JP6925274B2 - 治療 - Google Patents

Description

本発明は、ロイシンリッチα2糖タンパク質1（LRG1）、特にヒトLrg1に特異的に結合する抗体に関する。

網膜血管系の異常なリモデリングは、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、未熟児網膜症、加齢黄斑変性及び黄斑部毛細血管拡張症などの、失明の恐れのある疾患の顕著な特徴である。こうした血管の変化は、既存の網膜血管からの新たな毛細血管の成長（血管形成）として、並びに既存血管の血管奇形の発達（たとえば、毛細血管拡張症）として生じる。これらの疾患におけるこの病原性の血管リモデリングが、視力を失う主たる要因である。

同様の血管の病変及び機能不全は、腫瘍の増殖にも付随するものであって、この場合、血管新生が固形腫瘍の増大及び増殖並びにそれらの転移拡散を可能にする。

ロイシンリッチα2糖タンパク質1（Lrg1遺伝子識別子：HGNC: 29480; Entrez Gene: 116844; Ensembl: ENSG00000171236; UniProtKB: P02750）は1977年に同定され（Haupt & Baudner, 1977）、その一次構造は1985年に決定された（Takahashi et al, 1985）。Lrg1はマウスとヒトの間で高度に、進化的に保存されており、ヒトLrg1に対するポリクローナル抗体が市販されているが、ある種の疾患においてトランスフォーミング増殖因子β1（TGFβ1）、TGFβ受容体II（TGFβRII）及びLrg1のレベルが同時に増加するとの報告がある（Sun et al, 1995; Li et al, 2007）。他のグループは、Lrg1を特定の疾患のバイオマーカーとして（US 2005/0064516; WO 2008/092214）並びにシトクロムcのリガンドとして（US 2007/0184503）同定した。Lynchら(2012)は、マイクロRNA-335（miRNA-335）がLrg1を標的として、ミオシン軽鎖（MLC）のリン酸化状態を低下させることによって神経芽細胞腫細胞の遊走及び浸潤の減少をもたらすことを実証している。

本発明者は以前に、ロイシンリッチα2糖タンパク質1が、特に眼及び血管増殖を示す腫瘍における、病原性血管リモデリングを調節するための、新薬につながる標的であることを明らかにした。したがって、本発明者は、Lrg1をアンタゴナイズすることが、病原性血管リモデリングもしくは病原性血管新生の起こる症状、特に眼の症状、たとえば新生血管AMD、糖尿病性網膜症、及び未熟児網膜症の治療に有用であると予想した（WO 2011/027129）。Wang et al (2013)（本発明者により公開）はまた、Lrg1が血管リモデリングに関与し、TGFβシグナル伝達複合体内のLrg1の遮断が、TGFβを病原性血管新生から離す可能性を有することを開示している。

本発明者はまた以前に、Lrg1が免疫細胞機能のみならず新生物細胞に直接影響を及ぼすこと、そしてそれゆえに、これらの細胞に直接影響を及ぼすことにより癌の治療及び/又は予防の標的として使用できることを見い出している。本発明者は、Lrg1ターゲティングが、新生物細胞に直接影響をおよぼし、したがってこの直接的な癌細胞への効果、具体的には、腫瘍血管新生への影響によるのではなく、新生物細胞の増殖をダウンレギュレートすることによって、癌の治療及び/又は予防のためにLrg1ターゲティングを使用できることを実証している。本発明者はまた、Lrg1が、発癌促進環境の一因となる免疫細胞の性質を改変することも明らかにしている（WO2013132267）。

多数の癌の特徴は、構造的及び機能的に異常な脈管構造であり、これは、腫瘍灌流を低減し、低酸素、浸潤及び転移を増強する(Carmeliet及びJain、2011年)。腫瘍における血管正常化は、腫瘍の末梢のみならず腫瘍全体に対する細胞傷害性薬物及び免疫療法の送達を改善するための発展中の分野である(Carmeliet及びJain、2011年)(Maesら、2014年)。細胞傷害性物及び免疫療法の有効な送達のためには、適切に灌流され、成熟した血管が必要である。さらに、低酸素は、転移の推進力であり、不十分な細胞間結合及び癌細胞の循環への遊走を促進する。したがって、腫瘍の酸素化の増大は、腫瘍が転移性になる可能性を低減するように作用し得る。低酸素はまた、宿主免疫系に対しても悪影響を有し、それを免疫応答に対してあまり感受性ではないものにする。脈管構造の改善された任意の腫瘍は、治療をより受け入れられるようになり、低酸素を低減する。したがって、腫瘍の脈管構造を正常化できる薬剤を同定することが望まれている。

虚血性心疾患、糖尿病及び眼のいくつかの疾患を含む多数の疾患は、低酸素組織の存在を特徴とする。これらの状態によって影響を受けた組織の酸素化を増大するための、脈管構造を正常化するための、臨床上の利益を達成するための原動力がある。

本発明者らは、驚くべき特徴を有する、ヒトLrg1と結合する抗体をここで作製した。本発明者らは、治療において使用するのに適している抗体を製造した。本発明の抗体は、治療上及び臨床上関連する特性を有する。本発明の抗体は、ヒトLrg1と特異的に結合する。

ヒトLrg1と結合する102のマウス抗体(mAb)の最初のコホートを作製した。異種間反応性及び結合速度論解析によって、可能性ある治療用抗体の領域が狭められた。3種のリード抗体15C4、3A11及び4H2が、その治療効力を調べるために、in vitro及びin vivo解析を受けた。抗体15C4を配列決定し、ヒト化した。

本発明の抗体は、1nM以下と定義される、ヒトLrg1に対する高アフィニティを示す。特に、抗体15C4は、驚くべきことに、Lrg1に対してほとんど不可逆的な結合に達するピコモル範囲のアフィニティを示した。

本発明の抗体は、レーザー誘起脈絡膜血管新生(CNV)のマウス及びラットモデルにおいて血管新生の遮断を引き起こす。本発明の抗体は、血管新生のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)同時培養モデルにおける血管成長の遮断を引き起こす。

本発明の抗体は、その他の生物に由来するLrg1とより低い交差反応性を示す。

本発明者らは、固形腫瘍においてLrg1の発現をノックアウトすることが、腫瘍中の小血管数の低減を引き起こすことを見い出した。この低減は、腫瘍の大きさの低減、腫瘍中の増殖細胞数の低減及び残存する血管上の周皮細胞被覆度の増大と関連している。統合すると、これらの結果は、Lrg1発現をノックアウトすることは、血管新生を制限するだけでなく、腫瘍脈管構造を正常化するようにも作用することを示す。

さらに、本発明者らは、Lrg1アンタゴニストが、腫瘍成長を低減し、残存する腫瘍の脈管構造を正常化することも見い出した。これらのデータは、Lrg1のアンタゴニストを使用して、転移拡散を低減できることを示唆する。Lrg1のアンタゴニストを使用して、腫瘍への、抗癌及び細胞傷害性薬物/生物製剤の送達及び有効性を改善できる。

Lrg1アンタゴニストによる脈管構造の正常化はまた、血管新生を増大するために有用であろう疾患の治療も可能にするであろう。Lrg1アンタゴニストを用いる治療は、無秩序な、未成熟な血管形成を低減する。血管新生促進剤を用いるその後の治療は、機能的に成熟した血管新生を改善するであろう。このような治療は、組織が低酸素によって影響を受ける任意の疾患及び奇形血管がある疾患において使用されるであろう。このような疾患として、虚血、虚血性心疾患、糖尿病、虚血性脳卒中、血管性認知症、一過性脳虚血発作、僧帽弁疾患、慢性心房細動、心筋症、急性四肢虚血、末梢四肢虚血、血栓症、血管閉塞、胸郭出口症候群、アテローム性動脈硬化症、低血糖、頻脈、低血圧症、鎌形赤血球疾患、凍傷、動静脈奇形、血管破裂及び貧血が挙げられる。

したがって、本発明は、以下を提供する:
ヒトLrg1と特異的に結合し、配列番号21〜26から選択される少なくとも1つのCDRを含む抗体又はその断片。

別の実施形態では、配列番号23及び26から選択される少なくとも1つのCDRを含む抗体又はその断片。

別の実施形態では、配列番号23及び26のCDRを含む抗体又はその断片。

別の実施形態では、
(a)配列番号21、22及び23、又は
(b)配列番号24、25及び26
のCDRを含む抗体又はその断片。

別の実施形態では、配列番号21、22、23、24、25及び26のCDRを含む抗体又はその断片。

別の実施形態では、
(a)配列番号1、5、7、9、11若しくは13の重鎖可変領域アミノ酸配列、
(b)抗体若しくは断片が、Lrg1と特異的に結合する能力を保持する、(a)の少なくとも7個のアミノ酸の断片、又は
(c)抗体若しくは断片が、Lrg1と特異的に結合する能力を保持する、(a)の配列に対して少なくとも70％のアミノ酸配列同一性を有する(a)の変異体
を含む、抗体又はその断片。

別の実施形態では、
(a)配列番号2、15、17若しくは19の軽鎖可変領域アミノ酸配列、
(b)抗体若しくは断片が、Lrg1と特異的に結合する能力を保持する、(a)の少なくとも7個のアミノ酸の断片、又は
(c)抗体若しくは断片が、Lrg1と特異的に結合する能力を保持する、(a)の配列に対して少なくとも70％同一性のアミノ酸同一性を有する(a)の変異体
を含む、抗体又はその断片。

別の実施形態では、
(a)配列番号1の重鎖可変領域及び配列番号2の軽鎖可変領域、又は
(b)配列番号1の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
(c)配列番号1の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
(d)配列番号1の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域、又は
(e)配列番号5の重鎖可変領域及び配列番号2の軽鎖可変領域、又は
(f)配列番号5の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
(g)配列番号5の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
(h)配列番号5の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域、又は
(i)配列番号7の重鎖可変領域及び配列番号2の軽鎖可変領域、又は
(j)配列番号7の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
(k)配列番号7の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
(l)配列番号7の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域、又は
(m)配列番号9の重鎖可変領域及び配列番号2の軽鎖可変領域、又は
(n)配列番号9の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
(o)配列番号9の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
(p)配列番号9の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域、又は
(q)配列番号11の重鎖可変領域及び配列番号2の軽鎖可変領域、又は
(r)配列番号11の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
(s)配列番号11の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
(t)配列番号11の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域、又は
(u)配列番号13の重鎖可変領域及び配列番号2の軽鎖可変領域、又は
(v)配列番号13の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
(w)配列番号13の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
(x)配列番号13の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域
を含む、抗体又はその断片。

別の実施形態では、配列番号1、5、7、9、11若しくは13のCDR及び/又は配列番号2、15、17若しくは19のCDRを含む、Lrg1と特異的に結合する抗体又はその断片。

別の実施形態では、Lrg1のアミノ酸GNKLQVLGKDLLLPQ(配列番号30)と特異的に結合し、Lrg1活性を遮断する抗体又はその断片。

本発明の抗体はまた、血管増殖性状態の治療において使用できる。本発明の抗体は、癌の治療において使用できる。本発明の抗体は、細胞傷害性化合物又は抗癌剤と組み合わせて投与できる。

本発明はまた、癌の治療において使用するための抗血管新生剤と組み合わせたLrg1のアンタゴニストに関する。

本発明はまた、脈管構造が奇形である組織の再血管新生の方法において使用するための、血管新生促進剤と組み合わせたLrg1のアンタゴニストに関する。

配列表の簡単な説明
配列番号1は、抗体15C4の重鎖の可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号2は、抗体15C4の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号3は、抗体15C4の重鎖の可変領域のヌクレオチド配列である。
配列番号4は、抗体15C4の軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列である。
配列番号5は、変異体VH1の重鎖の可変領域−抗体15C4の重鎖の可変領域のヒト化変異体、のアミノ酸配列である。
配列番号6は、変異体VH1の重鎖の可変領域−抗体15C4の重鎖の可変領域のヒト化変異体、のヌクレオチド配列である。
配列番号7は、変異体VH2の重鎖の可変領域−抗体15C4の重鎖の可変領域のヒト化変異体、のアミノ酸配列である。
配列番号8は、変異体VH2の重鎖の可変領域−抗体15C4の重鎖の可変領域のヒト化変異体、のヌクレオチド配列である。
配列番号9は、変異体VH3の重鎖の可変領域−抗体15C4の重鎖の可変領域のヒト化変異体、のアミノ酸配列である。
配列番号10は、変異体VH3の重鎖の可変領域−抗体15C4の重鎖の可変領域のヒト化変異体、のヌクレオチド配列である。

配列番号11は、変異体VH4の重鎖の可変領域−抗体15C4の重鎖の可変領域のヒト化変異体、のアミノ酸配列である。
配列番号12は、変異体VH4の重鎖の可変領域−抗体15C4の重鎖の可変領域のヒト化変異体、のヌクレオチド配列である。
配列番号13は、変異体VH5の重鎖の可変領域−抗体15C4の重鎖の可変領域のヒト化変異体、のアミノ酸配列である。
配列番号14は、変異体VH5の重鎖の可変領域−抗体15C4の重鎖の可変領域のヒト化変異体、のヌクレオチド配列である。
配列番号15は、変異体VK1の軽鎖の可変領域−抗体15C4の軽鎖の可変領域のヒト化変異体、のアミノ酸配列である。
配列番号16は、変異体VK1の軽鎖の可変領域−抗体15C4の軽鎖の可変領域のヒト化変異体、のヌクレオチド配列である。
配列番号17は、変異体VK2の軽鎖の可変領域−抗体15C4の軽鎖の可変領域のヒト化変異体、のアミノ酸配列である。
配列番号18は、変異体VK2の軽鎖の可変領域−抗体15C4の軽鎖の可変領域のヒト化変異体、のヌクレオチド配列である。
配列番号19は、変異体VK3の軽鎖の可変領域−抗体15C4の軽鎖の可変領域のヒト化変異体、のアミノ酸配列である。
配列番号20は、変異体VK3の軽鎖の可変領域−抗体15C4の軽鎖の可変領域のヒト化変異体、のヌクレオチド配列である。

配列番号21、22及び23は、それぞれ上述した抗体の重鎖のCDR1、2及び3である。
配列番号24、25及び26は、それぞれ上述した抗体の軽鎖のCDR1、2及び3である。
配列番号27は、重鎖定常領域の一例のアミノ酸配列である。
配列番号28は、重鎖定常領域の一例のアミノ酸配列である。
配列番号29は、軽鎖定常領域の一例のアミノ酸配列である。
配列番号30は、ヒトLrg1のエピトープのアミノ酸配列である。
配列番号31は、ヒトLrg1のアミノ酸配列である。

