JP2022505152A - 抗シヌクレイン抗体 - Google Patents

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Abstract

抗アルファ－シヌクレイン抗体及びそれらの抗原結合断片について記載する。さらに記載するのは、抗体をコードする核酸、抗体を含む組成物及び抗体の製造方法及びレビー小体又はアルファ－シヌクレイン凝集を特徴とする疾患を治療又は予防するための抗体の使用方法である。

Description

本発明は、モノクローナル抗アルファ－シヌクレイン抗体、抗体をコードする核酸及び発現ベクター、ベクターを含有する組換え細胞並びに抗体を含む組成物に関する。抗体を作製する方法並びにレビー小体又はアルファ－シヌクレイン凝集を特徴とする疾患を診断及び治療するために抗体を使用する方法もまた提供される。
パーキンソン病（ＰＤ）は、振戦、硬直、動作緩慢並びに平衡及び協調運動障害を含む症状を備える２番目に多い神経変性障害である。米国においては毎年約５０，０００人がＰＤと診断され、約５０万人がこの疾患を有している（ＮＩＨファクトシート、パーキンソン病）。ＰＤの神経病理学的特徴は、レビー小体及び主としてアルファ－シヌクレイン・フィラメントから構成される異常なタンパク質凝集体であるレビー神経突起である（Ｇｏｅｄｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＰＤ、認知症を伴うＰＤ及びレビー小体型認知症は、世界中で５００万人に影響を及ぼす全てがレビー小体疾患である（Ｌａｓｈｕｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。多系統萎縮症（ＭＳＡ）（Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８）及びゴーシェ病（Ｓｈａｃｈａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）等の一部のリソソーム蓄積疾患もまた、アルファ－シヌクレイン凝集を示す。さらに、アルツハイマー病（ＡＤ）の症例の５０％は、レビー小体病理を示す（Ｄｉｔｔｅｒ ａｎｄ Ｍｉｒｒａ，１９８７）。加えて、アルファ－シヌクレインは、ＡＤの神経病理学的特徴に関連している２種のタンパク質であるアミロイドβ（Ｂａｃｈｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）及びタウ（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）の凝集を調節する。
レビー小体の病理の分析は、ＰＤの疾患の増悪又は臨床的進行を伴うアルファ－シヌクレイン凝集体の進行性びまんを示唆するが、これはアルファ－シヌクレイン凝集体の伝播が疾患病理の要因であることを示唆している（Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｄｅｌ Ｔｒｅｄｉｃｉ，２００８）。
アルファ－シヌクレインは、主として３つの領域、即ち、膜相互作用に関与するアミノ末端；変性酸性カルボキシル末端鎖；及びアルファ－シヌクレインの凝集のために極めて重要であるＡＤアミロイドプラーク（ＮＡＣ）の非アミロイドβ成分として公知である疎水性モチーフ（アミノ酸残基６５～９０）から構成される１４０アミノ酸の天然変性タンパク質である。アルファ－シヌクレインタンパク質の点突然変異（Ａ３０Ｐ、Ｅ４６Ｋ、Ｈ５０Ｑ、Ｇ５１Ｄ、Ａ５３Ｅ及びＡ５３Ｔ）並びにアルファ－シヌクレインをコードする遺伝子であるＳＮＣＡの用量の増加は、ＰＤの家族型と関連している（Ｌａｓｈｕｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｋｒａｉｎｃ，２０１７）。さらに、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）は、ＳＮＣＡを特発性ＰＤにとって最も重要な遺伝的危険因子の１つであると同定した（Ｇｏｅｄｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
アルファ－シヌクレインに対する受動免疫及び能動免疫は、マウスにおいてアルファ－シヌクレインを標的化することにより分析されている（Ｇａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。例えば、Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．は、組換えアルファ－シヌクレインタンパク質を用いてトランスジェニックマウスモデルを能動免疫した（Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２００５）。マウスは、アルファ－シヌクレインタンパク質の蓄積の有意な改善をもたらすアルファ－シヌクレインタンパク質に対する抗体を産生した（Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２００５）。アルファ－シヌクレインのＣ末端に対するモノクローナル抗体を用いた受動免疫は、シヌクレイノパチーのマウスモデルにおけるアルファ－シヌクレイン沈着に関連する行動欠陥を改善する（Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｇａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。合成アルファ－シヌクレインフィブリルが注射されたマウスでは、α－シヌクレインのＮ末端に対する抗体の注射は、レビー小体の病理を改善して神経変性を低減させた（Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
α－シヌクレインを直接的に標的とする免疫療法の臨床試験には、活性ワクチンＰＤ０１Ａ及びＰＤ０３Ａ（Ｓｃｈｎｅｅｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）又は抗体ＰＲＸ００２（Ｓｃｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７）及びＢＩＩＢ０５４（Ｗｅｉｈｏｆｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）を用いる受動免疫療法が含まれる。
ＰＤの発生率は年齢に伴って増大し、社会に与える負担は、疾患を診断、予防及び治療するための効果的方法がなければ増加する。現在、ＰＤは、ドーパミン神経細胞の大部分が既に失われている場合に診断され、基礎にある神経変性を有意に緩徐化できる治療方法は全くない（ＮＩＨファクトシート、パーキンソン病）。ＰＤ及び他のレビー小体疾患のための新規な診断方法及び治療薬の発見は、極めて重要である。
１つの一般的態様では、本発明は、ヒトアルファ－シヌクレインに結合する単離モノクローナル抗体（ｍＡｂ）若しくはそれらの抗原結合断片に関する。
提供されるのは：
（ａ）配列番号７、８、９、１６、１７及び１８、それぞれ；
（ｂ）配列番号１０、１１、１２、１９、２０及び２１、それぞれ；又は
（ｃ）配列番号１３、１４、１５、２２、２３及び２４、それぞれ
のポリペプチド配列を有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む単離モノクローナル抗体若しくはそれらの抗原結合断片であって；ここでアルファ－シヌクレイン、好ましくはヒトアルファ－シヌクレインに特異的に結合する単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片である。
特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片は、配列番号１、３若しくは５と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号２、４若しくは６と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片は：
（ａ）配列番号１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域；又は
（ｃ）配列番号５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
さらに提供されるのは、配列番号２８のアミノ酸配列を含むアルファ－シヌクレインペプチド上のエピトープに特異的に結合する単離モノクローナル抗体若しくはそれらの抗原結合断片である。さらに提供されるのは、配列番号３１のアミノ酸配列を含むアルファ－シヌクレインペプチド上のエピトープに特異的に結合する単離モノクローナル抗体若しくはそれらの抗原結合断片である。
特定の実施形態では、モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片は、アルファ－シヌクレインのレベルを低減する。
特定の実施形態では、モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片は、アルファ－シヌクレイン凝集を予防する、又はそのレベルを低減する。
さらに提供されるのは、本発明のモノクローナル抗体若しくはそれらの抗原結合断片の機能的変異体である。
特定の実施形態では、本発明の単離モノクローナル若しくは抗原結合断片及び少なくとも１つの治療薬及び／又は検出試薬を含む免疫コンジュゲートが提供される。
さらに提供されるのは、本明細書に開示した本発明のモノクローナル抗体若しくはそれらの抗原結合断片をコードする単離核酸である。
さらに提供されるのは、本発明のモノクローナル抗体若しくはそれらの抗原結合断片をコードする単離核酸を含むベクターである。
さらに提供されるのは、本発明のモノクローナル抗体若しくはそれらの抗原結合断片をコードする単離核酸を含むベクターを含む宿主細胞である。
特定の実施形態では、本発明の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
さらに提供されるのは、それを必要とする対象におけるアルファ－シヌクレイン凝集を予防又は低減する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法である。
さらに提供されるのは、それを必要とする対象におけるレビー小体又はアルファ－シヌクレイン凝集を特徴とする疾患を治療する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法である。特定の実施形態では、レビー小体又はアルファ－シヌクレイン凝集を特徴とする疾患は、任意のシヌクレイノパチーから選択される。他の実施形態では、レビー小体又はアルファ－シヌクレイン凝集を特徴とする疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症及びリソソーム蓄積疾患から成る群から選択される。
さらに提供されるのは、本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片を生成する方法であって、モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片を生成する条件下でモノクローナル抗体若しくは抗原結合断片をコードする核酸を含む細胞を培養するステップ、及びモノクローナル抗体若しくは抗原結合断片を細胞若しくは培養から回収するステップを含む方法である。
さらに提供されるのは、本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物を生成する方法であって、医薬組成物を入手するためにモノクローナル抗体若しくは抗原結合断片を薬学的に許容される担体と結合するステップを含む方法である。
さらに提供されるのは、対象におけるアルファ－シヌクレインのレベルを決定する方法である。本方法は、（ａ）対象から試料を入手するステップ；（ｂ）その試料を本発明の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片と接触させるステップ；及び（ｃ）対象におけるアルファ－シヌクレインのレベルを決定するステップを含む。特定の実施形態では、試料は、組織試料である。組織試料は、例えば、脳組織試料であり得る。特定の実施形態では、試料は、血液試料である。
特定の実施形態では、レビー小体又はアルファ－シヌクレイン凝集を特徴とする疾患を診断する方法が提供される。本方法は、（ａ）対象から試料を入手するステップ；（ｂ）その試料を本発明の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片と接触させるステップ；及び（ｃ）対象におけるアルファ－シヌクレイン凝集体を検出するステップを含み、ここでアルファ－シヌクレインの検出はレビー小体又はアルファ－シヌクレイン凝集体を特徴とする疾患を有する対象の診断上の特徴である。
さらに提供されるのは、少なくとも１つの本発明の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片を含むキットである。
上述の概要及び下記の本願の好ましい実施形態の詳細な説明は、添付した図面と共に読む場合により十分に理解されることになる。しかしながら、本願は、図面に示される明確な実施形態に限定されないことを理解すべきである。
図１：回収した抗アルファ－シヌクレインモノクローナル抗体の配列解析を示す。図１Ａは、パーキンソン病（ＰＤ）患者及び非パーキンソン病（ｎｏｎ－ＰＤ）患者由来メモリーＢ細胞から単離した抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）可変領域のアミノ酸（ａａ）配列及びヌクレオチド（ｎｔ）配列内の体細胞突然変異の数を示している。最も密接な生殖細胞系列の突然変異及び同定は、ＩｇＢｌａｓｔデータベースを使用して決定した。横線は、平均値を示す。図１Ｂは、近隣結合アルゴリズム（Ｊｕｋｅｓ Ｃａｎｔｏｒモデル）を用いてサーキュラーツリー（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｔｒｅｅ）として例示した、回収したアルファ－シヌクレイン抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の系統発生解析を示している。 （上記のとおり。） Ｏｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法によって決定された、ビオチニル化完全長シヌクレインに対する回収したヒト抗アルファ－シヌクレイン（ｈａｎｔｉ－Ａｓｙｎ）モノクローナル抗体の代表的な選択についての会合（０～６００秒間）及び解離（６００～１２００秒間）プロファイルを示す。個々のｈａｎｔｉ－Ａｓｙｎ変異体に対応するデータは、図面の説明文において強調した対応する線に示す。 図３：Ｏｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法によって決定される、ｈａｎｔｉ－Ａｓｙｎ－３２３．１、ｈａｎｔｉ－Ａｓｙｎ－３３６．１及びｈａｎｔｉ－Ａｓｙｎ－３３８．１のエピトープのマッピング及び特異性を示す。特異性は、１２９位（ｓｙｎ１１～１４０（ｐＳ１２９））でのリン酸化セリンと共にアミノ酸１～２５（ｓｙｎ１～２５）、１８～４４（ｓｙｎ１８～４４）、４０～６５（ｓｙｎ４０～６５）、１１１～１４０（ｓｙｎ１１１～１４０）、１２１～１４０（ｓｙｎ１２１～１４０）及び１１１～１４０をカバーするアルファ－シヌクレインのペプチド領域に対して決定した。様々なシヌクレインペプチドに対する結合についてのｈａｎｔｉ－Ａｓｙｎ－３２３．１（図３Ａ）、ｈａｎｔｉ－ＡＳｙｎ－３３６．１（図３Ｂ）及びｈａｎｔｉ－ＡＳｙｎ－３３８．１（図３Ｃ）に対する会合（０～６００秒間）及び解離（６００～１２００秒間）動態が示されており、無関係のタウペプチドに対する抗シヌクレインｍＡｂのオフターゲット結合は、各パネルの下方のグラフに示す。 （上記のとおり。） （上記のとおり。） インビトロシヌクレインシーディングアッセイにおいて試験した代表的選択のｈａｎｔｉ－Ａｓｙｎモノクローナル抗体についての機能活性を示す。このアッセイは、各抗シヌクレインｍＡｂが－Ｖ５及び－ＨＡ標識化完全長アルファ－シヌクレインを一過性発現し、並びに１０μｇ／ｍｌの組換えアルファ－シヌクレイン凝集体（シード）を用いて又は用いずに処理した細胞中のシヌクレイン凝集体の形成を阻害する能力を測定する。各抗体をシヌクレインシードの存在下若しくは不在下において５００μｇ／ｍｌで試験し、阻害活性をＡＰＣ陽性粒子のパーセントとしてグラフ表示した。各抗体は、２回の独立実験にわたって４回ずつ試験した。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。 図５：等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）によって決定される完全長シヌクレインタンパク質に対するヒト抗シヌクレイン抗体の親和性結合を示す。図５Ａは、ヒト抗アルファ－シヌクレイン抗体３２３．１（ｈａｎｔｉＡｓｙｎ－３２３．１）に対する結合親和性測定を示している。図５Ｂは、ヒト抗アルファ－シヌクレイン抗体３３６．１（ｈａｎｔｉＡｓｙｎ－３３６．１）に対する結合親和性測定を示している。図５Ｃは、ヒト抗アルファ－シヌクレイン抗体３３８．１（ｈａｎｔｉＡｓｙｎ－３３８．１）に対する結合親和性測定を示している。熱動態パラメーター及び平衡解離定数Ｋｄは、抗体：シヌクレイン（１：２）結合モデルに対応する単一セットの結合部位を想定したモデルにＩＴＣデータをフィッティングさせて決定した。実線は、単一セットの結合部位を想定して実験データの最良適合を表している。実験は、ＰＢＳ中で実施した。平衡解離定数（Ｋｄ）は個別グラフ上に示す。 （上記のとおり。） （上記のとおり。） パーキンソン病（ＰＤ）脳組織中のアルファ－シヌクレインの免疫組織化学的検出を示す。免疫組織化学的検査は、ＰＤ症例の中脳に対して実施した。パネルＡは、対照の抗シヌクレインｍＡｂ、ＬＢ５０９を用いた検出を示す；パネルＢは、ｈａｎｔｉＡｓｙｎ－３３６．１を用いた検出を示す；パネルＣは、ｈａｎｔｉＡｓｙｎ－３３８．１を用いた検出を示す；及びパネルＤは、ｈａｎｔｉＡｓｙｎ－３２３．１を用いた検出を示す。パネルＢでは、星印はレビー小体（＊から左、ＤＡＢで染色されていない）を指す。スケールバーは、５０μｍを表す。
