EA035861B1 - Антитела человека, связывающиеся с g-белком rsv - Google Patents
Антитела человека, связывающиеся с g-белком rsv Download PDFInfo
- Publication number
- EA035861B1 EA035861B1 EA201591973A EA201591973A EA035861B1 EA 035861 B1 EA035861 B1 EA 035861B1 EA 201591973 A EA201591973 A EA 201591973A EA 201591973 A EA201591973 A EA 201591973A EA 035861 B1 EA035861 B1 EA 035861B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- rsv
- seq
- antibody
- protein
- heavy chain
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 120
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 75
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 71
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 71
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 17
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims description 182
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 19
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 15
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 claims 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 63
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 62
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 48
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 40
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 19
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 18
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 16
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 15
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 12
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 8
- 210000001944 turbinate Anatomy 0.000 description 8
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 7
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 7
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 7
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 6
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 6
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 5
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000011553 hamster model Methods 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 4
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 4
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 4
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- -1 and the like Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 229960000402 palivizumab Drugs 0.000 description 3
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 229940036185 synagis Drugs 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101001037139 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 3-30 Proteins 0.000 description 2
- 101001138089 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1-39 Proteins 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 102100040219 Immunoglobulin heavy variable 3-30 Human genes 0.000 description 2
- 102100020910 Immunoglobulin kappa variable 1-39 Human genes 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 2
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 description 2
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 2
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFZFMHDDZRBTFH-CZEFNJPISA-N 2-[(e)-2-(5-carbamimidoyl-1-benzofuran-2-yl)ethenyl]-1-benzofuran-5-carboximidamide;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.NC(=N)C1=CC=C2OC(/C=C/C=3OC4=CC=C(C=C4C=3)C(=N)N)=CC2=C1 WFZFMHDDZRBTFH-CZEFNJPISA-N 0.000 description 1
- 102100039358 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 206010001889 Alveolitis Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000711895 Bovine orthopneumovirus Species 0.000 description 1
- 208000002330 Congenital Heart Defects Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001035740 Homo sapiens 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 1
- 101000998947 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-46 Proteins 0.000 description 1
- 101001037140 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 3-23 Proteins 0.000 description 1
- 101000839781 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 4-59 Proteins 0.000 description 1
- 101000840257 Homo sapiens Immunoglobulin kappa constant Proteins 0.000 description 1
- 101001138126 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1-16 Proteins 0.000 description 1
- 101001138130 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1-9 Proteins 0.000 description 1
- 101000604674 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 4-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000840271 Homo sapiens Immunoglobulin lambda constant 2 Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100036888 Immunoglobulin heavy variable 1-46 Human genes 0.000 description 1
- 102100040220 Immunoglobulin heavy variable 3-23 Human genes 0.000 description 1
- 102100028405 Immunoglobulin heavy variable 4-59 Human genes 0.000 description 1
- 102100029572 Immunoglobulin kappa constant Human genes 0.000 description 1
- 102100020946 Immunoglobulin kappa variable 1-16 Human genes 0.000 description 1
- 102100020770 Immunoglobulin kappa variable 1-9 Human genes 0.000 description 1
- 102100038198 Immunoglobulin kappa variable 4-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100029620 Immunoglobulin lambda constant 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 101710180643 Leishmanolysin Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102220608415 Lumican_S170C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101000966481 Mus musculus Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 206010037368 Pulmonary congestion Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 102220493287 Spermatid nuclear transition protein 1_I184A_mutation Human genes 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 208000037883 airway inflammation Diseases 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000001988 antibody-antigen conjugate Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 150000001508 asparagines Chemical class 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical class N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003236 bicinchoninic acid assay Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 208000028831 congenital heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 201000001155 extrinsic allergic alveolitis Diseases 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000022098 hypersensitivity pneumonitis Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000007925 intracardiac injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 230000003843 mucus production Effects 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 description 1
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 1
- 102200062551 rs121909367 Human genes 0.000 description 1
- 102220289727 rs1253463092 Human genes 0.000 description 1
- 102200124876 rs28928896 Human genes 0.000 description 1
- 102220084324 rs863224912 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000017960 syncytium formation Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012956 testing procedure Methods 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6839—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting material from viruses
- A61K47/6841—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting material from viruses the antibody targeting a RNA virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
- G01N2333/135—Respiratory syncytial virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
Abstract
Изобретение относится к выделенным антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с G-белком RSV и которые способны нейтрализовать RSV подтипов A и B, и их применению в диагностике, профилактике и/или лечении инфекций, вызванных RSV.
