abertos. Por exemplo, uma composição, uma mistura, um processo, um método, um artigo ou um dispositivo que compreende uma lista de elementos não está necessariamente limitado a apenas esses elementos, mas pode incluir outros elementos não expressa- mente listados ou inerentes a tal composição, mistura, processo, mé- todo, artigo ou dispositivo. Adicionalmente, salvo expressamente men- cionado em contrário, "ou" se refere a um ou inclusivo e não a um ou exclusivo. Por exemplo, uma condição A ou B é atendida por qualquer um dos seguintes: A é verdadeira (ou está presente) e B é falsa (ou não está presente), A é falsa (ou não está presente) e B é verdadeira (ou está presente), e tanto A como B são verdadeiras (ou estão pre- sentes).
[0042] Como usado no presente documento, o termo conjuntivo "e/ou" entre múltiplos elementos recitados é entendido como abran- gendo tanto as opções individuais como combinadas. Por exemplo, quando dois elementos são unidos por "e/ou", uma primeira opção se refere à aplicabilidade do primeiro elemento sem o segundo. Uma se-
gunda opção se refere à aplicabilidade do segundo elemento sem o primeiro. Uma terceira opção se refere à aplicabilidade dos primeiro e segundo elementos em conjunto. Qualquer uma dessas opções é en- tendida como caindo dentro do significado, e, portanto, satisfaz os re- quisitos do termo "e/ou" como usado no presente documento. A apli- cabilidade concorrente de mais do que uma das opções também é en- tendida como caindo dentro do significado, e, desse modo, satisfaz o requisito do termo "e/ou".
[0043] Como usado no presente documento, o termo "consiste em" ou variações tais como "consistem em" ou "consistindo em", como usados ao longo do relatório descritivo e das reivindicações, indica a inclusão de qualquer número inteiro ou grupo de números inteiros mencionado, mas que nenhum número inteiro ou grupo de números inteiros adicional pode ser adicionado ao método, estrutura ou compo- sição especificados.
[0044] Como usado no presente documento, o termo "consiste es- sencialmente em" ou variações tais como "consistem essencialmente em" ou "consistindo essencialmente em", como usados ao longo do relatório descritivo e das reivindicações, indica a inclusão de qualquer número inteiro ou grupo de números inteiros mencionado, e a inclusão opcional de qualquer número inteiro ou grupo de números inteiros mencionado que não mude de forma material as propriedades básicas ou novas do método, estrutura ou composição especificados. Ver M.P.E.P. $2111.03.
[0045] Como usado no presente documento, "indivíduo" significa qualquer animal, preferencialmente um mamífero, mais preferencial- mente um ser humano. O termo "mamífero", como usado no presente documento, abrange qualquer mamífero. Exemplos de mamíferos in- cluem, mas não se limitam a, vacas, cavalos, ovelhas, porcos, gatos, cães, camundongos, ratos, coelhos, porquinhos-da-índia, macacos,
seres humanos, etc., mais preferencialmente um ser humano.
[0046] Deve ser também entendido que os termos "cerca de", "aproximadamente", "geralmente", "substancialmente" e termos simila- res, usados no presente documento quando se referindo a uma di- mensão ou característica de um componente da invenção preferencial, indicam que a dimensão/característica descrita não é um limite ou pa- râmetro estrito e não exclui pequenas variações das mesmas que se- jam funcionalmente iguais ou similares, como será entendido por um perito na técnica. No mínimo, tais referências que incluem um parâme- tro numérico incluem variações que, usando princípios matemáticos e industriais aceites na técnica (por exemplo, erros de arredondamento, medição ou outros erros sistemáticos, tolerâncias de fabricação, etc.) não variam o dígito menos significativo.
[0047] Os termos "idêntico" ou porcentagem de "identidade", no contexto de dois ou mais ácidos nucleico ou sequências de polipeptí- deos (por exemplo, polipeptídeos de alfa-sinucleína e polinucleotídeos de alfa-sinucleína que codificam os mesmos), se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são a mesma ou têm uma porcentagem especificada de resíduos aminoácido ou nucleotídeos que são o mesmo, quando comparados e alinhados para máxima cor- respondência, como medido usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou por inspeção visual.
[0048] Para comparação de sequências, tipicamente uma sequên- cia atua como uma sequência de referência, com a qual as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, as coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo de sequência são designados. O algoritmo de comparação de sequências, em se- guida, calcula a porcentagem de identidade de sequência para a(s)
sequência(s) de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designados.
[0049] O alinhamento ótimo das sequências para comparação po- de ser conduzido, por exemplo, através do algoritmo de homologia lo- cal de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algorit- mo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela procura de método de semelhança de Pear- son & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. E.U.A. 85:2444 (1988), por im- plementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Software da Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por ins- peção visual (ver geralmente, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et a/l., eds., Current Protocols, uma joint venture entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (Suple- mento de 1995) (Ausubel)).
[0050] Exemplos de algoritmos que são adequados para a deter- minação porcentual da sequência de identidade e semelhança de se- quência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que estão descritos em Altschul et a/. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. O software para realizar análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information. Esse algoritmo envolve primeiramente a identificação de pares de sequência de elevada pon- tuação (HSPs) por identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que correspondem ou satisfazem alguma pontuação limite de valor positivo T quando alinhadas com uma pala- vra do mesmo comprimento em uma base de dados de sequências. T é referido como o limite de pontuação da palavra vizinha (Altschul et al, supra). Esses acertos de palavras vizinhas iniciais atuam como se- mentes para iniciar pesquisas de forma a encontrar HSPs mais longos que as contenham. Os acertos de palavras são então estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência tão longe quanto a pontuação de alinhamento cumulativo possa ser aumentada.
[0051] As pontuações cumulativas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de recom- pensa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos com emparelhamento defei- tuoso; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada de forma a calcular a pontuação cumulativa. A ex- tensão dos acertos de palavras em cada direção é interrompida quan- do: a pontuação de alinhamento cumulativa diminui pela quantidade X desde o seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa tende para zero ou menor, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou é atingido o fim de qualquer uma das sequências. Os parâmetros W, T, e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O progra- ma BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N =-4 e uma comparação de ambas as cadeias. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrões um comprimen- to de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pon- tuação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 89:10915 (1989)).
[0052] Em adição ao cálculo da identidade de sequência porcen- tual, o algoritmo BLAST também executa uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin & Al- tschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. E.U.A. 90:5873-5787 (1993)). Uma medi- da da similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade da menor soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilida- de de uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos ocorrer por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado semelhante a uma sequência de referência se a probabi- lidade da menor soma em uma comparação do ácido nucleico de teste com o ácido nucleico de referência for menor do que cerca de 0,1, mais preferencialmente menor do que cerca de 0,01, e o mais prefe- rencialmente menor do que cerca de 0,001.
[0053] Uma indicação adicional de que duas sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos são substancialmente idênticas é quando o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico é imunologica- mente reativo de forma cruzada com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico, como descrito abaixo. Desse modo, um poli- peptídeo é tipicamente substancialmente idêntico a um segundo poli- peptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas por substituições conservativas. Outra indicação que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é quando as duas moléculas hibridam uma com a outra sob condições estringentes. Anticorpos
[0054] A presente invenção geralmente se refere a anticorpos anti- alfa-sinucleína isolados, ácidos nucleicos e vetores de expressão codi- ficando os anticorpos, as células recombinantes contendo os vetores, e as composições compreendendo os anticorpos. Métodos de produ- ção de anticorpos e métodos de uso de anticorpos para diagnosticar e tratar doenças caracterizadas por corpos de Lewy ou agregação de alfa-sinucleína. Os anticorpos da invenção possuem uma ou mais pro- priedades funcionais desejáveis, incluindo, mas não se limitando a li- gação de elevada afinidade à alfa-sinucleína, a capacidade de reduzir o nível de alfa-sinucleína e a capacidade de prevenir ou reduzir a agregação de alfa-sinucleína.
[0055] Em um aspeto geral, a invenção se relaciona a anticorpos monoclonais isolados ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam à alfa-sinucleína humana.
[0056] Como usado no presente documento, o termo "anticorpo" é usado em um sentido lato e inclui imunoglobulina ou moléculas de an- ticorpo, incluindo anticorpos humanos, humanizados, compósitos e quiméricos e fragmentos de anticorpos que são anticorpos monoclio- nais ou policlonais. Em geral, os anticorpos são proteínas ou cadeias peptídicas que exibem especificidade de ligação a um antígeno espe- cífico. As estruturas de anticorpos são bem conhecidas. As imunoglo- bulinas podem ser associadas a cinco classes principais, (ou seja, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM), dependendo da sequência de aminoácidos de domínio constante de cadeia pesada. A IgA e IgG adicionalmente são subclassificadas como os isótipos IgAl, IgA2, IgG1, IgG2, I9gG3 e I1g9G4. Consequentemente, os anticorpos da invenção podem ser de qualquer uma das cinco classes principais ou subclasses correspondentes. Pre- ferencialmente, os anticorpos da invenção são Ig9G1, IgG2, IgG3 ou IgG4. As cadeias leves de anticorpos de espécies vertebradas podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, nomeadamente Kappa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. Consequentemente, os anticorpos da invenção podem conter um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda. De acordo com modalidades particulares, os anticorpos da invenção incluem regiões constantes de cadeia pesada e/ou leve a partir de an- ticorpos humanos. Além dos domínios constantes pesados e leves, os anticorpos contêm uma região de ligação ao antígeno que é composta por uma região variável de cadeia leve e uma região variável de ca- deia pesada, cada uma das quais contém três domínios (ou seja, regi- ões determinantes de complementaridade 1-3; CDR1, CDR2 e CDR3). Os domínios da região variável de cadeia leve são alternativamente referidos como LCDR1, LCDR2 e LCDR3, e os domínios da região va- riável de cadeia pesada são alternativamente referidos como HCDR1,
HCDR2 e HCDR3.
[0057] Como usado no presente documento, o termo "anticorpo isolado" se refere a um anticorpo que está substancialmente isento de outros anticorpos tendo diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a alfa-sinu- cleína está substancialmente ausente de anticorpos que não se ligam a alfa-sinucleína). Além disso, um anticorpo isolado está substancial- mente ausente de outro material celular e/ou produtos químicos.
[0058] Como no presente documento usado, o termo "anticorpo monoclonal" se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos, exceto para possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em pequenas quantidades.
[0059] Como usado no presente documento, o termo "fragmento de ligação ao antígeno" se refere a um fragmento de anticorpo tal co- mo, por exemplo, um diacorpo, um Fab, um Fab', um F(ab')2, um fra- gmento Fv, um fragmento Fv de dissulfeto estabilizado (dsFv), um (dsFv)2a, um dsFv biespecífico (dsFv-dsFv'), um diacorpo estabilizado por dissulfeto (diacorpo ds), uma molécula de anticorpo de cadeia úni- ca (scFv), um anticorpo de domínio único (sdab) um dímero de scFv (diacorpo bivalente), um anticorpo multiespecífico formado a partir de uma porção de um anticorpo compreendendo um ou mais CDRs, um anticorpo de domínio único camelizado, um nanocorpo, um anticorpo de domínio, um anticorpo de domínio bivalente ou qualquer outro fra- gmento de anticorpo que se ligue a um antígeno, mas que não com- preende uma estrutura de anticorpo completa. Um fragmento de liga- ção ao antígeno é capaz de se ligar ao mesmo antígeno ao qual o an- ticorpo parental ou um fragmento de anticorpo parental se ligam. De acordo com modalidades particulares, o fragmento de ligação ao antí-
geno compreende uma região variável de cadeia leve, uma região constante de cadeia leve e um segmento Fd da cadeia pesada. De acordo com outras modalidades particulares, o fragmento de ligação ao antígeno compreende Fab e F(ab').