背景技術の項で、又本明細書全体を通して、様々な刊行物、論文及び特許が引用又は記載されているが；これらの参考文献はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文献、行為、材料、装置、物品等の議論は、本発明の文脈を提供することを目的とする。そのような議論は、これらの内容のいずれか又は全てが、開示されている、又は特許請求されているあらゆる発明に関する先行技術の一部を形成することを認めるものではない。
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する分野の当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。さもなければ、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書で規定されている意味を有する。
本明細書で使用する場合及び添付した特許請求の範囲においては、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、別途文脈が明白に規定していない限り、複数の言及を含むことに留意しなければならない。
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲等の数値は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。従って、数値は、通常、列挙された値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は、０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１（重量／容積）％～１０（重量／容積）％の濃度範囲は、０．９（重量／容積）％～１１（重量／容積）％を含む。本明細書で使用する場合、数値範囲の使用は、全ての可能な部分的範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含み、文脈に明らかに別段の指示がない限り、そのような範囲内の整数及び値の分数を含む。
他に特に指示されない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の各要素に関すると理解すべきである。当業者は、通例の実験だけを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多数の等価物を認識することになるか、又は確認することができるであろう。かかる等価物は、本発明に包含されるものとする。
本明細書で使用する場合、用語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を有する（ｈａｓ）」、「～を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「～を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、若しくは「～を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又はそれらの任意の他の変形は、記載された整数又は整数群を包含することを意味するものと理解されるが、任意の他の整数又は整数群の排除を意味するものではなく、非排他的又はオープンエンドであることが意図されている。例えば、構成要素の一覧を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品又は装置は必ずしもそれらの構成要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されていない、又はかかる組成物、混合物、プロセス、方法、物品若しくは装置が本来具備している他の構成要素を含むことができる。さらに、明確に反対のことを述べない限り、「又は」は包括的又はを意味し、排他的又はを意味しない。例えば、条件Ａ又はＢは、以下のいずれか１つによって満たされる：Ａが真であり（又は、存在し）且つＢが偽である（又は、存在しない）、Ａが偽であり（又は、存在しない）且つＢが真である（又は、存在する）、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は、存在する）。
本明細書で使用する場合、多数の列挙された要素間の連結用語「及び／又は」は、個々の選択肢及び結合選択肢の両方を含むと理解されている。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって結合される場合、第１選択肢は第２要素を伴わない第１要素の適用性を指す。第２選択肢は、第１要素を伴わない第２要素の適用性を指す。第３選択肢は、第１及び第２要素を合わせた適用性を指す。これらの選択肢のいずれか１つは、本明細書で使用する用語「及び／又は」の意味の範囲内に含まれ、このため用語「及び／又は」の要件を満たすと理解されている。２つ以上の選択肢の同時の適合性は、さらに用語「及び／又は」の意味の範囲内に含まれ、このため用語「及び／又は」の要件を満たすと理解されている。
本明細書で使用する場合、「～から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」という用語、又は「～から成る（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」若しくは「～から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」等のその変形は、本明細書及び特許請求の範囲を通して使用されるとき、記載された整数又は整数群を全て包含するが、その特定の方法、構造又は組成物にさらなる整数又は整数群を加えることはできないことを意味する。
本明細書で使用する場合、「実質的に～から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語、又は「実質的に～から成る（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」若しくは「実質的に～から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」等のその変形は、本明細書及び特許請求の範囲を通して使用されるとき、記載された整数又は整数群を全て包含し、且つ、その特定の方法、構造又は組成物の基本の若しくは新規の特性を実質的に変化させない記載された整数又は整数群を任意選択的に包含することを意味する。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．２１１１．０３節を参照されたい。
本明細書で使用する場合、「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用する用語「哺乳動物」は、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒト等、より好ましくはヒトが挙げられるが、これには限定されない。
又、本明細書で好ましい発明の構成要素の寸法又は特性に言及するときに使用される「約」、「略」、「一般に」、「実質的に」等の用語は、当業者には理解されているであろうように、記載された寸法／特性が厳密な境界又はパラメーターではなく、機能的に同じか又は類似している、そこからの僅かな変形は排除しないことを示すことは理解されたい。少なくとも、そのような数値パラメーターを含む言及は、当技術分野で受容されている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定又はその他の系統的誤差、製造上の公差など）を使用して、最下位桁を変化させない変動を含むであろう。
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列（例えば、抗アルファ－シヌクレイン抗体、アルファ－シヌクレインポリペプチド及びそれらをコードするアルファ－シヌクレインポリヌクレオチド）の文脈における用語「同一」又はパーセント「同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、又は目視による調査によって測定されるとおり、最大の一致について比較及び整列される場合に、同じであるか、又は特定のパーセンテージの同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。
配列比較のために、通常１つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列及び参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次に、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメーターに基づいて参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は目視による調査（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．の合弁事業（１９９５年増補版）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照のこと）によって実行され得る。
パーセント配列同一性及び配列類似性を判定するのに好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３８９－３４０２において記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さの文字列とアラインメントさせた場合、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致又はそれを満たす、クエリ配列中の長さＷの短い文字列を同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔは隣接文字列スコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ、上記）。これらの最初の隣接文字列ヒットは、より長いＨＳＰを含む文字列を探し出すための探索を開始するためのシードとして作用する。次に、文字列ヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。
累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメーターＭ（一致残基の対に関する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不適正残基に関するペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列に関して、スコアリングマトリックスは、累積スコアを計算するために使用される。各方向における文字列ヒットの伸長は：累積アラインメントスコアが、その最大到達値から量Ｘ減少する場合；１つ以上の負のスコアの残基のアラインメントが蓄積することにより、累積スコアが０以下となる場合；又はいずれかの配列の端に到達する場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、ワード長（Ｗ）が１１、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４及び両鎖の比較を初期設定として使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長（Ｗ）が３、期待値（Ｅ）が１０及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを初期設定として使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）。
パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりもたらされる類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と参照核酸の比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは、約０．０１未満及び最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列と類似していると考えられる。
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる指標は、以下に記載されるとおり、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。従って、ポリペプチドは通常、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合には第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
抗体
本発明は、一般に、単離抗アルファ－シヌクレイン抗体、抗体をコードする核酸及び発現ベクター、ベクターを含有する組換え細胞並びに抗体を含む組成物に関する。抗体を作製する方法並びにレビー小体又はアルファ－シヌクレイン凝集を特徴とする疾患を診断及び治療するために抗体を使用する方法。本発明の抗体は、アルファ－シヌクレインへの高親和性結合、アルファ－シヌクレインのレベルを低減する能力及びアルファ－シヌクレイン凝集を予防又は低減する能力を含むがそれらに限定されない１つ以上の望ましい機能特性を有する。
１つの一般的態様では、本発明は、アルファ－シヌクレインに結合する単離モノクローナル抗体若しくはそれらの抗原結合断片に関する。
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、広い意味で使用され、ヒト、ヒト化、複合及びキメラ抗体並びにモノクローナル若しくはポリクローナルである抗体断片を含む免疫グロブリン若しくは抗体分子を含む。一般に、抗体は、特異的抗原に対して結合特異性を呈するタンパク質又はペプチド鎖である。抗体構造は周知である。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインアミノ酸配列に依存して、５つの主要なクラス（即ち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ）に割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４にさらに細分類される。従って、本発明の抗体は、５つの主要なクラス若しくは対応するサブクラスのいずれかであり得る。好ましくは、本発明の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である。脊椎動物種の抗体軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、つまり、カッパ及びラムダのうちの一方に割り当てられ得る。従って、本発明の抗体は、カッパ若しくはラムダ軽鎖定常ドメインを含有し得る。特定の実施形態によると、本発明の抗体は、ヒト抗体からの重鎖及び／又は軽鎖定常領域を含む。重鎖及び軽鎖定常ドメインに加えて、抗体は、それらの各々が３つのドメイン（即ち、相補性決定領域１～３；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含有する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域から構成される抗原結合領域を含有する。軽鎖可変領域ドメインは、又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と呼ばれ、重鎖可変領域ドメインは、又はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と呼ばれる。