Description
Область настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к медицине. Настоящее изобретение, в частности, относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые специфично связываются с гликопротеином связывания (G-белок) респираторного синцитиального вируса человека (RSV) и которые нейтрализуют RSV. Настоящее изобретение также относится к диагностическим, профилактическим и терапевтическим способам, в которых применяют антитела к RSV.
Предпосылки изобретения
Респираторный синцитиальный вирус человека (RSV) - это вирус, содержащий одноцепочечную РНК с отрицательной полярностью, из семейства Paramyxoviridae, которое также включает типичные респираторные вирусы, такие как вызывающие корь и эпидемический паротит. Существует два основных подтипа RSV: подтип A и подтип B. RSV реплицируется в верхних дыхательных путях и затем распространяется в нижние дыхательные пути, вызывая бронхиолит или пневмонию. Вирус вызывает воспаление, отек дыхательных путей, увеличивает выработку слизи и разрушает респираторный эпителий.
По предварительным подсчетам установлено 64 млн случаев респираторных заболеваний и 160000 смертельных исходов во всем мире, обусловленные RSV-индуцированным заболеванием. Тяжелая инфекция RSV чаще всего проявляется у детей и младенцев, особенно у недоношенных детей. Основные проблемы со здоровьем, такие как хронические заболевания легких или врожденные пороки сердца могут существенно увеличить риск серьезной болезни. Инфекции RSV также вызывают серьезную болезнь у пожилых людей, индивидуумов с хроническими заболеваниями легких и у взрослых с ослабленным иммунитетом, таких как реципиенты, которым пересадили костный мозг.
Были исследованы несколько подходов предупреждения и лечения инфекции RSV. Иммуноглобулин для внутривенного введения (RSV-IGIV; RespiGam®), выделенный у доноров, и моноклональное антитело паливизумаб (SYNAGIS®) были одобрены для применения с целью профилактики RSV у недоношенных детей с высоким риском заболеваемости. Однако вакцина или коммерчески доступное средство для лечения RSV до настоящего времени не доступны. Только рибавирин - ингибитор РНК одобрен для лечения инфекции RSV. Для того чтобы лечение инфекции RSV было эффективным, требуются высокие дозы, повторные введения и/или большие объемы продуктов на основе антител, таких как паливизумаб, из-за их низкой эффективности.
RSV имеет два основных поверхностных гликопротеина, F и G. F-белок опосредует слияние, обеспечивая проникновение вируса в цитоплазму клетки, и способствует образованию синцития in vitro. Последовательность F-белка является высококонсервативной (~90%) среди штаммов RSV (Johnson and Collins, J Gen Virol. (1988) 69: 2623-2628). Единственное представленное на рынке моноклональное антитело паливизумаб направлено против F-белка RSV.
G-белок RSV является поверхностным белком, который в значительной степени гликозилирован и функционирует в качестве белка связывания. В отличии от F-белка, G-белок является высоковариабельным среди штаммов, за исключением центрального консервативного домена (CCD), содержащего аминокислотные остатки 153-184 из G-белка в штамме A2 RSV или соответствующее аминокислотные остатки в других штаммах. Как центральный консервативный домен, так и смежные участки (остатки 145193) являются ограниченными жесткими и тяжелыми O-гликозилированными муциноподобными участками. N-концевая половина центрального консервативного домена содержит небольшой участок, который является консервативным среди более 700 штаммов. C-концевая половина содержит 4 консервативных цистеина, связанные в топологию 1-4, 2-3, и уложена в цистеиновую петлю.
Хотя пассивная иммунизация с использованием антител, направленных на G-белок, обычно считалась непрактичной из-за отсутствия консервативности последовательностей среди штаммов, известны нейтрализующие моноклональные антитела, которые связываются с G-белком RSV. В публикации Anderson, L. J. et al. (J. Virol. (1988) 62:4232-4238) описана нейтрализующая способность смеси из мышиных моноклональных антител к F и G, одно из которых связывается с G-белком RSV (т.е. 131-2G). Антигенный сайт этого антитела был позже определен Sullender (Virol. (1995) 209:70-79). Было обнаружено, что это антитело связывает вирусы как группы A, так и группы B RSV, относящиеся к основным штаммам RSV. Кроме того, в WO 2009/055711 раскрыты антитела, такие как 3D3 и 3G12, которые являются иммунореактивными с консервативным мотивом в G-белке RSV A2 и имеют нейтрализующую активность по отношению к A и B подтипам RSV. Было показано, что эти антитела распознают линейные эпитопы в центральном консервативном домене, но их не тестировали на предпочтительных животных моделях (т.е., хлопковых хомяках) для оценки антител к RSV и вакцин против RSV.