組換えマウスLrg1への抗体結合のヒストグラムを示す。このデータは、マウスLrg1との交差反応性がヒトLrg1に対して生起されたmAbの中で稀であることを示す。この実験では、mAbを100nMで評価し、大部分がバックグラウンドを超える応答単位（縦軸）を生じなかった。 Matrigelアッセイにおける管形成の阻害を示す。HUVECをMatrigelに播種し、100nM mAbの存在下で一晩培養した。ブロッキングウサギポリクローナル抗体（pAb）もまた40nM及び80nMで評価した。4H2では40％ブロッキングを、15C4では60％ブロッキングを観察した。 マウス中足骨アッセイにおける血管新生の抗体による遮断を示す。棒グラフは、mAb 3A11及び15C4によるブロッキングの定量を示す。PBS正規化対照の画像を含めて代表的な画像を示す。 標的に対する抗体特異性を示す。mAb 3A11、15C4及び4H2を、(1)MDA-MB細胞由来の馴化培地、(2)ヒト硝子体、及び(3)ヒト全血清、のサンプルに対して試験した。 レーザー誘起CNVのラットモデルにおける血管新生の抗体による遮断を示す。棒グラフは、mAb 15C4、4H2及び5F12によるブロッキングの定量を示す。代表的な画像を示す。 血管新生の同時培養モデルにおける血管成長の抗体による遮断を示す。HUVECを14日間にわたりヒト線維芽細胞と同時培養し、その後固定し、PECAMに対する抗体を用いて免疫染色した。アバスチン（Avastin）を陽性対照として含め、全4つのmAbを10、25、50、100及び200nMで試験した。24ウエル培養プレートにおいてn-8つの個々のウエルについてデータを収集した。25nMウエルからの代表的な画像を示す。 抗ヒトLrg1競合ELISAを示す。試験抗体の希釈系列を、組換えヒトLrg1との結合について、固定濃度のビオチニル化マウス15C4に対して競合させた。結合したビオチニル化マウス15C4は、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲート及びTMB基質を用いて検出した。上のグラフは、マウス15C4抗体、一過性発現（TT）キメラ及び対照抗体（VH1/Vk0; VH1-配列番号5、Vk0-配列番号2、及びVH0/Vk1; VH0-配列番号1、Vk1-配列番号15）である。下のグラフは、マウス15C4抗体、安定発現（NS0クローン1F6）及び一過性発現（TT）キメラ抗体、及び無関係のIgG4抗体、陰性対照である。 B16/F0及びLL/2腫瘍におけるLrg1及び血管新生を示す。図8Aの上パネルはB16/F0マウスメラノーマ細胞の画像であり、図8Aの中央パネルは、野生型マウス及びLrg1ノックアウトマウスにおけるB16/F0腫瘍の同時染色CD31（血管）及びDAPI（細胞核）切片の画像である。図8Aの下パネルは、野生型マウス及びLrg1ノックアウトマウスのB16/F0腫瘍における血管の数の棒グラフである。 図8Bの上パネルは、LL/2マウス肺癌細胞の画像であり、図8Bの中央パネルは、野生型マウス及びLrg1ノックアウトマウスにおけるLL/2腫瘍の同時染色CD31（血管）及びDAPI（細胞核）切片の画像である。図8Bの下パネルは、野生型マウス及びLrg1ノックアウトマウスのLL/2腫瘍における血管の数の棒グラフである。 B16/F0及びLL/2腫瘍におけるLrg1及び血管新生を示す。図9の左パネルは、Lrg1ノックアウト（血管サイズ当たりの左側棒）及び野生型（血管サイズ当たりの右側棒）の血管サイズ 対 血管数の棒グラフである。図9の中央パネルは、経時的な腫瘍サイズのプロットであり、野生型が上の線、Lrg1ノックアウトが下の線である。図9の右パネルは、野生型及びLrg1ノックアウトにおける、ホスホヒストンH3の存在により同定される、平方mm当たりの増殖細胞の棒グラフである。 Lrg1の喪失が周皮細胞被覆の増大を生じることを示す。図10の左パネルは、野生型マウス及びLrg1ノックアウトマウスから採取したB16/F0腫瘍における血管構造の再構築である。α-SMAは周皮細胞のマーカーであり、CD31は内皮細胞のマーカーであり、コラーゲンIVは血管のマーカーである。Lrg1画像から、Lrg1ノックアウト腫瘍の血管上では周皮細胞の被覆が増大することが明らかである。図10の棒グラフは、B16/F0及びLL/2腫瘍における周皮細胞の被覆の定量である。 15C4がLrg1ヌル表現型を再現することを示す。図11(A)は、総CD31陽性対象物/mm²である。(B)は、断面充填面積/mm²に従ってプールされた血管サイズである。(C)は、15C4及びIgGで処置されたマウスについてサイズに従ってプールされた血管の割合（％）である。15C4処置腫瘍ではより少ない小血管が観察され、IgG対照と比較して血管サイズの分布に有意差が観察された（Two-Way ANOVA, P<0.0001）。 15C4が腫瘍血管の正常化を駆動し、それゆえLrg1 KO表現型を再現することを示す。野生型（WT）、Lrg1ノックアウト（KO）、又はIgG若しくは15C4で処置された野生型マウスにおいて生じさせたB16F0腫瘍の凍結切片からの血管の免疫染色。切片を、内皮マーカーCD31、又は周皮細胞マーカーαSMA若しくはNG-2に対する抗体を用いて標識した。代表的な画像の最大強度映像を、3チャネルの水平分割で示す。画像は、Zeiss 710共焦点顕微鏡において40x対物で取得した。 内皮及び周皮細胞マーカーの共局在化の定量を示す。C57BL6マウスにおける抗LRG1ブロッキング抗体15C4によるB16F0腫瘍の処置によって、内皮と周皮細胞の共局在化が増大する。内皮はCD31発現により特定し、周皮細胞はαSMA又はNG2発現のいずれかにより特定した。データは、1以上の周皮細胞マーカーと共局在化した総内皮の割合（％）として表す。(A)総周皮細胞共局在化、p=0.04, Mann-Whitney検定；(B)αSMA共局在化、p=0.02, Mann-Whitney検定；(C)NG2共局在化、IgG N=10, 15C4 N=13。 15C4はシスプラチンの細胞傷害活性（腫瘍サイズに対する効果）を高めることを示す。(A)15C4とシスプラチンとの組み合わせで処置したB16/F0腫瘍は、IgG及びシスプラチン対照と比較して腫瘍成長の有意な低減を示した（Two-Way ANOVA, P<0.005）。(B)15C4で処置した腫瘍は、IgG及びビヒクル対照と比較して、同様の成長速度を示した。 15C4はシスプラチンの細胞傷害活性（アポトーシスレベルの増大）を高めることを示す。シスプラチン及びIgG又は15C4で処置した腫瘍を4℃で一晩かけて4％PFA中で浸漬固定し、次いで4℃で一晩30％スクロール中に浸漬した。続いて腫瘍組織を切片調製（40μm）のためにOCT包埋し凍結した。ApopTag in situアポトーシス検出キットを製造業者（Merk Millipore, USA）のプロトコールにしたがって使用してTUNELアッセイを実施した。 15C4はシスプラチンの細胞傷害活性（アポトーシスレベルの増大）を高めることを示す。腫瘍切片において、シスプラチン誘導DNA損傷を示すDNA二本鎖切断マーカーγ-H2AXを染色した。シスプラチンと組み合わせて15C4で処置した腫瘍では、IgG及びシスプラチン対照よりも、γ-H2AXフォーカスを有する核が有意に多く観察された（片側スチューデントT検定, P<0.05）。 15C4がレーザー誘起脈絡膜新血管新生のマウスモデルにおいて病変形成を阻害することを示す。左側の画像は、通常の照明下（Fundus）及び蛍光照明下、網膜色素上皮に3回のレーザ火傷を与えた7日後の典型的な野生型マウス網膜を示す。蛍光画像は、フルオレセインの全身投与の約60秒後（早期FFA）及び再度約7分後（後期FFA）に捕捉した。レーザ照射の時点で、動物に対照IgG（上パネル）又は15C4（下パネル）のいずれかの眼内注射を与えた。早期FFA画像は病変のサイズを示し、後期画像はフルオレセインの網膜への漏出を示す。病変サイズは、2.5、5及び10μg用量での15C4について、2及び4μgでのEyleaについても定量し、ブロッキング％は、対照において観察された平均病変サイズに対する平均病変サイズの尺度である。1番右側には、Eylea及びMagacizumab（いずれも2μgで）を単独及び組み合わせて使用して同様の分析を行った。 レーザー誘起CNVにおけるMagacizumabによる病変形成の用量応答阻害を示す。野生型C57B6マウスを麻酔し、網膜色素上皮のレーザ光凝固の直後に種々の用量のMagacizumab、Eylea又は両方の併用のいずれかの硝子体内投与を行った。7日後（血管病変を形成させる）に、マウスを再度麻酔し、蛍光眼底血管造影（FFA）により調べた。早期FFA画像（90秒後に取得）は、病変部位における血管形成の程度を示す。早期画像における病変面積の測定により、病変サイズの割合（％）をIgG4対照に対して正規化した定量が可能となる。 15C4はD25で回収したJR5558マウス(D14-D24)における病変形成を低減することを示す。15C4又はIgGを50mg/kgでD14から3日毎にIP投与した。D25に眼を回収し、コラーゲンIVでRPE/脈絡膜染色した。病変数を数え、2群についてデータを定量した。 Magacizumabの生化学的性質を示す。上のパネルは、単一ピーク及び凝集物なしを示す分析サイズ排除クロマトグラフィである。SDS-PAGEは、還元（レーン1）及び非還元（レーン2）抗体を示す。下のパネルは、抗hLRG1競合ELISAである。各精製抗体の希釈系列を、組換えhLRG1への結合について、固定濃度のビオチニル化マウス15C4に対して競合させた。結合したビオチニル化マウス15C4は、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ及びTMB基質を用いて検出した。 Magacizumabの脱免疫（De-immunisation）を示す。上のパネルは、試験抗体及び対照抗体のSDS-PAGEゲルを示す。1μgのキメラ(a)、完全ヒト化(b)又は臨床標準対照であるヒト化A33 (c)を、非還元（キメラ及びヒト化試験抗体のみ、レーン1）、及び還元（レーン2）サンプルとして、NuPage 4〜12％Bis-Trisゲル（Invitrogen, Paisley, UK）上で200Vにて35分間泳動させた。ゲルをInstantBlue（Expedeon, Cambridge, UK）で染色し、サイズマーカー（kDa）は、予備染色タンパク質標準Fermentas PageRuler Plus（Thermo Scientific, Loughborough, UK)）とした。下のパネルは、健常ドナーT細胞増殖応答の概要である。EpiScreen^TMの5〜8日の時間経過中の陽性T細胞応答を示す(P)。SI≧2.00で有意な（p<0.05）増殖を誘導するサンプルを陽性とみなした（ボーダーラインの応答* SI≧1.90, p<0.05も示す）。増殖に対する陽性T細胞応答の頻度は、カラムの下にパーセンテージとして示す。 15C4エピトープにおける不変な残基を示す。脊椎動物種にわたるエピトープ保存を示す。重複ペプチドを用いるペプチドマッピングにより、15C4により認識されるヒトLRG1中のLRG1エピトープを決定した。この図は、この配列と、ある範囲の他の種のLRG1アミノ酸配列のオルソログ領域とのアライメントを示す。高度に保存された残基を四角で囲い、ヒトに対するそれぞれの種の配列同一性の程度を右側に示す。この情報は、Magacizumabの必須の前臨床安全性及び毒性試験のために、好適な種の選択について関連している。

発明の詳細な説明
本発明は、Lrg1に結合する抗体に関する。本発明はまた、かかる抗体の用途、例えば治療用途に関する。抗体は、好ましくはLrg1に特異的に結合する、すなわちLrg1に結合するが他の分子には結合しないか低アフィニティで結合する。本発明書で使用する用語Lrg1とは、ヒトLrg1を指す。ヒトLrg1の配列を配列番号31に示す。本発明の抗体は、他の哺乳動物、例えば霊長類又はネズミ由来のLrg1、例えばマウス又はラットLrg1に対してある程度の結合アフィニティを有してもよい。他の種由来のLrg1に対する本発明の抗体の結合アフィニティは、結合エピトープが系統発生距離で保存されないほど、段階的に弱くなる。

本発明の抗体はLrg1の機能を遮断（ブロッキング）する。Lrg1の遮断は、その活性又は機能を低下させることを含んでおり、その結果として内皮細胞増殖、周皮細胞脱落、内皮細胞死、血管リモデリング、血管形成、毛細管拡張症、及び血管漏出などの血管増殖作用が低下するものである。

たとえば、Lrg1の遮断は、そのLrg1とALK1、TGFβRII及び/又はTGFβとの相互作用の遮断を介して行うことができる。Lrg1の遮断は、結果としてTGFβのバイオアベイラビリティも低下させる可能性がある。

遮断には、Lrg1の活性もしくは機能の完全な低下及び部分的な低下がいずれも含まれるが、これは、たとえばALK1-Lrg1、TGFβRII-Lrg1、及び/又はTGFβ-Lrg1相互作用の完全な遮断もしくは部分的な遮断である。たとえば、本発明の遮断性抗体は、Lrg1の活性を10から50％まで、少なくとも50％、又は少なくとも70％、80％、90％、95％もしくは99％、低下させることができる。

Lrg1活性もしくは機能の遮断は、任意の適当な手段で測定することができる。たとえば、ALK1-Lrg1、TGFβRII-Lrg1、及び/又はTGFβ-Lrg1相互作用の遮断は、Smad5リン酸化への影響を測定することによって判定することができるが、これは、Smad5リン酸化がALK5活性化経路ではなくてALK1活性化経路に特有であるという根拠に基づく。

Lrg1の遮断は、血管形成を測定するアッセイ、たとえばMatrigel中での血管増殖、大動脈輪からの血管増殖などのin vitroアッセイ、及び網膜血管形成（たとえば、レーザーによって生じる脈絡膜新血管形成、酸素誘導網膜症）を測定する方法などのin vivoアッセイによって測定することもできる。

遮断は、任意の適当なメカニズムで、たとえばALK1-Lrg1、TGFβRII-Lrg1、及び/又はTGFβ-Lrg1の直接的な相互作用によって生じるといえる。

用語「結合活性」及び「結合アフィニティ」は、抗体分子の、標的と結合する又は結合しない傾向を指すように意図される。結合アフィニティは、抗体及びその標的の解離定数(Kd)を決定することによって定量化され得る。同様に、抗体のその標的との結合の特異性は、抗体及び別の非標的分子に関する解離定数と比較されるような、抗体のその標的に対する競合解離定数(Kd)の点で定義され得る。

通常、標的に関する抗体のKdは、環境中の無関係の材料又は付随する材料などのその他の非標的分子に関するKdよりも2倍、好ましくは、5倍、より好ましくは、10倍小さくなる。より好ましくは、Kdは、50倍小さく、さらにより好ましくは、100倍小さく、なおより好ましくは、200倍小さくなる。

この解離定数の値は、周知の方法によって直接的に決定でき、例えば、Caceciら(Byte 9:340〜362頁、1984年)に示されるものなどの方法によって複雑な混合物についてであっても計算できる。例えば、Kdは、Wong & Lohman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA第90巻、5428〜5432頁、1993年)によって開示されるものなどの二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを使用して確立してもよい。

Lrg1に対する結合アフィニティを評価するための1つの方法は、ELISAによってである。標的に対する抗体などのリガンドの結合能力を評価するためのその他の標準アッセイは、当技術分野で公知であり、例えば、ウエスタンブロット、RIA及びフローサイトメトリー解析が挙げられる。抗体の結合速度論(例えば、結合アフィニティ)はまた、表面プラズモン共鳴などの当技術分野で公知の標準アッセイによって、例えば、Biacore(商標)システム解析によって評価できる。

本発明の抗体のその標的との結合アフィニティは、当業者に公知の方法によって、例えば、表面プラズモン共鳴によって測定できる。表面プラズモン共鳴の1種類として、Biacoreがある。好ましくは、本発明の抗体は、1nM以下のLrg1に対する結合アフィニティを有する。好ましくは、本発明の抗体は、0.5nM以下、0.1nM以下、50pM以下、10pM以下、5pM以下又は2pM以下のLrg1に対する結合アフィニティを有する。

抗体の標的との結合が、別の抗体などの標的の別の公知のリガンドによる標的の結合に対して比較される、競合結合アッセイを実施できる。50％阻害が起こる濃度は、Kiとして知られている。理想的条件下で、Kiは、Kdと同等である。Ki値は、決してKdより小さくならず、そのため、Kiの測定は、好都合なことに、Kdの上限を提供するように置き換えることができる。

本発明の抗体は、Lrg1と特異的に結合する。「特異的に結合する」とは、抗体が、別の標的よりも大きいアフィニティでLrg1と結合することを意味する。本発明の抗体は、好ましくは、別の非標的分子との結合のアフィニティよりも、少なくとも2倍、10倍、50倍、100倍又はそれより大きいアフィニティでその標的と結合可能である。

本発明の抗体は、通常、配列番号1及び2の重鎖及び軽鎖可変領域配列を有する抗体と同一エピトープと結合する。一実施形態では、本発明の抗体は、Lrg1のエピトープGNKLQVLGKDLLLPQ(配列番号30)又はLrg1のGNKLQVLGKDLLLPQ(配列番号30)を含むエピトープと結合する。本明細書において、用語「エピトープ」とは、一般に、抗体などの免疫受容体によって認識される標的抗原上の部位を指す。好ましくは、タンパク質に由来する、又はタンパク質の一部としての短いペプチドである。エピトープは、ペプチドのアミノ酸及び対応するDNA配列の知識から、並びに特定のアミノ酸の性質(例えば、大きさ、電荷など)及びコドン辞書から、過度の実験を伴わずに同定できる。例えば、Ivan Roitt、Essential Immunology、1988年;Janis Kuby、Immunology、1992年、例えば、79〜81頁を参照のこと。

エピトープの位置は、慣用的な方法によって同定してもよい。例えば、エピトープの大まかな位置は、抗体の、種々の断片又は変異体Lrg1ポリペプチド結合する能力を評価することによって決定してもよい。抗体と接触するLrg1内の特定のアミノ酸も、実施例に記載されるものなどの慣用的な方法を使用して決定してもよい。例えば、抗体及び標的分子を組み合わせてもよく、抗体/標的複合体を結晶化してもよい。複合体の結晶構造を決定して、抗体とその標的間の相互作用の特定の部位を同定するために使用してもよい。エピトープは、アミノ酸の連続配列又はアミノ酸の非連続配列であり得る。

本発明の抗体は、本発明の別の抗体と同一エピトープ又は領域と結合し得る。例えば、本発明の抗体が公知である場合には、本発明のその他の抗体は、Lrg1とのその結合を、公知の抗体のものと比較することによって同定され得る。

本発明の抗体は、配列番号1及び2の配列を有する、本明細書に記載される抗体と同一のLrg1中のエピトープと結合する抗体であり得る。本発明の抗体は、重鎖及び/又は軽鎖を含み得る。

本発明の抗体は、本明細書に記載されるようなLrg1との結合について本発明の別の抗体と交差競合する能力を有し得る。例えば、本発明の抗体は、本明細書に記載される抗体のうち1種以上、例えば、配列番号1及び2の配列を有する抗体と、Lrg1との、又は抗体によって結合されるLrg1の適した断片又は変異体との結合について交差競合し得る。好ましくは、本発明の抗体は、抗体15C4と交差競合し得る。このような交差競合抗体は、標準結合アッセイにおいて、本発明の公知の抗体と交差競合するその能力に基づいて同定できる。例えば、BIAcore解析、ELISAアッセイ又はフローサイトメトリーを使用して、交差競合を実証してもよい。このような交差競合は、2種の抗体が同一又は同様のエピトープと結合することを示唆し得る。

したがって、本発明の抗体は、試験抗体が、本発明の公知の抗体と、標的分子上の結合部位について交差競合できるか否かを評価する結合アッセイを含む方法によって同定できる。競合結合アッセイを実施するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、それらは、本発明の公知の抗体及び標的分子を、抗体が標的分子と結合し得る条件下で一緒に接触させることを含み得る。次いで、抗体/標的複合体を、試験抗体と接触させてもよく、試験抗体が、抗体/標的複合体に由来する本発明の抗体と置き換わることができる程度を評価してもよい。代替法は、抗体結合を可能にする条件下で試験抗体を標的分子と接触させること、その標的分子を結合可能である本発明の抗体を添加すること、及び本発明の抗体が、抗体/標的複合体に由来する試験抗体と置き換わることができる程度を評価することを含み得る。

試験抗体の、本発明の抗体の標的との結合を阻害する能力は、試験化合物が、本発明の抗体と、標的との結合について競合できること、従って、試験抗体が、本発明の公知の抗体と同一のLrg1タンパク質上のエピトープ又は領域と結合することを実証する。このような方法で本発明の公知の抗体と交差競合すると同定される試験抗体はまた、本発明の可能性ある抗体である。試験抗体が、本発明の公知の抗体と同一の領域でLrg1と結合でき、本発明の公知の抗体と交差競合できるという事実は、試験抗体が、公知の抗体と同一の結合部位でリガンドとして作用し得ること及び従って、試験抗体が、公知の抗体の作用を模倣し得ることを示唆する。