本明細書で使用する場合、用語「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含んでいない抗体を指す（例えば、アルファ－シヌクレインに特異的に結合する単離抗体は、アルファ－シヌクレインに結合しない抗体を実質的に含んでいない）。さらに、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含んでいない。
本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す、即ちこの集団を含む個別抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然型突然変異を除けば同一である。
本明細書で使用する場合、用語「抗原結合断片」は、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部分から形成された多重特異性抗体、ラクダ科単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体又は完全抗体構造を含まない抗原に結合する任意の他の抗体断片を指す。抗原結合断片は、それに親抗体若しくは親抗体断片が結合する同一抗原に結合することができる。特定の実施形態によると、抗原結合断片は、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＦｄセグメントを含む。他の特定の実施形態によると、抗原結合断片は、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）を含む。
本明細書で使用する場合、用語「ヒト抗体」は、ヒトによって生成された抗体又は当技術分野において公知の任意の技術を使用してヒトによって生成された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体についてのこの定義には、インタクト抗体若しくは完全長抗体、それらの断片及び／又は少なくとも１つのヒト重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。ファージディスプレイ抗体ライブラリ又は異種マウスから人工的に作製されたヒト様抗体、例えば一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）と比較して、本発明のヒト抗体は、（ｉ）抗原結合領域が代理動物よりむしろヒトの免疫反応を用いて得られる、即ち抗原結合領域が人体におけるその関連性のあるコンホメーションの天然アルファ－シヌクレインに応答して作製されたものであること、及び／又は（ｉｉ）個体を保護したことがあるか、又はアルファ－シヌクレインの存在に関して少なくとも有意であることによって特徴付けられる。
例えば、典型的にファージディスプレイから単離される合成及び半合成抗体などのヒト様抗体の重鎖及び軽鎖の対形成は、必ずしも元のヒトＢ細胞であったような元の対形成を反映するものではない。従って先行技術で一般に用いられるとおりの組換え発現ライブラリから得られるＦａｂ及びｓｃＦｖ断片は、免疫原性及び安定性に対する可能な全ての関連効果をもって人工的なものと見なされ得る。対照的に、本発明は、選択されたヒト対象から親和性成熟抗抗アルファ－シヌクレイン抗体の抗原結合領域を提供するが、これは、特定の実施形態では、共通のＩｇＧ１定常領域を有するキメラとして組換え発現される。
本明細書で使用する場合、用語「アルファ－シヌクレイン」若しくは「α－シヌクレイン」は、互換的に使用され、シヌクレインのタンパク質ファミリーのメンバーであるヒトアルファ－シヌクレインタンパク質を指す。アルファ－シヌクレインは、中枢神経系を通して発現する高度に可溶性の天然では折り畳まれていないタンパク質である。病理学的条件下では、アルファ－シヌクレインは、凝集してレビー小体の主要構造成分を形成する不溶性繊維又はプロトフィブリルを形成する（Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９７；Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．１９９８）。アルファ－シヌクレイン凝集体の伝播は、疾患の進行と関連付けられてきた（Ｂｒａａｋ ｅｔ ａｌ．２００３）。タンパク質は、３つの別個の領域：（１）膜結合上にα－螺旋構造を形成する傾向を付与する両親媒性ヘリックスを形成すると予測されるアポリポタンパク質脂質結合モチーフを含有するアミノ末端（残基１～６０）、（２）β－シート電位を付与するいわゆるＮＡＣ（非Ａβ成分）である中枢性疎水性領域（６１～９５）、及び（３）高度に負に帯電しており、非構造化する傾向があるカルボキシル末端から構成される。ＳＮＣＡ遺伝子は、１４０アミノ酸のアルファ－シヌクレインタンパク質をコードする。アルファ－シヌクレインタンパク質の点突然変異（Ａ３０Ｐ、Ｅ４６Ｋ、Ｈ５０Ｑ、Ｇ５１Ｄ、Ａ５３Ｅ及びＡ５３Ｔ）並びにアルファ－シヌクレインをコードする遺伝子である増加した用量のＳＮＣＡは、ＰＤの家族型と結び付いている（Ｌａｓｈｕｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｋｒａｉｎｃ，２０１７）。さらに、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）は、ＳＮＣＡ（アクセッション番号ＮＭ＿０００３４５）を特発性ＰＤにとって最も重要な遺伝的危険因子の１つであると同定した（Ｇｏｅｄｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
本明細書で使用する場合、「アルファ－シヌクレインに特異的に結合する」抗体は、アルファ－シヌクレイン、好ましくはヒトアルファ－シヌクレインに１×１０－５Ｍ以下、好ましくは５×１０－６Ｍ以下、より好ましくは１×１０－７Ｍ以下、好ましくは１×１０－８Ｍ以下、より好ましくは５×１０－９Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、５×１０－１０Ｍ以下又は１×１０－１０Ｍ以下のＫＤで結合する抗体を指す。用語「ＫＤ」は、Ｋｄ対Ｋａ（即ち、Ｋｄ／Ｋａ）の比から得られ、モル濃度（Ｍ）として表示される解離定数を指す。抗体のＫＤ値は、本開示に照らして当技術分野における方法を用いて決定することができる。例えば、抗体のＫＤは、表面プラズモン共鳴法を用いることによって、例えばバイオセンサーシステム、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを用いて、又はバイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システムを用いて決定することができる。
抗体のＫＤ値が小さいほど、抗体が標的抗原に結合する親和性が高くなる。本明細書で使用する場合、用語「親和性」は、結合分子（例えば、免疫グロブリン分子）のＣＤＲとの個々のエピトープ又は部分エピトープの結合の強度の尺度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．（１９８８），ｐａｇｅｓ ２７－２８を参照されたい。抗原に対する抗体の親和性を測定する一般的な技法には、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）及び表面プラズモン共鳴法が含まれる。
本明細書で使用する用語「エピトープ」は、抗体のＣＤＲループが接触する抗原の部分を意味する。「構造的エピトープ」は、抗原表面上の約１５～２２個の接触残基を含み、抗体のパラトープと一括して称されるＣＤＲ上の残基の大きい群と接触する多数のアミノ酸残基が関わる。エピトープ残基とパラトープ残基との間の直接接触は水素結合、塩橋、疎水性表面のファンデルワールス力及び形状相補性等の静電力によって確立される。界面にはまた、抗原－抗体相互作用の特異性及び親和性に寄与する結合水分子又は他の補助因子がある。抗原－抗体複合体の結合エネルギーはエピトープ－パラトープ界面におけるごく一部の接触残基によって主に媒介される。これらの「エネルギー残基」は、多くの場合、エピトープ－パラトープ界面の中心に位置して機能的エピトープを作り上げる。界面の周辺の接触残基は、概して結合エネルギーへの寄与は小さく；それらを置き換えても、往々にして抗原との結合にはほとんど影響がない。従って、エピトープの結合又は機能活性には、構造的エピトープの中心に位置し、且つ特異性決定ＣＤＲが接触するごく一部のエネルギー残基が関わる。抗原タンパク質上の機能的エピトープの割り当ては、アラニンスキャン突然変異誘発を含むいくつかの方法を用いるか、又は抗体で抗原の結晶構造を解くことによって行い得る。
エピトープは本質的に線状であってもよく、又は不連続エピトープ、例えば立体エピトープ（これは線状の一続きのアミノ酸よりむしろ、抗原の非連続アミノ酸の間の空間的関係によって形成される）であってもよい。立体構造エピトープは、抗原の折り畳みの結果として生じるエピトープ（ここでは抗原の線状配列の異なる部分のアミノ酸が三次元空間で近接するようになる）を含む。不連続エピトープについては、１つ以上の線状ペプチドが、例えばタンパク質配列の異なる領域に分散したいわゆる部分エピトープと低い親和性で結合することが可能であり得る（Ｍ．Ｓ．Ｃｒａｇｇ（２０１１），Ｂｌｏｏｄ １１８（２）：２１９－２０）。
特定の態様によると、本発明は：
（ａ）配列番号７、８、９、１６、１７及び１８、それぞれ；
（ｂ）配列番号１０、１１、１２、１９、２０及び２１、それぞれ；又は
（ｃ）配列番号１３、１４、１５、２２、２３及び２４、それぞれ
のポリペプチド配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片に関するが；ここで抗体若しくはその抗原結合断片は、アルファ－シヌクレイン、好ましくはヒトアルファ－シヌクレインに特異的に結合する。
別の特定の態様によると、本発明は：
（ａ）配列番号１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域；又は
（ｃ）配列番号５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、本発明の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片に関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号７、８、９、１６、１７及び１８、それぞれのポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片に関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片は、配列番号１と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号２と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片は、配列番号１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；及び配列番号２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、配列番号１０、１１、１２、１９、２０及び２１、それぞれのポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片に関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片は、配列番号３と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号４と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片は、配列番号３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；及び配列番号４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、配列番号１３、１４、１５、２２、２３及び２４、それぞれのポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片に関する。別の実施形態では、単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片は、配列番号５と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号６と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片は、配列番号５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；及び配列番号６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
別の特定の態様によると、本発明は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むアルファ－シヌクレインペプチド上のエピトープに特異的に結合する単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片に関する。別の特定の態様によると、本発明は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むアルファ－シヌクレインペプチド上のエピトープに特異的に結合する単離モノクローナル抗体若しくはそれらの抗原結合断片に関する。
一般的態様では、本発明は、単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片の機能的変異体に関する。用語「機能的変異体」は、本明細書で使用される場合、参照抗体のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列と比較して１つ以上のヌクレオチド及び／又はアミノ酸のみが改変されているヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を含む抗体であって、結合パートナー、即ちアルファ－シヌクレインとの特異的結合について参照抗体と競合できる能力を有する抗体を指す。言い換えれば、参照抗体のアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列における修飾は、ヌクレオチド配列によってコードされる、又はそのアミノ酸配列を含有する抗体の結合特質に有意に影響を与えず、改変もしない、つまり、抗体はなお、その標的を特異的に認識し、それに結合することができる。機能的変異体は、ヌクレオチド及びアミノ酸の置換、付加及び欠失を含む、保存された配列修飾を有し得る。機能的変異体の例としては、超可変領域内の潜在的翻訳後修飾を用いて遊離システイン若しくはアミノ酸をリスク除去するステップ、並びに血清半減期及び／又はＩｇＧ抗体のＦｃＲｎへの結合親和性を増加／低減するためのＦｃ遺伝子操作するステップが挙げられる。機能的変異体はまた、ヒトキメラＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプとしての、又は異なる種のキメラアイソタイプとしての抗体の生成もまた含むことができる。これらの修飾は、ＰＣＲ、部位特異的突然変異誘発及びランダムＰＣＲ媒介突然変異誘発等の当技術分野において公知の標準技法によって導入することができ、天然並びに非天然ヌクレオチド及びアミノ酸を含み得る。
別の一般的態様では、本発明は、化学療法薬、薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、細菌性、真菌性、植物又は動物起源の酵素的に活性の毒素若しくはそれらの断片）等の細胞傷害性薬にコンジュゲート化した抗体又は放射性同位体（即ち、放射性コンジュゲート）を含む、免疫コンジュゲート又は抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。特定の態様によると、免疫コンジュゲートは、少なくとも１種の治療薬及び／又は検出試薬に共有結合した上記の抗体のいずれかを含む。