Принимая во внимание степень тяжести респираторных заболеваний, вызываемых RSV, в частности, у маленьких детей и пожилых людей, существует постоянная потребность в эффективных средствах для профилактики и лечения инфекции RSV.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связываются с G-белком RSV и способны нейтрализовать RSV. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты предпочтительно способны специфически связываться и нейтрализовать RSV
- 1 035861 обоих подтипов A и B. Предпочтительно антитела являются антителами человека. Антитела связываются с эпитопами в центральном консервативном негликозилированном участке (также называемом центральным консервативным доменом, CCD) G-белка RSV.
Антитела и антигенсвязывающие фрагменты обладают высокой аффинностью к G-белку и обладают потенциальной нейтрализующей способностью. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению являются применимыми в качестве диагностических, профилактических и/или терапевтических средств, оба по отдельности и в комбинации с другими диагностическими, профилактическими и/или терапевтическими средствами.
Настоящее изобретение дополнительно предлагает композиции, которые содержат одним или несколько антител по настоящему изобретению и/или их антигенсвязывающие фрагменты. Настоящее изобретение также предлагает диагностические, профилактические и терапевтические способы, в которых применяют антитела к RSV. Профилактические и терапевтические способы включают введение людямсубъектам антител к RSV и/или их антигенсвязывающих фрагментов для предупреждения или лечения инфекции RSV и опосредованных заболеваний RSV или состояний, и/или уменьшение тяжести одного или более симптомов инфекции RSV. Комбинации множества разных антител к RSV и/или их антигенсвязывающих фрагментов и/или с другими антителами к RSV можно применять для комбинированной терапии. Также могут предлагаться композиции, содержащее антитела к RSV и/или их антигенсвязывающие фрагменты в комбинации с другими профилактическими или терапевтическими средствами. Настоящее изобретение также предлагает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих антитела или их антигенсвязывающие фрагменты.
Антитела по настоящему изобретению отличаются тем, что эти антитела являются более эффективными против RSV типа A и B, чем любые известные антитела к G RSV, в частности, чем известные ранее моноклональные антитела 3D3 к G RSV, по меньшей мере, в анализе нейтрализации in vitro.
Антитела по настоящему изобретению связываются с уникальными эпитопами на G-белке RSV.
Согласно определенным вариантам осуществления антитела содержат тяжелую цепь с CDR3, содержащим мотив CXXXXC в его аминокислотной последовательности.
Согласно определенным вариантам осуществления антитела и их антигенсвязывающие фрагменты отличаются тем, что они действуют аддитивно и/или синергически с антителами к F RSV.
Описание фигур
На фиг. 1 показаны профили связывания для белков Ga RSV и Gb RSV. Было проведено исследование IgG с использованием анализов ELISA в отношении их способности связывать эктодомен рекомбинантных Ga- и Gb-белков RSV. Незакрашенные кружки (пунктирная линия) обозначают связывание с Ga (RSV A/Long), а закрашенные кружки (сплошная линия) обозначают связывание с Gb (RSV B/B1).
На фиг. 2 приведены профили нейтрализации в отношении штаммов RSV-A и RSV-B. Проводили тестирование IgG в реакции нейтрализации в отношении их способности нейтрализовать штаммы RSV-A и RSV-B. Пустые круги (пунктирная линия) обозначают нейтрализацию RSV-A (RSV A/A2), а заретушированные круги (сплошная линия) обозначают нейтрализацию RSV-B (RSV В/18537).
На фиг. 3 показано связывание моноклональных антител, специфичных к G-белку RSV, с пептидами из G RSV (ELISA). Короткий и длинный пептиды из G RSV охватывают центральный консервативный домен (табл. 15), используемый в экспериментах связывания в ELISA с варьирующими концентрациями mAb (моноклональных антител), специфичных к G RSV: CB003.1 (закрашенные черные кружки, сплошная линия), CB10.7 (незакрашенные черные кружки, пунктирная линия), или отсутствие моноклональных антител (закрашенные светло-серые кружки).
На фиг. 4 картирование минимального эпитопа в PepScan. Активность связывания антител, специфичных к G-белку RSV, с полностью перекрывающимися 5-мерными, 8-мерными, 10-мерными, 14мерными, 18-мерными, 25-мерными и 32-мерными пептидами из центрального участка (остатки 145-201 в у RSV-G типа A и типа B). Активность связывания с пептидом приведена в виде вертикальной линии пропорционально сигналу PepScan ELISA.