[0060] Como usado no presente documento, o termo "anticorpo humano" se refere a um anticorpo produzido por um ser humano ou um anticorpo tendo uma sequência de aminoácidos correspondente a um anticorpo produzido por um ser humano feito usando qualquer téc- nica conhecida na técnica. Essa definição de um anticorpo humano inclui anticorpos intactos ou de comprimento total, seus fragmentos e/ou anticorpos compreendendo pelo menos um polipeptídeo humano de cadeia pesada e/ou leve. Comparado com anticorpos do tipo hu- mano gerados artificialmente, tais como fragmentos de anticorpo de cadeia simples (scFvs) a partir de uma biblioteca de anticorpos apre- sentada por fagos ou camundongos xenogênicos, o anticorpo humano da presente invenção é caracterizado por (i) a região de ligação ao an- tígeno ser obtida usando a resposta imunitária humana em vez da de substitutos animais, ou seja, a região de ligação ao antígeno foi gerada em resposta à alfa-sinucleína natural na sua conformação relevante no corpo humano e/ou (ii) tendo protegido o indivíduo ou é pelo menos significativo para a presença de alfa-sinucleína.
[0061] Por exemplo, o emparelhamento de cadeias pesadas e le- ves de anticorpos de tipo humano, tais como anticorpos sintéticos e semissintéticos tipicamente isolados a partir da expressão de fagos, não reflete necessariamente o emparelhamento original tal como ocor- re na célula B humana original. Consequentemente, os fragmentos Fab e scFv obtidos a partir de bibliotecas de expressão recombinan- tes, tal como normalmente usados na técnica precedente, podem ser considerados como sendo artificiais com todos os possíveis efeitos associados em termos de imunogenicidade e estabilidade. Em con-
traste, a presente invenção proporciona regiões de ligação a antígeno de anticorpos anti-alfa-sinucleína madurados por afinidade a partir de indivíduos humanos selecionados, as quais, em certas modalidades, são expressas de forma recombinante como quimeras com uma região constante de IgG1 comum.
[0062] Como usado no presente documento, os termos "alfa- sinucleína" ou "a-sinucleína" são usados indistintamente e se referem à proteína alfa-sinucleína humana, a qual é um membro de uma famí- lia de proteínas de sinucleínas. A alfa-sinucleína é uma proteína nati- vamente desdobrada altamente solúvel, expressa em todo o sistema nervoso central. Sob condições patológicas, a alfa-sinucleína forma fibras insolúveis, ou protofibrilas, que se agregam e formam o principal componente estrutural dos corpos de Lewy (Spillantini et a/. 1997; Spil- lantini et a/. 1998; Baba et a/. 1998). A disseminação de agregados de alfa-sinucleína foi correlacionada com a progressão da doença (Braak et al. 2003). A proteína é composta por três regiões distintas: (1) um terminal amino (resíduos 1-60), contendo motivos de ligação a lipídios de apolipoproteína, que são previstos formarem hélices anfifílicas con- ferindo a propensão de formar estruturas em hélice a na ligação à membrana, (2) uma região hidrofóbica central (61-95), denominada NAC (componente não AB), que confere o potencial de folha B, e (3) um terminal carboxila que está altamente carregado negativamente e é propenso a ser não estruturado. O gene SNCA codifica para a proteína alfa-sinucleína de 140 aminoácidos. Mutações pontuais (A3SOP, E46K, H50Q, G51D, A53E e A53T) da proteína alfa-sinucleína e dosagem aumentada de SNCA, o gene que codifica a alfa-sinucleína, estão as- sociadas à forma familiar da DP (Lashuel et al/., 2013; Wong e Krainc, 2017). Além disso, um estudo de associação ampla do genoma (GWAS) identificou SNCA(número de acesso NM 000345) como um dos mais importantes fatores de risco genético para a DP idiopática
(Goedert et al., 2013).
[0063] Como usado no presente documento, um anticorpo que "se liga especificamente a alfa-sinucleína" se refere a um anticorpo que se liga a uma alfa-sinucleína, preferencialmente uma alfa-sinucleína hu- mana, com um KD de 1x10” M ou menos, preferencialmente 5x10"6 ou menos, mais preferencialmente 1x10-7 M ou menos, preferencial- mente 1x10-8 M ou menos, mais preferencialmente 5x 10-9 ou me- nos, 1x10-9 M ou menos, 5%X10-10 M ou menos, ou 1xX10-10 M ou menos. O termo "KD" se refere à constante de dissociação, que é ob- tida a partir da proporção de Kd em relação a Ka (isto é, Kd/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Os valores de KD para anticorpos podem ser determinados usando métodos na técnica em vista da presente invenção. Por exemplo, a KD de um anticorpo pode ser determinada usando ressonância de plasmon de superfície, tal como usando um sistema biossensor, por exemplo, um sistema Biaco- reO, ou usando tecnologia de interferometria de bio-camada, tal como um sistema Octet RED96.
[0064] Quanto menor o valor de KD de um anticorpo, maior a afi- nidade para o anticorpo se ligar a um antígeno alvo. Como usado no presente documento, o termo "afinidade" se refere a uma medida da força da ligação de um epítopo individual ou epítopo parcial com as CDRs de uma molécula de ligação, por exemplo, uma molécula de imunoglobulina; ver, por exemplo, Harlow et a/l., Antibodies: A Labora- tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2º ed. (1988) nas páginas 27-28. As técnicas gerais para medir a afinidade de um anti- corpo para um antígeno incluem ensaios imunosorventes ligados a en- zima (ELISA), radioimunoensaios (RIA), calorimetria de titulação iso- térmica (ITC) e ressonância de plasmon de superfície.
[0065] O termo "epítopo", como usado no presente documento, significa a parte do antígeno que é contatada pelo laços da CDR do anticorpo. Um "epítopo estrutural" compreende cerca de 15 — 22 resí- duos de contato na superfície do antígeno e envolve muitos resíduos de aminoácidos que estabelecem contato com um grande grupo de resíduos em CDRs coletivamente referidas como o paratopo do anti- corpo. O contato direto entre os resíduos de epítopo e paratopo é es- tabelecido por meio de forças eletrostáticas, tais como ligações de hi- drogênio, pontes salinas, forças de van der Waals de superfícies hidro- fóbicas e complementaridade de forma. A interface também tem liga- das moléculas de água ou outros cofatores que contribuem para a es- pecificidade e afinidade de interações antígeno-anticorpo. A energia de ligação de um complexo antígeno-anticorpo é principalmente mediada por um pequeno subconjunto de resíduos de contato na interface epí- topo-paratopo. Esses "resíduos energéticos" estão frequentemente localizados no centro da interface epíitopo-paratopo e formam o epíto- po funcional. Os resíduos de contato na periferia da interface fazem geralmente contribuições menores para a energia de ligação; as suas substituições têm frequentemente pouco efeito na ligação com o antí- geno. Assim, a atividade de ligação ou funcional de um epítopo envol- ve um pequeno subconjunto de resíduos energéticos localizados cen- tralmente no epítopo estrutural e contatados pelas CDRs que determi- nam a especificidade. A atribuição de um epítopo funcional ligado a uma proteína antigênica pode ser feita usando vários métodos incluin- do a mutagênese de varredura de Alanina ou resolvendo a estrutura cristalina do antígeno com o anticorpo.
[0066] Um epítopo pode ser de natureza linear ou pode ser um epítopo descontínuo, por exemplo, um epítopo conformacional, que é formado por uma relação espacial entre aminoácidos não contíguos de um antígeno em vez de uma série linear de aminoácidos. Um epítopo conformacional inclui epítopos resultantes da dobragem de um antíge- no, em que os aminoácidos a partir de diferentes porções da sequên-
cia linear do antígeno vêm em grande proximidade no espaço tridi- mensional. Para epítopos descontínuos, pode ser possível obter a li- gação de um ou mais peptídeos lineares com afinidade diminuída a um epítopo dito parcial, por exemplo disperso em diferentes regiões da sequência da proteína (M.S. Cragg (2011), Blood 118 (2):219—20).
[0067] De acordo com um aspeto particular, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma região determinante de complementa- ridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma HCDR2, uma HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR?2 e uma LCDR3, tendo as sequências polipeptídicas de: (a) SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 16, 17, e 18, respectivamente; (b) SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 19, 20, e 21, respectivamente; ou (c) SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 22, 23, e 24, respectivamente; em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga especificamente à alfa-sinucleína, preferencialmente à alfa-sinucleína humana.
[0068] De acordo com outro aspeto particular, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compreendendo: (a) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia polipeptídica de SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia le- ve tendo a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2; (b) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia polipeptídica de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia le- ve tendo a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 4; ou (c) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia polipeptídica de SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia le- ve tendo a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 6.
[0069] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências polipeptídicas de SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 16, 17, e 18, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isola- do ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência polipeptídica de pelo menos 85%, preferencialmente 90%, mais preferencialmente 95% ou mais, tal como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 1, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência polipeptídi- ca de pelo menos 85%, preferencialmente 90%, mais preferencialmen- te 95% ou mais, tal como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 2. Preferencialmente, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variá- vel de cadeia pesada tendo a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 1; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência polipeptídi- ca de SEQ ID NO: 2.
[0070] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências polipeptídicas de SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 19, 20, e 21, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isola- do ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência polipeptídica de pelo menos 85%, preferencialmente 90%, mais preferencialmente 95% ou mais, tal como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência polipeptídi- ca de pelo menos 85%, preferencialmente 90%, mais preferencialmen- te 95% ou mais, tal como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 4. Preferencialmente, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variá-
vel de cadeia pesada tendo a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência polipeptídi- ca de SEQ ID NO: 4.
[0071] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências polipeptídicas de SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 22, 23, e 24, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isola- do ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência polipeptídica de pelo menos 85%, preferencialmente 90%, mais preferencialmente 95% ou mais, tal como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 5, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência polipeptídi- ca de pelo menos 85%, preferencialmente 90%, mais preferencialmen- te 95% ou mais, tal como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 6. Preferencialmente, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variá- vel de cadeia pesada tendo a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência polipeptídi- ca de SEQ ID NO: 6.
[0072] De acordo com outro aspeto particular, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um epítopo em um peptídeo de alfa-sinucleína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28. De acordo com outro aspeto particular, a invenção se refe- re a anticorpos monoclionais isolados ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a um epítopo em um peptí- deo de alfa-sinucleína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.
[0073] Em um aspeto geral, a invenção se refere a variantes funci-
onais do anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno. O termo "variante funcional," como usado no presente do- cumento, se refere a um anticorpo compreendendo um nucleotídeo, e/ou sequência de aminoácidos, que é alterado por um ou mais nucle- otídeos e/ou aminoácidos em comparação com os nucleotídeos e/ou sequências de aminoácidos de um anticorpo de referência e que é ca- paz de competir pela ligação específica ao parceiro de ligação, isto é, alfa-sinucleína, com o anticorpo de referência. Por outras palavras, as modificações na sequência de aminoácidos e/ou nucleotídeos do anti- corpo de referência não afetam ou alteram significativamente as carac- terísticas de ligação do anticorpo codificado pela sequência nucleotídi- ca ou contendo a sequência de aminoácidos, isto é, o anticorpo é ain- da capaz de reconhecer especificamente e se ligar ao seu alvo. A va- riante funcional pode ter modificações de sequência conservativas in- cluindo substituições, adições e deleções de nucleotídeos e aminoáci- dos. Exemplos de variantes funcionais incluem remover riscos de uma cisteína ou aminoácido livre com modificação pós-tradução potencial na região hipervariável, bem como engenharia de Fc de forma a au- mentar/diminuir a semivida sérica e/ou a afinidade de ligação de anti- corpos IgG para FcRn. Uma variante funcional também pode incluir a geração do anticorpo como um isótipo IgG2, IgG3 ou IgG4 quimérico humano, ou como um isótipo quimérico de uma espécie diferente. Es- sas modificações podem ser introduzidas por técnicas padrão conhe- cidas na técnica, tais como PCR, mutagênese direcionada para o local e mutagênese aleatória mediada por PCR e podem compreender nu- cleotídeos e aminoácidos naturais, bem como não naturais.