本発明の公知の抗体は、本明細書に記載されるようなLrg1抗体のうち1種又はLrg1と結合する能力を保持する本明細書に記載されるようなその任意の変異体又は断片などの本明細書に記載されるような抗体であり得る。本発明の抗体は、本明細書に記載されるような抗体のうち1種以上又はLrg1と結合する能力を保持する本明細書に記載されるようなその任意の変異体又は断片と同一のエピトープと結合し得る。

抗体の、標的ではない分子との結合に関して特異的結合を評価してもよい。この比較は、抗体の、標的及び別の分子と結合する能力を比較することによって行ってもよい。この比較は、Kd又はKiの評価において上記のように行ってもよい。このような比較において使用されるその他の分子は、標的分子ではない任意の分子であり得る。好ましくは、その他の分子は、標的分子と同一ではない。好ましくは、標的分子は、標的分子の断片ではない。

本明細書で使用される「抗体」という用語は、全抗体及び任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）又はそれらの一本鎖を含んでいる。抗体は、ジスルフィド結合で相互に連結された、少なくとも2つの重（H）鎖及び2つの軽（カッパ）（L）鎖を含む糖タンパク質、又はその抗原結合部分を指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではVHと略す）及び重鎖定常領域で構成される。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではVLと略す）及び軽鎖定常領域で構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。VH及びVL領域は、さらに、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変性領域に細分化することができ、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる保存性の高い領域が散在している。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、宿主組織もしくは因子、たとえば免疫系のさまざまな細胞（例、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第1成分（C1q）などとの結合を媒介することができる。

本発明の抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体でありうる。一実施形態において、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、種々のB細胞系列に由来する抗体である。ポリクローナル抗体は、特異的な抗原に対して生起された種々の免疫グロブリン分子の混合物を含む。ポリクローナル抗体は、抗原分子内の1以上の異なるエピトープに結合する種々の免疫グロブリン分子の混合物を含む。ポリクローナル抗体は、当該抗原による免疫化といった常法によって作製することができる。例えば、ヒト抗体配列を発現することができるマウスをヒトLrg1で免疫することができる。その後、血液を採取してIg画分を精製することができる。

モノクローナル抗体は、互いに同一な免疫グロブリン分子であり、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及びアフィニティを有する。本発明のモノクローナル抗体（mAb）は、慣用のモノクローナル抗体の手法、たとえば「Monoclonal Antibodies; A manual of techniques」 H Zola (CRC Press, 1988)及び「Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application」 SGR Hurrell (CRC Press, 1982)に開示されている手法などのさまざまな技術によって作製することができる。

抗体の「抗原結合部分」という用語は、抗原（Lrg1など）と特異的に結合する能力を保持する、抗体の1つもしくは複数の断片を意味する。全長抗体の断片が抗体の抗原結合機能を果たすことができることが明らかになっている。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合断片の例には、Fab断片、F(ab')₂ 断片、Fab'断片、Fd断片、Fv断片、dAb断片、及び個別の相補性決定領域(CDR)がある。scFv抗体などの一本鎖抗体、並びにVHH及びラクダ抗体などの重鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれるものとする。こうした抗体断片は、当業者に知られている慣用の技術を用いて得ることができ、断片はインタクトな抗体と同様に、有用性のためにスクリーニングすることができる。

本発明の抗体又は抗体断片は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4領域であるFc領域を含むことが好ましい。本発明の抗体又は抗体断片は、好ましくはIgG1領域であるFc領域を含む。本発明の抗体又は抗体断片は、好ましくはIgG2領域であるFc領域を含む。本発明の抗体又は抗体断片は、好ましくはIgG3領域であるFc領域を含む。本発明の抗体又は抗体断片は、好ましくはIgG4領域であるFc領域を含む。

本発明の抗体は、たとえば標準的なELISAもしくはウェスタンブロッティングによって、標的タンパク質との結合を調べることができる。ELISAアッセイを用いて、標的タンパク質と陽性の反応性を示すハイブリドーマをスクリーニングすることもできる。抗体の結合特異性は、標的タンパク質を発現する細胞に対する抗体の結合を、たとえばフローサイトメトリーでモニターすることによっても決定することができる。

本発明の抗体の、標的タンパク質に対する特異性は、抗体が他の関連タンパク質と結合するか否かを判定することによって、さらに検討することができる。たとえば、Lrg1又はLrg1の特定の部分（例えばエピトープ）に特異的に結合する抗体を作製することが望ましい場合、抗体の特異性は、抗体が、他の分子、又は対象の部分を欠損するLrg1の改変形態とも結合するか否かを決定することにより評価することができる。

適当な抗体が特定され、選択された後、その抗体のアミノ酸配列を、当技術分野で知られている方法によって同定することができる。抗体をコードする遺伝子は縮重プライマーを用いてクローニングすることができる。抗体は常法により組換え技術で作製することができる。

「ポリペプチド」は、2以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体又はその他のペプチドミメティックの化合物を指すように、その最も広い意味で本明細書において使用される。したがって、用語「ポリペプチド」は、短いペプチド配列及びより長いポリペプチド及びタンパク質を含む。本明細書において、用語「アミノ酸」とは、グリシン及びD又はL光学異性体の両方及びアミノ酸類似体及びペプチドミメティックを含む、天然及び/又は非天然又は合成アミノ酸のいずれかを指す。

本発明者らは、実施例に記載されるように抗体を同定した。本発明は、これらの抗体及びこれらの抗体の1種以上の活性を保持するその変異体及び断片を包含する。これらの抗体の活性は、Lrg1と結合する能力を含む。

この抗体の適した断片又は変異体は、Lrg1と結合する能力を保持する。Lrg1と特異的に結合する能力を保持することが好ましいであろう。由来する抗体、例えば、配列番号1及び2の配列を有する抗体と同一のLrg1分子のエピトープ又は領域と特異的に結合する能力を保持することが好ましいであろう。

本発明のポリペプチド又は抗体「断片」は、末端切断によって、例えば、ポリペプチドのN及び/又はC末端からの1個以上のアミノ酸の除去によって作製してもよい。この方法では、N及び/又はC末端から最大10個、最大20個、最大30個、最大40個又はそれ以上のアミノ酸を除去してもよい。断片はまた、1つ以上の内部の欠失によって作製してもよい。

本発明の抗体は、抗体の断片又はその変異体であり得るか、又はそれを含み得る。本発明の抗体は、上記でさらに論じられるように、これらの抗体の抗原結合部分又はその変異体を含み得る。例えば、本発明の抗体は、これらの抗体のうち1種のFab断片又はその変異体であり得、又はこれらの抗体のうち1種に由来する一本鎖抗体又はその変異体であり得る。

本発明の特定の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1及び2に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1及び15に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1及び17に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号1及び19に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5及び2に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5及び15に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5及び17に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号5及び19に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7及び2に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7及び15に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7及び17に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号7及び19に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9及び2に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9及び15に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9及び17に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号9及び19に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号11及び2に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号11及び15に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号11及び17に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号11及び19に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号13及び2に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号13及び15に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号13及び17に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の別の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号13及び19に与えられている。VH鎖のCDRは、配列番号21、22及び23に示されている。VL鎖のCDRは、配列番号24、25及び26に示されている。

本発明の抗体は、配列番号1、5、7、9、11又は13のVHアミノ酸配列又はそのいずれかの断片又は変異体を含み得る。本発明の抗体は、配列番号2、15、17又は19のVLアミノ酸配列又はそのいずれかの断片又は変異体を含み得る。

本発明の抗体は、(a)配列番号1のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号2のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号1のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号15のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号1のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号17のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号1のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号19のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号5のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号2のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号5のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号15のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号5のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号17のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号5のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号19のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号7のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号2のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号7のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号15のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号7のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号17のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号7のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号19のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号9のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号2のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号9のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号15のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号9のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号17のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号9のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号19のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号11のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号2のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号11のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号15のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号11のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号17のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号11のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号19のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号13のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号2のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号13のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号15のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号13のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号17のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

或いは、本発明の抗体は、(a)配列番号13のVHアミノ酸配列又はその断片又は変異体及び(b)配列番号19のVLアミノ酸配列又はその断片又は変異体の両方を含み得る。

本発明の抗体は、上記で示されるVL又はVHアミノ酸配列の一方の断片を含み得る。例えば、本発明の抗体は、前記VL又はVHアミノ酸配列に由来する、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも12個、少なくとも15個、少なくとも18個、少なくとも20個又は少なくとも25個の連続アミノ酸の断片を含み得る。このような断片は、上記で論じられる機能のうち1種以上、例えば、Lrg1と結合する能力を保持することが好ましい。

本発明の抗体は、本明細書において同定される特定の抗体のうちいずれか1種に由来する1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つのCDR配列を含み得る。

一実施形態では、本発明の抗体は、Lrg1と特異的に結合するものであり、配列番号1、5、7、9、11若しくは13のCDR及び/又は配列番号2、15、17若しくは19のCDRを含む。

本発明の抗体は、上記のような特定の抗体のうちいずれか1種のCDR配列のうち1つ以上を含み得る。本発明の抗体は、前記の特定の抗体の1つ以上の重鎖CDR配列、或いは又はさらに、1つ以上の軽鎖CDR配列を含み得る。本発明の抗体は、上記のような特定の抗体の重鎖CDR配列のうち1つ、2つ又は3つすべて、或いは又はさらに、前記の特定の抗体の軽鎖CDR配列のうち1つ、2つ又は3つすべてを含み得る。本発明の抗体は、上記のような特定の抗体の6つのCDR配列すべてを含み得る。例として、本発明の抗体は、配列番号21、22、23、24、25及び26のうち1以上を含み得る。本発明の抗体は、配列番号21、22及び23のうち1つ、2つ若しくは3つすべて、並びに/又は配列番号24、25及び26のうち1つ、2つ若しくは3つすべてを含み得る。本発明の抗体は、配列番号21、22、23、24、25及び26のうち6つすべてを含み得る。

本発明の抗体は、或いは、これらの重鎖若しくは軽鎖可変領域又はCDR配列のうち1種の変異体を含み得る。例えば、変異体は、上記のアミノ酸配列のいずれかの置換、欠失又は付加変異体であり得る。

変異体抗体は、本明細書に記載される抗体の活性を維持しながら、上記で論じられる特定の配列及び断片から、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、最大10、最大20、最大30又はそれ以上のアミノ酸置換及び/又は欠失を含み得る。「欠失」変異体は、例えば、1、2、3、4若しくは5個の個々のアミノ酸の、又は1以上のアミノ酸の小さいグループ、例えば、2、3、4若しくは5個のアミノ酸の欠失を含み得る。「置換」変異体は、好ましくは、1個以上のアミノ酸の、同数のアミノ酸での、保存的アミノ酸置換を作製する置換を含む。例えば、アミノ酸は、同様の特性を有する代替アミノ酸、例えば、別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸又は別の脂肪族アミノ酸で置換され得る。適した置換を選択するために使用できる20種の主なアミノ酸のいくつかの特性は、以下の通りである:

好ましい「誘導体」又は「変異体」として、天然に存在するアミノ酸の代わりに配列中に現れるアミノ酸が、その構造的類似体であるものが挙げられる。配列中に使用されるアミノ酸はまた、抗体の機能が大幅に悪影響を受けない限り、誘導体化又は修飾、例えば、標識され得る。

上記のような誘導体及び変異体は、抗体の合成の間に、又は製造後修飾によって、抗体が、組換え形態である場合には、部位指定突然変異誘発、ランダム突然変異誘発又は酵素的切断及び/又は核酸の連結の公知の技術を使用して調製してもよい。

好ましくは、本発明の変異体抗体は、本明細書において開示される抗体の、VL及び/又はVHドメイン又はその断片に対して60％超又は70％超、例えば、75又は80％、好ましくは、85％超、例えば、90、95％、96％、97％、98％又は99％超のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列である。このレベルのアミノ酸同一性は、関連配列番号配列の全長にわたって、又は配列の一部にわたって、例えば、全長ポリペプチドの大きさに応じて、20個、30個、50個、75個、100個、150個、200個又はそれ以上のアミノ酸にわたって見られ得る。

好ましくは、変異体抗体は、本明細書に記載されるようなCDR配列のうち1つ以上を含む。

アミノ酸配列に関連して、「配列同一性」とは、以下のパラメータを用い、ClustalW(Thompsonら、1994年、前掲)を使用して評価される場合に定められた値を有する配列を指す:
ペアワイズアラインメントパラメータ-方法:正確、マトリックス:PAM、ギャップオープンペナルティー:10.00、ギャップエクテンションペナルティー:0.10;、
マルチプルアラインメントパラメータ-マトリックス:PAM、ギャップオープンペナルティー:10.00、遅延についての同一性％:30、エンドギャップにペナルティーを科す:オン、ギャップ分離距離:0、ネガティブマトリックス:なし、ギャップエクステンションペナルティー:0.20、残基特異的ギャップペナルティー:オン、親水性ギャップペナルティー:オン、親水性残基:G、P、S、N、D、Q、E、K、R。特定の残基での配列同一性は、簡単に誘導体化されている同一残基を含むものとする。

本発明は、従って、これらのVH及びVLドメインの機能又は活性を維持する、特定のVH及びVLアミノ酸配列及びその変異体及び断片を有する抗体を提供する。

したがって、本発明の抗体は、以下を含み得る:
(a)配列番号1、5、7、9、11若しくは13の重鎖可変領域アミノ酸配列、
(b)抗体若しくは断片が、Lrg1と特異的に結合する能力を保持する、(a)の少なくとも7個のアミノ酸の断片、又は
(c)抗体若しくは断片が、Lrg1と特異的に結合する能力を保持する、(a)の配列に対して少なくとも70％のアミノ酸配列同一性を有する(a)の変異体。

本発明の抗体は、以下を含み得る:
(a)配列番号2、15、17若しくは19の軽鎖可変領域アミノ酸配列、
(b)抗体若しくは断片が、Lrg1と特異的に結合する能力を保持する、(a)の少なくとも7個のアミノ酸の断片、又は
(c)抗体若しくは断片が、Lrg1と特異的に結合する能力を保持する、(a)の配列に対して少なくとも70％同一性のアミノ酸同一性を有する(a)の変異体。

上記で説明されるように、本発明の抗体は、本発明の別の抗体と同一のエピトープ又は領域と結合し得る。したがって、このような抗体は、本明細書に記載される特定の抗体、断片及び変異体のいずれかと同一の、Lrg1のエピトープ又は領域と結合し得るということがわかる。

本発明の抗体は、癌の治療において使用できる。本発明の抗体又は断片の高い割合が、前記抗体又は断片の腫瘍部位への局所投与後、長期間、in vivoで腫瘍微小環境内に保持されることが好ましい。すなわち、抗体又は断片が、腫瘍部位から血管系又はリンパ系循環への漏出の低減を示すことが好ましい。好ましくは、腫瘍部位に投与された抗体用量の少なくとも30％が、投与の4時間後に腫瘍部位中に保持される、より好ましくは、用量の少なくとも40％が、投与の4時間後に保持される、最も好ましくは、用量の少なくとも50％が、投与の4時間後に保持される。腫瘍微小環境における抗体保持は、抗体をマウスモデル中の腫瘍中に注入すること及び投与後経時的に抗体の血清レベルを測定することによって研究できる。或いは、抗体の分布は、マウスモデルにおいて腫瘍中に注入された放射標識された抗体を使用して測定できる。

in vivoでの腫瘍微小環境におけるpHは、健常組織のものよりも大幅により酸性である。腫瘍の範囲は、健常組織の7.2〜7.4と比較しておよそpH6.5〜7.2又は6.6〜7.0と報告されている。この酸度は、主に、無秩序な血流が減少した不十分に組織化された脈管構造の結果として短期間又は長期間低酸素に付された腫瘍領域における嫌気的解糖及び好気的解糖(Warburg効果)、酸素の存在下でさえ解糖代謝経路が使用される共通の癌表現型特性によるものである。この酸度を考えると、本発明の抗体は高い等電点を有することが好ましいが、これは、より低い等電点を有する同様の抗体と比較して、腫瘍微小環境における滞留の改善につながるからである。

抗体の等電点は、任意の適した方法によって決定してもよい。例えば、電気泳動的方法によってin vitroで決定してもよい。或いは、等電点は、基本原理から算出してもよい。この場合には、得られた等電点は、通常、理論的等電点と呼ばれる。理論的等電点のコンピュータによる算出のための多数のソフトウェアプログラム、例えば、GP-MAW(Lighthouse Data製のバージョン9.2)が存在する。本発明の抗体は、9.0以上の、好ましくは、9.1以上の、より好ましくは、9.2以上の、最も好ましくは、9.25以上の理論的等電点(pI)を有することが好ましい。

本発明はまた、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに関する。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるような任意の抗体又は断片をコードし得る。用語「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書において同義的に使用され、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのいずれか、又はその類似体の重合体形態を指す。ポリヌクレオチドの限定されない例として、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーRNA(mRNA)、cDNA、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ及びプライマーが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、単離された又は精製された形態で提供され得る。

選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合にin vivoで転写され(DNAの場合には)、ポリペプチドに翻訳される(mRNAの場合には)核酸分子である。コード配列の境界は、5'(アミノ)末端の開始コドン及び3'(カルボキシ)末端の翻訳停止コドンによって決定される。本発明の目的上、このような核酸配列として、それだけには限らないが、ウイルス由来のcDNA、原核生物又は真核生物mRNA、ウイルス又は原核生物DNA又はRNA由来のゲノム配列及びさらに合成DNA配列を挙げることができる。転写終結配列は、コード配列の3'に位置し得る。