На фиг. 5 анализ полных замен эпитопа CB003.1 и CB010.7 с использованием PepScan. Связывающая активность моноклональных антител CB003.1 и CB010.7 при 100 и 30 нг/мл соответственно с пептидом показана как вертикальная линия, пропорциональная сигналу Pepscan ELISA. Каждая группа из 20 линий соответствует полному замещающему набору для каждого аминокислотного положения в исходном 14-мерном пептиде (FHFEVFNFVPCSIC). Внутри каждой группы из 20 линий замены расположены в алфавитном порядке, основываясь на коде аминокислоты, состоящем из одной буквы (ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY), а реакционная способность исходного 14-мерного пептида показана в виде столбца серого цвета.
На фиг. 6 аланиновое сканирование центрального участка G-белка RSV (PepScan). Замены на аланин во всех положениях в пептидах, соответствующие остаткам 161-192 центрального домена RSV-G типа A (левый график) и типа B (правый график). Аланин в положении 180 типа A был заменен глицином. Реактивность исходных пептидов приведена в сером столбце.
На фиг. 7 показано связывание моноклональных антител с встречающимися в природе вариантами центрального участка G-белка RSV. Связывание mAb CB003.1 и CB010.7 с разными пептидами соответ- 2 035861 ствует доступным вариантам типа A (верхний рисунок) и типа B (нижний рисунок). Активность пептидов дикого типа показана в виде серого столбца.
На фиг. 8 показана профилактическая эффективность mAb к G RSV в модели хлопкового хомяка, которую инфицировали штаммом RSV-A/Long, по вирусной нагрузке в легких и носовых раковинах на 4 день после заражения.
На фиг. 9 показана терапевтическая эффективность mAb к G RSV в модели хлопкового хомяка, которую инфицировали штаммом RSV-A/Long, по вирусной нагрузке в легких и носовых раковинах на 4 день после заражения.
На фиг. 10 показана терапевтическая эффективность mAb к G RSV в модели хлопкового хомяка, которую инфицировали штаммом RSV-A/Long, по гистопатологической оценке в 6 день после заражения.
Описание настоящего изобретения Определения
Ниже представлены определения выражений, используемых в настоящем изобретении.
Предусматривается, что после используемых в данном документе терминов включенный или включающий следуют слова без ограничения.
Используемый в данном документе термин антитело относится к молекулам иммуноглобулинов, включая моноклональные антитела, такие как химерные, гуманизированные или человеческие моноклональные антитела. Термин антитело включает все известные в данной области классы и подклассы иммуноглобулинов. В зависимости от аминокислотной последовательности в константном домене тяжелой цепи антитела можно разделить на пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.
Термин антигенсвязывающий фрагмент относится к антигенсвязывающим и/или вариабельным доменам, содержащим фрагменты иммуноглобулинов, которые конкурируют с интактным иммуноглобулином за специфичное связывание с партнером иммуноглобулинов, т.е. G-белком RSV. Независимо от структуры, антигенсвязывающий фрагмент связывается с тем же антигеном, который распознается интактным иммуноглобулином, антигенсвязывающие фрагменты включают, в частности, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, фрагменты участка, определяющего комплементарность (CDR), одноцепочечные антитела (scFv), двухвалентные одноцепочечные антитела, (одно)доменные антитела, диатело, триотело, тетратело, (поли)пептиды, которые содержат по меньшей мере фрагмент иммуноглобулина, что является достаточным чтобы предать специфичности антигену, который связывается с (поли)пептидом и т.д. антигенсвязывающие фрагменты могут содержать пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность как минимум из 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 или 250 повторяющихся аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности антитела, антигенсвязывающие фрагменты можно получить синтетически или ферментативным или химическим расщеплением интактных иммуноглобулинов, или они могут быть генетически сконструированы путем использования методик рекомбинантной ДНК. Способы получения хорошо известны из уровня техники и описаны, например, для антител: A Laboratory Manual, Edited by: E. Harlow and D, Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут иметь один или несколько сайтов связывания. При наличии более одного сайта связывания сайты связывания могут быть идентичны друг другу или они могут отличаться.