[0074] Em outro aspeto geral, a invenção confere imunoconjuga- dos, ou conjugados anticorpo-fármaco(ADC), compreendendo um an- ticorpo conjugado a um agente citotóxico, tal como um agente quimio- terapêutico, um fármaco, um agente inibidor do crescimento, uma toxi-
na (por exemplo, um toxina enzimaticamente ativa de origem bacteria- na, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado). De acordo com um aspeto par- ticular, um imunoconjugado compreende qualquer um dos anticorpos acima covalentemente ligados a pelo menos um agente terapêutico e/ou detectável.
[0075] De acordo com um outro aspeto particular da invenção, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmen- to de ligação ao antígeno, em que o anticorpo monoclonal ou seu fra- gmento de ligação ao antígeno reduz o nível de alfa-sinucleína.
[0076] De acordo com um outro aspeto particular da invenção, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmen- to de ligação ao antígeno, em que o anticorpo monoclonal ou seu fra- gmento de ligação ao antígeno impede ou reduz o nível de agregação da alfa-sinucleína.
[0077] Em outro aspeto geral, a invenção se refere a um ácido nu- cleico isolado codificando um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção. Será apreciado pelos peritos na técnica que a sequência de codificação de uma proteína pode ser alte- rada (por exemplo, substituída, eliminada, inserida, etc.) sem alterar a sequência de aminoácidos da proteína. Consequentemente, será en- tendido pelos peritos na técnica que as sequências de ácido nucleico codificando anticorpos monoclonais ou seus fragmentos de ligação ao antígeno da invenção podem ser alteradas sem alterar as sequências de aminoácidos das proteínas.
[0078] Em outro aspeto geral, a invenção se refere a um vetor compreendendo um ácido nucleico isolado codificando um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção. Qualquer vetor conhecido pelos peritos na técnica em vista da presen- te invenção pode ser usado, tal como um plasmídeo, um cosmídeo,
um vetor de fago ou um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão recombinante, tal como um plasmídeo. O ve- tor pode incluir qualquer elemento para estabelecer uma função con- vencional de um vetor de expressão, por exemplo, um promotor, ele- mento de ligação ao ribossoma, terminador, intensificador, marcador de seleção e origem de replicação. O promotor pode ser um promotor constitutivo, indutível ou repressível. Vários vetores de expressão ca- pazes de distribuir ácidos nucleicos a uma célula são conhecidos na técnica e podem ser usados neste documento para a produção de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno na célula. Técnicas convencionais de clonagem ou síntese de gene artificial podem ser usadas de modo a gerar um vetor de expressão recombinante de acordo com modalidades da invenção.
[0079] Em outro aspeto geral, a invenção se refere a uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico isolado codificando um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno da in- venção. Qualquer célula hospedeira conhecida pelos peritos na técni- ca em vista da presente invenção pode ser usada para a expressão recombinante de anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antíge- no da invenção. Em algumas modalidades, as células hospedeiras são células E. coli DH5a ou BL21 (para expressão de, por exemplo, um anticorpo scFv ou Fab), células HEK293 (para expressão de, por exemplo, um anticorpo IgG de comprimento total). De acordo com mo- dalidades particulares, o vetor de expressão recombinante é transfor- mado em células hospedeiras por métodos convencionais, tais como transfecção química, choque térmico ou eletroporação, onde é inte- grado de forma estável no genoma da célula hospedeira de modo que o ácido nucleico recombinante seja efetivamente expresso.
[0080] Em outro aspeto geral, a invenção se refere a um método de produção de um anticorpo monoclional ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção, compreendendo a cultura de uma célula compreendendo um ácido nucleico codificando o anticorpo monoclional ou seu fragmento de ligação ao antígeno sob condições para produzir o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção e recuperação do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno a partir da célula ou cultura celular (por exemplo, a partir do sobrenadante). Anticorpos expressos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno podem ser colhidos a partir das células e purificados de acordo com técnicas convencionais conhecidas na técnica e como descrito neste documento. Composições Farmacêuticas
[0081] Em outro aspeto geral, a invenção se refere a uma compo- sição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção e um portador farmaceuticamente aceitável. O termo "composição farmacêutica", como usado no presente documento, significa um produto compreen- dendo um anticorpo da invenção juntamente com um portador farma- ceuticamente aceitável. Os anticorpos da invenção e as composições que os compreendem também são úteis no fabrico de um medicamen- to para aplicações terapêuticas mencionadas no presente documento.
[0082] Como usado no presente documento, o termo "portador" se refere a qualquer excipiente, diluente, agente de enchimento, sal, tam- pão, estabilizador, solubilizador, óleo, lipídeo, vesícula contendo lipí- deo, microesfera, encapsulação lipossômica, ou outro material bem conhecido na técnica para uso em formulações farmacêuticas. Será entendido que as características do portador, excipiente ou diluente dependerão da via de administração para uma aplicação particular. Como usado no presente documento, o termo "portador farmaceutica- mente aceitável" se refere a um material não tóxico que não interfere na eficácia de uma composição de acordo com a invenção ou com a atividade biológica de uma composição de acordo com a invenção. De acordo com modalidades particulares, em vista da presente invenção, qualquer portador farmaceuticamente aceitável adequado para uso em uma composição farmacêutica de anticorpo pode ser usado na inven- ção.
[0083] A formulação de ingredientes farmaceuticamente ativos com portadores farmaceuticamente aceitáveis é conhecida na técnica, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por exemplo, 21º edição (2005), e quaisquer edições posteriores). Exem- plos não limitadores de ingredientes adicionais incluem: tampões, dilu- entes, solventes, agentes reguladores da tonicidade, conservantes, estabilizadores, e agentes quelantes. Um ou mais portadores farma- ceuticamente aceitáveis podem ser usados na formulação das compo- sições farmacêuticas da invenção.
[0084] Em uma modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica é uma formulação líquida. Um exemplo preferido de uma formula- ção líquida é uma formulação aquosa, isto é, uma formulação compre- endendo água. A formulação líquida pode compreender uma solução, uma suspensão, uma emulsão, uma microemulsão, um gel e similares. Uma formulação aquosa compreende tipicamente pelo menos 50% p/p de água, ou pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou pelo menos 95% p/p de água.
[0085] Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode ser formulada como um injetável, que pode ser injetado, por exemplo, por meio de um dispositivo de injeção (por exemplo, uma seringa ou uma bomba de infusão). A injeção pode ser administrada por via subcutã- nea, intramuscular, intraperitoneal, intravítrea ou intravenosa, por exemplo.
[0086] Em outra modalidade, a composição farmacêutica é uma formulação sólida, por exemplo, uma composição liofilizada ou seca por pulverização, que pode ser usada tal como está, ou em que o mé- dico ou o paciente adiciona solventes e/ou diluentes antes do uso. As formas de dosagem sólidas podem incluir comprimidos, tais como comprimidos prensados e/ou comprimidos revestidos e cápsulas (por exemplo, cápsulas de gelatina dura ou mole). A composição farmacêu- tica também pode estar na forma de sachês, drageias, pós, grânulos, pastilhas ou pós para reconstituição, por exemplo.
[0087] Em outras modalidades, a composição farmacêutica pode ser administrada por via intranasal, intrabucal ou sublingual.
[0088] O pH em uma formulação aquosa pode se situar entre pH 3 e pH 10. Em uma modalidade da invenção, o pH da formulação vai desde cerca de 7,0 até cerca de 9,5. Em outra modalidade da inven- ção, o pH da formulação vai desde cerca de 3,0 até cerca de 7,0.
[0089] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um tampão. Exemplos não limitadores de tampões incluem: arginina, ácido aspártico, bicina, citrato, hidrogenofosfato dis- sódico, ácido fumárico, glicina, glicilglicina, histidina, lisina, ácido ma- leico, ácido málico, acetato de sódio, carbonato de sódio, di-hidrogeno- fosfato de sódio, fosfato de sódio, succinato, ácido tartárico, tricina, e tris(hidroximetil)-aminometano, e suas misturas. O tampão pode estar presente individualmente ou no agregado, em uma concentração de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. Composições farmacêuticas com- preendendo cada um desses tampões específicos constituem modali- dades alternativas da invenção.
[0090] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um conservante. Exemplos não limitadores de con- servantes incluem: cloreto de benzetônio, ácido benzoico, álcool ben- Zzílico, bronopol, 4-hidroxibenzoato de butila, clorobutanol, clorocresol, cloro-hexidina, clorfenesina, o-cresol, m-cresol, p-cresol, 4-hidroxiben-
zoato de etila, imidureia, 4-hidroxibenzoato de metila, fenol, 2-fenoxie- tanol, 2-feniletanol, 4-hidroxibenzoato de propila, desidroacetato de sódio, tiomerosal, e suas misturas. O conservante pode estar presente individualmente ou no agregado, em uma concentração de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. Composições farmacêuticas compreen- dendo cada um desses conservantes específicos constituem modali- dades alternativas da invenção.
[0091] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um agente isotônico. Exemplos não limitadores da modalidade incluem um sal (tal como cloreto de sódio), um aminoácido (tal como glicina, histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, e treonina), um alditol (tal como glicerol, 1,2-propanodiol, propilenoglicol), 1,3-propanodiol, e 1,3-butanodiol), polietilenoglicol (por exemplo, PEG400), e suas misturas. Outro exemplo de um agente isotônico inclui um açúcar. Exemplos não limitativos de açúcares po- dem ser mono-, di- ou polissacarídeos, ou glucanos solúveis em água, incluindo, por exemplo, frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, mal- tose, lactose, sacarose, trealose, dextrano, pululano, dextrina, ciclo- dextrina, alfa e beta-HPCD, amido solúvel, hidroxietilamido e carboxi- metilcelulose de sódio. Outro exemplo de um agente isotônico é um álcool de açúcar, em que o termo "álcool de açúcar" é definido como um C(4-8) hidrocarboneto tendo pelo menos um grupo -OH. Exemplos não limitadores de álcoois de açúcares incluem manitol, sorbitol, inosi- tol, galactitol, dulcitol, xilitol, e arabitol. Composições farmacêuticas compreendendo cada agente isotônico listado neste parágrafo consti- tuem modalidades alternativas da invenção. O agente isotônico pode estar presente individualmente ou no agregado, em uma concentração de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. Composições farmacêuticas compreendendo cada um desses agente isotônicos específicos consti- tuem modalidades alternativas da invenção.
[0092] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um agente quelante. Exemplos não limitadores de agentes quelantes incluem ácido cítrico, ácido aspártico, sais do ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA), e suas misturas. O agente quelan- te pode estar presente individualmente ou no agregado, em uma con- centração de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. Composições farmacêu- ticas compreendendo cada um desses agente quelantes específicos constituem modalidades alternativas da invenção.
[0093] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um estabilizador. Exemplos não limitadores de esta- bilizadores incluem um ou mais inibidores da agregação, um ou mais inibidores da oxidação, um ou mais tensoativos, e/ou um ou mais inibi- dores de proteases.
[0094] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um estabilizador, em que o referido estabilizador é carboxi-/hidroxicelulose e seus derivados (tais como HPC, HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, 2-metiltioetanol, polietilenoglico! (tal como PEG 3350), álcool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, sais (tais como cloreto de sódio), substâncias contendo enxofre tais como monotioglicerol), ou ácido tioglicólico. O estabilizador pode estar pre- sente individualmente ou no agregado, em uma concentração de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. Composições farmacêuticas compreen- dendo cada um desses estabilizadores específicos constituem modali- dades alternativas da invenção.