本発明の別の特定の態様によると、本発明は、単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片に関するが、ここでモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片は、アルファ－シヌクレインのレベルを低減する。
本発明の別の特定の態様によると、本発明は、単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片に関するが、ここでモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片は、アルファ－シヌクレイン凝集を予防する、又はそのレベルを低減する。
別の一般的態様では本発明は、本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片をコードする単離核酸に関する。タンパク質のコーディング配列は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく変化させられ得る（例えば、置換する、欠失させる、挿入する等）ことは、当業者には理解されるであろう。従って、当業者には、本発明のモノクローナル抗体若しくはそれらの抗原結合断片をコードする核酸配列が、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく変化させられ得ることは理解されるであろう。
別の一般的態様では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片をコードする単離核酸を含むベクターに関する。本開示の観点から、プラスミド、コスミド、ファージベクター又はウイルスベクター等の当業者に知られている任意のベクターを使用することができる。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミド等の組換え発現ベクターである。ベクターは、発現ベクターの従来型の機能を確立するための任意の要素、例えば、プロモーター、リボソーム結合要素、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー及び複製起源を含み得る。プロモーターは、構成的、誘導性又は抑制性プロモーターであり得る。細胞に核酸を送達できる多数の発現ベクターは、当技術分野において知られており、細胞内の抗体若しくはその抗原結合断片を生成するために本明細書で使用することができる。本発明の実施形態による組換え発現ベクターを生成するために、従来型のクローン化技術又は人工遺伝子合成を使用することができる。
別の一般的態様では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片をコードする単離核酸を含む宿主細胞に関する。本開示に照らして当業者には公知の任意の宿主細胞は、本発明の抗体若しくはそれらの抗原結合断片の組換え発現のために使用することができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α若しくはＢＬ２１細胞（例えば、ｓｃＦｖ若しくはＦａｂ抗体を発現させるため）、ＨＥＫ２９３細胞（例えば、完全長ＩｇＧ抗体を発現させるため）である。特定の実施形態によると、組換え発現ベクターは、化学的形質転換、熱ショック又はエレクトロポレーション等の従来法によって宿主細胞内に形質転換されるが、ここで組換え発現ベクターは、組換え核酸が効果的に発現させられるように宿主細胞ゲノム内に安定性で統合される。
別の一般的態様では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片を生成する方法であって、本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片を生成する条件下でモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片をコードする核酸を含む細胞を培養するステップ、及び抗体若しくはその抗原結合断片を細胞若しくは細胞培養から（例えば、上清から）回収するステップを含む方法に関する。発現抗体若しくはそれらの抗原結合断片は、当技術分野において知られている、且つ本明細書に記載した従来技術に従って、細胞から採取して精製することができる。
医薬組成物
別の一般的態様では、本発明は、本発明の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。本明細書で使用する用語「医薬組成物」は、本発明の抗体を薬学的に許容される担体と一緒に含む生成物を意味する。本発明の抗体及びそれらを含む組成物は、本明細書に言及した治療用途のための医薬品の製造においても有用である。
本明細書で使用する場合、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入又は医薬製剤において使用するための当技術分野において周知の他の物質を指す。担体、賦形剤若しくは希釈剤の特性決定が特定用途の投与経路に依存するであろうことは、理解されるであろう。本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される担体」は、本発明による組成物の有効性又は本発明による組成物の生物学的活性に干渉しない非毒性物質を指す。特定の実施形態によると、本開示に照らして、本発明においては、抗体医薬組成物において使用するために好適な任意の薬学的に許容される担体を使用することができる。
薬学的に許容される担体を用いた薬学的有効成分の製剤は、当技術分野において、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（例えば、第２１版（２００５）及び任意のその後の版）において知られている。追加の成分の非限定的な例としては：バッファー、希釈剤、溶媒、等張化剤、保存剤、安定剤及びキレート剤が挙げられる。本発明の医薬組成物を製剤化する際には、１種以上の薬学的に許容される担体を使用することができる。
本発明の一実施形態では、医薬組成物は、液体製剤である。液体製剤の好ましい例は、水性製剤、即ち水を含む製剤である。液体製剤は、液剤、懸濁剤、エマルション剤、マイクロエマルション剤、ゲル剤等を含み得る。水性製剤は、典型的には、少なくとも５０重量％の水、又は少なくとも６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％若しくは少なくとも９５重量％の水を含む。
一実施形態では、医薬組成物は、例えば、注射器具（例えば、シリンジ若しくは注入ポンプ）を介して注射できる注射可能物質として製剤化され得る。注射は、例えば、皮下、皮内、腹腔内、硝子体内又は静脈内に送達され得る。
別の実施形態では、医薬組成物は、固体製剤、例えば、そのままで使用できる、又は医師若しくは患者が使用前にそれに溶媒及び／又は希釈剤を加えるフリーズドライ若しくはスプレー乾燥組成物である。固体剤形は、圧縮錠剤及び／又は被覆錠剤等の錠剤及びカプセル剤（例えば、硬質若しくは軟質ゼラチンカプセル）を含み得る。医薬組成物は、さらに、例えば、サシェ剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤、ロゼンジ剤又は再構成用の散剤であってもよい。
他の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内、口腔内又は舌下に送達され得る。
水性製剤中のｐＨは、ｐＨ３～ｐＨ１０の間であってよい。本発明の一実施形態では、製剤のｐＨは、約７．０～約９．５である。本発明の別の実施形態では、製剤のｐＨは、約３．０～約７．０である。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、バッファーを含む。バッファーの非限定的な例としては：アルギニン、アスパラギン酸、ビシン、クエン酸塩、リン酸水素二ナトリウム、フマル酸、グリシン、グリシルグリシン、ヒスチジン、リシン、マレイン酸、リンゴ酸、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、コハク酸塩、酒石酸、トリシン、トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン及びそれらの混合物が挙げられる。バッファーは、個別に、又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してよい。これらの特定のバッファーの各１種を含む医薬組成物は、本発明の代わりの実施形態を構成する。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、保存剤を含む。保存剤の非限定的な例としては：塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブロノポール、ブチル４－ヒドロキシ安息香酸、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロヘキシジン、クロロフェネシン、ｏ－クレゾール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、エチル４－ヒドロキシ安息香酸、イミド尿素、メチル４－ヒドロキシ安息香酸、フェノール、２－フェノキシエタノール、２－フェニルエタノール、プロピル４－ヒドロキシ安息香酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、チオメロサール及びそれらの混合物が挙げられる。保存剤は、個別に、又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してよい。これらの特定の保存剤の各１種を含む医薬組成物は、本発明の代わりの実施形態を構成する。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、等張剤を含む。この実施形態の非限定的な例としては：塩（塩化ナトリウム等）、アミノ酸（グリシン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン及びトレオニン）、アルジトール（グリセロール、１，２－プロパンジオールプロピレングリコール、１，３－プロパンジオール及び１，３－ブタンジオール等）、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００）並びにそれらの混合物が挙げられる。等張剤の別の例には、糖が含まれる。糖の非限定的な例は、例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、アルファ及びベータ－ＨＰＣＤ、可溶性デンプン、ヒドロキシメチルデンプン及びカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む単糖、二糖若しくは多糖又は水溶性グルカンであり得る。等張剤の別の例は、糖アルコールであるが、ここで用語「糖アルコール」は、少なくとも１つの－ＯＨ基を有するＣ（４～８）炭化水素であると規定されている。糖アルコールの非限定的な例としては、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルチトール、キシリトール及びアラビトールが挙げられる。この段落に列挙した各等張剤を含む医薬組成物は、本発明の代わりの実施形態を構成する。等張剤は、個別に、又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してよい。これらの特定の等張剤の各１種を含む医薬組成物は、本発明の代わりの実施形態を構成する。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、キレート剤を含む。キレート剤の非限定的な例としては、クエン酸、アスパラギン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の塩及びそれらの混合物が挙げられる。キレート剤は、個別に、又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してよい。これらの特定のキレート剤の各１種を含む医薬組成物は、本発明の代わりの実施形態を構成する。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、安定剤を含む。安定剤の非限定的な例としては、１種以上の凝集阻害剤、１種以上の酸化阻害剤、１種以上の界面活性剤及び／又は１種以上のプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、安定剤を含むが、ここで前記安定剤は、カルボキシ／ヒドロキシセルロース及びそれらの誘導体（ＨＰＣ、ＨＰＣ－ＳＬ、ＨＰＣ－Ｌ及びＨＰＭＣ等）、シクロデキストリン、２－メチルチオエタノール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ３３５０等）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、塩（塩化ナトリウム等）、モノチオグリセロール等の硫黄含有物質、又はチオグリコール酸である。安定剤は、個別に、又は凝集体中に、約０．０１ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してよい。これらの特定の安定剤の各１種を含む医薬組成物は、本発明の代わりの実施形態を構成する。
本発明のまた別の実施形態では、医薬組成物は、１種以上の界面活性剤、好ましくは１種の界面活性剤、少なくとも１種の界面活性剤又は２種の界面活性剤を含む。用語「界面活性剤」は、水溶性（親水性）部分及び脂溶性（親油性）部分から構成される任意の分子若しくはイオンを指す。界面活性剤は、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤及び／又は両性イオン性界面活性剤から成る群から選択され得る。界面活性剤は、個別に、又は凝集体中に、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してよい。これらの特定の界面活性剤の各１種を含む医薬組成物は、本発明の代わりの実施形態を構成する。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、例えば、ＥＤＴＡ等の１種以上のプロテアーゼ阻害剤及び／又はベンズアミジン塩酸（ＨＣｌ）を含む。プロテアーゼ阻害剤は、個別に、又は凝集体中に、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してよい。これらの特定のプロテアーゼ阻害剤の各１種を含む医薬組成物は、本発明の代わりの実施形態を構成する。
別の一般的態様では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物を生成する方法であって、医薬組成物を入手するためにモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片を薬学的に許容される担体と結合するステップを含む方法に関する。
使用方法
別の一般的態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるアルファ－シヌクレイン凝集を予防又は低減する方法であって、対象に本発明のアルファ－シヌクレインに特異的に結合する単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を投与するステップを含む方法に関する。
アルファ－シヌクレインに結合する抗体及びそれらの抗原結合断片の機能活性は、当技術分野において知られている、及び本明細書に記載した方法によって特性決定することができる。アルファ－シヌクレインに結合する抗体及びそれらの抗原結合断片を特性決定するための方法には、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ及びＯｃｔｅｔＲｅｄ分析を含む親和性及び特異性アッセイ；表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを含むがそれらに限定されない。抗アルファ－シヌクレインｍＡｂの機能活性は、さらに細胞内アルファ－シヌクレイン凝集アッセイにおいて評価することもできるが、ここで細胞は抗体がアルファ－シヌクレイン凝集体取り込み及び細胞内シヌクレイン凝集をブロックできるかどうかを決定するためにミスフォールドされた組換えアルファ－シヌクレインシード及び抗アルファ－シヌクレイン抗体と共にインキュベートされる。特定の実施形態によると、アルファ－シヌクレインに結合する抗体及びそれらの抗原結合断片を特性決定するための方法は、下記に記載した方法を含む。