Используемый в настоящем документе термин моноклональное антитело относится к молекулам антитела одной специфичности. Моноклональное антитело характеризуется одной специфичностью и аффинностью связывания в отношении конкретного эпитопа. Соответственно, термин моноклональное антитело человека относится к антителу, характеризующемуся одной специфичностью связывания, которое имеет вариабельные и константные участки, полученные от последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека или основанные на них или полученные от полностью искусственных последовательностей. Способ получения моноклонального антитела не относится к вопросу специфичности связывания.
Используемый в настоящем документе термин функциональный вариант относится к антителу, которое содержит нуклеотидную и/или аминокислотную последовательность, которая изменена на один или несколько нуклеотидов и/или аминокислот в сравнении с нуклеотидными и/или аминокислотными последовательностями исходного антитела, и которое способно конкурировать за специфическое связывание с партнером по связыванию, т.е. RSV, с исходным антителом. Другими словами, модификация аминокислотной и/или нуклеотидной последовательности исходного антитела существенно не влияет или не изменяет характеристики связывания антитела, кодируемого нуклеотидной последовательностью, или содержащего аминокислотную последовательность; т.е. антитело все еще способно специфично распознавать и связывать свою мишень. Функциональный вариант может иметь модификации в консервативной последовательности, в том числе нуклеотидные и аминокислотные замены, присоединения и делеции. Эти модификации можно вводить с помощью стандартных методик, известных в данной области,
- 3 035861 таких как сайт-направленный мутагенез и опосредованный ПЦР мутагенез, и они могут включать естественные, а также неестественные нуклеотиды и аминокислоты.
Используемый в настоящем документе термин нейтрализующий применительно к антителам по настоящему изобретению относится к антителам, которые способны предупреждать или ингибировать инфицирование вирусом клетки посредством их нейтрализующего или ингибирующего биологического эффекта и/или снижения инфекционного титра RSV, вне зависимости от механизма посредством которого достигается нейтрализация. Нейтрализация также может достигаться ингибированием контакта или адгезии вируса с поверхностью клетки, или ингибированием слияния вирусной и клеточной мембран после контакта вируса с клеткой-мишенью и им подобными.
Используемый в настоящем документе термин специфичное связывание относится к взаимодействию антитела с его партнером по связыванию, например антиген обозначает что взаимодействие зависит от присутствия конкретной структуры, например антигенной детерминанты или эпитопа на партнере по связыванию. Другими словами, антитело предпочтительно связывается или распознает партнера по связыванию даже если партнер по связыванию присутствует в смеси из других молекул или организмов. Связывание может быть опосредовано ковалентными или нековалентными взаимодействиями или комбинацией и тех, и других. Другими словами, термин специфичное связывание означает, что антитело является специфично иммунореактивным по отношению к антигенной детерминанте или эпитопу, и не является иммунореактивным с другими антигенными детерминантами и эпитопами. Антитело, которое (иммуно)специфично связывается с антигеном, может связываться с другими пептидами или полипептидами с низкой аффинностью, как определено, например, для радиоиммунного анализа (RIA), иммуноферментного анализа (ELISA), BIACORE и других анализов, известных из уровня техники. Антитела или их фрагменты, которые специфично связываются с антигеном, могут характеризоваться перекрестной реактивностью с родственными антигенами, несущими тот же эпитоп. Предпочтительно антитела или их фрагменты, которые специфично связываются с антигеном, не проявляют перекрестную реактивность с другими антигенами.
Подробное описание настоящего изобретения
Согласно первому аспекту настоящее изобретение предлагает антитела и антигенсвязывающие фрагменты, способные к специфичному связыванию G-белка респираторного синцитиального вируса человека (RSV), и которые способны нейтрализовать RSV. Антитела предпочтительно способны специфично связывать и нейтрализовать RSV обоих подтипов A и B. Предпочтительно антитела являются моноклональными антителами человека.
В соответствии с настоящим изобретением антитела и антигенсвязывающие фрагменты связываются с эпитопами в центральном консервативном домене (CCD) G-белка RSV. Центральный консервативный домен охватывает аминокислотную последовательность, содержащую аминокислоты 153-184 Gбелка у штамма A2 RSV (или соответствующие аминокислотные остатки у других штаммов). В некоторых вариантах осуществления антитела и антигенсвязывающие фрагменты связываются с эпитопом, содержащим один или несколько аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, содержащей аминокислотные остатки 161-169, в частности одну или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности, содержащей аминокислотные остатки 162-168 G-белка RSV A2 штамма RSV (нумерация согласно RSV штамму A2).