[0095] Em modalidades adicionais da invenção, a composição farmacêutica compreende um ou mais tensoativos, preferencialmente um tensoativo, pelo menos um tensoativo, ou dois tensoativos diferen- tes. O termo "tensoativo" se refere a quaisquer moléculas ou íons que sejam compreendidos por uma parte solúvel em água (hidrofílica), e uma parte solúvel em gordura (lipofílica). O tensoativo pode, por exemplo, ser selecionado a partir do grupo consistindo em tensoativos aniônicos, tensoativos catiônicos, tensoativos não iônicos e/ou tensoa- tivos zwitteriônicos. O tensoativo pode estar presente individualmente Ou no agregado, em uma concentração de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. Composições farmacêuticas compreendendo cada um desses tensoativos específicos constituem modalidades alternativas da invenção.
[0096] Em uma modalidade adicional da invenção, a composição farmacêutica compreende um ou mais inibidores de protease, tais co- mo, por exemplo, EDTA, e/ou ácido clorídrico (HCI) de benzamidina. O inibidor de protease pode estar presente individualmente ou no agre- gado, em uma concentração de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. Composições farmacêuticas compreendendo cada um desses inibidores de proteases específicos constituem modalidades alternati- vas da invenção.
[0097] Em outro aspeto geral, a invenção se refere a um método de produção de uma composição farmacêutica compreendendo o anti- corpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno da inven- ção, compreendendo a combinação de um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno com um portador farmaceutica- mente aceitável de forma a obter a composição farmacêutica. Métodos de uso
[0098] Em outro aspeto geral, a invenção se refere a um método de prevenção ou redução da agregação de alfa-sinucleína em um indi- víduo em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de um anticorpo monoclional isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente à alfa-sinucleína ou uma composição farmacêutica da invenção.
[0099] A atividade funcional de anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a alfa-sinucleína pode ser caracteri- zada por métodos conhecidos na técnica e como descrito no presente documento. Os métodos para caracterizar anticorpos e seus fragmen- tos de ligação ao antígeno que se ligam a alfa-sinucleína incluem, mas não estão limitados a, ensaios de afinidade e especificidade, incluindo análise de Biacore, ELISA e OctetRed; ensaios de ressonância plas- mônica de superfície (SPR). A atividade funcional de um mAb anti-alfa- sinucleína também pode ser avaliada em um ensaio de agregação de alfa-sinucleína intracelular, em que as células são incubadas com se- mentes de alfa-sinucleína recombinante mal dobrada e anticorpo anti- alfa-sinucleína de forma a determinar se o anticorpo pode bloquear a captação de agregado de alfa-sinucleína e de agregação de sinucleína intracelular. De acordo com modalidades particulares, os métodos pa- ra caracterizar anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam à alfa-sinucleína incluem aqueles descritos abaixo.
[00100] Os anticorpos da invenção são adequados tanto como agentes terapêuticos como profiláticos para o tratamento ou prevenção de doenças que envolvem a agregação patológica de alfa-sinucleína. Em outro aspeto geral, a invenção se refere a um método de tratamen- to ou prevenção de uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou agregação de alfa-sinucleína em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente à alfa-sinucleína ou uma composição farmacêuti- ca da invenção. Os corpos de Lewy são inclusões citoplasmáticas con- tendo fibrilas de alfa-sinucleína agregadas de modo a formarem uma massa insolúvel localizada dentro das células neurais. As doenças ca-
racterizadas pela presença de corpos de Lewy ou agregados de alfa- sinucleína são conhecidas coletivamente como doenças de corpos de Lewy ou sinucleinopatias. Como usado no presente documento, uma "sinucleinopatia" abrange qualquer doença neurodegenerativa que en- volva a agregação patológica de alfa-sinucleína. Em modalidades par- ticulares, a doença pode, por exemplo, ser selecionada a partir de, mas não limitada a, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, de- mência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, falha auto- nômica pura, doenças de armazenamento lisossomal e outras patolo- gias relacionadas com sinucleínas.
[00101] De acordo com modalidades da invenção, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-alfa-sinucleína ou seu fragmento de ligação ao antí- geno. Como usado no presente documento, o termo "quantidade tera- peuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de um ingrediente ativo ou componente que induz a resposta biológica ou medicinal de- sejada em um indivíduo. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" pode ser determinada empiricamente e de um modo rotineiro, em rela- ção ao objetivo indicado.
[00102] De acordo com modalidades particulares, uma quantidade terapeuticamente eficaz se refere à quantidade de terapia que é sufici- ente para atingir um, dois, três, quatro ou mais dos efeitos seguintes: (i) reduzir ou melhorar a gravidade da doença, distúrbio ou condição a ser tratada ou um sintoma associado à mesma; (ii) reduzir a duração da doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associ- ado à mesma; (ili) prevenir a progressão da doença, distúrbio ou con- dição a ser tratada, ou um sintoma associado à mesma; (iv) causar regressão da doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sin- toma associado à mesma; (v) prevenir o desenvolvimento ou início da doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado à mesma; (vi) prevenir a recorrência da doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado à mesma; (vii) reduzir a hospi- talização de um indivíduo que tenha a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado à mesma; (viii) reduzir a duração da hospitalização de um indivíduo que tenha a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado à mesma; (ix) au- mentar a sobrevivência de um indivíduo que tenha a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado à mesma; (xi) ini- bir ou reduzir a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sin- toma associado à mesma em um indivíduo; e/ou (xii) aumentar ou me- lhorar o(s) efeito(s) profilático(s) ou terapêutico(s) de outra terapia.
[00103] A quantidade ou dosagem terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com vários fatores, tais como a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, o meio de administração, o local alvo, o estado fisiológico do indivíduo (incluindo, por exemplo, idade, peso corporal, saúde), tanto se o indivíduo for um ser humano ou um animal, outros medicamentos administrados e tanto se o tratamento for profilático ou terapêutico. As dosagens de tratamento são otimamente tituladas para otimizar a segurança e eficácia.
[00104] “De acordo com modalidades particulares, as composições descritas no presente documento são formuladas para serem adequa- das para a via de administração pretendida para um indivíduo. Por exemplo, as composições descritas no presente documento podem ser formuladas de forma a serem adequadas para administração intrave- nosa, subcutânea ou intramuscular.
[00105] Como usado no presente documento, os termos "tratar," "tratando," e "tratamento" se destinam todos a se referir a uma melho- ria ou inversão de, pelo menos, um parâmetro físico mensurável rela- cionado com uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou agre- gação alfa-sinucleína, que não é necessariamente discernível no indi-
víduo, mas que ser discernível no indivíduo. Os termos tratar," "tratan- do," e "tratamento" também se podem referir a provocar a regressão, prevenir a progressão, ou pelo menos retardar a progressão da doen- ça, distúrbio ou condição. Em uma modalidades particular, "tratar," "tratando," e "tratamento" se referem a um alívio, prevenção do desen- volvimento ou aparecimento, ou redução na duração de um ou mais sintomas associados com a doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidades particular, "tratar," "tratando," e "tratamento" se referem a reduzir o risco de, diminuir a gravidade, ou atrasar o aparecimento de uma doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidades particular, "tratar," "tratando," e "tratamento" se referem a um aumento na sobre- vivência de um indivíduo tendo a doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidades particular, "tratar," "tratando," e "tratamento" se refe- rem à eliminação da doença, distúrbio ou estado no indivíduo.
[00106] Em outro aspeto geral, a invenção se refere a um método para determinar um nível de alfa-sinucleína em um indivíduo. Os mé- todos compreendem (a) obter uma amostra a partir do indivíduo; (b) colocar a amostra em contato com um anticorpo monoclional isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção; e (c) determinar o nível de alfa-sinucleína no indivíduo.
[00107] “Como usado no presente documento, "amostra" se refere a uma amostra biológica isolada a partir de um indivíduo e pode incluir, mas não está limitada a, sangue total, soro, plasma, células sanguí- neas, células endoteliais, biópsias de tecido (por exemplo, tecido cere- bral), líquido linfático, líquido ascítico, líquido intersticial, medula ós- sea, líquido cefalorraquidiano, saliva, muco, expectoração, suor, urina ou qualquer outra secreção, excreção ou outros fluidos corporais. Uma "amostra de sangue" se refere a sangue total ou qualquer fração do mesmo, incluindo células sanguíneas, soro e plasma.
[00108] Em certas modalidades, o nível de alfa-sinucleína no indiví-
duo pode ser determinado usando ensaios selecionados a partir de, mas não limitados a, um ensaio de Western blot, um ensaio ELISA, um ensaio FACS e/ou um radioimunoensaio (RIA). Os níveis relativos de proteína podem ser determinados usando análise de Western blot, en- saio FACS e imuno-histoquímica (IHC), imagiologia in vivo e níveis ab- solutos de proteína podem ser determinados utilizando um ensaio ELISA. Ao determinar os níveis relativos de alfa-sinucleína, os níveis de alfa-sinucleína podem ser determinados entre pelo menos duas amostras, por exemplo, entre amostras do mesmo indivíduo em dife- rentes momentos do tempo, entre amostras a partir de tecidos diferen- tes no mesmo indivíduo, e/ou entre amostras de indivíduos diferentes. Alternativamente, ao determinar os níveis absolutos de alfa-sinucleína, tal como por um ensaio ELISA, o nível absoluto de alfa-sinucleína na amostra pode ser determinado ao criar um padrão para o ensaio EL|- SA antes de testar a amostra. Um perito na técnica perceberia quais as técnicas analíticas a usar para determinar o nível de alfa-sinucleína em uma amostra do indivíduo usando os anticorpos ou seus fragmen- tos de ligação ao antígeno da invenção.
[00109] O uso de métodos para determinar um nível de alfa- sinucleína em uma amostra a partir de um indivíduo pode levar ao di- agnóstico de níveis anormais (elevados, reduzidos ou insuficientes) de alfa-sinucleína em uma doença e tomar decisões terapêuticas apropri- adas. Essa doença pode ser selecionada a partir de doença de Al- zheimer, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas e doenças de armazenamento lisossomal. Adici- onalmente, ao monitorar os níveis de alfa-sinucleína em um indivíduo, o risco de desenvolver uma doença, como indicado acima, pode ser determinado com base no conhecimento do nível de alfa-sinucleína em uma doença particular e/ou durante a progressão da doença parti- cular.
[00110] Anticorpos de diagnóstico ou reagentes semelhantes po- dem ser administrados por injeção intravenosa no corpo do paciente ou diretamente no cérebro por qualquer via adequada que forneça o agente ao hospedeiro como exemplificado acima. A dosagem de anti- corpo deve estar dentro dos mesmos intervalos que para os métodos de tratamento. Tipicamente, o anticorpo é marcado, embora em alguns métodos, o anticorpo primário com afinidade para alfa-sinucleína não seja marcado e um agente de marcação secundário seja usado para se ligar ao anticorpo primário. A escolha do marcador depende dos meios de detecção. Por exemplo, um marcador fluorescente é ade- quado para detecção óptica. O uso de marcadores paramagnéticos é adequada para detecção tomográfica sem intervenção cirúrgica. Os marcadores radioativos também podem ser detectados usando PET ou SPECT.
[00111] O diagnóstico é realizado comparando o número, tamanho e/ou intensidade da alfa-sinucleína marcada, agregados de alfa- sinucleína e/ou corpos de Lewy em uma amostra do indivíduo ou no indivíduo, com os correspondentes valores da linha de base. Os valo- res da linha de base podem representar os níveis médios em uma po- pulação de indivíduos não doentes. Os valores da linha de base tam- bém podem representar níveis precedentes determinados no mesmo indivíduo.
[00112] Os métodos de diagnóstico acima descritos também pode ser usados para monitorar uma de um resposta indivíduo a terapia, através da detecção da presença de alfa-sinucleína em um indivíduo antes, por ou após o tratamento. Uma alteração nos valores relativos à linha de base sinaliza uma resposta ao tratamento. Os valores também podem mudar temporariamente nos fluidos biológicos à medida que a alfa-sinucleína patológica está sendo eliminada do cérebro.