一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、上記のようなVH又はVLアミノ酸配列をコードする配列を含む。ポリヌクレオチドは、本明細書において開示されるような特定の抗体のVH又はVL配列をコードし得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1、5、7、9、11若しくは13の配列を含むポリペプチドコードし得る、又は上記のような配列番号2、15、17若しくは19若しくはそのいずれかの変異体若しくは断片の配列を含むポリペプチドをコードし得る。

このようなポリヌクレオチドは、配列番号3、6、8、10、12若しくは14又は配列番号4、16、18若しくは20のいずれか1種の核酸配列からなり得る、又は含み得る。

本発明のポリヌクレオチドは、配列番号3及び4、配列番号3及び16、配列番号3及び18、配列番号3及び20、配列番号6及び4、配列番号6及び16、配列番号6及び18、配列番号6及び20、配列番号8及び4、配列番号8及び16、配列番号8及び18、配列番号8及び20、配列番号10及び4、配列番号10及び16、配列番号10及び18、配列番号10及び20、配列番号12及び4、配列番号12及び16、配列番号12及び18、配列番号12及び20、配列番号14及び4、配列番号14及び16、配列番号14及び18又は配列番号14及び20の配列の両方を含み得る、又はからなり得る。

適したポリヌクレオチド配列は、或いは、これらの特定のポリヌクレオチド配列のうちの1種の変異体であり得る。例えば、変異体は、上記の核酸配列のうちのいずれかの置換、欠失又は付加変異体であり得る。変異体ポリヌクレオチドは、配列表中に示される配列から、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、最大10、最大20、最大30、最大40、最大50、最大75又はそれ以上の核酸置換及び/又は欠失を含み得る。

適した変異体は、本明細書に開示される核酸配列のうちいずれか1種のポリヌクレオチドに対して少なくとも70％相同であり得、好ましくは、それに対して少なくとも80又は90％、より好ましくは、少なくとも95％、97％又は99％相同である。好ましくは、これらのレベルでの相同性及び同一性は、少なくともポリヌクレオチドのコード領域に関して存在する。相同性を測定する方法は、当技術分野で周知であり、当業者ならば、本文脈では、相同性は、核酸同一性に基づいて算出されるということは理解するであろう。このような相同性は、少なくとも15、好ましくは、少なくとも30、例えば、少なくとも40、60、100、200又はそれ以上の連続するヌクレオチドの領域にわたって存在し得る。このような相同性は、非修飾ポリヌクレオチド配列の全長にわたって存在し得る。

ポリヌクレオチド相同性又は同一性を測定する方法は、当技術分野で公知である。例えば、UWGCGパッケージは、相同性を算出するために使用できる(例えば、そのデフォルト設定で使用される)BESTFITプログラムを提供する(Devereuxら(1984年) Nucleic Acids Research 第12巻、387〜395頁)。

例えば、Altschul S.F. (1993年) J Mol Evol 第36巻:290〜300頁;Altschul,S,Fら(1990年) J Mol Biol 第215巻:403〜10頁に記載されるような、PILEUP及びBLASTアルゴリズムも、相同性を算出する、又は配列を並べるために使用できる(通常、そのデフォルト設定で)。

BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、National Centre for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を介して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、第1に、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインした場合に、いくつかの正値閾値スコアTに対応する又はそれを満たす、クエリー配列中の長さWの短いワードを同定することによって、ハイスコア配列対(high scoring sequence pair)(HSP)を同定することを含む。Tは、隣接ワードスコア閾値(Altschulら、前掲)と呼ばれる。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含有するHSPを見い出すための検索を開始するためのシードとして作用する。累積アラインメントスコアが増大され得る限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長する。1以上の負スコア残基アラインメントの累積のために、累積アラインメントスコアがゼロ以下になる場合、又はいずれかの配列の末端に到達する場合には、各方向のワードヒットの伸長を停止する。BLASTアルゴリズムパラメータW、T及びXは、アラインメントの感受性及び速度を決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして、11のワード長(W)、50のBLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoff及びHenikoff (1992年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第89巻:10915〜10919頁を参照のこと)アラインメント(B)、10の期待値(E)、M=5、N=4及び両鎖の比較を使用する。

BLASTアルゴリズムは、2種の配列間の類似性の統計分析を実施する;例えば、Karlin及びAltschul (1993年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第90巻:5873〜5787頁を参照のこと。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は、最小和確率(smallest sum probability)(P(N))であり、これは、2種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、配列は、第2の配列に対する第1の配列の比較における最小和確率別が、約1未満、好ましくは、約0.1未満、より好ましくは、約0.01未満、最も好ましくは、約0.001未満の配列に対して同様と考えられる。

相同体は、関連ポリヌクレオチド中の配列と、3未満、5、10、15、20又はそれ以上の突然変異(各々は、置換、欠失又は挿入であり得る)で異なり得る。これらの突然変異は、相同体の少なくとも30、例えば、少なくとも40、60又は100又はそれ以上の連続ヌクレオチドの領域にわたって測定され得る。

一実施形態では、変異体配列は、遺伝暗号の縮重によって、配列リスト中に与えられる特定の配列から変わり得る。DNAコードは、4種の主な核酸残基(A、T、C及びG)を有し、これらを使用して、生物の遺伝子中にコードされるタンパク質におけるアミノ酸を表す3文字コドンを「綴る」。DNA分子に沿ったコドンの直鎖配列は、それらの遺伝子によってコードされるタンパク質(複数可)中のアミノ酸の直鎖配列に翻訳される。コードは、高度に縮重しており、20種の天然アミノ酸をコードする61種のコドン及び「停止」シグナルを表す3種のコドンがある。したがって、ほとんどのアミノ酸は、2種以上のコドンによってコードされる-実際、いくつかは、4種以上の異なるコドンによってコードされる。したがって、本発明の変異体ポリヌクレオチドは、本発明の別のポリヌクレオチドと同一ポリペプチド配列をコードし得るが、同一アミノ酸をコードする異なるコドンの使用のために異なる核酸配列を有し得る。

本発明のポリヌクレオチド「断片」は、末端切断によって、例えば、ポリヌクレオチドの一方又は両方の末端からの1つ以上のヌクレオチドの除去によって作製してもよい。この方法で、最大10、最大20、最大30、最大40、最大50、最大75、最大100、最大200個又はそれ以上のアミノ酸が、ポリヌクレオチドの3'及び/又は5'末端から除去され得る。断片はまた、1以上の内部欠失によって作製してもよい。このような断片は、本明細書に記載されるような配列に由来し得る、又は本明細書に記載されるような変異体ポリヌクレオチドに由来し得る。好ましくは、このような断片は、30から300個の間の残基長、例えば、30〜300、30〜200、30〜100、100〜200又は200〜300個の残基である。或いは、本発明の断片は、例えば、本発明の全長ポリヌクレオチドの少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％又は少なくとも90％を含むより長い配列であり得る。

したがって、本発明の抗体は、それをコードする、それを発現可能であるポリヌクレオチドから製造してもよく、又はポリヌクレオチドの形態で送達してもよい。抗体が2以上の鎖を含む場合には、本発明のポリヌクレオチドは、1以上の抗体鎖をコードし得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、抗体軽鎖、抗体重鎖又は両方をコードし得る。一方が抗体軽鎖をコードし、もう一方が、対応する抗体重鎖をコードする2種のポリヌクレオチドを提供してもよい。このようなポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの対を一緒に発現させてもよく、その結果、本発明の抗体が作製される。

本発明のポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の方法に従って、例として、Sambrookら(1989年、Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)に記載されるように合成できる。

本発明の核酸分子を、挿入された配列と機能可能に連結され、従って、in vivoで本発明の抗体の発現を可能にする制御配列を含む発現カセットの形態で提供してもよい。これらの発現カセットは、順に、通常、ベクター(例えば、プラスミド又は組換えウイルスベクター)内に提供される。このような発現カセットを、宿主対象に直接的に投与してもよい。或いは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを、宿主対象に投与してもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドを、遺伝子ベクターを使用して調製及び/又は投与する。適したベクターは、十分な量の遺伝情報を保持し、本発明のポリペプチドの発現を可能にすることが可能である任意のベクターであり得る。

したがって、本発明は、このようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。このような発現ベクターは、分子生物学の技術分野で慣用的に構築され、例えば、プラスミドDNA及び適当なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー及び本発明のペプチドの発現を可能にするために必要であり得、正しい配向に配置されているその他のエレメント、例えば、ポリアデニル化シグナルなどの使用を含み得る。その他の適したベクターは、当業者に明らかであろう。これに関してさらなる例として、本発明者らは、Sambrookらに言及する。

本発明はまた、本発明の抗体を発現するように改変された細胞を含む。このような細胞として、一過性の、又は好ましくは、安定な、高等真核細胞株、例えば、哺乳動物細胞又は昆虫細胞、下等真核細胞、例えば、酵母又は原核細胞、例えば、細菌細胞が挙げられる。本発明の抗体をコードするベクター又は発現カセットの挿入によって改変され得る細胞の特定の例として、哺乳動物HEK293T、CHO、HeLa、NS0及びCOS細胞が挙げられる。好ましくは、選択される細胞株は、安定であるだけでなく、成熟グリコシル化も可能にするものとなる。

本発明のこのような細胞株を、本発明の抗体を製造する慣用的な方法を使用して培養してもよく、又は本発明の抗体を対象に送達するために治療的若しくは予防的に使用してもよい。或いは、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを、ex vivoで対象から得た細胞に投与し、次いで、細胞を対象の身体中に戻してもよい。

別の態様では、本発明は、本発明の分子、例えば、本明細書に記載される抗体、ポリヌクレオチド、ベクター及び細胞を含む組成物及び製剤を提供する。例えば、本発明は、1種以上の本発明の分子を含む医薬組成物、例えば、医薬上許容される担体と一緒に製剤化された1種以上の本発明の抗体を提供する。

本明細書において、「医薬上許容される担体」は、生理学的に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、非経口、例えば、静脈内、眼球内、筋肉内又は皮下投与(例えば、注射又は注入による)に適している。

通常、注射による、本発明の抗体の直接網膜、網膜下又は硝子体内送達は、好ましいものであり得る。網膜、網膜下空間又は硝子体内空間への送達が好ましいものであり得る。

投与経路に応じて、抗体を酸の作用及び抗体を不活性化又は変性し得るその他の天然条件から保護する材料で抗体をコーティングしてもよい。

好ましい医薬上許容される担体は、水性担体又は希釈剤を含む。本発明の医薬組成物に使用してもよい適した水性担体の例として、水、緩衝水及び生理食塩水が挙げられる。その他の担体の例として、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)及びそれらの適した混合物、植物油、例えば、オリーブオイル及び注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持できる。多数の場合には、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール又は塩化ナトリウムなどのポリアルコールを含むことが好ましい。

本発明の医薬組成物はまた、医薬上許容される抗酸化物質を含み得る。これらの組成物はまた、保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の存在の防止は、滅菌手順、前掲によって、並びに種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることの両方によって確実にしてもよい。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物中に含めることが望ましい場合もある。さらに、注射用医薬形態の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延する薬剤を含めることによって引き起こされ得る。

治療用組成物は、通常、製造及び貯蔵条件下で無菌で安定でなくてはならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム又は高い薬物濃度に適したその他の秩序構造として製剤化できる。

滅菌注射用溶液は、必要な量の活性薬剤(例えば、抗体)を、必要に応じて、上記で列挙された成分のうち1種又は組合せとともに適当な溶媒中に組み込むこと、続いて、滅菌微量濾過することによって調製できる。一般に、分散液は、活性薬剤を、基礎分散媒及び上記で列挙されたものから必要なその他の成分を含有する滅菌媒体中に組み込むことによって調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌散剤の場合には、好ましい調製方法は、その先に滅菌濾過された溶液から活性薬剤及び任意のさらなる所望の成分の散剤が得られる、真空乾燥及び凍結乾燥(freeze-drying)(凍結乾燥(lyophilization))である。

本発明の医薬組成物は、さらなる有効成分並びに本発明の抗体を含み得る。上記のように、本発明の組成物は、1種以上の本発明の抗体を含み得る。それらはまた、さらなる治療薬又は予防薬を含み得る。

また、本発明の範囲内に、本発明の抗体又はその他の組成物及び使用のための説明書を含むキットがある。キットは、1種以上のさらなる試薬、例えば、上記で論じられたようなさらなる治療薬又は予防薬をさらに含有し得る。

本発明に係る抗体は、治療において使用してもよい。治療的適用では、抗体又は組成物を、障害又は状態をすでに患っている対象に、状態又は1種以上のその症状を治癒、軽減又は部分的に停止するのに十分な量で投与する。このような治療的処置は、疾患症状の重症度の低下又は症状のない期間の頻度又は持続時間の増大をもたらし得る。これを達成するのに適当な量は、「治療上有効な量」と定義される。所与の目的のための有効量は、疾患又は傷害の重症度並びに対象の体重及び全身状態に応じて変わる。本明細書において、用語「対象」は、任意のヒトを含む。

原理上、Lrg-1媒介性血管増殖が起こる任意の状態を、本発明に従って治療、予防又は寛解させうる。「血管増殖」、「血管増殖性」、「血管増殖性状態」及び同様の用語は、本明細書において、血管又は血管組織又は細胞の異常な又は望まれない発達と関連するありとあらゆる病理を包含する。例えば、病原性血管新生(例えば、既存の血管からの新規毛細血管成長による新規血管の形成)及び血管奇形(例えば、毛細血管拡張、拡張された蛇行状の無能力の血管の形成、微小動脈瘤)の両方を、防止又は低減でき、新血管新生及び血管内皮細胞増殖も防止又は低減できる。また、当技術分野で公知であるように、新生物成長には、成長中の腫瘍への血液供給を提供するために新規血管の形成が必要である。したがって、Lrg1媒介性血管増殖が起こる腫瘍はまた、本発明にしたがって治療、予防又は寛解され得る状態である。

正常な、例えば、発生的な血管新生、特に、網膜における発生的な血管新生に対して効果がないか、又は最小の効果しかないことが好ましい。

眼部血管増殖性状態の治療は、好ましい実施形態である。治療できる状態の中に、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、未熟児網膜症、黄斑性毛細血管拡張症、加齢性黄斑変性症又は脈絡膜新血管新生がある。したがって、一実施形態では、本発明は、血管増殖性状態の治療において使用するための本発明の抗体又はその断片を提供する。本発明はまた、本発明の抗体又はその断片を個体に含む、血管増殖性状態を治療する方法を提供する。本発明はまた、血管増殖性状態の治療のための医薬の製造において使用するための本発明の抗体又はその断片を提供する。

腫瘍、通常、固形腫瘍の治療も達成できる。したがって、一実施形態では、本発明は、癌の治療において使用するための本発明の抗体又はその断片を提供する。本発明はまた、本発明の抗体又はその断片を個体に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。本発明はまた、癌の治療のための医薬の製造において使用するための本発明の抗体又はその断片を提供する。

癌は、固形腫瘍を示す癌であり得る。癌は、脳、乳房、腎臓、結腸直腸、肺、前立腺、頭頸部、胃、膵臓、皮膚、子宮頸部、骨、卵巣、精巣又は肝臓癌であり得る。

特定の実施形態では、本発明の抗体を、(直接的又は間接的に)別の部分に連結してもよい。その他の部分は、細胞傷害性部分又は薬物などの治療薬であり得る。その他の部分は、検出可能な標識であり得る。その他の部分は、結合部分、例えば、腫瘍特異的抗体又は標的がヒトLrg1ではない治療標的、好ましくは、癌と関連している治療標的に特異的なポリペプチド結合ドメインであり得る。得られた二重特異的分子は、癌の治療において使用するためのものであり得る。

したがって、例として、本発明の抗体又はその抗原結合断片を、ヒトVEGFに特異的なポリペプチド結合ドメインと(直接的又は間接的に)連結してもよい。

本発明の抗体は、二重特異性抗体であり得る。本発明の抗体は、ヒトLrg1及びヒトVEGFと結合する二重特異性抗体であり得る。本発明の抗体は、ヒトLrg1及びヒトPDGFと結合する二重特異性抗体であり得る。本発明の抗体は、ヒトLrg1及びヒト抗補体因子D Fabと結合する二重特異性抗体であり得る。本発明の抗体は、ヒトLrg1及びヒトPDGFRと結合する二重特異性抗体であり得る。本発明の抗体は、ヒトLrg1及びヒトTie2チロシンキナーゼ阻害剤と結合する二重特異性抗体であり得る。

治療薬又は検出可能な標識を、例えば、化学的コンジュゲーションによって本発明の抗体と直接結合してもよい。薬剤又は標識を、抗体にコンジュゲートする方法は、当技術分野で公知である。例えば、カルボジイミドコンジュゲーション(Bauminger & Wilchek (1980) Methods Enzymol.第70巻、151〜159頁)を使用して、ドキソルビシンを含む種々の薬剤を、抗体又はペプチドとコンジュゲートしてもよい。水溶性カルボジイミド、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)は、さらなる部分を結合部分とコンジュゲートするのに特に有用である。

部分を、抗体とコンジュゲートするためのその他の方法も使用できる。例えば、適当な反応物の過ヨウ素酸ナトリウム酸化と、それに続く、還元的アルキル化を使用でき、グルタルアルデヒド架橋も使用できる。しかし、本発明のコンジュゲートを製造するどの方法が選択されるかにかかわらず、抗体がその標的化能力を維持し、機能的部分がその関連機能を維持する決定がなされなければならないことは認識される。

細胞傷害性部分は、直接的及び/又は間接的に細胞傷害性であり得る。「直接的に細胞傷害性」とは、部分が、それだけで細胞傷害性であるものであることを意味する。「間接的に細胞傷害性」とは、部分が、自身は細胞傷害性ではないが、例えば、さらなる分子に対するその作用によって、又はそれに対するさらなる作用によって細胞傷害性を誘導できるものであることを意味する。細胞傷害性部分は、細胞内にある場合にのみ細胞傷害性であり得、細胞外にある場合には細胞傷害性ではないことが好ましい。