本発明の抗体は、アルファ－シヌクレインの病理学的凝集を伴う疾患を治療又は予防するための治療薬及び予防薬のいずれとしても好適である。別の一般的態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるレビー小体又はアルファ－シヌクレイン凝集を特徴とする疾患を治療又は予防する方法であって、対象に本発明のアルファ－シヌクレインに特異的に結合する単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片又は医薬組成物を投与するステップを含む方法に関する。レビー小体は、神経系細胞内に所在する不溶性塊を形成するために凝集したアルファ－シヌクレインフィブリルを含有する細胞質内封入体である。レビー小体又はアルファ－シヌクレイン凝集体の存在を特徴とする疾患は、集合的にレビー小体病又はシヌクレイノパチーとして知られている。本明細書で使用する場合、「シヌクレイノパチー」は、アルファ－シヌクレインの病理学的凝集を伴うあらゆる神経変性疾患を包含する。特定の実施形態では、疾患は、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、純粋自律神経不全症、リソソーム蓄積疾患及び他のシヌクレイン関連病理から選択され得るが、それらに限定されない。
本発明の実施形態によると、医薬組成物は、治療有効量の抗アルファ－シヌクレイン抗体若しくはその抗原結合断片を含む。本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」は、対象における所望の生物学的応答又は医学的応答を誘発する有効成分又は構成成分の量を指す。治療有効量は、記述されている目的に対して、実験的に且つ通例の様式で決定され得る。
特定の実施形態によれば、治療有効量は、以下の効果の１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上を達成するのに十分な療法の量を指す：（ｉ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状の重症度を低減又は改善すること；（ｉｉ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状の期間を減少させること；（ｉｉｉ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状の進行を予防すること；（ｉｖ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状の退行をもたらすこと；（ｖ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状の発症若しくは発病を予防すること；（ｖｉ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状の再発を予防すること；（ｖｉｉ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状を有する対象の入院を減少させること；（ｖｉｉｉ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状を有する対象の入院期間を減少させること；（ｉｘ）治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状を有する対象の生存を増加させること；（ｘｉ）対象において治療されることになる疾患、障害若しくは状態、又はそれと関連する症状を阻害又は低減すること；及び／又は（ｘｉｉ）別の療法の予防効果若しくは治療効果を増強又は改善すること。
治療有効量又は投与量は、治療されることになる疾患、障害又は状態、投与の手段、標的部位、対象の生理的状態（例えば、年齢、体重、健康を含む）、対象がヒトであるか又は動物であるか、投与される他の医薬及び治療が予防的であるか又は治療的であるか等の様々な要因に応じて変動し得る。治療用量は、安全性及び有効性を最適化するように最適に用量設定される。
特定の実施形態によると、本明細書に記載の組成物は、対象への意図した投与経路に好適であるように製剤化される。例えば、本明細書に記載した組成物は、静脈内、皮下又は筋肉内投与のために適切であるように製剤化することができる。
本明細書で使用する場合、用語「治療する」、「治療すること」及び「治療」は全て、対象において必ずしも識別可能ではないが、対象において識別可能であり得るレビー小体又はアルファ－シヌクレイン凝集によって特徴付けられる疾患に関連する少なくとも１つの測定可能な身体的パラメーターの改善又は回復を指すことが意図される。用語「治療する」、「治療すること」及び「治療」はまた、疾患、障害、又は状態の退行をもたらすこと、進行を予防すること、又は少なくとも進行を遅らせることを指してもよい。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、疾患、障害若しくは状態に関連する１つ以上の症状の改善、発症若しくは発病の予防、又は期間の減少を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、疾患、障害又は状態のリスクを低減すること、重症度を低減すること、又は再発を遅延させることを指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、疾患、障害又は状態を有する対象の生存の増加を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、対象における疾患、障害、又は状態の消失を指す。
別の一般的態様では、本発明は、対象におけるアルファ－シヌクレインのレベルを決定する方法に関する。本方法は、（ａ）対象から試料を入手するステップ；（ｂ）その試料を本発明の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片と接触させるステップ；及び（ｃ）対象におけるアルファ－シヌクレインのレベルを決定するステップを含む。
本明細書で使用する場合、「試料」は、対象から単離した生物学的試料を指し、全血、血清、血漿、血液細胞、組織生検（例えば、脳組織）、リンパ液、腹水、間質液、骨髄、脳脊髄液、唾液、粘液、痰、汗、尿若しくは任意の他の分泌液、排出物又は他の体液を含み得るが、それらに限定されない。「血液試料」は、血液細胞、血清及び血漿を含む全血又はそれらの任意の画分を指す。
特定の実施形態では、対象におけるアルファ－シヌクレインのレベルは、ウェスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳアッセイ及び／又は放射標識免疫測定法（ＲＩＡ）から選択されるがそれらに限定されないアッセイを利用して決定することができる。相対タンパク質レベルは、ウェスタンブロット分析、ＦＡＣＳアッセイ及び免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）、インビボイメージングを利用することによって決定することができ、及び絶対タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡアッセイを利用することによって決定することができる。アルファ－シヌクレインの相対レベルを決定する場合には、アルファ－シヌクレインのレベルは、例えば異なる時点での同一対象からの試料間、同一対象における異なる組織からの試料間及び／又は異なる対象からの試料間の少なくとも２つの試料間で決定することができる。或いは、ＥＬＩＳＡアッセイによる等のアルファ－シヌクレインの絶対レベルを決定する場合は、試料中のアルファ－シヌクレインの絶対レベルは、試料を検査する前にＥＬＩＳＡアッセイのための標準物質を作成することによって決定することができる。当業者であれば、本発明の抗体若しくはそれらの抗原結合断片を利用して、対象からの試料中のアルファ－シヌクレインのレベルを決定するためにいずれの分析技術を利用できるかを理解しているであろう。
対象からの試料中のアルファ－シヌクレインのレベルを決定する方法を利用すると、疾患における異常な（上昇した、減少した又は不十分な）アルファ－シヌクレインのレベルの診断及び適切な治療上の決定をもたらし得る。そのような疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症及びリソソーム蓄積疾患から選択することができる。加えて、対象におけるアルファ－シヌクレインのレベルを監視することによって、上記に記載した疾患を発症するリスクを特定疾患及び／又は特定疾患の進行中におけるアルファ－シヌクレインのレベルに関する知見に基づいて決定することができる。
診断用抗体又は同様の試薬は、静脈内注射によって患者の体内に投与してもよく、或いは上記に例示したとおりに、その薬剤を宿主に送達する任意の好適な経路によって脳に直接投与してもよい。抗体の用量は、治療方法の用量と同一範囲内でなければならない。典型的には、抗体は標識されるが、一部の方法においては、アルファ－シヌクレインに対して親和性を有する一次抗体は標識されず、一次抗体に結合させるため二次標識剤が使用される。標識の選択は検出手段に依存する。例えば、光学的検出には蛍光標識が好適である。外科的介入のない断層撮影法による検出には、常磁性標識の使用が好適である。ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴを使用すると、放射性標識を検出することもできる。
診断は、対象由来の試料中又は対象中の標識されたアルファ－シヌクレイン、アルファ－シヌクレイン凝集体及び／又はレビー小体の数、サイズ及び／又は強度を対応するベースライン値と比較することによって行われる。ベースライン値は、健常者の集団における平均レベルに相当し得る。ベースライン値はまた、同じ対象で測定された以前のレベルに相当し得る。
上記の診断方法はまた、対象における治療前、治療中又は治療後のアルファ－シヌクレインの存在を検出することにより、療法に対する対象の応答のモニタリングにも用いることができる。ベースラインと比較した値の変化が治療応答性を示す。値はまた、病的アルファ－シヌクレインが脳から除去されていくにつれ、生体液中で一時的に変化することもある。
本発明は、さらに、上述の診断及びモニタリング方法を実施するためのキットを対象とする。典型的には、かかるキットは、本発明の抗体等の診断用試薬と任意選択で検出可能標識とを含む。診断用抗体それ自体が、直接検出可能な、又は二次的反応（例えば、ストレプトアビジンとの反応）を介して検出可能な検出可能標識（例えば、蛍光分子、ビオチン等）を含んでいてもよい。或いは、検出可能標識を含有する第２の試薬を利用してもよく、ここで、この第２の試薬は一次抗体に対して結合特異性を有する。生体試料中のアルファ－シヌクレインの測定に好適な診断キットにおいて、キットの抗体は、マイクロタイターディッシュのウエル等の固相に予め結合させて供給されてもよい。
実施形態
本発明はまた、以下の非限定的な実施形態を提供する。
実施形態１は：
（ａ）配列番号７、８、９、１６、１７及び１８、それぞれ；
（ｂ）配列番号１０、１１、１２、１９、２０及び２１、それぞれ；又は
（ｃ）配列番号１３、１４、１５、２２、２３及び２４、それぞれ
のポリペプチド配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片であるが；ここで抗体若しくはその抗原結合断片は、アルファ－シヌクレイン、好ましくはヒトアルファ－シヌクレインに特異的に結合する。
実施形態２は、配列番号１、３若しくは５と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号２、４若しくは６と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片である。
実施形態３は、
（ａ）配列番号１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域；又は
（ｃ）配列番号５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、実施形態１又は２に記載の単離モノクローナル抗体若しくは抗原結合断片である。
実施形態４は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むアルファ－シヌクレインペプチド上のエピトープに特異的に結合する、実施形態１～３のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片である。
実施形態５は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むアルファ－シヌクレインペプチド上のエピトープに特異的に結合する、実施形態１～３のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片である。
実施形態６は、実施形態１～５のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片であるが、ここでモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片は、アルファ－シヌクレインのレベルを低減する。
実施形態７は、実施形態１～６のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片であるが、ここでモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片は、アルファ－シヌクレイン凝集を予防する、又はそのレベルを低減する。
実施形態８は、実施形態１～７のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片の機能的変異体である。
実施形態９は、実施形態１～７のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片及び少なくとも１種の治療薬及び／又は検出試薬を含む免疫コンジュゲートである。
実施形態１０は、実施形態１～７のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片をコードする単離核酸である。
実施形態１１は、実施形態１０に記載の単離核酸を含むベクターである。
実施形態１２は、実施形態１１のベクターを含む宿主細胞である。
実施形態１３は、実施形態１～７のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
実施形態１４は、それを必要とする対象におけるアルファ－シヌクレイン凝集を予防又は低減する方法であって、実施形態１３に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法である。
実施形態１５は、それを必要とする対象におけるレビー小体又はアルファ－シヌクレイン凝集を特徴とする疾患を治療又は予防する方法であって、実施形態１４に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法である。
実施形態１６は、疾患が任意のシヌクレイノパチーから選択される、実施形態１５に記載の方法である。
実施形態１７は、疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症及びリソソーム蓄積疾患から成る群から選択される、実施形態１５に記載の方法である。
実施形態１８は、実施形態１～７のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片を生成する方法であって、モノクローナル抗体若しくは抗原結合断片を生成する条件下でモノクローナル抗体若しくは抗原結合断片をコードする核酸を含む細胞を培養するステップ、及びモノクローナル抗体若しくは抗原結合断片を細胞若しくは培養から回収するステップを含む方法である。
実施形態１９は、実施形態１～７のモノクローナル抗体若しくは抗原結合断片を含む医薬組成物を生成する方法であって、医薬組成物を入手するためにモノクローナル抗体若しくは抗原結合断片を薬学的に許容される担体と結合するステップを含む方法である。
実施形態２０は、対象におけるアルファ－シヌクレインのレベルを決定する方法であって：
（ａ）対象から試料を入手するステップ；
（ｂ）その試料を実施形態１～７のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片と接触させるステップ；及び
（ｃ）対象におけるアルファ－シヌクレインのレベルを決定するステップを含む方法である。
実施形態２１は、試料が組織試料である、実施形態２０に記載の方法である。
実施形態２２は、組織試料が脳組織試料である、実施形態２１に記載の方法である。
実施形態２３は、試料が血液試料である、実施形態２１に記載の方法である。