[00113] A presente invenção é ainda direcionada a um kit para a realização dos métodos acima descritos de diagnóstico e monitoração. Tipicamente, tais kits contêm um reagente de diagnóstico tal como os anticorpos da invenção, e opcionalmente um marcador detectável. O próprio anticorpo de diagnóstico pode conter o marcador detectável (por exemplo, molécula fluorescente, biotina, etc.) o qual é diretamente detectável ou detectável através de uma reação secundária (por exemplo, reação com estreptavidina). Alternativamente, pode ser utili- zado um segundo reagente contendo o marcador detectável, em que o segundo reagente tem especificidade de ligação para o anticorpo pri- mário. Em um kit de diagnóstico adequado para medir a alfa-sinucleína em uma amostra biológica, os anticorpos do kit podem ser conferidos pré-ligados a uma fase sólida, tal como aos poços de uma placa de microtitulação.
MODALIDADES
[00114] A presente invenção também proporciona as seguintes mo- dalidades não limitativas.
[00115] A modalidade 1 é um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região deter- minante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDRI1), HCDR2, HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências poli- peptídicas de: (a) SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 16, 17, e 18, respectivamente; (b) SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 19, 20, e 21, respectivamente; ou (c) SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 22, 23, e 24, respectivamente; em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga especificamente à alfa-sinucleína, preferencialmente à alfa-sinucleína humana.
[00116] A modalidade 2 é um anticorpo monoclonal ou seu frag-
mento de ligação ao antígeno da modalidade 1, compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência polipeptídica pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 1, 3 ou 5, ou uma região vari- ável de cadeia leve tendo uma sequência polipeptídica pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, 4 ou 6.
[00117] A modalidade 3 é o anticorpo monoclonal isolado ou frag- mento de ligação ao antígeno da modalidade 1 ou 2, compreendendo (a) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia polipeptídica de SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia le- ve tendo a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2; (b) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia polipeptídica de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia le- ve tendo a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 4; ou (c) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia polipeptídica de SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia le- ve tendo a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 6.
[00118] A modalidade 4 é um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1-3 que se liga especificamente a um epítopo em um peptídeo de alfa- sinucleína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
[00119] A modalidade 5 é um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1-3 que se liga especificamente a um epítopo em um peptídeo de alfa- sinucleína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.
[00120] A modalidade 6 é um anticorpo monoclonal ou seu frag- mento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades iso- lado 1-5, em que o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno reduz o nível de alfa-sinucleína.
[00121] A modalidade 7 é um anticorpo monoclonal ou seu frag- mento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades iso- lado 1-6, em que o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno previne ou reduz o nível de agregação de alfa-sinucleína.
[00122] A modalidade 8 é uma variante funcional do anticorpo mo- noclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1-7.
[00123] A modalidade 9 é um imunoconjugado compreendendo o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1-7 e pelo menos um agente tera- pêutico e/ou detectável.
[00124] A modalidade 10 é um ácido nucleico isolado codificando o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1-7.
[00125] A modalidade 11 é um vetor compreendendo o ácido nu- cleico isolado da modalidade 10.
[00126] A modalidade 12 é uma célula hospedeira compreendendo o vetor da modalidade 11.
[00127] A modalidade 13 é uma composição farmacêutica, compre- endendo o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1-7 e um portador far- maceuticamente aceitável.
[00128] A modalidade 14 é um método de prevenção ou redução da agregação de alfa-sinucleína em um indivíduo com necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo da composição farmacêutica da modalidade 13.
[00129] A modalidade 15 é um método de tratamento ou prevenção de uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou agregação de alfa-sinucleína em um indivíduo com necessidade do mesmo, compre- endendo a administração ao indivíduo da composição farmacêutica da modalidade 14.
[00130] A modalidade 16 é o método da modalidade 15, em que a doença é selecionada a partir de qualquer sinucleinopatia.
[00131] A modalidade 17 é o método da modalidade 15, em que a doença é selecionada a partir do grupo consistindo em doença de Al- zheimer, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia sistêmica múltipla, e doenças do armazenamento lisossomal.
[00132] A modalidade 18 é um método de produção do anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1-7, compreendendo a cultura de uma célula com- preendendo um ácido nucleico codificando o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno sob condições para produzir o anti- corpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno e recuperação do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno a partir da célula ou cultura.
[00133] A modalidade 19 é um método de produção de uma com- posição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal ou fra- gmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1-7, compreendendo a combinação do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno com um portador farmaceuticamente aceitável de forma a obter a composição farmacêutica.
[00134] A modalidade 20 é um método para determinar um nível de alfa-sinucleína em um indivíduo, o método compreendendo: (a) obtenção de uma amostra a partir do indivíduo; (b) contatar a amostra com um anticorpo monoclonal isola- do ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das mo- dalidades 1-7; e (c) determinar o nível de alfa-sinucleína no indivíduo.
[00135] A modalidade 21 é o método da modalidade 20, em que a amostra é uma amostra de tecido.
[00136] A modalidade 22 é o método da modalidade 21, em que a amostra de tecido é uma amostra de tecido cerebral.
[00137] A modalidade 23 é o método da modalidade 21, em que a amostra é uma amostra de sangue.
[00138] A modalidade 24 é um método para diagnosticar uma do- ença caracterizada por corpos de Lewy ou agregação de alfa- sinucleína, compreendendo: (a) obtenção de uma amostra a partir do indivíduo; (b) contatar a amostra com um anticorpo monoclonal isola- do ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das mo- dalidades 1-7; e (c) detectar agregados de alfa-sinucleína no indivíduo, em que a detecção de alfa-sinucleína é diagnóstico de que o indivíduo tem uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou agregados de alfa-sinucleína.
[00139] A modalidade 25 é um kit compreendendo pelo menos um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antíge- no, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-7.
EXEMPLOS Exemplo 1: Geração de construtos de alfa-sinucleína para produ- ção de proteínas e ensaios celulares
[00140] O gene de a-sinucleína SNCA humana de comprimento to- tal (140 aminoácidos) foi otimizado quanto a códons para expressão bacteriana, sintetizado e subclonado no vetor puC57 na Genewiz, Inc. (Genewiz, Inc.; Plainfield do Sul, NJ) e um Marcador Avi C-terminal, local de clivagem da trombina e marcador de his foram incluídos no gene sintetizado. Os locais Xbal e Notl foram introduzidos por PCR usando Phusion High Fidelity PCR Master Mix (Thermo Fisher; Wal- tham, MA), e os produtos de PCR foram duplamente digeridos (New England Biolabs (NEB); Ipswich, MA), purificados em gel e ligados em um vetor pET28 seguindo o protocolo do fabricante para gerar proteína alfa-sinucleína de comprimento completo marcada com His-Trombina- Avi.
[00141] O SNCA humano foi amplificado por PCR a partir de um vetor pUC57 (Genewiz, Inc) com iniciadores (Eton Bioscience, Inc.) sobrepostos ao vetor SNCA e pcDNAZ004 e os iniciadores 3' têm se- quências codificando as sequências-V5 e -HA. Os fragmentos foram então purificados em gel e montados no vetor usando um kit de Clo- nagem de Montagem da Gibson (NEB) seguindo o protocolo do fabri- cante. A mistura montada foi transformada em células competentes DH5a (Thermo Fisher) e o plasmídeo correto foi confirmado por se- quenciação. Da mesma forma, para gerar um vetor de controle positivo para o ensaio de células, ou seja, SNCA marcado tanto com V5-(C- terminal) como com HA-(N-terminal), o fragmento foi gerado por PCR amplificando o gene SNCA usando um iniciador 5' composto por nu- cleotídeos que se sobrepõem ao marcador HA vetor pc/DNAZ004 e 5' do gene SNCA e um iniciador 3' composto por nucleotídeos que se sobrepõem ao marcador vetor-V5 e 3' do gene SNCA. O produto de PCR foi purificado em gel e montado no vetor pcDNAZ2004 usando o Kit de Montagem da Gibson (NEB). Exemplo 2: Purificação de sinucleína recombinante e biotinilação
[00142] —a-sinucleína de tipo selvagem (WT) de comprimento total, com um marcador avi C-terminal, local de clivagem de trombina e marcador his, foi produzida por células E.coli BL21 (DE3) em um saco de ondas de 10 L. Duas horas após a indução com IPTG (Sigma- Aldrich; St. Louis, MO), as células foram colhidas e os péletes foram armazenados a -80 º C. Os péletes foram ressuspensos e desconge- lados em tampão de extração (BugBuster Master mix, EMD Millipore, Burlington, MA) suplementado com 1 comprimido de coquetel inibidor de protease (Roche; Basileia, Suíça). A suspensão foi centrifugada, e o sobrenadante foi aquecido por uma hora a 60 ºC e centrifugado a
5.250 X g a 4 ºC por 30 min. O sobrenadante foi trocado por tampão para Bicina a 50 MM pH 8,3. A cromatografia de exclusão de tamanho com análise de espalhamento de luz estática de múltiplos ângulos (SEC-MALS) foi usada para estimar a quantidade total de proteína a- sinucleína. As quantidades necessárias de enzima BirA, biotina, ATP e acetato de magnésio foram adicionadas para biotinilação durante a noite de acordo com as instruções do fabricante (Kit de reação em massa de biotina-proteína ligase BirA, Avidity LLC; Aurora, CO).
[00143] A biotinilação foi confirmada por análise SEC-MALS da |i- gação da biotina-sinucleína à Estreptavidina-PE. Em seguida, o mate- rial de sinucleína biotinilado foi aplicado à resina de purificação marca- dor His, lavado 3 vezes de modo a remover impurezas, e a o- sinucleína foi clivada da resina por trombina com a incubação durante a noite, seguido por purificação usando uma coluna SEC.
[00144] A a-sinucleína altamente pura biotinilada foi confirmada por SDS-PAGE e SEC analítica. Além disso, a a-sinucleína purificada e biotinilada foi misturada com Estreptavidina-PE e analisada por SEC- MALS, mostrando que a a-sinucleína foi, de fato, biotinilada.
[00145] A reatividade da a-sinucleína biotinilada foi avaliada por ELISA, usando uma placa revestida com Estreptavidina (ver Exemplo 5). A proteína foi totalmente reativa aos anticorpos de Syn303 (Biole- gend; San Diego, CA) e C20 (Santa Cruz Biotechnology; Dallas, TX), que reconhecem o N-terminal (aminoácidos 1-5) e o C-terminal (ami- noácidos 120-140) de sinucleína, respectivamente. Exemplo 3: Geração de iscos de a-sinucleína e seleção de célula ordenando as células B de memória específicas de isco
[00146] Para rastrear e clonar mAbs humanos de ocorrência natural para a proteína a-sinucleína, um painel de 7 peptídeos cobrindo a re- gião central e o terminal C da a-sinucleína (aminoácidos 61-140) foram projetados e sintetizados. O painel incluiu peptídeos fosforilados em Ser-129 e Ser-87 e uma truncagem nos aminoácidos 110 e 120. Os peptídeos foram sintetizados por química de fase sólida com pureza > 95% confirmada por LC-MS (New England Peptide, Inc. e Eton Biosci- ence, Inc.). O ligante Biotina e LC foi sintetizado tanto no N-terminal como no C-terminal dos peptídeos como indicado. O peptídeo de alfa- sinucleína e os iscos de seleção de proteínas foram preparados mistu- rando proteínas de peptídeos biotinilados com Estreptavidina-APC ou Estreptavidina-PE (Thermo Fisher). A maioria dos peptídeos e biotina livre (um controle negativo) foram preparados na proporção de 1:9 (Es- treptavidina:peptídeo), incubados por 30 minutos em gelo e passados por uma coluna BioSpin 30 (Bio-Rad Laboratories; Hercules, CA) para remover o peptídeo livre. A proteína de comprimento total e o peptídeo biotinilado C-terminalmente propenso à agregação 61-95 foram prepa- rados a uma proporção de 1:4 e foram usados sem limpeza da coluna. A proporção de peptídeos para Estreptavidina foi determinada por SEC-MALS. Cada tetrâmero foi usado em uma concentração final de 36 nM, com base na concentração de Estreptavidina.