好ましくは、本発明は、抗体又はその抗原結合断片又は変異体、融合物又は誘導体を提供し、ここで、細胞傷害性部分は、直接的に細胞傷害性の化学療法薬である。任意選択で、細胞傷害性部分は、直接的に細胞傷害性のポリペプチドである。細胞傷害性化学療法薬は、当技術分野で周知である。

細胞傷害性薬剤はまた、本発明の抗体と別個に投与してもよい。

細胞傷害性化学療法薬、例えば、抗癌剤として、ナイトロジェンマスタード、例えば、メクロレタミン(HN2)、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン(L-サルコリシン)及びクロラムブシルを含むアルキル化剤;エチレンイミン及びメチルメラミン、例えば、ヘキサメチルメラミン、チオテパ;アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン;ニトロソウレア、例えば、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、セムスチン(メチル-CCNU)及びストレプトゾシン(ストレプトゾトシン);及びトリアゼン、例えば、デカルバジン(decarbazine)(DTIC;ジメチルトリアゼノイミダゾール-カルボキサミド);葉酸類似体、例えば、メトトレキサート(アメトプテリン)を含む代謝拮抗剤;ピリミジン類似体、例えば、フルオロウラシル(5-フルオロウラシル;5-FU)、フロクスウリジン(フルオロデオキシウリジン;FUdR)及びシタラビン(シトシンアラビノシド);並びにプリン類似体及び関連阻害剤、例えば、メルカプトプリン(6-メルカプトプリン;6-MP)、チオグアニン(6-チオグアニン;TG)及びペントスタチン(2'-デオキシコホルマイシン)が挙げられる。ビンカアルカロイド、例えば、ビンブラスチン(VLB)及びビンクリスチンを含む天然物;エピポドフィロトキシン、例えば、エトポシド及びテニポシド;抗生物質、例えば、ダクチノマイシン(アクチノマイシンD)、ダウノルビシン(ダウノマイシン;ルビドマイシン(rubidomycin))、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン(ミトラマイシン)及びマイトマイシン(マイトマイシンC);酵素、例えば、L-アスパラギナーゼ;並びに生物反応修飾物質、例えば、インターフェロンアルフェノム(alphenomes)。白金配位複合体、例えば、シスプラチン(シス-DDP)及びカルボプラチンを含む種々の薬剤;アントラセンジオン、例えば、ミトキサントロン及びアントラサイクリン;置換尿素、例えば、ヒドロキシ尿素;メチルヒドラジン誘導体、例えば、プロカルバジン(N-メチルヒドラジン、MIH);並びに副腎皮質抑制剤、例えば、ミトタン(o,p'-DDD)及びアミノグルテチミド;タキソール及び類似体/誘導体;並びにホルモンアゴニスト/アンタゴニスト、例えば、フルタミド及びタモキシフェン。

本発明の一実施形態では、細胞傷害性部分は、細胞死につながる細胞傷害性ペプチド又はポリペプチド部分である。細胞傷害性ペプチド及びポリペプチド部分は、当技術分野で周知であり、例えば、リシン、アブリン、シュードモナス外毒素、組織因子などが挙げられる。それらを、抗体などの標的化部分と連結するための方法もまた当技術分野で公知である。その他のリボソーム不活性化タンパク質は、WO96/06641において細胞傷害性薬剤として記載されている。シュードモナス外毒素はまた、細胞傷害性ポリペプチドとして使用してもよい。特定のサイトカイン、例えば、TNFα及びIL-2も、細胞傷害性薬剤として有用である。

特定の放射活性原子も、十分な用量で送達される場合には、細胞傷害性であり得る。したがって、細胞傷害性部分は、使用において十分な量の放射能を、細胞傷害性であるように標的部位に送達する放射活性原子を含み得る。適した放射活性原子として、リン-32、ヨウ素-125、ヨウ素-131、インジウム-111、レニウム-186、レニウム-188又はイットリウム-90又は隣接する細胞、オルガネラ又は核酸を破壊するのに十分なエネルギーを発する任意のその他の同位元素が挙げられる。好ましくは、本発明の薬剤中の同位元素及び放射活性原子の密度は、4000cGyを超える(好ましくは、少なくとも6000、8000又は10000cGy)の用量が、標的部位に、好ましくは、標的部位の細胞及びそのオルガネラ、特に核に送達されるようなものである。

放射活性原子は、公知の方法で、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合物又は誘導体と結合してもよい。例えば、EDTA又は別のキレート化剤を、結合部分と結合してもよく、111In又は90Yを結合するために使用してもよい。チロシン残基を、125I又は131Iを用いて直接的に標識してもよい。

細胞傷害性部分は、適した間接的に細胞傷害性のポリペプチドであり得る。特に好ましい実施形態では、間接的に細胞傷害性のポリペプチドは、酵素活性を有し、非毒性及び/又は相対的に非毒性のプロドラッグを、細胞傷害性薬物に変換できるポリペプチドである。抗体を用いる場合、この種の系は、ADEPT(抗体指向性酵素プロドラッグ療法)と呼ばれることが多い。この系は、抗体が、酵素部分を患者の身体中の所望の部位に位置づけることを必要とし、酵素が、その部位に局在化する時間を見越し、酵素の基質であるプロドラッグを投与した後、触媒作用の最終産物が、細胞傷害性化合物である。このアプローチの目的は、所望の部位での薬物の濃度を最大化すること及び正常組織における薬物の濃度を最小化することである。好ましい実施形態では、細胞傷害性部分は、非細胞傷害性プロドラッグを、細胞傷害性薬物に変換可能である。

本明細書に記載されるような標的化された酵素を使用する系の酵素及びプロドラッグは、これまでに提案されたもののいずれかであり得る。細胞傷害性物質は、任意の既存の抗癌剤、例えば、アルキル化剤;DNA中に介入する薬剤;任意の需要な酵素、例えば、ジヒドロホレートレダクターゼ、チミジンシンセターゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、ヌクレオシドキナーゼ又はトポイソメラーゼを阻害する薬剤;又は任意のその他の細胞成分と相互作用することによって細胞死を達成する薬剤であり得る。エトポシドは、トポイソメラーゼ阻害剤の一例である。

報告されたプロドラッグ系として、以下の表2に列挙されるものが挙げられる。

酵素部分の一部を形成するのに適した酵素として:エキソペプチダーゼ、例えば、カルボキシペプチダーゼG、G1及びG2(グルタミル化マスタードプロドラッグのための)、カルボキシペプチダーゼA及びB(MTXベースのプロドラッグのための)及びアミノペプチダーゼ(2-α-アミノシルMTCプロドラッグのための);エンドペプチダーゼ、例えば、トロンボリシン(thrombolysin)(トロンビンプロドラッグのための)など;ヒドロラーゼ、例えば、ホスファターゼ(例えば、アルカリホスファターゼ)又はスルファターゼ(例えば、アリールスルファターゼ)(リン酸化又は硫酸化プロドラッグのための);アミダーゼ、例えば、ペニシリンアミダーゼ及びアリールアシルアミダーゼ;ラクタマーゼ、例えば、β-ラクタマーゼ;グリコシダーゼ、例えば、β-グルクロニダーゼ(β-グルクロノミドアントラサイクリンのための)、α-ガラクトシダーゼ(アミグダリンのための)及びβ-ガラクトシダーゼ(β-ガラクトースアントラサイクリンのための);デアミナーゼ、例えば、シトシンデアミナーゼ(5FCのための);キナーゼ、例えば、ウロキナーゼ及びチミジンキナーゼ(ガンシクロビルのための);レダクターゼ、例えば、ニトロレダクターゼ(CB1954及び類似体のための)、アゾレダクターゼ(アゾベンゼンマスタードのための)及びDT-ジアホラーゼ(CB1954のための);オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ(グルコースのための)、キサンチンオキシダーゼ(キサンチンのための)及びラクトペルオキシダーゼ;DL-ラセマーゼ、触媒抗体及びシクロデキストリンが挙げられる。

好ましくは、プロドラッグは、細胞傷害性薬物と比較して相対的に非毒性である。通常、適したin vitro細胞毒性試験において測定されるような、毒性の10％未満、好ましくは、毒性の1％未満を有する。

プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換できる部分は、本発明の薬剤の残部からの単離において活性となるが、(a)本発明の薬剤の残部と組み合わされ、(b)本発明の薬剤が標的細胞に結合される、標的細胞に隣接している又は標的細胞中に内部移行される場合に、それのみが活性であることが必要であるということがあり得る。

各部分がポリペプチドである場合には、ポリペプチドを架橋する従来法のいずれによって2つの部分を一緒に連結してもよい。例えば、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合物又は誘導体を、チオール基及びそれらのチオール基と反応可能である二官能性薬剤と反応されるさらなる部分、例えば、ヨード酢酸のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHIA)又はN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)を用いて濃縮してもよい。アミド及び例えば、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて達成されるチオエーテル結合は、一般に、ジスルフィド結合よりもin vivoでより安定である。

或いは、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合物又は誘導体を、組換えDNA技術によって、DNAの長さが、互いに隣接している、又は薬剤の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離されている、本発明の薬剤の2つの部分をコードするそれぞれの領域を含む、融合化合物として製造してもよい。おそらく、薬剤の2つの部分は、全体的に又は部分的に重複し得る。

細胞傷害性部分は、放射線増感剤であり得る。放射線増感剤として、フルオロピリミジン、チミジン類似体、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、フルダラビン、ニコチンアミド、ハロゲン化ピリミジン、3-アミノベンズアミド、3-アミノベンゾジアミド、エタニクサドール(etanixadole)、ピモニダゾール及びミソニダゾールが挙げられる。また、細胞への遺伝子の送達、例えば、p53遺伝子又はサイクリンDの送達は、それらを放射線増感し得る。さらなる部分は、照射の際に、細胞傷害性になるもの又は細胞傷害性部分を放出するものであり得る。例えば、ホウ素-10同位元素は、適宜照射されると、細胞傷害性であるα粒子を放出する。同様に、細胞傷害性部分は、フォトフリンなどの光線力学的治療において有用であるものであり得る。

細胞傷害性薬剤は、パクリタキセルなどの細胞骨格薬物であり得る。

さらなる部分は、直接的又は間接的に細胞傷害性である核酸分子を含み得る。例えば、核酸分子は、標的部位に局在化すると、細胞中に入ることができ、細胞死につながるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。したがって、オリゴヌクレオチドは、必須遺伝子の発現を妨げるもの又はアポトーシスを引き起こす遺伝子発現の変化につながるものであり得る。或いは、細胞傷害性部分は、直接的及び/又は間接的に細胞傷害性のポリペプチドをコードする核酸分子である。適したオリゴヌクレオチドの例として、bcl-2、DNAポリメラーゼα及びトポイソメラーゼIIαに向けられるものが挙げられる。ペプチド核酸は、従来の核酸の代わりに有用であり得る。

標的に核酸を送達するために、抗体、その抗原結合断片、変異体、融合物又は誘導体を、送達媒体中に含めてもよい。送達媒体は、任意の適した送達媒体であり得る。例えば、核酸を含有するリポソームであり得る、又は核酸を送達できるウイルス若しくはウイルス様粒子であり得る。これらの場合には、送達されるべき分子は、通常、送達媒体の表面上に存在する。例えば、抗体又は断片は、リポソームの外表面に存在し得、送達されるべき核酸は、リポソームの内部中に存在し得る。別の例として、レトロウイルス又はアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターが、結合部分が、ウイルス粒子の表面に結合されるか、又は位置づけられ、したがって、ウイルス粒子が所望の部位にターゲッティングされることを可能にするように遺伝子操作される。免疫リポソーム(抗体指向性リポソーム)を使用してもよい。免疫リポソームを調製するための一方法では、MPB-PE(N-[4-(p-マレイミドフェニル)-ブチリル]-ホスファチジルエタノール-アミン)が、Martin & Papahadjopoulos (1982) J. Biol. Chem.第257巻、286〜288頁の方法に従って合成される。MPB-PEは、リポソーム二重層中に組み込まれて、抗体又はその断片のリポソーム表面との共有カップリングを可能にする。リポソームは、例えば、DNA又はその他の遺伝子構築物の溶液中で前記リポソームを形成し、続いて、最大0.8MPaの窒素圧下で0.6μm及び0.2μmの孔の大きさを有するポリカーボネートメンブレンフィルターを通して逐次押し出すことによって、標的細胞への送達のためにDNA又はその他の遺伝子構築物がロードされることが好都合である。押し出し後に、80000×gで45分間超遠心分離することによって、封入されたDNA構築物を、遊離DNA構築物から分離する。脱酸素化されたバッファー中で新たに調製されたMPB-PE-リポソームを、新たに調製された抗体(又はその断片)と混合し、窒素雰囲気中、4℃で、一定のエンドオーバーエンド回転下で一晩カップリング反応を実施する。80000×gで45分間超遠心分離することによって、免疫リポソームを、コンジュゲートされていない抗体と分離する。免疫リポソームを、腹膜内に、又は腫瘍中に直接注入してもよい。

標的部位に送達される核酸は、細胞毒性に直接的に又は間接的につながる任意の適したDNAであり得る。例えば、核酸は、細胞に対して細胞傷害性であるリボザイムをコードし得る、又は実質的に非毒性プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換できる酵素をコードし得る(この後者の系は、GDEPT:遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法と呼ばれることもある)。適したリボザイムとして、ポリメラーゼ、デホスホリラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼが挙げられる。リボザイムの適した標的として、c-fos及びc-myc及びbcl-2などの転写因子が挙げられる。上記のADEPT系についての酵素及びプロドラッグの選択に関する同様の考慮は、GDEPT系に当てはまる。標的部位に送達される核酸は、直接的に細胞傷害性のポリペプチドをコードし得る。

抗体に連結される治療薬は、ポリペプチド又は直接的又は間接的に細胞傷害性ではないが、治療上有益であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。このようなポリペプチドの例として、抗増殖性又は抗炎症性サイトカイン及び抗増殖性、免疫調節性又は例えば、癌の治療において医薬において有益であり得る血液凝固に影響を与える因子が挙げられる。薬剤は、役立つように、ペプチドアンギオスタチン又はエンドスタチンなどの血管新生の阻害剤であり得る。薬剤はまた、役立つように、前駆体ポリペプチドをアンギオスタチン又はエンドスタチンに変換する酵素であり得る。マクロファージエラスターゼ、ゼラチナーゼ及びストロモライシン(stromolysin)などのヒトマトリックスメタロプロテアーゼは、プラスミノゲンをアンギオスタチンに変換する。プラスミノゲンは、アンギオスタチンの前駆体である。

抗体を、検出可能な標識に連結してもよい。「検出可能な標識」とは、抗体が、患者への抗体の投与後に標的部位に位置付けられる場合に、通常、身体及び位置づけられる標的の部位の外側から非侵襲的に検出され得る部分に連結されることを意味する。したがって、抗体は、イメージング及び診断において有用であり得る。

通常、標識は、イメージングにおいて有用である放射活性原子である、又はそれを含む。適した放射活性原子として、シンチグラフィー研究のための99mTc及び123Iが挙げられる。その他の標識として、例えば、再度123I、131I、111In、19F、13C、15N、17O、ガドリニウム、マンガン又は鉄などの磁気共鳴画像法(MRI)のためのスピン標識が挙げられる。分子が容易に検出可能であるために、十分な量の適当な原子同位元素が抗体に連結されなくてはならないことは明らかである。

放射標識又はその他の標識を、公知の方法で組み込むことができる。例えば、抗体又はその断片を生合成してもよく、又は例えば、水素の代わりにフッ素-19を含む、適したアミノ酸前駆体を使用して化学的アミノ酸合成によって合成してもよい。99mTc、123I、186Rh、188Rh及び111Inなどの標識は、例えば、ポリペプチド中のシステイン残基を介して結合できる。イットリウム-90は、リジン残基を介して結合できる。好ましくは、検出可能な標識は、例えば、テクネチウム-99m又はヨウ素-123などの放射活性原子を含む。

或いは、検出可能な標識は、ヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン、鉄を含む群から選択してもよい。

一実施形態では、本発明の抗体は、直接的又は間接的に細胞傷害性の部分と、又は検出可能な標識と選択的に結合できる。したがって、この実施形態では、抗体を、細胞傷害性であるか、又は容易に検出可能であるさらなる化合物又は成分と選択的に結合する部分と連結する。

本発明の抗体若しくは断片又は前記抗体若しくは断片を含む組成物を、当技術分野で公知の種々の方法のうち1種以上を使用して、1種以上の投与経路によって投与することができる。当業者には明らかであろうが、投与経路及び/又は投与方法は、所望の結果に応じて変わる。本発明の抗体又は組成物の好ましい投与経路として、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄又は例えば、注射若しくは注入によるその他の非経口投与経路が挙げられる。本明細書において、語句「非経口投与」とは、経腸以外の投与方法及び通常、注射による局所投与を意味する。或いは、本発明の抗体又は組成物を、局所、上皮又は粘膜投与経路などの非経口経路によって投与できる。腫瘍周囲の、腫瘍近傍の(juxtatumoral)、腫瘍内、病巣内、病巣周囲の、腔内注入、膀胱内投与及び吸入を含む局所投与もまた、好ましい。

1つの好ましい実施形態では、抗体を、直接網膜、網膜下又は硝子体内送達によって投与する。通常、この投与は、注射によってである。

本発明の抗体の適した投与量は、熟練した医師によって決定されうる。本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性ではない、個々の患者、組成物及び投与方法についての所望の治療的応答を達成するのに有効である有効成分の量を得るために変更してもよい。選択される投与量レベルは、使用される特定の抗体の活性、投与経路、投与時間、抗体の排出速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用されるその他の薬物、化合物及び/又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康及び以前の病歴及び医術において周知の同様の因子を含む種々の薬物動態因子に応じて変わる。