実施形態２４は、レビー小体又はアルファ－シヌクレイン凝集を特徴とする疾患を診断する方法であって：
（ａ）対象から試料を入手するステップ；
（ｂ）その試料を実施形態１～７のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片と接触させるステップ；及び
（ｃ）対象におけるアルファ－シヌクレイン凝集体を検出するステップを含み、
ここでアルファ－シヌクレインの検出がレビー小体又はアルファ－シヌクレイン凝集体を特徴とする疾患を有する対象の診断上の徴候である方法。
実施形態２５は、実施形態１～７のいずれか１つに記載の少なくとも１つの単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片を含むキットである。
実施例１：タンパク質生成及び細胞アッセイのためのアルファ－シヌクレイン構築物の生成
完全長（１４０アミノ酸）ヒトα－シヌクレイン遺伝子ＳＮＣＡは、Ｇｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ．；Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）で細菌発現のためにコドン最適化し、合成し、ｐＵＣ５７ベクター内にサブクローニングし、Ｃ末端Ａｖｉタグ、トロンビン切断部位及びｈｉｓタグを合成遺伝子内に含めた。Ｘｂａｌ及びＮｏｔＩ部位は、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いるＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって導入し、ＰＣＲ産物は、Ｈｉｓ－トロンビン－Ａｖｉ標識化完全長アルファ－シヌクレインタンパク質を生成するために製造者のプロトコルに従って二重消化し（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、ゲル精製し、ｐＥＴ２８ベクター内にライゲートした。
ヒトＳＮＣＡは、ＳＮＣＡと重複するプライマー（Ｅｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）及びｐｃＤＮＡ２００４ベクターを用いてｐＵＣ５７ベクター（Ｇｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ）からＰＣＲ増幅させ、３’プライマーは－Ｖ５及び－ＨＡ配列のいずれかをコードする配列を有する。断片は、次にゲル精製し、製造者のプロトコルに従ってＧｉｂｓｏｎ組立体クローニングキット（ＮＥＢ）を用いてベクター内で組み立てた。組み立てた混合物は、ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）内に形質転換させ、シークエンシングによって正確なプラスミドを確証した。同様に、細胞アッセイのための陽性対照ベクター、即ちＶ５－（Ｃ末端）及びＨＡ－（Ｎ末端）両方で標識されたＳＮＣＡを生成するために、断片は、ｐｃＤＮＡ２００４ベクター－ＨＡタグ及びＳＮＣＡ遺伝子の５’に重複するヌクレオチドから構成される５’プライマー、並びにベクター－Ｖ５タグ及びＳＮＣＡ遺伝子の３’と重複するヌクレオチドから構成される３’プライマーを用いてＳＮＣＡ遺伝子をＰＣＲ増幅させることによって生成した。ＰＣＲ産物はゲル精製され、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙキット（ＮＥＢ）を用いてｐｃＤＮＡ２００４ベクター内に組み立てた。
実施例２：組換えシヌクレインの精製及びビオチン化
Ｃ末端ａｖｉタグ、トロンビン切断部位及びｈｉｓタグを備える完全長野生型（ＷＴ）α－シヌクレインは、１０Ｌウェーブバッグ内で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）細胞によって生成した。ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いた誘導の２時間後、細胞を採取し、ペレットを－８０℃で貯蔵した。ペレットを再懸濁させ、１錠のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ；Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を補給された抽出用バッファー（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ，ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）中で解凍させた。懸濁液を遠心し、上清を１時間６０℃で加熱し、５２５０×ｇ、４℃で３０分間遠心した。上清は、５０ｍＭのビシン（ｐＨ８．３）へバッファー交換した。多角度光散乱法を伴うサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）分析を使用して、α－シヌクレインタンパク質の総量を推定した。必要量のＢｉｒＡ酵素、ビオチン、ＡＴＰ及び酢酸マグネシウムを製造者の指示（ＢｉｒＡビオチン－タンパク質リガーゼバルク反応キット、Ａｖｉｄｉｔｙ ＬＬＣ；Ａｕｒｏｒａ，ＣＯ）に従ってビオチン化のために一晩かけて添加した。
ビオチン化は、ストレプトアビジン－ＰＥへのビオチン－シヌクレインの結合のＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析によって確証した。次にビオチン化シヌクレイン物質をＨｉｓタグ精製樹脂に塗布し、不純物を除去するために３回洗浄し、一晩のインキュベーション中にトロンビンによってα－シヌクレインを樹脂から切断し、その後にＳＥＣカラムを利用して精製した。
高度に純粋のビオチン化α－シヌクレインは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び分析的ＳＥＣによって確証した。さらに、精製及びビオチン化α－シヌクレインをストレプトアビジン－ＰＥと混合し、ＳＥＣ－ＭＡＬＳによって分析すると、α－シヌクレインが実際にビオチン化されたことを示していた。
ビオチン化α－シヌクレインの応答性は、ストレプトアビジンを被覆したプレートを用いてＥＬＩＳＡによって評価した（実施例５を参照されたい）。このタンパク質は、シヌクレインのＮ末端（アミノ酸１～５）及びＣ末端（アミノ酸１２０～１４０）、それぞれを認識するＳｙｎ３０３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びＣ２０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）の抗体に対して十分に応答性であった。
実施例３：α－シヌクレインベイトの生成及びベイト特異的メモリーＢ細胞の単細胞選別
α－シヌクレインタンパク質に対して天然型ヒトｍＡｂをスクリーニング及びクローニングするために、α－シヌクレインの中心領域及びＣ末端に及ぶ１パネルの７ペプチド（アミノ酸６１～１４０）を設計且つ合成した。このパネルは、Ｓｅｒ－１２９及びＳｅｒ－８７でリン酸化されたペプチド並びにアミノ酸１１０及び１２０での切断を含んでいた。ペプチドは、ＬＣ－ＭＳによって確証された＞９５％の純度で固相化学によって合成した（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｉｎｃ．及びＥｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）。ビオチン及びＬＣリンカーは、指示したペプチドのＮ末端若しくはＣ末端のいずれかで合成した。アルファ－シヌクレインペプチド及びタンパク質選別用ベイトは、ビオチン化ペプチドタンパク質をストレプトアビジン－ＡＰＣ若しくはストレプトアビジン－ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と混合することによって調製した。大多数のペプチド及び遊離ビオチン（陰性対照）は、１：９の比（ストレプトアビジン：ペプチド）で調製し、氷上で３０分間インキュベートし、遊離ペプチドを除去するためにＢｉｏＳｐｉｎ ３０カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の上方を通過させた。完全長タンパク質及び凝集傾向のあるＣ末端ビオチン化ペプチド６１～９５は、１：４の比で調製し、カラムのクリーンアップを行わずに使用した。ペプチド対ストレプトアビジンの比率は、ＳＥＣ－ＭＡＬＳによって決定した。各四量体は、ストレプトアビジン濃度に基づいて、３６ｎＭの最終濃度で使用した。
臨床的に診断された２５例のパーキンソン病（ＰＤ）患者（年齢：５０～６５歳）からの全血（１００ｍｌ）は、Ｓａｎｇｕｉｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎｇｕｉｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓｈｅｒｍａｎ Ｏａｋｓ，ＣＡ）から購入した。３６例の非ＰＤドナー（年齢：２１～６８歳）の全血は、Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、以前に記載されたように凍結保存した（Ｐａｓｃｕａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １３３，７６７－７８３）。手短には、細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）上で単離し、９０％のＦＢＳ及び１０％のＤＭＳＯ中で冷凍保存した。メモリーＢ細胞をスクリーニングし、ドナーからモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を回収するための手技については、以前に記載された（Ｐａｓｃｕａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。手短には、３例の健常ドナー又は４～６例の患者ドナーからのＰＢＭＣは、解凍し、３７℃の完全ＲＰＭＩ培地（１０％のＦＢＳ及び１％のペニシリン、１％のストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ）中で一晩休ませた。Ｂ細胞は、ＣＤ２２＋磁気ビーズを用いた陽性選択によって濃縮した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ；Ｇｅｒｍａｎｙ）。細胞は、ＦＡＣＳバッファー（２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．２５％のウシ血清アルブミン、第Ｖ因子を含むトリス緩衝食塩液（ＴＢＳ））中に再懸濁させた。
細胞外マーカーＩｇＧ－ＦＩＴＣ、ＣＤ１９－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５及びＣＤ２７－ＰＥＣｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）をＰＥ及びＡＰＣ標識タンパク質及びペプチドパネルと一緒に添加した。四量体の非特異的結合を決定するために、抗体標識細胞のアリコートは、ペプチドプールの等モル量で使用したビオチン四量体と共にインキュベートした。細胞及びペプチドは、緩徐に混合しながら１時間にわたり４℃でインキュベートした。洗浄した後、細胞はＦＡＣＳバッファー中に細胞２０×１０６個／ｍｌで再懸濁させた。生／死マーカーＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＭｏＦｌｏ ＸＤＰ又はＡｓｔｒｉｏｓ上での選別の前に添加した。ゲートは、非特異的事象を除外するためのガイドとしての陰性対照を使用して設定した。ＣＤ１９＋、ＩｇＧ＋、ＣＤ２７ｈｉ及び抗原二重陽性生細胞は、単細胞選別によって収集した。細胞は、低温リアルタイムＰＣＲ反応バッファー及びＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で収集した。プレートを短時間遠心し、－８０℃で貯蔵した。
実施例４：メモリーＢ細胞からの重鎖及び軽鎖抗体遺伝子の回収
次に個々のＢ細胞から二段階ＰＣＲアプローチによって重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡを回収し、可変ドメイン配列をクローニングし、完全長組換えＩｇＧ１抗体としてインビトロで発現させた。
第一鎖相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、下記の修飾を加えて、製造者のプロトコル（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に従って選別単細胞から生成した：単一Ｂ細胞を含有する各ウエルに０．５μｌの１０％のＮＰ－４０、１．０μｌのオリゴｄＴ、１．０μｌのｄＮＴＰを添加し、試料を６５℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を氷上に１分間置いた。各ウエルに以下：２．０μｌのＤＴＴ、４．０μｌのＭｇＣｌ２、１．０μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴ及び０．５μｌのＲＮａｓｅＯｕｔを添加した。試料を５０℃で５０分間インキュベートし、続いて８５℃で５分間インキュベートした。初回ＰＣＲ（ステップＩ）については、２．５μｌのｃＤＮＡ調製物を鋳型として使用して重鎖及びカッパ又はラムダ軽鎖を増幅させた。抗体の重鎖、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖のリーダー領域に特異的なプライマープールを使用した。ステップＩ ＰＣＲ反応においては、重鎖、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖それぞれのＣＨ１領域、ＣＫ及びＣＬ領域に特異的な単一リバースプライマーを使用した。
ステップＩＩについては、２．５μｌのステップＩ ＰＣＲ産物を鋳型として使用して、重鎖及びカッパ若しくはラムダ軽鎖可変領域を増幅させた。抗体の重鎖、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖のフレームワーク１領域に対して特異的に設計されたフォワードプライマー及びリバースプライマーのプールを使用して、可変領域からＤＮＡを調製した。さらに、ステップＩＩプライマーは、下流クローニングのためＸｂａＩ及びＸｈｏＩ制限部位を導入するために設計した。ステップＩＩ増幅反応の後、重鎖及び軽鎖可変ドメインＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル上で泳動させた。重鎖及び軽鎖可変領域断片は、製造者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ；Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って精製し、ステップＩＩＩ ＰＣＲ反応に使用した。
ステップＩＩＩについては、ステップＩＩで作製した重鎖及び軽鎖可変領域ＤＮＡ断片を：１）カッパリンカー若しくはラムダリンカー（以下のリンカー調製方法を参照されたい）（軽鎖ステップＩＩ断片の３’末端及び重鎖ステップＩＩ断片の５’末端にアニールするもので、カッパ又はラムダ定常領域のいずれかを含有する）、２）ＸｂａＩ制限部位を含有するフォワードオーバーラッププライマー、及び３）ＸｈｏＩ制限部位を含有するリバースプライマーを用いたオーバーラップ伸長ＰＣＲによって単一カセットに連結した。この反応により、軽鎖可変領域、リンカー及び重鎖可変領域から成る、カッパ鎖又はラムダ鎖それぞれについて約２４００ｂｐ又は２２００ｂｐのアンプリコン（即ち、カセット）が得られる。増幅後、オーバーラップ伸長ＰＣＲ反応産物を製造者の指示（Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット）に従ってＰＣＲ精製した。
リンカー断片は、インハウスで生成した二重ＣＭＶプロモーターベクターであるｐＣＢ－ＩｇＧを用いて増幅させ、これを使用して重鎖及び軽鎖遺伝子の両方を発現させた。リンカー断片の長さは、カッパ又はラムダリンカーそれぞれについて１７６５又は１５３６塩基対である。カッパリンカーは、５’から３’に向かって、イントロン配列、その後にカッパ定常領域、ポリ（Ａ）終結配列及び組換え抗体の１つのベクター発現を可能にするサイトメガロウイルスプロモーター配列を含有する。ラムダリンカーは、ラムダ定常領域、ポリ（Ａ）終結配列及びサイトメガロウイルスプロモーター配列を含有する。一般的なリバースプライマー及びカッパ特異的フォワードプライマーを使用した。増幅断片は１％アガロースゲル上で分離し、製造者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット）に従って精製した。