[00147] Sangue total (100 mL) a partir de 25 pacientes com diag- nóstico clínico de doença de Parkinson (DP) (idade de 50-65) foi ad- quirido na Sanguine Biosciences (Sanguine Biosciences; Sherman Oaks, CA). O sangue total de 36 doadores sem DP foi obtido a partir do The Scripps Research Institute (idade de 21-68). Células mononu- cleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas e criopreserva- das como descrito precedentemente (Pascual et al. (2017) Acta Neu- ropathol 133, 767-783). Resumidamente, as células foram isoladas em Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare; Chicago, IL) e criopreservadas em 90% de FBS e 10% de DMSO. O procedimento para rastreio de célu- las B de memória e recuperação de anticorpos monoclonais (mAbs) a partir de doadores foi descrito precedentemente (Pascual et al., 2017).
Resumidamente, os PBMCs a partir de 3 dadores saudáveis ou de pa- cientes 4-6 foram descongeladas e repousou durante a noite em meio RPMI completo (RPMI com 10% de FBS e 1% de penicilina, 1% de estreptomicina) a 37 ºC. As células B foram enriquecidas por seleção positiva com esferas magnéticas CD22+ (Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach; Alemanha). As células foram ressuspensas em tampão FACS (solução salina tamponada com Tris (TBS) com EDTA a 2mM e albumina de soro bovino a 0,25%, Fração V).
[00148] Os marcadores extracelulares IgG-FITC, CD19-PerCPCy5.5, e CD27-PECy7 (BD Biosciences; San Jose, CA) foram adicionados jun- tamente com proteína marcada com PE e APC e painel de peptídeo. Para determinar a ligação não específica dos tetrâmeros, uma alíquota de células marcadas com anticorpo foi incubada com os tetrâmeros de biotina, usados no equivalente molar do conjunto de peptídeos. As cé- lulas e os peptídeos foram incubados por 1 hora a 4 ºC misturando su- avemente. Após lavagem, as células foram ressuspensas em 20 x10º células/mlL em tampão de FACS. O marcador vivo/morto DAPI (Ther- mo Fisher) foi adicionado antes da classificação em um Beckman Coulter MoFlo XDP ou Astrios. Os intervalos foram definidos usando o controle negativo como um guia para excluir eventos não específicos. As células vivas duplamente positivas CD19*, IgG*, CD27"i, e antígeno foram coletadas por classificação de célula única. As células foram co- letadas em tampão de reação de PCR em tempo real frio e RNase- OUT (Thermo Fisher). As placas foram centrifugadas brevemente e armazenadas a -80 ºC.
Exemplo 4: Recuperação de genes de anticorpos de cadeia pesa- da e leve a partir de células B de memória
[00149] Os cDNAs de cadeia pesada e leve foram então recupera- dos por uma abordagem de PCR de dois passos a partir de células B individuais, e as sequências de domínio variável foram clonadas e ex-
pressas in vitro como anticorpos de IgG1 recombinantes de compri- mento total.
[00150] — DNA complementar de primeira cadeia (CDNA) foi gerado a partir de células individuais ordenadas de acordo com o protocolo do fabricante (Superscript Ill, Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA) com as se- guintes modificações: a cada um dos poços contendo uma célula B única, foi adicionado 0,5 ul de NP-40 a 10%, 1,0 uL de oligo dT, 1,0 ul de dNTP e as amostras foram incubadas a 65 ºC por 5 minutos. Após a incubação, as amostras foram colocadas em gelo por 1 minuto. O seguinte foi então adicionado a cada poço: 2,0 uL de DTT, 4,0 uL de MgCl2, 1,0 uL de SuperScript RT e 0,5 uL de RNaseOut. As amostras foram incubadas a 50 ºC por 50 minutos, seguido por incubação a 85 ºC por 5 minutos. Para a PCR inicial (Passo |), 2,5 uL de preparação de cDNA foram usados como um modelo para amplificar cadeias pe- sadas e leves kappa ou lambda. Foram usados conjuntos de iniciado- res específicos para as regiões líder de anticorpo pesado, cadeia leve kappa e cadeia leve lambda. Um único iniciador inverso específico pa- ra a região CH1, regiões CK, e CL da cadeia pesada, leve kappa e lambda, respectivamente, foram usados no Passo | da reação de PCR.
[00151] Parao Passo ll, 2,5 uL do produto de PCR de Passo | fo- ram usados como um modelo para amplificar regiões variáveis de ca- deia pesada, e leve kappa ou lambda. Um conjunto de iniciadores dire- tos e inversos especificamente projetados para a região estrutural 1 de cadeia pesada do anticorpo, cadeia leve kappa e cadeia leve lambda foi usado para preparar o DNA a partir das regiões variáveis. Além dis- So, os iniciadores do Passo Il foram concebidos para introduzir locais de restrição Xbal e Xhol para clonagem a jusante. Após as reações de amplificação da Etapa Il, os produtos de PCR de domínio variável de cadeia pesada e leve foram processados em um gel de agarose a 1%. Fragmentos de região variável de cadeia pesada e leve foram purifica-
dos de acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen; Hilden, Alema- nha) e usados no Passo Ill de reação por PCR.
[00152] Para o Passo Ill, os fragmentos de DNA de região variável de cadeia pesada e leve produzidos no Passo || foram ligados em um único cassete via PCR por sobreposição e extensão usando: 1) um ligante kappa ou ligante lambda (ver método de preparação de ligante abaixo), que anela para a extremidade 3' do fragmento do Passo || de cadeia leve e para a extremidade 5' do fragmento do passo |l da ca- deia pesada, e contém tanto a região constante kappa como a lambda, 2) um iniciador de sobreposição direta contendo um local de restrição Xbal, e 3) um iniciador inverso contendo um local de restrição Xhol. Essa reação resulta em um amplicon (isto é, cassete) de aproximada- mente 2.400 pb ou 2.200 pb para as cadeias kappa ou lambda, res- pectivamente, consistindo na região variável de cadeia leve, ligante, e região variável da cadeia pesada. Após a amplificação, o produto da reação de PCR de extensão de sobreposição foi purificado por PCR de acordo com as instruções do fabricante (Kit de Purificação de PCR da Qiagen).
[00153] O fragmento ligante foi amplificado usando pCB-IlgG, um vetor promotor dual-CMV gerado em casa e usado para expressar ambos os genes de cadeia pesada e leve. O fragmento ligante é de
1.765 ou 1.536 pares de bases de comprimento para o ligante kappa ou lambda, respectivamente. O ligante kappa contém de 5' a 3' uma sequência de íntron seguida pela região constante kappa, sequência de terminação poli(A) e sequência do promotor de citomegalovírus, permitindo a expressão de um vetor dos anticorpos recombinantes. O ligante lambda contém a região constante lambda, a sequência de terminação poli(A) e a sequência do promotor do citomegalovírus. Um iniciador inverso comum e um iniciador direto específico para kappa foram usados. O fragmento amplificado foi separado em um gel de agarose a 1% e purificado de acordo com o protocolo do fabricante (Kit de Extração de Gel da Qiagen).
[00154] Após purificação do produto de PCR por sobreposição e extensão, o fragmento foi digerido com Xhol e Xbal e subsequente- mente separado em um gel de agarose a 1%. A banda correspondente à cassete de sobreposição (— 2,4 kb) foi purificada e ligada em um ve- tor de expressão IgG1, pCB-IgG. Os genes variáveis de anticorpos fo- ram subclonados nesse vetor e os anticorpos foram expressos de for- ma recombinante como IgG1 independentemente do seu isótipo origi- nal (nativo). Todas as transformações foram realizadas usando células de Eficiência Máxima DH5a (Invitrogen Corp.) e recuperadas em 250 ul de SOC por 1 hora a 37 ºC. Aproximadamente 100 uL de células recuperadas foram plaqueadas em uma placa de carbenicilina suple- mentada com glicose a 20 mM. As placas foram incubadas durante a noite a 37 ºC para permitir o crescimento da colônia. A restante mistu- ra de células recuperada foi cultivada com 4 mL de meio Super Broth (SB) suplementado com 50 ug/mL de carbenicilina e incubada durante a noite a 37 ºC com agitação a 250 rpm. No dia seguinte, cinco colô- nias foram colhidas por placa e cultivadas em 3 mL de meio SB su- plementado com 50 ug/mL de carbenicilina durante a noite a 37 ºC. Culturas durante a noite foram usadas para preparação de plasmídeo de DNA (Qiagen).