本発明の抗体の適した用量は、例えば、約0.1μg/治療されるべき患者の体重1kg〜約100mg/治療されるべき患者の体重1kgの範囲であり得る。例えば、適した投与量は、1週間あたり約1μg/体重1kg〜約10mg/体重1kg、1週間あたり約100μg/体重1kg〜約10mg/体重1kg又は1週間あたり約10μg/体重1kg〜約5mg/体重1kgであり得る。

適した投与量は、1日あたり約1μg/体重1kg〜約10mg/体重1kg、1日あたり約100μg/体重1kg〜約10mg/体重1kg又は1日あたり約10μg/体重1kg〜約5mg/体重1kgであり得る。

眼への注射には、適した用量は、注射あたり約100μg〜10mg又は注射あたり約1mg〜10mg又は注射あたり約1mg〜5mgであり得る。

投与計画は、最適の所望の応答(例えば、治療的応答)を提供するように調整してもよい。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよい、又は治療状況の緊急事態によって示されるように、用量を比例的に減少又は増大してもよい。投与の容易性及び投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位剤形に製剤化することは特に有利である。投与単位剤形とは、本明細書において、治療されるべき対象の単位投与量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように算出された活性化合物の所定の量を含有する。

抗体は、単回用量で投与しても、複数回用量で投与してもよい。複数回用量は、同一又は異なる位置へ、同一経路によって投与しても、異なる経路によって投与してもよい。或いは、抗体を、持続放出製剤として投与でき、この場合には、あまり頻繁ではない投与が必要とされる。投与量及び頻度は、患者における抗体の半減期及び望まれる治療期間に応じて変わり得る。投与量及び投与の頻度はまた、治療が予防的であるか、治療的であるかに応じて変わり得る。予防的適用では、比較的低い投与量を、比較的低頻度の間隔で長期間にわたって投与してもよい。治療的適用では、比較的高い投与量を、例えば、患者が疾患の症状の部分寛解又は完全寛解を示すまで投与してもよい。

2種以上の薬剤の組み合わされた投与（併用投与）は、いくつかの異なる方法で達成してもよい。一実施形態では、抗体及びその他の薬剤を、単一組成物で一緒に投与してもよい。別の実施形態では、抗体及びその他の薬剤を、組み合わされた（併用）療法の一部として別個の組成物で投与してもよい。例えば、抗体を、その他の薬剤の前に、その後に又はそれと同時に投与してもよい。本発明の抗体を、細胞傷害性薬剤、抗癌剤、腫瘍ターゲッティング抗体、標的療法、経路阻害剤又は例えば、PD-1、PD-L1、CD137、GITR、OX40、CTLA-4、CD27、HVEM、LtBR、LAG3、PDGFをターゲッティングするその他の免疫調節性抗体、抗補体因子D Fab、PDGFR及びTie2チロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて、又はそれと連続して投与してもよい。さらに、本発明の抗体をまた、局所放射線照射と組み合わせてもよい。

本発明の抗体を、VEGFのアンタゴニストと組み合わせて投与してもよい。本発明の抗体を、抗VEGF抗体又はVEGFの可溶性受容体、例えば、アフリベルセプト(Eylea)又は抗VEGF抗体、例えば、ベバシズマブ(アバスチン)又はラニビズマブ(ルセンティス)と組み合わせて投与できる。

本発明の抗体を、免疫系を刺激する抗癌剤と組み合わせて投与できる。本発明の抗体を、サイトカインなどの免疫系を刺激する抗癌剤と組み合わせて投与できる。本発明の抗体を、腫瘍抗原を発現する細胞に対して細胞傷害性応答を開始するように刺激されている樹状細胞と組み合わせて投与できる。本発明の抗体を、癌性細胞を攻撃するように抗原刺激されている、T細胞又は腫瘍浸潤リンパ球と組み合わせて投与できる。本発明の抗体を、腫瘍抗原を認識するように遺伝子操作されているT細胞と組み合わせて投与できる。本発明の抗体を、自己免疫増強療法と組み合わせて投与できる。

本発明者らは、固形腫瘍においてLrg1の発現をノックアウトすることが、腫瘍中の小血管数の低減を引き起こすことを見い出した。この低減は、腫瘍の大きさの低減、腫瘍中の増殖細胞数の低減及び残存する血管上の周皮細胞被覆度の増大と関連している。統合すると、これらの結果は、Lrg1発現をノックアウトすることは、腫瘍脈管構造を正常化するように作用することを示す。

さらに、本発明者らはまた、Lrg1アンタゴニストが、腫瘍成長を低減し、残存する腫瘍の脈管構造を正常化することも見い出した。これらのデータは、Lrg1のアンタゴニストを使用して、転移拡散を低減できることを示唆する。Lrg1のアンタゴニストを使用して、腫瘍への抗癌及び細胞傷害性薬物並びに細胞の送達及び有効性を改善できる。

Lrg1は、腫瘍において無秩序な脈管構造に至らせる。Lrg1は、無秩序なVEGF血管新生に至らせ、これでは、血管は、非生理学的である。しかし、Lrg1は、発生上の血管新生では上方制御されない。異常な脈管構造を有する任意の腫瘍を、その例が本明細書に記載される任意のその他の抗癌薬物と組み合わせて、Lrg1のアンタゴニストを用いて治療して、腫瘍の脈管構造を正常化できる。例えば、Lrg1のアンタゴニストを、VEGFアンタゴニストと組み合わせて使用して腫瘍を治療できる。Lrg1のアンタゴニストを用いて任意の腫瘍を同時治療できる。

Lrg1アンタゴニストとして、Lrg1と結合する抗体、Lrg1との結合によってLrg1機能を遮断するペプチド及びペプチドミメティック、Lrg1と結合する小分子阻害剤、Lrg1発現を阻害する二本鎖RNA、Lrg1を標的とするアプタマー及びリボザイムが挙げられる。好ましいアンタゴニストとして、Lrg1のペプチド断片、Lrg1発現を阻害する二本鎖RNA、Lrg1発現を阻害するアプタマー及びLrg1と結合する抗体が挙げられる。

本発明の一実施形態では、癌転移の防止においてLrg1のアンタゴニストを使用できる。

本発明の一実施形態では、Lrg1のアンタゴニストを、免疫系を刺激する抗癌剤と組み合わせて使用できる。本発明のLrg1アンタゴニストを、サイトカインなどの免疫系を刺激する抗癌剤と組み合わせて投与できる。本発明のLrg1アンタゴニストを、腫瘍抗原を発現する細胞に対して細胞傷害性応答を開始するように刺激されている樹状細胞と組み合わせて投与できる。本発明のLrg1アンタゴニストを、癌性細胞を攻撃するように抗原刺激されている、T細胞又は腫瘍浸潤リンパ球と組み合わせて投与できる。本発明のLrg1アンタゴニストを、腫瘍抗原を認識するように遺伝子操作されているT細胞と組み合わせて投与できる。本発明のLrg1アンタゴニストを、自己免疫増強療法と組み合わせて投与できる。

本発明の一実施形態では、本明細書に記載されるような本発明の抗体を、転移の防止において使用できる。

本発明の一実施形態では、VEGF阻害剤耐性腫瘍又は眼の状態の治療において使用するための、VEGF阻害剤と組み合わせたLrg1のアンタゴニスト。

本発明の一実施形態では、本発明の抗体又はその断片を、抗血管新生化合物と組み合わせて使用できる。

本発明の一実施形態では、本発明の抗体又はその断片を、抗癌剤と組み合わせて使用できる。

本発明のさらなる実施形態では、抗血管新生化合物は、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のアンタゴニストである。

さらなる実施形態では、VEGFのアンタゴニストは抗VEGF抗体である。

さらなる実施形態では、VEGFのアンタゴニストはアフリベルセプト(Eylea)である。

さらなる実施形態では、VEGFのアンタゴニストはベバシズマブ(アバスチン)又はラニビズマブ(ルセンティス)である。

本発明者らは、Lrg1の遮断が、組織における血管の生理学的状態を改善し、無秩序な血管の存在を低減することを示した。Lrg1活性の遮断は、血管新生促進薬物とともに、一般に、再血管新生にとって有利であろう。Lrg1アンタゴニストによる脈管構造の正常化はまた、血管新生を増大することが有用であろう疾患の治療を可能にするであろう。Lrg1アンタゴニストを用いる治療は、無秩序な未成熟な血管形成を低減するであろう。血管新生促進剤を用いるその後の治療は、機能的に成熟した血管新生を改善するであろう。このような治療は、組織が低酸素によって影響を受ける任意の疾患又は奇形血管がある疾患の治療にとって有用であろう。このような疾患として、虚血、虚血性心疾患、糖尿病、虚血性脳卒中、血管性認知症、一過性脳虚血発作、僧帽弁疾患、慢性心房細動、心筋症、急性四肢虚血、末梢四肢虚血、血栓症、血管閉塞、胸郭出口症候群、アテローム性動脈硬化症、低血糖、頻脈、低血圧症、鎌形赤血球疾患、凍傷、動静脈奇形、血管破裂及び貧血が挙げられる。

Lrg1アンタゴニストとともに使用できる血管新生促進剤として、VEGF、bFGF(線維芽細胞増殖因子)、PLGF(胎盤増殖因子)及びアンジオポエチン2が挙げられる。

本発明は、脈管構造が奇形である組織の再血管新生の方法において使用するためのLrg1のアンタゴニストを提供する。本発明は、脈管構造が奇形である組織の再血管新生の方法において使用するための、血管新生促進剤ととものLrg1のアンタゴニストを提供する。本発明は、個体に、Lrg1のアンタゴニストを投与することを含む、脈管構造が奇形である組織の再血管新生の方法を提供する。本発明は、個体に、Lrg1のアンタゴニストを、血管新生促進剤とともに投与することを含む、再血管新生の方法を提供する。本発明は、脈管構造が奇形である組織の再血管新生の方法のための医薬の製造において使用するための、血管新生促進剤ととものLrg1のアンタゴニストを提供する。

本発明の一実施形態では、再血管新生の方法は、上記のような組織が低酸素によって影響を受ける疾患である。

本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
１．ヒトLrg1と特異的に結合する抗体又はその断片であって、配列番号21〜26から選択される少なくとも1つのCDRを含む、抗体又はその断片。
２．配列番号23及び26から選択される少なくとも1つのCDRを含む、実施形態1に記載の抗体又はその断片。
３．配列番号23及び26のCDRを含む、実施形態2に記載の抗体又はその断片。
４．(a)配列番号21、22及び23、又は
(b)配列番号24、25及び26
のCDRを含む、実施形態2に記載の抗体又はその断片。
５．配列番号21、22、23、24、25及び26のCDRを含む、実施形態4に記載の抗体又はその断片。
６．(a)配列番号1、5、7、9、11若しくは13の重鎖可変領域アミノ酸配列、
(b)抗体若しくは断片が、Lrg1と特異的に結合する能力を保持する、(a)の少なくとも7個のアミノ酸の断片、又は
(c)抗体若しくは断片が、Lrg1と特異的に結合する能力を保持する、(a)の配列に対して少なくとも70％のアミノ酸配列同一性を有する(a)の変異体
を含む、実施形態1から5のいずれかに記載の抗体又はその断片。
７．(a)配列番号2、15、17若しくは19の軽鎖可変領域アミノ酸配列、
(b)抗体若しくは断片が、Lrg1と特異的に結合する能力を保持する、(a)の少なくとも7個のアミノ酸の断片、又は
(c)抗体若しくは断片が、Lrg1と特異的に結合する能力を保持する、(a)の配列に対して少なくとも70％の同一性のアミノ酸同一性を有する(a)の変異体
を含む、実施形態1から6のいずれかに記載の抗体又はその断片。
８．抗体が
(a)配列番号1の重鎖可変領域及び配列番号2の軽鎖可変領域、又は
(b)配列番号1の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
(c)配列番号1の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
(d)配列番号1の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域、又は
(e)配列番号5の重鎖可変領域及び配列番号2の軽鎖可変領域、又は
(f)配列番号5の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
(g)配列番号5の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
(h)配列番号5の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域、又は
(i)配列番号7の重鎖可変領域及び配列番号1の軽鎖可変領域、又は
(j)配列番号7の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
(k)配列番号7の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
(l)配列番号7の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域、又は
(m)配列番号9の重鎖可変領域及び配列番号2の軽鎖可変領域、又は
(n)配列番号9の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
(o)配列番号9の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
(p)配列番号9の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域、又は
(q)配列番号11の重鎖可変領域及び配列番号2の軽鎖可変領域、又は
(r)配列番号11の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
(s)配列番号11の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
(t)配列番号11の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域、又は
(u)配列番号13の重鎖可変領域及び配列番号2の軽鎖可変領域、又は
(v)配列番号13の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
(w)配列番号13の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
(x)配列番号13の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域
を含む、実施形態1から7のいずれかに記載の抗体又はその断片。
９．配列番号1、5、7、9、11若しくは13のCDR及び/又は配列番号2、15、17若しくは19のCDRを含む、Lrg1と特異的に結合する抗体又はその断片。
１０．Lrg1のアミノ酸GNKLQVLGKDLLLPQ(配列番号30)と特異的に結合し、Lrg1活性を遮断する抗体又はその断片。
１１．Lrg1と1nM以下のアフィニティで結合する、実施形態1から10のいずれかに記載の抗体又は断片。
１２．Lrg1との結合について、実施形態8に記載の抗体と競合する抗体又はその断片。
１３．IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4領域であるFc領域を含む、実施形態1から12のいずれかに記載の抗体又は断片。
１４．さらなる部分とコンジュゲートしている、実施形態1から13のいずれかに記載の抗体又はその断片。
１５．実施形態1から13のいずれかに記載の抗体若しくはその断片の重鎖若しくは軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
１６．実施形態1から13のいずれかに記載の抗体又は断片を発現する宿主細胞。
１７．実施形態1から14のいずれかに記載の抗体又はその断片及び少なくとも1種の医薬上許容される希釈剤又は担体を含む組成物。
１８．癌の治療のための方法において使用するための、実施形態1から14のいずれかに記載の抗体又はその断片。
１９．個体に、実施形態1から14のいずれかに記載の抗体又はその断片を投与することを含む、疾患又は状態を治療する方法であって、疾患又は状態が癌である、方法。
２０．脳、乳房、腎臓、結腸直腸、肺、前立腺、頭頸部、胃、膵臓、皮膚、子宮頸部、骨、卵巣、精巣又は肝臓癌から選択される癌の治療において使用するための、実施形態1から14のいずれかに記載の抗体又はその断片。
２１．血管増殖性状態の治療において使用するための、実施形態1から14のいずれかに記載の抗体又はその断片。
２２．血管増殖性状態が、新血管新生、血管内皮細胞増殖、血管新生、毛細血管拡張又は微小動脈瘤を含む、実施形態21に記載の抗体又はその断片。
２３．眼の血管増殖性状態の治療において使用するための、実施形態1から14のいずれかに記載の抗体又はその断片。
２４．糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、未熟児網膜症、黄斑性毛細血管拡張症、加齢性黄斑変性症又は脈絡膜新血管新生から選択される眼の障害の治療において使用するための、実施形態23に記載の抗体又はその断片。
２５．血管増殖を示す腫瘍の治療において使用するための、実施形態1から14のいずれかに記載の抗体又はその断片。
２６．脳腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、前立腺腫瘍、頭頸部腫瘍、胃の腫瘍、膵臓腫瘍、皮膚腫瘍、子宮頸部腫瘍、骨の腫瘍、卵巣腫瘍、精巣腫瘍及び肝臓腫瘍から選択される腫瘍の治療において使用するための、実施形態25に記載の抗体又はその断片。
２７．血管増殖の治療において抗血管新生化合物と組み合わせて使用するための、実施形態1から14のいずれかに記載の抗体又はその断片。
２８．癌の治療において抗癌剤と組み合わせて使用するための、実施形態1から14のいずれかに記載の抗体又はその断片。
２９．抗血管新生化合物が、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のアンタゴニスト又はVEGFの可溶性受容体である、実施形態27に記載の抗体又はその断片。
３０．前記VEGFアンタゴニストが、抗VEGF抗体である、実施形態29に記載の抗体又はその断片。
３１．前記VEGFアンタゴニストが、アフリベルセプトである、実施形態29に記載の抗体又はその断片。
３２．眼の血管増殖性状態の治療において使用するための、実施形態27又は28に記載の抗体又はその断片。
３３．前記VEGFアンタゴニストが、ベバシズマブ又はラニビズマブである、実施形態29に記載の抗体又はその断片。
３４．癌の治療において使用するための、実施形態27に記載の抗体又はその断片。
３５．癌が、脳、乳房、腎臓、結腸直腸、肺、前立腺、頭頸部、胃、膵臓、皮膚、子宮頸部、骨、卵巣、精巣又は肝臓癌から選択される、実施形態34に記載の抗体又はその断片。
３６．癌を治療するための細胞傷害性化合物又は免疫治療薬と組み合わせて使用するための、実施形態1から14のいずれかに記載の抗体又はその断片。
３７．癌の治療又は予防において使用するための、細胞傷害性化合物又は免疫治療薬と組み合わせた、Lrg1のアンタゴニスト。
３８．細胞傷害性化合物が、化学療法薬、細胞死につながるペプチド、放射活性原子、放射線増感剤及び細胞骨格薬物から選択される、実施形態36に記載の使用のための抗体若しくは断片又は実施形態37に記載のLrg1のアンタゴニスト。
３９．癌転移の予防において使用するための、Lrg1のアンタゴニスト。
４０．VEGF阻害剤耐性腫瘍又は眼の状態の治療において使用するための、VEGF阻害剤と組み合わせたLrg1のアンタゴニスト。
４１．脈管構造が奇形である組織の再血管新生の方法において使用するための、Lrg1のアンタゴニスト。
４２．血管新生促進剤とともに使用するための、実施形態41に記載の使用のためのLrg1のアンタゴニスト。
４３．血管新生促進剤が、VEGF、bFGF、PLGF及びアンジオポエチン2から選択される、実施形態42に記載の使用のためのLrg1のアンタゴニスト。
４４．再血管新生の方法が、虚血、虚血性心疾患、糖尿病、虚血性脳卒中、血管性認知症、一過性脳虚血発作、僧帽弁疾患、慢性心房細動、心筋症、急性四肢虚血、末梢四肢虚血、血栓症、血管閉塞、胸郭出口症候群、アテローム性動脈硬化症、低血糖、頻脈、低血圧症、鎌形赤血球疾患、凍傷、動静脈奇形、血管破裂及び貧血から選択される、実施形態43に記載の使用のためのLrg1のアンタゴニスト。
４５．再血管新生の方法が、組織が低酸素によって影響を受ける疾患である、実施形態44に記載の使用のためのLrg1のアンタゴニスト。
４６．個体に、Lrg1のアンタゴニストを投与することを含む、脈管構造が奇形である組織の再血管新生の方法。
４７．Lrg1のアンタゴニストが、血管新生促進剤とともに投与される、実施形態46に記載の方法。
４８．血管新生促進剤が、VEGF、bFGF、PLGF及びアンジオポエチン2から選択される、実施形態47に記載の方法。
４９．再血管新生の方法が、組織が低酸素によって影響を受ける疾患である、実施形態48に記載の方法。
５０．再血管新生の方法が、虚血、虚血性心疾患、糖尿病、虚血性脳卒中、血管性認知症、一過性脳虚血発作、僧帽弁疾患、慢性心房細動、心筋症、急性四肢虚血、末梢四肢虚血、血栓症、血管閉塞、胸郭出口症候群、アテローム性動脈硬化症、低血糖、頻脈、低血圧症、鎌形赤血球疾患、凍傷、動静脈奇形、血管破裂及び貧血から選択される、実施形態49に記載の方法。
５１．Lrg1と結合する抗体、Lrg1遺伝子発現を阻害する二本鎖RNA、Lrg1を標的とするアプタマー、又はLrg1と結合することによってLrg1機能を遮断するペプチド若しくはペプチドミメティックを含む、実施形態37から50のいずれかに記載のLrg1のアンタゴニスト。
５２．実施形態1から14のいずれかに記載の抗体である、実施形態51に記載のLrg1のアンタゴニスト。
本発明を、以下の実施例によってさらに例示するが、これは、さらなる制限として解釈されてはならない。本出願を通じて引用された、すべての図面及びすべての参考文献、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書において明確に組み込まれる。