オーバーラップ伸長ＰＣＲ産物の精製後、断片をＸｈｏＩ及びＸｂａＩで消化し、続いて１％アガロースゲル上で分離した。オーバーラップカセット（約２．４ｋｂ）に対応するバンドを精製し、ＩｇＧ１発現ベクター、ｐＣＢ－ＩｇＧにライゲートした。このベクターに抗体可変遺伝子をサブクローニングし、その元の（天然）アイソタイプに関わらず、抗体をＩｇＧ１として組換え発現させた。全ての形質転換は、ＤＨ５ａ Ｍａｘ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を使用して実施し、２５０μｌのＳＯＣ中において３７℃で１時間かけて回収した。およそ１００μｌの回収細胞は、２０ｍＭのグルコースが補給されたカルベニシリンプレート上でプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートしてコロニーを増殖させた。残留している回収細胞混合物は、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンが補給された４ｍｌのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）培地を用いて培養し、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩インキュベートした。翌日、１プレート当たり５つのコロニーを採集し、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンが補給された３ｍｌのＳＢ培地中において３７℃で一晩増殖させた。ＤＮＡプラスミド調製（Ｑｉａｇｅｎ）のために一晩培養物を使用した。
配列分析は、重鎖及び軽鎖可変領域上で実施した（図１Ａ～１Ｂ）。ＮＣＢＩ ＩｇＢｌａｓｔによって決定される生殖細胞配列とはかけ離れた体細胞突然変異の数は、抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）可変領域両方についてのアミノ酸（ａａ）及びヌクレオチド（ｎｔ）レベルで実施した（図１Ａ）。回収したアルファ－シヌクレイン抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の系統発生解析は、近隣結合アルゴリズムを用いて実施した（Ｊｕｋｅｓ Ｃａｎｔｏｒ ｍｏｄｅｌ；図１Ｂ）。重鎖及び軽鎖配列は、表１及び表２に示す。重鎖及び軽鎖可変領域の相補性決定領域は、表３及び表４に示す。
Figure 2022505152000001
Figure 2022505152000002
Figure 2022505152000003
Figure 2022505152000004
クローン化ｍＡｂは、Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）において一過性で形質転換させ、形質転換７２時間後に遠心分離によって採取した。ＩｇＧは、以前に記載されたように（Ｐａｓｃｕａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７）プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって培養培地から精製した。培地は、ＧＥプロテインＡセファロースカラムに２回通過させ、５０ｍｌのＰＢＳを用いて洗浄した。培地は１００ｍＭのクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．５）中のプロテインＡ親和性カラムから溶出させ、トリスバッファー（ｐＨ８．０）により中和した。溶出液はＰＢＳに対して一晩透析し、次に超遠心分離装置（１０，０００ｋＤａのＣＯ；ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。ＩｇＧは、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４（ＦｏｒｔｅＢｉｏ；Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）上でプロテインＡセンサーチップを用いて定量し、ＩｇＧの量は、凝集体若しくは分解の存在を検出するために還元条件及び非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、及びＦＰＬＣ ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって試験した。不純物が観察された場合は、ＩｇＧ単量体画分を収集した。
実施例５：シヌクレインタンパク質及びシヌクレインペプチドに対する抗シヌクレインｍＡｂの反応性のＥＬＩＳＡによるスクリーニング及び確証
Ｐｉｅｒｃｅストレプトアビジン被覆９６ウエルプレート又はＣｏｓｔａｒ高結合プレートは、４℃でそれぞれ一晩、ＴＢＳ中で希釈した個別ビオチン化シヌクレインペプチド（最終的に４００ｎＭ）若しくは対照（ウシアクチン、１ｕｇ／ｍｌ）により被覆した。抗体のＩｇＧ濃度は、プロテインＡキャリブレーターセット（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いてプロテインＡバイオセンサーを備えるＯｃｔｅｔによって決定した。ＴＢＳ－Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０及び０．２５％のＢＳＡを含有するＴＢＳ）中で１０μｇ／ｍｌに希釈した抗シヌクレインＩｇＧを２回ずつウエルに添加し、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ－ＨＲＰ（１：２０００）若しくはヤギ抗マウスＨＲＰ（１：４０００，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を添加し、１時間インキュベートした。プレートはＴＢＳ－Ｔで５回洗浄し、ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢマイクロウエルペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ Ｉｎｃ．；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で発色させた。１００μｌのＴＭＢ停止液（ＫＰＬ）を添加することにより反応を停止させ、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００プレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの吸光度を計測した。抗原特異的結合は、０．５超のＯＤ４５０及び二次抗体単独の少なくとも３倍超であると定義された。これらの結果を確証するために、抗原特異性についての基準に合致した抗体は、１０ｕｇ／ｍｌの出発濃度からＴＢＳ－Ｔ中で連続的に５倍に希釈し、それらが反応性を証明した抗原に対して再試験した。
実施例６：Ｏｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法による完全長シヌクレイン及びシヌクレインペプチドに対する定性的会合及び解離の測定
バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ３８４；ＦｏｒｔｅＢｉｏ）による完全長シヌクレインに対する抗体の相対結合を評価するために、ビオチン化シヌクレインタンパク質は、アッセイバッファーとしての１０％のＦｏｒｔｅＢｉｏ動力学バッファーを含有する動力学のためのストレプトアビジン（ＳＡ）Ｄｉｐ及びＲｅａｄバイオセンサー上に固定化した。リアルタイム結合曲線は、１００ｎＭの抗体を含有する溶液中のセンサーを適用することによって測定した（図２）。解離を誘導するために、抗体－シヌクレイン複合体を含有するバイオセンサーは、抗体を含まないアッセイバッファー中に浸漬した。ペプチドエピトープマッピングについても残基１～２５（配列番号２５）、１８～４４（配列番号２６）、４０～６５（配列番号２７）、１２１～１４０（配列番号２８）、１１１～１４０（配列番号２９）、１１１～１４０ｐＳ１２９（配列番号３０）を包含するシヌクレインビオチン化ペプチドを用いてストレプトアビジン（ＳＡ）Ｄｉｐ及びＲｅａｄバイオセンサー上で評価した（図３）。全３種の抗体はα－シヌクレイン残基１１１～１４０に及ぶペプチドに結合した；しかしながら、Ａｓｙｎ－３２３．１及びＡｓｙｎ－３３８．１だけは、残基１２１～１４０を包含するペプチドに結合した（図３Ａ及び図３Ｃ）。これは、Ａｓｙｎ－３３６．１が残基１１１～１２１の間に結合するが（図３Ｂ）、他の２種の抗体は、よりＣ末端方向の残基１２１～１４０の間に結合することを示唆している。これらの３種の抗体を各パネルの下方のグラフに示したように無関係のタウペプチドへのオフターゲット結合について試験した（図３）。ｍＡｂであるｈａｎｔｉＡＳｙｎ－３２３．１、ｈａｎｔｉＡＳｙｎ－３３６．１及びｈａｎｔｉＡＳｙｎ－３３８．１に結合したペプチドの配列は、表５に示す。
Figure 2022505152000005
実施例７：免疫沈降フローサイトメトリー（ＩＰ－ＦＣＭ）アッセイ
フローサイトメトリーによって検出された免疫沈降（ＩＰ－ＦＣＭ）は、タンパク質－タンパク質相互作用を定量する高感度法である（Ｓｃｈｒｕｍ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉ ＳＴＫＥ ２００７，ｐｌ２．）。－Ｖ５及び－ＨＡにより標識したシヌクレインは、ＨＥＫ２９３細胞内にコトランスフェクトした。抗体標的－ＨＡ（若しくは－Ｖ５）をビーズにコンジュゲート化し、細胞溶解液の免疫沈降のために使用し、次に抗Ｖ５－ＡＰＣ（若しくは抗ＨＡ－ＡＰＣ）抗体をビーズ－抗体混合物に導入した。細胞内シヌクレインが凝集して凝集体内に存在する－Ｖ５及び－ＨＡタグの両方を生じさせると、陽性シグナルは、フローサイトメトリーを用いて検出及び定量することができる。
抗体コンジュゲート化手技は、Ｓｃｈｒｕｍ ｅｔ ａｌ（Ｓｃｈｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，２００７）に記載されたように実施した。手短には、ＣＭＬラテックスビーズ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）上のカルボキシル基は、ＭＥＳ結合バッファー（５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）中に溶解させてＥＤＡＣ（５０ｍｇ／ｍｌ）により活性化した。ＰＢＳ中のマウスモノクローナルＶ５抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）は３～４時間にわたり振とうしながらビーズに添加し、次に抗体を後に使用するために洗浄した。
２万個のＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＭＡ；３０継代未満）は１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリン、１％のストレプトマイシン及び１％のＬ－グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）が補給されたＤＭＥＭ高グルコース培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中の９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）の１つのウエル内にプレーティングし、次に３７℃の８％のＣＯ２中で一晩インキュベートした。細胞は、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて形質転換させた。手短には、５０ｎｇのＳｙｎ－ＨＡ及び５０ｎｇのＳｙｎ－Ｖ５プラスミド（又は陰性対照プラスミドｐｃＤＮＡ－ＳＮＣＡ－Ｄｅｌ６１－９２－Ｖ５を備えるＳｙｎ－ＨＡ）と０．３μｌのＦｕＧＥＮＥとを混合し、１０分間インキュベートし、次に１０μｌの形質転換混合物を２４時間にわたり３７℃で細胞と共にインキュベートした。
上述したように生成した単量体のα－シヌクレイン（アミノ酸１～１４０）は、小さなＴｅｆｌｏｎビーズ（直径１／１６インチ）の存在下での回転装置内において３７℃で５～６日間にわたるインキュベーションによって凝集させた。モノマー／オリゴマー及び凝集体を分離するために、試料を１５分間、２０，０００ｇで遠心分離した。ペレットはベイトとして使用できるように－８０℃で貯蔵し、ペレット内のα－シヌクレイン含量を定量するために上清をＳＥＣ－ＭＡＬＳ内に注入した。シヌクレイン凝集体は、１５分間かけて室温で解凍させ、ボルテックスにかけ、１ｍｇ／ｍｌに希釈した。４μｇの凝集体及び２００μｇの抗シヌクレイン抗体を最終容積５０μｌのＰＢＳ中で混合し、２時間にわたり３７℃で振とうしながらインキュベートし、次に３５０μｌの培地を用いて希釈した。混合物は各ウエル内に１００μｌで４つのウエルに添加し、７２時間インキュベートした。使用した対照抗体としては、陽性対照抗体、マウスＳｙｎ２１１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、マウスアイソタイプ対照、マウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びヒトアイソタイプ対照ヒト（抗ＲＳＶ抗体）が挙げられる。
細胞は、５０μｌの０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡ ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を添加することにより剥離させた。次に１５０μｌの培地を添加し、細胞を遠心分離により収集した。細胞は、氷上の１Ｘプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）が補給されたＴＢＳ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中の１００μｌの氷冷溶解バッファー（１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中に溶解させた。溶解液は、細胞残屑を除去するために遠心し（３０００×ｇ、５分間、４°Ｃ）、８０ｕｌの上清を低温９６ウエルの丸底プレート内に移した。１０μｌの溶解バッファー中の１５０，０００個のビーズを各ウエルに添加し、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｇｅｎｉｅ（ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｏｃａｌａ，ＦＬ）上で７５０ｒｐｍで振とうしながら４℃で一晩インキュベートした。次にビーズを遠心し、２００ｕｌの氷冷Ｐｏｓｔ－ＩＰバッファー（溶解バッファー中で０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００）中で２回洗浄した。
捕捉用ビーズは、遠心分離によって氷冷ＦＣＭ染色バッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で２回洗浄した。マウス抗ＨＡ－ＳｕｒｅＬｉｇｈｔ ＡＰＣ抗体（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を各試料に加え、４℃で４０～６０分間インキュベートした。試料はＦＣＭ染色バッファー中で３回洗浄し、２００μｌのＦＣＭ染色バッファー中に再懸濁させ、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてフローサイトメトリー分析を実施した。ｈａｎｔｉＡｓｙｎ ３２３．１、３３６．１及び３３８．１モノクローナル抗体は、細胞内アルファ－シヌクレイン凝集をブロックした（図４）。
実施例８：等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）による親和性測定
完全長シヌクレインタンパク質に対する抗体の親和性は、ＭｉｃｒｏＣａｌ Ａｕｔｏ－ｉＴＣ２００システム（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｓｔｉｃａｌ；Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）上の溶液中で決定した。４０μＭのシヌクレインペプチドを、２００μＭのｈａｎｔｉＡＳｙｎ－３２３．１、ｈａｎｔｉＡＳｙｎ－３３６．１及びｈａｎｔｉＡＳｙｎ－３３８．１それぞれを含有する同一バッファー中において１ステップ当たり２μｌの２０ステップで滴定した。熱動態パラメーター及び平衡解離定数Ｋｄは、抗体：シヌクレイン（１：２）結合モデルに対応する単一セットの結合部位を想定したモデルにＩＴＣデータをフィッティングさせて決定した（図５）。