[00155] A análisede sequência foi conduzida nas regiões variáveis de cadeia pesada e leve (FIG. 1A4-1B). O número de mutações somáti- cas afastadas das sequências da linha germinativa, como determinado por NCBI IgBlast, foi conduzido no nível de aminoácido (aa) e nucleo- tídeo (nt) tanto para as regiões variáveis de cadeia pesada (HC) como de cadeia leve (LC) de anticorpos (FIG. 1A). A análise filogenética das regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo alfa-sinucleína recuperado foi conduzida usando o algoritmo de união de vizinhança
(modelo Jukes Cantor; FIG. 1B). As sequências de cadeia pesada e leve são mostradas na Tabela 1 e na Tabela 2. A região determinante de complementaridade das regiões variáveis de cadeia pesada e leve são mostradas na Tabela 3 e na Tabela 4. Tabela 1: Sequências de regiões variáveis de cadeia pesada para mAbs anti-alfa-sinucleína 323,1 EVOLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSASAMHWVRQTSDKRLE
WVGRIRNKANNYATAYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTA
WE 336,1 EVOLVOSGGTLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAISWVRQAPGRGLEW
VSFITGDGSRILYADSVRGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRTDDTAMYY o rea em 338,1 QVQALVESGGDIVAQPGGSLKLSCAASGFTFKSYWMHWVRQVPGKGLF
WVSRINTFGNKTSYADSVRGRFSISRDNTKSILYLQMNSLKAEDTAVY eee VH: região variável de cadeia pesada Tabela 2: Sequências de regiões variáveis de cadeia leve para mAbs anti-alfa-sinucleína 323,1 DVVMTQSPLSSPVTLGQPASISCRASQSPVHSDGNTYLSWLQQRPGQ
PPRLLIYTISNRFPGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQ a Era 336,1 AIQLTASPDSLAVSLGERATINCKASQOSLLYSSNNRNYLAWYQQKPGQ
PPKALIYNWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCHQ EEE me— 338,1 AIQLTASPDSLAVSLGERATINCKASQOSLLYSSNNRNYLAWYQQKPGQ
PPKALIYNWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCHQ | seems OTA VL: região variável de cadeia leve
Tabela 3: regiões CDR 1-3 de cadeia pesada para mAbs anti-alfa- sinucleíina HC: cadeia pesada; CDR: região determinante de complementaridade Tabela 4: regiões CDR 1-3 de cadeia pesada para mAbs anti-alfa- sinucleíina LC: cadeia leve; CDR: região determinante de complementaridade
[00156] Os mAbs clonados foram transitoriamente transfetados em células Expi293 (Thermo Fisher) e o meio foi colhido por centrifugação 72 horas após a transfeção. A IgG foi purificada a partir do meio de cultura por cromatografia de afinidade de Proteína A, como descrito precedentemente (Pascual et a/., 2017). O meio foi passado duas ve- zes através de colunas de proteína A Sepharose GE e lavado com 50 mL de PBS. Os meios foram eluídos a partir da coluna de afinidade de proteína A em tampão de citrato de sódio a 100 mM (pH 3,5) e neutra- lizados com tampão Tris a pH 8,0. Os eluatos foram dialisados durante a noite contra PBS e depois concentrados usando uma unidade ultra- centrífuga (10.000 kDa CO; EMD Millipore). As IgGs foram quantifica- das usando pontas de sensor de Proteína A no Octet Red384 (Forte- Bio; Menlo Park, CA), e a qualidade das IgGs foi examinada por SDS- PAGE sob condições redutoras e não redutoras e cromatografia de exclusão de tamanho usando FPLC AKTA Pure (GE Healthcare) de modo a detectar a presença de agregados ou degradação. A fração de monômero de IgG foi coletada se uma impureza foi observada. Exemplo 5: Rastreio e confirmação da reatividade de mAbs anti- sinucleína para proteína sinucleína e peptídeos de sinucleína por
ELISA
[00157] Placas de 96 poços revestidas com Estreptavidina Pierce ou placas Costar de elevada ligação foram revestidas com os peptí- deos de sinucleína biotinilados individuais (400 nM final) ou controle (actina bovina, 1ug/mL) diluídos em TBS durante a noite a 4 “C, res- pectivamente. A concentração de IgG dos anticorpos foi determinada pelo Octet com biossensores de Proteína A usando um conjunto cali- brador de proteína A (ForteBio). As IgG anti-sinucleína, diluídas a 10 pg/ml em TBS-T (TBS contendo 0,05% de Tween 20 e 0,25% de BSA), foram adicionados aos poços em duplicado e incubadas a tem- peratura ambiente por 2 horas. Após a lavagem, foram adicionados e incubados, por 1 hora, Fab-HRP de cabra anti-lgG humana (1:2000) ou HRP de cabra anti-camundongo (1:4000, Jackson ImmunoRese- arch; West Grove, PA) e incubados por 1 hora. As placas foram lava- das 5 vezes com TBS-T e desenvolvidas com Substrato de Peroxidase SureBlue Reserve TMB Microwell (KPL Inc.; Gaithersburg, MD). A rea- ção foi interrompida pela adição de 100 ul de Solução de Paragem TMB (KPL), e a absorbância a 450 nm foi medida usando um leitor de placas Tecan M1000. A ligação específica do antígeno foi definida co- mo uma OD450 maior do que 0,5 e pelo menos 3 vezes acima do que o anticorpo secundário sozinho. Para confirmar esses resultados, os anticorpos que satisfizeram os critérios de especificidade do antígeno foram diluídos em série 5 vezes em TBS-T a partir de uma concentra- ção inicial de 10 ug/mL e novamente testados contra o antígeno para o qual demonstraram reatividade. Exemplo 6: Medições qualitativas de associação e dissociação por interferometria de biocamada de Octet para sinucleíina de comprimento total e peptídeos de sinucleína
[00158] Para avaliar a ligação relativa dos anticorpos à sinucleína de comprimento total por interferometria de biocamada (Octet Red 384; ForteBio), a proteína sinucleína biotinilada foi imobilizada em bi- ossensores de Estreptavidina (SA) Dip e Read para cinética contendo 10% de tampão de cinética ForteBio como tampão de ensaio. As cur- vas de ligação em tempo real foram medidas aplicando o sensor em uma solução contendo anticorpo a 100 nM (FIG. 2). Para induzir a dis- sociação, o biossensor contendo o complexo anticorpo-sinucleína foi imerso em tampão de ensaio sem anticorpo. O mapeamento do epíto- po do peptídeo também foi avaliado em biossensores de Estreptavidi- na (SA) Dip e Read usando peptídeos biotinilados de sinucleína abrangendo os resíduos 1-25 (SEQ ID NO: 25), 18-44 (SEQ ID NO: 26), 40-65 (SEQ ID NO: 27), 121-140 (SEQ ID NO: 28), 111-140 (SEQ ID NO: 29), 111-140pS129 (SEQ ID NO: 30) (FIG. 3). Todos os três anticorpos se ligaram a um peptídeo cobrindo os resíduos de a- sinucleína 111-140; no entanto, apenas Asyn-323.1 e Asyn-338.1 se ligaram ao peptídeo abrangendo os resíduos 121-140 (FIG. 3A e FIG. 3C). Isso sugere que Asyn-336.1 se liga entre os resíduos 111-121 (FIG. 3B), enquanto os outros dois anticorpos se ligam mais C- terminalmente, entre os resíduos 121 e 140. Os três anticorpos foram testados quanto à ligação fora do alvo a peptídeos tau irrelevantes, como mostrado no gráfico inferior de cada painel (FIG. 3). As sequên- cias dos peptídeos que se ligam aos mAbs hantiASyn-323.1, hanti- ASyn-336.1 e hantiASyn-338.1 são mostradas na Tabela 5. Tabela 5: Regiões de peptídeo ligadas por mAbs anti-sinucleína [Nome [Residuos Etope(sFGIPNO)
Exemplo 7: Ensaio de citometria de fluxo de imunoprecipitação (IP-FCM)
[00159] A imunoprecipitação detectada por citometria de fluxo (IP- FCM) é um método sensível que quantifica a interação proteína- proteína (Schrum et a/. (2007) Sci STKE 2007, pl2.). A sinucleína mar- cada com V5 e HA foi cotransfectada em células HEK293. O anticorpo alvo-HA (ou -V5) foi conjugado com grânulos e usado para imunopre- cipitação de lisados celulares e, em seguida, o anticorpo anti-V5-APC (ou anti-HA-APC) foi introduzido na mistura de grânulos-anticorpo. Se agregados de sinucleína intracelular resultando em ambas as marcas - V5 e -HA estiverem presentes dentro dos agregados, o sinal positivo pode ser detectado e quantificado usando citometria de fluxo.
[00160] Procedimento de conjugação do anticorpo foi efetuado co- mo descrito por Schrum et al (Schrum et al., 2007). Resumidamente, grupos carboxila em grânulos CML Latex (Sigma-Aldrich) foram ativa- dos com EDAC (50 mg/mL) dissolvido em Tampão de acoplamento MES (MES a 50 mM pH 6,0, EDTA a 1 mM). Anticorpo monoclonal V5 de camundongo (Sigma-Aldrich) em PBS foi adicionado aos grânulos com agitação por 3-4 horas e, em seguida, o anticorpo foi lavado para uso posterior.
[00161] Vinte mil células HEK293 (ATCC; Manassas, MA; menos de passagens) foram plaqueadas em um poço de uma placa de 96 po- ços (Costar) em meio DMEM de elevada glicose (Cellgro) suplementa- do com 10% de FBS (Gibco), 1% de penicilina, 1% de estreptomicina e 1% de L-glutamina (Hyclone) e incubadas durante a noite a 37 ºC em 8% de CO?2. As células foram transfetadas usando FUGENE HD (Pro- mega; Madison, WI). Resumidamente, 50 ng de plasmídeos Syn-HA e 50 ng de Syn-V5 (ou Syn-HA com plasmídeo de controle negativo PcDNA-SNCA-Del61-92-V5) e 0,3 ul de FUGENE foram misturados,
incubados por 10 min e, em seguida, 10 ul da mistura de transfeção foram incubados com células a 37 ºC por 24 horas.
[00162] A a-sinucleína monomérica (aminoácidos 1-140), gerada como descrito acima, foi agregada por incubação por 5 a 6 dias a 37 ºC em um rotador na presença de pequenos grânulos de Teflon (1/16 polegada de diâmetro). As amostras foram centrifugadas por 15 min a
20.000 g para separar monômeros/oligômeros e agregados. O pélete foi armazenado a -80 ºC para ser usado como isco e o sobrenadante foi injetado em SEC-MALS para quantificar o conteúdo de a-sinucleína nos péletes. Os agregados de sinucleína foram descongelados à tem- peratura ambiente por 15 min, depois submetidos a vórtex e diluídos para 1 mg/mL. 4 ug de agregados e 200 ug de anticorpo anti- sinucleína foram misturados em um volume final de 50 ul de PBS, in- cubados por 2 horas com agitação a 37 ºC e, em seguida, diluídos com 350 uL de meio. A mistura foi adicionada a 4 poços com 100 ul em cada poço e incubada por 72 horas. Os anticorpos de controle usados incluem um anticorpo de controle positivo, Syn211 de camun- dongo (ThermofFisher), controle de isótipo de camundongo, anti-FLAG M2 de camundongo (Sigma-Aldrich) e um controle de isótipo humano (um anticorpo anti-RSV).
[00163] As células foram destacadas através da adição de 50 ul de PBS 0,25% de Tripsina-EDTA (Gibco). Em seguida, 150 ul de meio foram adicionados e as células foram coletadas por centrifugação. As células foram lisadas em 100 ul de tampão de lise gelado (1% Triton- X (Sigma-Aldrich) em TBS (Qualidade Biológica; Gaithersburg, MD) suplementado com inibidores de protease 1X (Roche) em gelo. Os |li- sados foram centrifugados para remover detritos celulares (3.000 X 9, min, a 4 ºC) e 80 uL de sobrenadante foram transferidos para uma placa fria de fundo redondo de 96 poços. 150.000 grânulos em 10 ul de tampão de lise foram adicionados a cada poço e incubados durante a noite a 4 ºC com agitação a 750 rom em uma Microplaca Genie (USA Scientific; Ocala, FL). Em seguida, os grânulos foram centrifuga- dos e lavados duas vezes em 200 uL de tampão Post-IP gelado (0,2% TritonX-100 em tampão de lise).
[00164] Os grânulos de captura foram lavados duas vezes em Tampão de Coloração FCM gelado (BD Biosciences) por centrifuga- ção. Anticorpo de APC SureLight anti-HA de camundongo (Columbia Biosciences; Frederick, MD) foi adicionado a cada amostra e incubado 40-60 min a 4 ºC. As amostras foram lavadas 3 vezes em Tampão de Coloração FCM, ressuspensas em 200 ul de Tampão de Coloração FCM e a Análise de Citometria de Fluxo foi realizada usando o MA- CSQuant (Miltenyi Biotec). Os anticorpos monocionais hantiAsyn 323,1, 336,1 e 338,1 bloquearam a agregação intracelular de alfa- sinucleína (FIG. 4). Exemplo 8: Medições de afinidade por Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC)
[00165] As afinidades dos anticorpos para a proteína sinucleina de comprimento completo foram determinados em solução em um siste- ma MicroCal Auto-iTC200 (Malvern Panalystical; Malvern, Reino Uni- do). Peptídeos de sinucleína a 40 uM foram titulados em 20 passos de 2 ul por passo, em tampões idênticos contendo 200 uM de hantiASyn-
323.1, hantiASyn-336.1 e hantiASyn-338.1, respectivamente. Os pa- râmetros termodinâmicos e as constantes de dissociação de equilíbrio, Kd, foram determinados mediante o ajuste dos dados ITC a um mode- lo assumindo um conjunto único de locais de ligação correspondentes a um modelo de ligação de anticorpo:sinucleína (1:2) (FIG. 5). Exemplo 9: Imuno-histoquímica em tecido cerebral humano post mortem
[00166] Tecido cerebral humano post-mortem foi obtido a partir do Vrije Universiteit Medical Center, Amsterdã, Países Baixos. Seções (5 um de espessura) de tecido cerebral DP fixado em formalina e embe- bido em parafina (mesencéfalo) foram montadas em lâminas de vidro revestidas (Menzel gláser superfrost plus, VWR International; Leuven, Bélgica) e secas durante a noite a 37 ºC. As lâminas foram desparafi- nizadas em xileno e reidratadas através de concentrações decrescen- tes de álcool. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada atra- vés da incubação das lâminas por 30 minutos em tampão de fosfato salino (PBS; pH 7,4) contendo 0,3% de H2O>2. Entre os passos de in- cubação, as seções foram enxaguadas em PBS. Todos os anticorpos foram diluídos em diluente de anticorpos (Immunologic; Duiven, Países Baixos) e incubados durante a noite à temperatura ambiente. Os anti- corpos anti-alfa-sinucleína humanahantiAsyn-323.1, hantiAsyn-336.1, hantiAsyn-338.1 foram usados a uma concentração de 0,5 ug/mL. An- ticorpo anti-alfa-sinucleína de camundongo LB509 (Thermofisher) foi usado a uma concentração de 1,25 ug/mL. Os anticorpos primários foram detectados com HRP de cabra anti-humano (diluição 1:250, 60 min à temperatura ambiente, Santa Cruz) ou HRP de cabra anti- camundongo/coelho (pronto para uso, 30 min à temperatura ambiente; EnVision Dako; Glostrup, Dinamarca). Para visualizar a coloração, 3,3'-diaminobenzidina (DAB; Dako; Glostrup, Dinamarca) foi usada. As lâminas foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas e monta- das com meio de montagem Quick-D (Klinipath; Duiven, Países Bai- xos) (FIG. 6).