ヒトLrg1に対する102の候補mAbを作製し、すべてを以下の試験に供した：全血清を用いた種交差反応性、Matrigelアッセイ（ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を使用）、HUVEC同時培養アッセイ、Biacoreを使用したヒト及びマウスLrg1の両方の組換え形態に対するアフィニティ決定、並びにマウス中足骨血管新生アッセイ。続いて、最も有望なmAbのサブセットを以下の試験で検査した：マウス及びラットの両方におけるレーザー誘起脈絡膜新血管新生、分画全血清を用いた種交差反応性分析、ELISAによるアフィニティ決定、ウエスタンブロッティングによる標的に対する特異性、並びにTGFβによるSmad5のLrg1媒介活性化をブロックする能力。

実施例1-全血清を用いた種交差反応性
種交差反応性は、マルチウエルプレートをrhLrg1と、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ及びネコからの肝臓抽出物とでコーティングするプロトコールにおいてELISAにより実施した。次に、プレートを100nMの各mAbと反応させ、続いてアルカリホスファターゼ複合化二次抗体を反応させて色反応をさせた。mAb 4H2は、マウス及びラットの両方に対して（ラットLrg1に対する優れた反応性を示したが）、そしてネコ、イヌ、カニクイザル及びウサギに対しても交差反応性を有することが観察された。抗体4H2、3A11又は15C4のいずれもげっ歯類Lrg1と強い交差反応性を示さなかった。

実施例2-Biacoreを使用したアフィニティ測定
Biacoreを使用して、抗体のヒトLrg1に対する結合アフィニティ、会合及び解離定数を測定した。ヒトLrg1をBiacoreチップ上に固定し、mAbを20〜100nMの範囲の濃度で通過させた。結合アフィニティのカットオフ値2nMを使用して、さらなる検査のための可能な候補抗体を単離した。3つの抗体15C4、4H2及び3A11が特に高アフィニティで結合した。

またBiacoreを使用して組換えマウスLrg1に対するすべてのmAbのアフィニティを調べた。これらの実験では、マウスLrg1をBiacoreチップ上に固定し、ヒトLrg1分析で行ったのと同様に100nMでmAbを通過させた。図1は、この濃度で試験した場合に3つのmAbのみが測定可能な応答単位と誘起したことを示す。このデータは、マウスLrg1との交差反応性がヒトLrg1に対して生起された抗体の中で稀であることを示す。

結合アフィニティ及び種交差反応性に基づいて、最初の102種のmAbの大部分を早い段階で除外したが、このことはプールではなく個々のmAbを使用して後続の機能調査を行うことができたことを意味する。除外の反復工程によって、4つの有望な候補3A11、15C4、4H2及び5F12の詳細な試験を行うに至った。

実施例3-Matrigelアッセイ
Matrigelアッセイにおいて管形成を阻害する抗体の能力について試験した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）をMatrigelに播種し、100nM mAbの存在下で一晩培養した。ブロッキングウサギポリクローナルLrg1抗体もまた評価した。mAb 4H2では管形成の40％ブロッキングを、mAb 15C4では60％ブロッキングを観察した（図2）。このアッセイにおけるHUVECのバッチ間の変動が観察され、ある場合には3A11及び15C4による阻害は80％を超え、100nMで使用した場合のウサギポリクローナル抗体で観察された約80％の阻害と同等であった。4H2によるブロッキングは約50％を超えなかった。

実施例4-ex vivoアッセイでの機能試験-マウス中足骨血管新生アッセイ
このアッセイでは、移植したE16.5マウス中足骨を用いてmAbの機能ブロッキング活性を試験した。血管は胚性骨から自発的に成長し、2次元ネットワークを形成し、これを、例えば血管長、径及び分岐点に関して容易に定量することができる。マウス中足骨アッセイにおいて、12日間の培養の間、2日毎に培地及びmAbを補充しながらmAbを100nMで培養培地に添加した。実験の最後にサンプルを固定し、血小板内皮細胞接着分子（PECAM）について免疫染色し、血管網をImarisソフトウエアで定量し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）対照に対して正規化した。

図3は、15C4及び3A11が、このアッセイにおいて血管新生を阻害したことを示し、15C4について最大値約40％まで阻害した。4H2及び5F12は効果がなかったが、5F12はマウスLrg1を認識せず、4H2は非常に弱く認識することに留意されたい。発明者は、Lrg1-/-マウス由来の中足骨において血管新生のわずか約25％の抑制が観察されることを以前に示している（Wang et al., 2013）。したがって、15C4及び3A11の効果は理論上最大の効果を反映しているだろう。

実施例5-ヒトLrg1に対する特異性
ヒトLrg1に対するリードmAbの特異性を評価するため、それぞれのウエスタンブロット分析をMDA-MBヒト腫瘍細胞株由来の馴化培地、ヒト硝子体のサンプル、及びヒト全血清のサンプルに対して実施した。図4は、3A11及び15C4が馴化培地及び硝子体において50kDにてLrg1の単一バンドを強く認識することを示す。4H2はブロッティングにおいてあまり十分に機能しないが、Lrg1に対する特異性も示す。硝子体サンプルにおける単一バンドの同定は、これらのmAbの治療用投与についての最適性を示唆している。

実施例6-結合反応速度
4つのリードmAbをBiacoreを用いて調べ、この実験ではヒトLrg1をチップ上に固定し、mAbを20〜100nMの範囲の濃度で流した。以下の表に反応速度データをまとめる。

4つの候補抗体のヒトLrg1に対する結合アフィニティは、3A11が1.7pM、15C4が1.2pM、4H2が930pM、5F12が59pMである。3A11と特に15C4がヒトLrg1に対して非常に高いアフィニティを示す。

実施例7-ラットレーザー誘起脈絡膜新血管新生（CNV）における機能試験
数種の抗体をラットにおけるCNVを遮断（ブロッキング）する能力について試験した。これらの実験では、レーザー処置の時点でmAbを硝子体内に注射し、7日後の分析のために眼を回収した（図5）。Long Evansラット（6〜8週齢）のそれぞれは4mgのmAb又は対照IgGの両方の眼への硝子体内送達と同時に5回の網膜レーザ火傷を受けた。各mAbについて4匹のラットを使用し、したがって合計40の病変をコラーゲンIVについての染色により分析し、新生血管面積を定量した。結果は、15C4、4H2及び5F12についての（但し3A11についてはない）血管新生の機能的遮断が観察されることを示す。3A11について効果がないことは、そのげっ歯類Lrg1との弱い交差反応性を考慮すべきである。血管内皮細胞増殖因子（VEGF）ブロック抗体をまた試験し、アッセイにおいて機能的効果がないことを確認した。アバスチン（Avastin）をまたラットレーザーモデルにおいて試験し（データを示さず）、ラットVEGFに対して低アフィニティを有するアバスチンと一致して、効果を有しないことが観察された。

上位4つのmAbは中足骨及びCNVモデルにおける機能的活性を示す。これらのmAb、特に15C4は、治療的及び臨床的に関連する特性を有する。Lrg1遺伝子ノックアウトが中足骨アッセイにおける血管新生のほんの約25％の低減を生じることが確立されており、このことは、25％の阻害が抗体遮断によって達成可能な最大であろうことを示唆している。しかしながら、15C4はこの値を上回り、3A11は近似している。CNVモデルでは、4μgの15C4又は4H2が眼内注射後に有効な遮断を生じる一方、抗ラットVEGFブロックmAbは遮断を生じない。

4μgの用量は、硝子体体積25μl及びmAb分子量150kDと仮定した場合に約1.0μMの即時眼内濃度を生じると予測され得る。しかしながら、注射したmAbの眼内濃度は迅速に低下することが知られており、そのためCNVが発生開始した後（数日後）のmAbの有効量は必然的にはるかに低い。さらに、Lucentisを硝子体濃度約2.6μMを生じるように新生血管AMDを有する患者に注射する。したがって、この戦略は臨床的に関連する治療投薬に基づくものであった。

実施例8-血管新生のHUVEC同時培養モデル
抗体4H2、15C4及び3A11を、血管新生の同時培養モデルにおいて血管成長の阻害を誘発するかどうかを観察するために試験した。HUVECを14日間にわたりヒト線維芽細胞と同時培養し、その後固定し、PECAMに対する抗体を用いて免疫染色した。アバスチン（Avastin）を陽性対照として含め、全4つのmAbを10、25、50、100及び200nMで試験した。結果を図6に示す。この実験から2つの重要な観察結果があった。第１は、3A11がこのアッセイでは比較的有効ではなく、第２は、15C4及び4H2が同等に有効であったことである。

4H2及び15C4は、有望な治療薬であり、それゆえヒト化に好適であることがわかった。4H2はヒトLrg1に対してより低いアフィニティを有する（依然として高アフィニティで結合するが）が、げっ歯類Lrg1と良好な交差反応性を示し、将来的な毒性学試験がより簡便なものとなる。一方、15C4はヒトLrg1に対してはるかに高いアフィニティを有するが、血管新生のin vivoげっ歯類モデルにおいて4H2よりも有効性が低い。

実施例9:候補抗体のエピトープマッピング
4H2、15C4及び3A11抗体のエピトープマッピングを実施した。抗体−抗原相互作用は免疫学において重要な事象である。したがって、抗原のエピトープ又は免疫優勢領域の同定は、可能性ある抗体の開発の特性決定において重要なステップである。そのようなエピトープを同定する方法で最も効率的なもののひとつは、ペプチドマイクロアレイ上に提示された抗原由来ペプチドの集合を、精製されたポリクローナル若しくはモノクローナル抗体、又は対象の複合生体混合物（すなわち、血清/血漿）と共にインキュベートすることによるものである。

ペプチド−抗体結合の決定は、血清又は抗体サンプルとProArray Ultra(R)ペプチドマイクロアレイとのインキュベーションと、それに続く、蛍光標識二次抗体とのインキュベーションにより行った。

すべてのペプチドを別々に合成し、次にProImmuneの専有技術を用いてProArray Ultra(R)スライド表面に結合させた。この最適化されたプロセスにより、対応するタンパク質領域の性質を近似して模倣するように、ペプチドをアレイ上に提示させることができ、遊離ペプチド自体の固有の生理学的変動を回避し、適合されたペプチド及びタンパク質の組み合わせアレイプラットフォームを作製した。試験分析物（ペプチド又はタンパク質）をProArray Ultra(R)スライド上に別々のスポットで分注し、適切なgalファイルによって、得られたアレイの特徴を分注した分析物に正確にアラインすることができた。

ProArray Ultra(R)スライドを有効なブロッキングバッファーを用いてブロッキングし、血清の非特異的結合を低減させた。続いて試験サンプルとインキュベートし、続いて特異的蛍光標識二次抗体とインキュベートした。数回の洗浄ステップ後、ProArray Ultra(R)アレイを乾燥し、高分解能蛍光マイクロアレイスキャニングシステムを用いて走査した。

LRG1の重複するペプチドを合成し、選択したマウスIgG対照と並行してProArray Ultra(R)マイクロアレイスライド上にプリントした。スライドをマウスモノクローナル抗体サンプル4H2、15C4及び3A11と共にインキュベートして、推定エピトープを同定した。Lrg1の重複ペプチドライブラリは、スポンサーによって提供された配列から合成した。10アミノ酸が重複する15-merの合成ペプチドを生成した。

固定したペプチドを含むProArray Ultra(R)スライドを抗体サンプルと共にインキュベートした。すべてのインキュベーションスライドが、3×バックグラウンド（3を超える平均シグナル強度×対応の陰性対照特徴の平均シグナル強度として定義される）の陽性閾値レベルを超える検出可能なシグナルを生じた。マウスIgG陽性対照はすべてのサンプルで検出された。いずれのペプチドと対照インキュベーションでの二次検出抗体との間に有意な相互作用は観察されなかった。したがって、二次検出抗体への非特異的結合のために捨てたエピトープはなかった。

4H2、15C4及び3A11抗体のすべての希釈で結合因子として全長Lrg1を同定した。

4H2、15C4及び3A11抗体の3つについて、1つのペプチド（GNKLQVLGKDLLLPQ（配列番号30）、Lrg1のアミノ酸221〜235）をヒットとして同定した。

実施例10-抗体15C4のヒト化
15C4ハイブリドーマから可変領域遺伝子をクローニングし、配列決定し、VH及びVκのそれぞれの単一の固有配列を同定した。同定した可変領域遺伝子をベクターにクローニングして、マウス可変領域をヒトIgG4（S241P）重鎖定常領域及びκ軽鎖定常領域と組み合わせて含むキメラ抗体を作製した。さらに、Composite Human Antibody^TM技術を用いて一連の5つのヒト化VH領域と3つのヒト化Vκ領域を設計した。

HEK EBNA細胞において一過的にそしてNS0マウスミエローマ細胞において安定的にキメラ抗体を発現させ、精製し、競合ELISAアッセイにおいてヒトLrg1への結合について試験した。Nunc Immuno MaxiSorp 96ウエル平底マイクロタイタプレート（Fisher, カタログ番号DIS-971-030J）を、0.1N炭酸ナトリウムバッファー（NaHCO₃）中で＋4℃にて0.2μg/ml hLrg1（UCLより供給）で一晩かけて予めコーティングした。翌日、プレートをPBSTで1回洗浄し、3％BSA/PBSで室温にて1時間かけてブロッキングした。PBSTで3回洗浄した後、100μg/mlから0.13μg/mlのキメラ、マウス又は対照抗体の3倍希釈系列を一定濃度のビオチニル化マウス15C4（0.4μg/ml、最終濃度）と予め混合し、プレートに添加し、室温で1.5時間インキュベートした。PBSTで3回洗浄後、ストレプトアビジン-HRP（Sigma, カタログ番号S5512）及びTMB基質（Invitrogen, カタログ番号00-2023）を用いてビオチニル化mAbの結合を検出した。3M HClで反応を停止させ、450nmでの吸収をDynex Technologies MRX TC IIプレートリーダーで読み取り、結合曲線をプロットした。

キメラ抗体及びマウス抗体の比較（図7）は、キメラ抗体及び対照抗体がマウス15C4に対して非常に類似した結合プロフィールを有し、IC₅₀値が2倍以内であったことを示した。これは、正確な可変領域配列が同定され、クローニングされたことを示す。無関係のヒトIgG4抗体はヒトLrg1への結合について競合しなかった。

実施例11-配列情報のまとめ
以下に記載する各抗体について、アミノ酸配列中、CDRは太字かつ下線付きである。

抗体15C4
可変重鎖(V _H )アミノ酸配列- 配列番号1

可変軽鎖(V _L )アミノ酸配列- 配列番号2

可変重鎖(V _H )ヌクレオチド配列 配列番号3

可変軽鎖(V _L )ヌクレオチド配列 配列番号4

CDRアミノ酸配列

V_HCDR: CDR1: GYWMN (配列番号21)
CDR2: QIYPGDGDTNYNGKFKG (配列番号22)
CDR3: SITTVVLDY (配列番号23)
V_LCDR: CDR1: RASQSVSTSGYSFMH (配列番号24)
CDR2: YASNLES (配列番号25)
CDR3: QHSWEMPLT (配列番号26)