実施例９：死後ヒト脳組織に対する免疫組織化学的検査
死後ヒト脳組織は、Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手した。ホルマリン固定パラフィン包埋ＰＤ脳組織（中脳）からの切片（厚さ５μｍ）は、被覆したガラススライド（Menzel glaser superfrost plus，ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）上に封入し、３７℃で一晩乾燥させた。スライドは、キシレン中でパラフィン除去し、アルコール濃度を下げながらアルコールに通して再水和させた。内因性ペルオキシダーゼ活性は、０．３％のＨ２Ｏ２を含有するリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）中でスライドを３０分間インキュベートすることによってブロックした。インキュベーションのステップ間では切片をＰＢＳ中ですすぎ洗いした。全抗体は、抗体希釈液（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ；Ｄｕｉｖｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中で希釈し、室温で一晩インキュベートした。ヒト抗アルファ－シヌクレイン抗体であるｈａｎｔｉＡｓｙｎ－３２３．１、ｈａｎｔｉＡｓｙｎ－３３６．１、ｈａｎｔｉＡｓｙｎ－３３８．１は、０．５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。マウス抗アルファ－シヌクレイン抗体ＬＢ５０９（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）は、１．２５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。一次抗体は、ヤギ抗ヒトＨＲＰ（希釈率１：２５０、室温で６０分間、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）又はヤギ抗マウス／ウサギＨＲＰ（即時使用可能、室温で３０分間；ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｄａｋｏ；Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて検出した。可視化するために、染色液３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ；Ｄａｋｏ；Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用した。スライドはヘマトキシリンにより対比染色し、脱水し、Ｑｕｉｃｋ－Ｄ封入剤（Ｋｌｉｎｉｐａｔｈ；Ｄｕｉｖｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により封入した（図６）。
実施例１０：脱リスク及びＦｃ遺伝子組換え抗シヌクレインモノクローナル抗体の生成
実施例４で単離した各抗シヌクレイン抗体クローンの重鎖及び軽鎖可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を遊離システインの存在並びにグリコシル化部位、酸化部位及びアミド分解部位を含む翻訳後修飾部位の傾向を示す潜在的部位の存在に関して分析した。可変領域内の非保存システインは、セリンに突然変異し、これらの部位を除去するためには、構造的に保存された、及び／又は生殖細胞系置換から成るアミノ酸突然変異を使用する。グリコシル化部位については、アスパラギンの保存的グルタミンとの交換又は生殖細胞系コード化残基への突然変異を含むいくつかの突然変異を使用することができる。アミド分解部位の修飾には、アスパラギン酸によるアスパラギンの置換及びセリン又はアラニンによるグリシンの置換が含まれる。潜在的酸化部位は改変されない。ＦｃＲｎに対する結合親和性を増加させ、従ってＩｇＧ１ ｍＡｂのインビボ半減期を増加させるため、それらの全部がＦｃＲｎへのＩｇＧ１結合を増加させることが証明されているＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ（Ｖａｃｃａｒｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１０）：１２８３－８）又はＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３－６）の突然変異を含むＣＨ２及びＣＨ３領域間の境界に位置する幾つかの突然変異を作製する。全ての置換は、製造者の指示（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に従って部位特異的突然変異誘発によって作製する。全ての構築体のヌクレオチド配列は、当業者に公知の標準的な技法により検証される。
実施例１１：抗シヌクレイン抗体エピトープ中の接触残基を同定するためのアラニンスキャニング突然変異誘発
シヌクレインへの回収ｍＡｂの各々の特異性及びその結合に対するアミノ酸の寄与をさらに評価するため、アラニンと置換された各位置とのヌクレインペプチドに対するそれらの反応性をＥＬＩＳＡによって試験する。ビオチン化シヌクレインペプチドは商業的に合成されており、１ｍｇ／ｍｌで水中に溶解させ、－８０℃で冷凍する。手短には、９６ウエルのストレプトアビジン結合プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）をＴＢＳ中で希釈した２μｇ／ｍｌのシヌクレインペプチドで被覆し、４℃で一晩インキュベートする。翌日、プレートをＴＢＳ－Ｔで洗浄し、続いて室温で２時間かけてＴＢＳ中の２．５％のＢＳＡでブロックする。ブロッキング後、精製抗ｓｙｎ ＩｇＧ（即ち、Ａｓｙｎ－３２３．１、Ａｓｙｎ－３３６．１及びＡｓｙｎ－３３８．１）を５μｇ／ｍｌに希釈し、ＴＢＳ＋０．２５％のＢＳＡ中で５倍に滴定し、室温で２時間インキュベートする。プレートをＴＢＳ－Ｔで５回洗浄し、続いてＴＢＳ＋０．２５％ＢＳＡに希釈した二次抗体［１：２０００の希釈率のヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）］を添加し、室温で１時間インキュベートする。インキュベーション後、プレートをＴＢＳ－Ｔ中で４回洗浄し、約９０秒間にわたりＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢマイクロウエルペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）を用いて発色させる。この反応を直ちにＴＭＢ停止液（ＫＰＬ）の添加により停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定する。各実験を３回ずつ実施し、反応性は、数値がＥＬＩＳＡアッセイにおいてＯＤが０．３以上である場合に陽性と見なす。抗体反応性は、結合なし（－）、弱度（－／＋）、中等度（＋）、又は強度（＋＋）とスコア付けする。２つのＯ．Ｄ．４５０ｎｍ示度の平均が＜０．３については（－）；＞０．５且つ＜１．０については（－／＋）；＞１．０且つ＜１．５については（＋）；＞１．５については（＋＋）。
実施例１２：抗シヌクレイン抗体の親和性成熟
Ａｓｙｎ－３２３．１、Ａｓｙｎ－３３６．１及びＡｓｙｎ－３３８．１に対応するｓｃＦｖのコーディング配列は、ファージＭ１３ ｐＩＩＩ遺伝子を含有する誘導性原核生物発現ベクター内にクローン化する。この実施例では、ランダム突然変異は意図的に変異性ＰＣＲ（Ｇｅｎｅｍｏｒｐｈ ＩＩ ＥＺＣｌｏｎｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってｓｃＦｖ内に導入し、その後にＤＮＡをＴＧ１細菌内に形質転換させる。形質転換体を第２対数期に増殖させ、ファージアッセンブリーのために必要とされる全ての遺伝子を提供するヘルパーファージで感染させる。ＳｃＦｖ発現ファージは、タンパク質ｐＩＩＩの感染性ドメインＮ１及びＮ２を欠如する、従ってそれらが完全長ｐＩＩＩに結合したｓｃＦｖを提示する場合にのみ感染性であるＣＴヘルパーファージゲノムによって救済される（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１，１１，ｅ５９．）。ファージライブラリーは、ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ内の完全長シヌクレイン及び／又は同族Ａｓｙｎペプチドで被覆した磁気ビーズを用いてスクリーニングする。非特異的結合剤を除外するために、チューブはＡｓｙｎ ｍＡｂエピトープが欠如する非関連性ペプチドで被覆する。正しいエピトープに対する成熟を保証するために、同族ペプチドで被覆したビーズを用いて選択を継続する。溶出ファージは、その後の選択ラウンドのために使用されるファージを救済するために培養してヘルパーファージにより感染させたＸＬ１－ｂｌｕｅ Ｆ’細菌を感染させるために使用する。３回のパニングラウンド後、個々のファージクローンを単離し、完全長シヌクレイン及び／又は同族Ａｓｙｎ－３２３．１、Ａｓｙｎ－３３６．１及びＡｓｙｎ－３３８．１ペプチドに結合させるためにファージＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングする。選択した変異体クローンは、Ｏｃｔｅｔ及び等温カロリメトリーによって溶液中のそれらの親和性を詳細に評価するためのＩｇＧ１として変換させられて発現される。
上記の実施形態に対して、この広い発明概念から逸脱することなく変更を加えることができることが当業者には理解されるであろう。従って、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されるものではなく、本明細書によって規定される本発明の趣旨及び範囲に含まれる変形形態を包含することが意図されることを理解されたい。

Claims (25)

  1. （ａ）配列番号７、８、９、１６、１７及び１８、それぞれ；
    （ｂ）配列番号１０、１１、１２、１９、２０及び２１、それぞれ；又は
    （ｃ）配列番号１３、１４、１５、２２、２３及び２４、それぞれ；
    のポリペプチド配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片であって、アルファ－シヌクレイン、好ましくはヒトアルファ－シヌクレインに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片。
  2. 配列番号１、３若しくは５と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を有する重鎖可変領域又は配列番号２、４若しくは６と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片。
  3. （ａ）配列番号１のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域；
    （ｂ）配列番号３のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域；又は
    （ｃ）配列番号５のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域及び配列番号６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１又は２に記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片。
  4. 配列番号２８のアミノ酸配列を含むアルファ－シヌクレインペプチド上のエピトープに特異的に結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片。
  5. 配列番号３１のアミノ酸配列を含むアルファ－シヌクレインペプチド上のエピトープに特異的に結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片。
  6. アルファ－シヌクレインのレベルを低減する、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片。
  7. アルファ－シヌクレイン凝集を予防する、又はその前記レベルを低減する、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片の機能的変異体。
  9. 請求項１～７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片と少なくとも１種の治療薬及び／又は検出試薬とを含む免疫コンジュゲート。
  10. 請求項１～７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片をコードする単離核酸。
  11. 請求項１０に記載の単離核酸を含むベクター。
  12. 請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
  13. 請求項１～７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  14. それを必要とする対象におけるアルファ－シヌクレイン凝集を予防又は低減する方法であって、前記対象に請求項１３に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
  15. それを必要とする対象におけるレビー小体又はアルファ－シヌクレイン凝集を特徴とする疾患を治療又は予防する方法であって、前記対象に請求項１４に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
  16. 前記疾患は、任意のシヌクレイノパチーから選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症及びリソソーム蓄積疾患から成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  18. 請求項１～７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片を生成する方法であって、前記モノクローナル抗体若しくは抗原結合断片を生成する条件下で前記モノクローナル抗体若しくは抗原結合断片をコードする核酸を含む細胞を培養するステップ、及び前記モノクローナル抗体若しくは抗原結合断片を前記細胞若しくは培養から回収するステップを含む方法。
  19. 請求項１～７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体若しくは抗原結合断片を含む医薬組成物を生成する方法であって、前記医薬組成物を入手するために前記モノクローナル抗体若しくは抗原結合断片を薬学的に許容される担体と結合するステップを含む方法。
  20. 対象におけるアルファ－シヌクレインのレベルを決定する方法であって；
    （ａ）前記対象から試料を入手するステップ；
    （ｂ）前記試料を請求項１～７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片と接触させるステップ；及び
    （ｃ）前記対象におけるアルファ－シヌクレインのレベルを決定するステップを含む方法。
  21. 前記試料は、組織試料である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記組織試料は、脳組織試料である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記試料は、血液試料である、請求項２１に記載の方法。
  24. レビー小体又はアルファ－シヌクレイン凝集を特徴とする疾患を診断する方法であって：
    （ａ）対象から試料を入手するステップ；
    （ｂ）前記試料を請求項１～７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片と接触させるステップ；及び
    （ｃ）前記対象におけるアルファ－シヌクレイン凝集体を検出するステップを含み、
    ここでアルファ－シヌクレインの前記検出は、レビー小体又はα－シヌクレイン凝集体を特徴とする疾患を有する前記対象の診断上の徴候である方法。
  25. 請求項１～７のいずれか一項に記載の少なくとも１つの単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片を含むキット。
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