Exemplo 10: Geração de anticorpos monoclonais anti-sinucleína sem risco e projetados com Fc
[00167] As regiões variáveis de cadeia pesada e leve (VH e VL) pa- ra cada clone de anticorpo anti-sinucleína isolado no Exemplo 4 são analisadas quanto à presença de cisteínas livres e locais potenciais propensos a modificações pós-tradução, incluindo locais de glicosila- ção, oxidação e desamidação. Cisteínas não conservadas nas regiões variáveis são mutadas para serina e mutações de aminoácidos consis- tindo em substituições estruturalmente conservadas e/ou baseadas na linha germinativa são usadas para remover esses locais. Para locais de glicosilação, várias mutações podem ser usadas, incluindo a substi- tuição de asparagina pela glutamina conservativa ou mutações em re- síduos codificados pela linha germinativa. As modificações nos locais de desamidação incluem a substituição de ácido aspártico por aspara- gina e serina ou alanina por glicina. Os locais de potencial oxidação não são modificados. Para aumentar a afinidade de ligação para FcRn e, desse modo, aumentar a semivida de mAbs de IgG1 in vivo, várias mu- tações localizadas na fronteira entre a região CH2 e CH3 são geradas, incluindo mutações M252Y/S254T/T256E mais H433K/N434F (Vaccaro et al. (2005) Nat Biotechnol. 23(10):1283-8) ou T250Q/M428L (Hinton et al. (2004) J Biol Chem. 279(8):6213-6), todas as quais mostraram au- mentar a ligação de IgG1 a FcRn. Todas as substituições são geradas por mutagênese direcionada para o local de acordo com as instruções do fabricante (QuickChange 1l, Agilent Technologies; Santa Clara, CA). As sequências de nucleotídeos para todos os construtos são verifica- das de acordo com técnicas padrão conhecidas do perito na técnica. Exemplo 11: Mutagênese de triagem de alanina para identificar resíduos de contato em epítopos de anticorpo anti-sinucleína
[00168] Para avaliar a especificidade e a contribuição de aminoáci- dos para a ligação de cada um dos mAbs recuperados à sinucleína, a sua reatividade aos peptídeos de sinucleína com cada posição substi- tuída por alanina é testada por ELISA. Os peptídeos de sinucleína bio- tinilados são sintetizados comercialmente e dissolvidos em água a 1 mg/mL e congelados a -80 ºC. Resumidamente, placas de ligação de estreptavidina de 96 poços (Thermo Fisher) são revestidas com 2 upg/mL de peptídeos de sinucleína diluídos em TBS e incubados duran- te a noite a 4 ºC. No dia seguinte, as placas são lavadas com TBS-T e subsequentemente bloqueadas com BSA 2,5% em TBS por 2 horas à temperatura ambiente. Após o bloqueio, as IgGs anti-syn purificadas (ou seja, Asyn-323.1, Asyn-336.1 e Asyn-338.1) são diluídas para 5 upg/mL e tituladas 5 vezes em TBS mais 0,25% de BSA e incubadas à temperatura ambiente por 2 horas. As placas são lavadas 5 vezes com TBS-T seguido pela adição de anticorpo secundário [IG F(ab'), de cabra Anti-Humana (Jackson Labs) na diluição de 1:2.000], diluído em TBS mais 0,25% de BSA, e incubado à temperatura ambiente por 1 h. Após a incubação, as placas são lavadas 4 vezes em TBS-T e desen- volvidas com Substrato de Peroxidase de Micropoço SureBlue Reser- ve TMB (KPL) por aproximadamente 90 seg. A reação é imediatamen- te interrompida pela adição de Solução Interrupção de TMB (KPL) e a absorbância a 450 nm é medida usando um leitor de placas ELISA. Cada experimento é conduzido em triplicado e a reatividade é conside- rada positiva quando os valores são iguais ou superiores a uma DO de 0,3 no ensaio ELISA. A reatividade do anticorpo é classificada como sem ligação (-), fraca (-/+), moderada (+) ou forte (++). (-) para uma média de duas leituras de D.O. a 450 nm <0,3; (-/+) para >0,5 e <1,0; (+) para > 1,0 e <1,5; (++) para >1,5.
Exemplo 12: Maturação de afinidade de anticorpos anti-sinucleína
[00169] A sequência de codificação de scFv correspondendo a Asyn-323,1, Asyn-336,1, e Asyn-338.1 é clonada em um vetor de ex- pressão procariótico indutível contendo o gene de fago M13 pill. Neste exemplo, mutações aleatórias são deliberadamente introduzidas no scFv por PCR propenso a erros (kit de Mutagénese de Domínio de Clone Genemorph Il EZ, tecnologias Agilent) após o que o DNA é transformado em bactérias TG1. Os transformantes são cultivados até a fase mid-log e infectados com fagos auxiliares que conferem todos OS genes necessários para a montagem do fago. Os fagos que ex- pressam ScFv são resgatados por um genoma de fago auxiliar de CT,
sem os domínios de infecciosidade N1 e N2 da proteína plll e, desse modo, tornando as partículas de fago infecciosas só se exibirem o scFv ligado ao plll de comprimento total (Kramer et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31 (11): e59.). As bibliotecas de fagos são rastreadas usando grânulos magnéticos revestidos com sinucleína de comprimen- to total e/ou peptídeos Asyn cognatos em imunotubos. Para desseleci- onar ligantes não específicos, os tubos são revestidos com um peptí- deo não relevante sem o epítopo do mAb Asyn. Para garantir a matu- ração contra o epítopo correto, a seleção é continuada usando grânu- los revestidos com o peptídeo cognato. Os fagos eluídos são usados para infectar bactérias XL1-azul F' que foram cultivadas e infectadas com fagos auxiliares para resgatar fagos usados para rodadas de se- leção subsequentes. Após três rodadas de seleção, os clones de fago individuais são isolados e rastreados em fago ELISA para ligação a sinucleína de comprimento total e/ou peptídeos Asyn-323.1, Asyn-
336.1 e Asyn-338.1 cognatos. Os clones variantes selecionados são convertidos e expressos como IgG1 para avaliar adicionalmente a sua afinidade em solução por Octet e calorimetria isotérmica.
[00170] Será apreciado pelos peritos na técnica que podem ser fei- tas alterações nas modalidades acima descritas sem se afastar do seu amplo conceito inventivo. Em consequência, é entendido que essa in- venção não está limitada às modalidades particulares descritas, sendo pretendido que abranja modificações dentro do espírito e escopo da presente invenção como definidos pela presente descrição.

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de liga- ção ao antígeno, caracterizado por compreender uma região determi- nante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR?2, HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências polipeptídicas de: (a) SEQID NOs: 7,8, 9,16, 17 e 18, respectivamente; (b) SEQID NOs: 10, 11, 12, 19, 20 e 21, respectivamente; ou (c) SEQID NOs: 13, 14, 15, 22, 23 e 24, respectivamente; em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga especificamente à alfa-sinucleína, preferencialmente à alfa-sinucleína humana.
2. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de liga- ção ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada tendo uma se- quência polipeptídica pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 1,3 ou 5, ou uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência poli- peptídica pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, 4 ou 6.
3. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de liga- ção ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia polipeptídica de SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia le- ve tendo a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2; (b) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia polipeptídica de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia le- ve tendo a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 4; ou (c) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên-
cia polipeptídica de SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia le- ve tendo a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 6.
4. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de liga- ção ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se ligar especificamente a um epítopo em um pep- tídeo de alfa-sinucleína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
5. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de liga- ção ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se ligar especificamente a um epítopo em um pep- tídeo de alfa-sinucleína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.
6. Anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ca- racterizado por o anticorpo monoclional ou seu fragmento de ligação ao antígeno reduzirem o nível de alfa-sinucleína.
7. Anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ca- racterizado por o anticorpo monoclional ou seu fragmento de ligação ao antígeno prevenirem ou reduzirem o nível de agregação de alfa- sinucleína.
8. Variante funcional, caracterizada por ser do anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
9. Imunoconjugado, caracterizado por compreender o anti- corpo monoclional isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e pelo me- nos um agente terapêutico e/ou detectável.
10. Ácido nucleico isolado caracterizado por codificar o an- ticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
11. Vetor, caracterizado por compreender o ácido nucleico isolado, como definido na reivindicação 10.
12. Célula hospedeira, caracterizada por compreender o vetor, como definido na reivindicação 11.
13. Composição farmacêutica, caracterizada por compre- ender o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um portador farmaceuticamente aceitável.
14. Método de prevenção ou redução da agregação de alfa- sinucleína em um indivíduo com necessidade do mesmo, caracteriza- do por compreender a administração ao indivíduo da composição far- macêutica, como definida na reivindicação 13.
15. Método de tratamento ou prevenção de uma doença definida por corpos de Lewy ou agregação de alfa-sinucleína em um indivíduo com necessidade do mesmo, caracterizado por compreender a administração ao indivíduo da composição farmacêutica, como defi- nido na reivindicação 14.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do por a doença ser selecionada a partir de qualquer sinucleinopatia.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do por a doença ser selecionada a partir do grupo consistindo em do- ença de Alzheimer, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia sistêmica múltipla, e doenças do armazenamento lisos- somal.
18. Método de produção do anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por compreender a cultura de uma célula compreendendo um ácido nucleico codificando o anticorpo mo- noclonal ou fragmento de ligação ao antígeno sob condições para pro-
duzir o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno e recuperação do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao an- tígeno a partir da célula ou cultura.
19. Método de produção de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por compreender a combinação do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno com um portador farmaceutica- mente aceitável de forma a obter a composição farmacêutica.
20. Método para determinar um nível de alfa-sinucleína em um indivíduo caracterizado por compreender: (a) obtenção de uma amostra a partir do indivíduo; (b) contatar a amostra com um anticorpo monoclonal isola- do ou seu fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a7;e (c) determinar o nível de alfa-sinucleína no indivíduo.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteriza- do por a amostra ser uma amostra de tecido.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteriza- do por a amostra de tecido ser uma amostra de tecido cerebral.
23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteriza- do por a amostra ser uma amostra de sangue.
24. Método para diagnosticar uma doença definida por cor- pos de Lewy ou agregação de alfa-sinucleína, caracterizado por com- preender: (a) obtenção de uma amostra a partir do indivíduo; (b) contatar a amostra com um anticorpo monoclional iso- lado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qual- quer uma das modalidades 1-7; e (c) detectar agregados de alfa-sinucleína no indivíduo,
em que a detecção de alfa-sinucleína é diagnóstico de que o indivíduo tem uma doença definida por corpos de Lewy ou agrega- dos de alfa-sinucleína.
25. Kit, caracterizado por compreender pelo menos um an- ticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das modalidades 1 a 7.
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