ヒト化15C4抗体
可変重鎖(V _H )アミノ酸配列 VH1- 配列番号5

可変重鎖(V _H )ヌクレオチド配列 VH1- 配列番号6

CDRアミノ酸配列

V_HCDR: CDR1: GYWMN (配列番号21)
CDR2: QIYPGDGDTNYNGKFKG (配列番号22)
CDR3: SITTVVLDY (配列番号23)

可変重鎖(V _H )アミノ酸配列 VH2- 配列番号7

可変重鎖(V _H )ヌクレオチド配列 VH2- 配列番号8

CDRアミノ酸配列

V_HCDR: CDR1: GYWMN (配列番号21)
CDR2: QIYPGDGDTNYNGKFKG (配列番号22)
CDR3: SITTVVLDY (配列番号23)

可変重鎖(V _H )アミノ酸配列 VH3- 配列番号9

可変重鎖(V _H )ヌクレオチド配列 VH3- 配列番号10

CDRアミノ酸配列

V_HCDR: CDR1: GYWMN (配列番号21)
CDR2: QIYPGDGDTNYNGKFKG (配列番号22)
CDR3: SITTVVLDY (配列番号23)

可変重鎖(V _H )アミノ酸配列 VH4- 配列番号11

可変重鎖(V _H )ヌクレオチド配列 VH4- 配列番号12

CDRアミノ酸配列

V_HCDR: CDR1: GYWMN (配列番号21)
CDR2: QIYPGDGDTNYNGKFKG (配列番号22)
CDR3: SITTVVLDY (配列番号23)

可変重鎖(V _H )アミノ酸配列 VH5- 配列番号13

可変重鎖(V _H )ヌクレオチド配列 VH5- 配列番号14

CDRアミノ酸配列

V_HCDR: CDR1: GYWMN (配列番号21)
CDR2: QIYPGDGDTNYNGKFKG (配列番号22)
CDR3: SITTVVLDY (配列番号23)

可変軽鎖(V _L )アミノ酸配列 VK1- 配列番号15

可変軽鎖(V _L )ヌクレオチド配列 VK1- 配列番号16

CDRアミノ酸配列

V_LCDR: CDR1: RASQSVSTSGYSFMH (配列番号24)
CDR2: YASNLES (配列番号25)
CDR3: QHSWEMPLT (配列番号26)

可変軽鎖(V _L )アミノ酸配列 VK2- 配列番号17

可変軽鎖(V _L )ヌクレオチド配列 VK2- 配列番号18

CDRアミノ酸配列

V_LCDR: CDR1: RASQSVSTSGYSFMH (配列番号24)
CDR2: YASNLES (配列番号25)
CDR3: QHSWEMPLT (配列番号26)

可変軽鎖(V _L )アミノ酸配列 VK3- 配列番号19

可変軽鎖(V _L )ヌクレオチド配列 VK3- 配列番号20

CDRアミノ酸配列

V_LCDR: CDR1: RASQSVSTSGYSFMH (配列番号24)
CDR2: YASNLES (配列番号25)
CDR3: QHSWEMPLT (配列番号26)

本発明の抗体の定常領域の例
定常重鎖(C _H )アミノ酸配列(Igγ2-4_HUMAN)−配列番号27
Mueller J.P. et al. Molecular Immunology vol. 34 no.6 pp 441-452, 1997にて公表
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

定常重鎖(C _H )アミノ酸配列(Igγ-1_Uniprotアクセッション番号:P01857_HUMAN)−配列番号28
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

定常軽鎖(C _L )アミノ酸配列(Igκ鎖C領域Genbankアクセッション番号:AAA58989.1_HUMAN)−配列番号29
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ヒトLrg1のアミノ酸配列, NCBI ref: NP_443204.1−配列番号31
実施例9で同定されたLrg1のエピトープは太字かつ下線付き。

重鎖可変領域VH5及びκ鎖軽鎖可変領域VK3を含むヒト化15C4抗体をMagacizumabと呼ぶ。

実施例12-Lrg1アンタゴニストの存在下におけるLrg1ノックアウトマウスにおける腫瘍血管新生の正規化
B16/F0及びLL/2ヒト腫瘍細胞株を野生型マウス及びLrg1ノックアウトマウスに移植した。

得られたB16/F0及びLL/2腫瘍は、野生型マウスと比較した場合にLrg1ノックアウトマウスにおける血管数の低下を示した（図8）。CD31（分化クラスター31）は血管のマーカーであり、DAPIは細胞核のマーカーである。腫瘍の可視観察により、より少ない小血管が存在することが示唆された。

血管の数及びサイズを定量したとき、野生型マウスと比較してLrg1ノックアウトマウスでは小血管の数の不均衡な低下、より小さな血管の大規模な喪失が示された（図9）。腫瘍のサイズは有意に低減し、ホスホ-ヒストンH3の存在により測定した場合に腫瘍当たり有意に少ない分裂細胞が観察された（図9）。

これらの結果は、1kg当たり50mgの濃度で使用した抗体15C4の存在下における野生型マウスのB16/F0及びLL/2腫瘍において模倣された。

接着細胞株B16/F0を回収し、100μl PBS中1x10⁶細胞の単一細胞懸濁液をC57Bl/6マウスの背下部に皮下注射した。腫瘍をカリパスを用いて一日おきに測定し、体積を式：V＝(4/3)×π×(L/2)×(W/2)×(H/2)を用いて計算した。既定の時間間隔で又は腫瘍が2000mm³に達した後にマウスを犠牲にした。3日後に50mg/kgで15C4又はIgGによる腹腔内注射での処置を開始し、3日毎に反復した。腫瘍切片におけるCD31免疫組織化学により血管を特定した（図11）。

15C4処置腫瘍ではより少ない小血管が観察され、例えばIgG対照と比較して血管サイズの分布に有意差が観察された（Two-Way ANOVA, P<0.0001）。

興味深いことに、野生型マウスと比較してLrg1ノックアウトマウスでは、Lrg1の喪失が大血管及び小血管の両方に対する周皮細胞の被覆（血管成熟の兆候）の増大を生じることも見い出された（図10）。α-SMA（平滑筋アクチン）は周皮細胞のマーカーである。画像は、Lrg1ノックアウトでは周皮細胞により覆われていない血管数がわずかであることを示す。

これらの結果はまた、抗体15C4の存在下におけるB16/F0腫瘍でも模倣される。C57BL6マウスにおける抗LRG1ブロッキング抗体15C4によるB16F0腫瘍の処置によって、内皮と周皮細胞の共局在化が増大する。内皮はCD31発現により特定し、周皮細胞はαSMA又はNG2発現のいずれかにより特定した（図12において染色画像で示し、図13において定量した）。

これらの結果は、Lrg1ノックアウトマウスにおける腫瘍、及び抗体15C4の存在下での野生型マウスの腫瘍において、血管がより機能的であり成熟していることを示す。

実施例13-15C4はシスプラチンの細胞傷害活性を高める
接着細胞系B16-F0を回収し、100μl PBS中1×10⁶細胞の単一細胞懸濁液をC57Bl/6雄マウスの背下部に皮下注射した。3日後に50mg/kgの腹腔内注入で15C4又はIgGによる処置を開始し、3日毎に反復した。準最適用量のシスプラチン（2.5mg/kg）を、隔日に腹腔内注入で平均サイズ0.5cm³の腫瘍を有するマウスに投与した。隔日にカリパスで腫瘍を計測し、以下の式：V＝(4/3)×π×(L/2)×(W/2)×(H/2)を用いて体積を算出した。

15C4とシスプラチンとの組み合わせで処置した腫瘍は、IgG及びシスプラチン対照と比較して腫瘍成長の有意な低減を示した（Two-Way ANOVA, P<0.005）（図14A）。15C4で処置した腫瘍は、IgG及びビヒクル対照と比較して、同様の成長速度を示した（図14B）。

シスプラチン及びIgG又は15C4で処置した腫瘍を4℃で一晩かけて4％PFA中で浸漬固定し、次いで4℃で一晩30％スクロール中に浸漬した。続いて腫瘍組織を切片調製（40μm）のためにOCT包埋し凍結した。ApopTag in situアポトーシス検出キットを製造業者（Merk Millipore, USA）のプロトコールにしたがって使用してTUNELアッセイを実施した。シスプラチンと組み合わせて15C4で処置した腫瘍では、IgG及びシスプラチン対照よりも、アポトーシスが有意に多く観察された（片側スチューデントT検定, P<0.05）（図15）。

腫瘍切片において、シスプラチン誘導DNA損傷を示すDNA二本鎖切断マーカーγ-H2AXを染色した。シスプラチンと組み合わせて15C4で処置した腫瘍では、IgG及びシスプラチン対照よりも、γ-H2AXフォーカスを有する核が有意に多く観察された（片側スチューデントT検定, P<0.05）（図16）。

実施例14-レーザー誘起CNVのマウスモデル
15C4の用量応答分析、及びEyleaとの比較
レーザー誘起脈絡膜新血管新生のマウスモデルにおける病変形成に対する15C4の効果についての実験を行った。15C4がレーザー誘起脈絡膜新血管新生のマウスモデルにおいて病変形成を阻害することがわかった（図17）。

図17の左側の画像は、通常の照明下（Fundus）及び蛍光照明下、網膜色素上皮に3回のレーザ火傷を与えた7日後の典型的な野生型マウス網膜を示す。蛍光画像は、フルオレセインの全身投与の約60秒後（早期FFA）及び再度約7分後（後期FFA）に捕捉した。レーザ照射の時点で、動物に対照IgG（上パネル）又は15C4（下パネル）のいずれかの眼内注射を与えた。早期FFA画像は病変のサイズを示し、後期画像はフルオレセインの網膜への漏出を示す。病変サイズは、2.5、5及び10μg用量での15C4について、2及び4μgでのEyleaについても定量し、ブロッキング％は、対照において観察された平均病変サイズに対する平均病変サイズの尺度である。1番右側には、Eylea及びMagacizumab（いずれも2μgで）を単独及び組み合わせて使用して同様の分析を行った。これらの実験は、このモデルにおいて、15C4及びヒト化抗体Magacizumabが両方とも、VEGFブロッカーであるEyleaと同様の効力で病変形成を阻害することを示す。

レーザー誘起 CNVにおけるMagacizumabによる病変形成の用量応答阻害
野生型C57B6マウスを麻酔し、網膜色素上皮のレーザ光凝固の直後に種々の用量のMagacizumab、Eylea又は両方の併用のいずれかの硝子体内投与を行った。7日後（血管病変を形成させる）に、マウスを再度麻酔し、蛍光眼底血管造影（FFA）により調べた。早期FFA画像（90秒後に取得）は、病変部位における血管形成の程度を示す。早期画像における病変面積の測定により、病変サイズの割合（％）をIgG4対照に対して正規化した定量が可能となる（図18）。

Magacizmabによる処置によって、単独で又はEyleaとの併用で、対照と比較して病変サイズの有意な低減が生じた（図18）。

15C4はJR5558マウスにおける病変形成を低減する
図19はまた、15C4で処置した場合のJR5558マウスにおける病変数の低減を示す。15C4又はIgGを50mg/kgでD14から3日毎にIP投与した。D25に眼を回収し、コラーゲンIVでRPE/脈絡膜染色した。病変数を数え、2群についてデータを定量した。15C4の存在下では、対照マウスよりも有意に少ない病変が生じた。

実施例15-マガシズマブ（Magacizumab）の生化学的性質
Magacizumabの性質を調べた。分析サイズ排除クロマトグラフィを実施したところ、単一ピーク及び凝集物なしを示した（図20）。抗hLRG1 競合ELISAを行った。各精製抗体の希釈系列を、組換えhLRG1への結合について、固定濃度のビオチニル化マウス15C4に対して競合させた。結合したビオチニル化マウス15C4は、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ及びTMB基質を用いて検出した。これは、複数のヒト化変異体をキメラ15C4に対して試験する分析ステップであり、これは最良の結合特性を保持する抗体を同定するために行った。VH5/Vk3_3B6クローン（後の名称Magacizumab）は、キメラ15C4と同様の結合プロフィールを示し、したがってリード抗体として選択した（図20）。

図21の上のパネルは、Magacizumabが、非還元及び還元条件下で抗体について予想されたのと一致したタンパク質バンドをSDS-PAGE上で生じたことを示す。

図21の下のパネルは、Magacizumabが脱免疫されるかどうかを検出するためのT細胞増殖アッセイの結果を示す。この結果は、Magacizumab（ヒト化抗体）が、脱免疫に成功している抗体と一致して、20個のドナーT細胞サンプルのいずれにおいても増殖応答を誘導しなかったことを示す。

参考文献

Claims (22)

1. ヒトLrg1と特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、配列番号21、22、23、24、25及び26のCDRを含む、抗体又はその抗原結合断片。
2. (a)(i)配列番号1、5、7、9、11若しくは13の重鎖可変領域アミノ酸配列、又は
   (ii)抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号21、22及び23のCDRを含み、Lrg1と特異的に結合する能力を保持する、(i)の配列に対して少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有する(i)の変異体、及び／又は
   (b)(iii)配列番号2、15、17若しくは19の軽鎖可変領域アミノ酸配列、又は
   (iv)抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号24、25及び26のCDRを含み、Lrg1と特異的に結合する能力を保持する、(iii)の配列に対して少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有する(iii)の変異体
   を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
3. 抗体が
   (a)配列番号1の重鎖可変領域及び配列番号2の軽鎖可変領域、又は
   (b)配列番号1の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
   (c)配列番号1の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
   (d)配列番号1の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域、又は
   (e)配列番号5の重鎖可変領域及び配列番号2の軽鎖可変領域、又は
   (f)配列番号5の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
   (g)配列番号5の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
   (h)配列番号5の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域、又は
   (i)配列番号7の重鎖可変領域及び配列番号2の軽鎖可変領域、又は
   (j)配列番号7の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
   (k)配列番号7の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
   (l)配列番号7の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域、又は
   (m)配列番号9の重鎖可変領域及び配列番号2の軽鎖可変領域、又は
   (n)配列番号9の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
   (o)配列番号9の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
   (p)配列番号9の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域、又は
   (q)配列番号11の重鎖可変領域及び配列番号2の軽鎖可変領域、又は
   (r)配列番号11の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
   (s)配列番号11の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
   (t)配列番号11の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域、又は
   (u)配列番号13の重鎖可変領域及び配列番号2の軽鎖可変領域、又は
   (v)配列番号13の重鎖可変領域及び配列番号15の軽鎖可変領域、又は
   (w)配列番号13の重鎖可変領域及び配列番号17の軽鎖可変領域、又は
   (x)配列番号13の重鎖可変領域及び配列番号19の軽鎖可変領域
   を含む、請求項1又は2に記載の抗体又はその抗原結合断片。
4. Lrg1のアミノ酸GNKLQVLGKDLLLPQ(配列番号30)と特異的に結合し、Lrg1活性を遮断する抗体又はその抗原結合断片。
5. Lrg1と1nM以下のアフィニティで結合する、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
6. Lrg1との結合について、請求項3に記載の抗体と競合する抗体又はその抗原結合断片。
7. IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4領域であるFc領域を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
8. 抗体又はその抗原結合断片が、Fab断片、F(ab')₂ 断片、Fab'断片、Fd断片、Fv断片、dAb断片、scFv、VHH抗体又はラクダ抗体を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
9. さらなる部分とコンジュゲートしている、請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
10. 請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
11. （a）請求項10に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、又は
    （b）請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、及び請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドの両方を含む宿主細胞、又は
    （c）請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片を発現する宿主細胞。
12. 請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片及び少なくとも1種の医薬上許容される希釈剤又は担体を含む組成物。
13. (a)癌；又は
    (b)血管増殖性状態；又は
    (c)血管増殖を示す腫瘍
    の治療のための医薬組成物の製造における、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の使用。
14. (a)癌が、脳、乳房、腎臓、結腸直腸、肺、前立腺、頭頸部、胃、膵臓、皮膚、子宮頸部、骨、卵巣、精巣及び肝臓癌から選択される；あるいは
    (b)血管増殖性状態が、新血管新生、血管内皮細胞増殖、血管新生、毛細血管拡張又は微小動脈瘤を含む；又は眼の血管増殖性状態である；あるいは
    (c)腫瘍が、脳腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、前立腺腫瘍、頭頸部腫瘍、胃の腫瘍、膵臓腫瘍、皮膚腫瘍、子宮頸部腫瘍、骨の腫瘍、卵巣腫瘍、精巣腫瘍及び肝臓腫瘍から選択される、請求項13に記載の使用。
15. 眼の血管増殖性状態が、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、未熟児網膜症、黄斑性毛細血管拡張症、加齢性黄斑変性症又は脈絡膜新血管新生から選択される、請求項14に記載の使用。
16. (a)血管増殖の治療のための医薬組成物の製造における抗血管新生化合物と組み合わせた；又は
    (b)癌の治療のための医薬組成物の製造における抗癌剤と組み合わせた、
    請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の使用。
17. 血管増殖の治療が、癌の治療である、請求項16に記載の使用。
18. 癌が、脳、乳房、腎臓、結腸直腸、肺、前立腺、頭頸部、胃、膵臓、皮膚、子宮頸部、骨、卵巣、精巣及び肝臓癌から選択される、請求項17に記載の使用。
19. 抗血管新生化合物が、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のアンタゴニスト又はVEGFの可溶性受容体である、請求項16から18のいずれか一項に記載の使用。
20. VEGFアンタゴニストが、
    (a)抗VEGF抗体；又は
    (b)アフリベルセプト；又は
    (c)ベバシズマブ若しくはラニビズマブ
    である、請求項19に記載の使用。
21. 眼の血管増殖性状態の治療のための医薬組成物の製造における、請求項16から18のいずれか一項に記載の使用。
22. 癌を治療するための医薬組成物の製造における、細胞傷害性化合物又は免疫治療薬と組み合わせた、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の使用。

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