Таким образом, предложены антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с эпитопом в G-белке, находящемся в сайте, представляющем собой N-конец цистеиновой петли. Согласно изобретению было показано, что несмотря на то, что, по меньшей мере, некоторые из нейтрализующих антител настоящего изобретения связываются с похожим, но не идентичным линейным эпитопом, как, например, ранее описанным моноклональным антителом 3D3 (WO 2009/055711), антитела настоящего изобретения обладают более сильной нейтрализующей активностью согласно результатам количественного анализа нейтрализации in vitro. Согласно изобретению было показано, что антитела данного изобретения связываются с линейным эпитопом присущим только им образом. Так, согласно данному изобретению, было показано, что эти антитела имеют отличающуюся специфичность боковой цепи по отношению к эпитопу 161-169 RSV типа A и B (нумерация согласно RSV штамму A2). Это отражено, например, в результатах анализа замен (см. пример 11), которые показывают, что эпитоп антител данного изобретения имеет другие основные остатки по сравнению, например, с 3D3.
Было показано, что антитела и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению являются более активными против RSV типа A и B, чем любые другие из известных антител к G RSV, в частности, более активные чем известные моноклональные антитела 3D3 к G RSV, в in vitro анализе нейтрализации, в частности в in vitro анализе, описанном в примере 7.
В определенных вариантах осуществления IC50 (эффективное разведение для 50% нейтрализации бляшкообразования) антител и антигенсвязывающих фрагментов к штамму A/A2 RSV (ATCC № по кат. VR-1540) было ниже 40 нг/мл и/или IC50 для штамма B/18537 RSV (ATCC № по кат. VR-1589) было ниже 30 нг/мл.
В одном варианте осуществления антитело не является антителом, выбранным из группы, состоящей из 1F12, 3G12, 1A5, 3D3, 1G1, 2B11, 5D8, 2D10, 3F9, 1D4, 1G8, 6A12, 10C6 (как описано в публика- 4 035861 ции WO 2009/055711).
В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела по данному изобретению конкурирует за связывание с G-белком RSV с антителом, выбранным из группы, состоящей из 1F12,
3G12, 1A5, 3D3, 1G1, 2B11, 5D8, 2D10, 3F9, 1D4, 1G8, 6A12 и 10C6 (как описано в публикации WO
2009/055711).
Согласно определенным вариантам осуществления антитела содержат тяжелую цепь с CDR3, содержащим мотив CXXXXC в его аминокислотной последовательности.
В определенных вариантах осуществления антитело включает тяжелую цепь, содержащую:
a) CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 1, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2 и CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 3,
b) CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 4, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 5 и CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 6,
c) CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 7, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 8 и CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 9,
d) CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 10, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 11 и CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 12,
e) CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 25, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 26 и CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 27 или
f) CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 31, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 32 и CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 33.
В определенных вариантах осуществления антитело включает легкую цепь, содержащую:
a) CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 13, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 14 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 15,
b) CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 16, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 17 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 18,
c) CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 19, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 20 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 21,
d) CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 22, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 23 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 24,
e) CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 28, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 29 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 30 или
f) CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 34, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 35 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 36.
Согласно определенным вариантам осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из:
a) антитела, содержащего CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 1, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2 и CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 3, CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 13, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 14 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 15;
b) CDR1-участка тяжелой цепи с SEQ ID NO: 4, CDR2-участка тяжелой цепи с SEQ ID NO: 5 и CDR3-участка тяжелой цепи с SEQ ID NO: 6 и CDR1-участка легкой цепи с SEQ ID NO: 16, CDR2участка легкой цепи с SEQ ID NO: 17 и CDR3-участка легкой цепи с SEQ ID NO: 18;
c) антитела, содержащего CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 7, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 8 и CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 9, CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 19, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 20 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 21;
d) антитела, содержащего CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 10, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 11 и CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 12, CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 22, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 23 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 24;
e) антитела, содержащего CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 25, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 26 и CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 27, CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 28, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 29 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 30; и
f) антитела, содержащего CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 31, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 32 и CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 33, CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 34, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 35 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 36.
В определенных вариантах осуществления антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 37, вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 39, вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 41, вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 43, вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 45, или вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 47.
В определенных вариантах осуществления антитело содержит вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 38, вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 40, вариабельный участок легкой цепи,
- 5 035861 содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 42, вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 44, вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 46, или вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 48.
Согласно определенным вариантам осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из
a) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 37, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 38;
b) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 39, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 40;
c) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 41, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 42;
d) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 43, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 44;
e) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 45, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 46; и
f) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 47, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 48.
Согласно определенным вариантам осуществления предложены антигенсвязывающие фрагменты описанных выше антител. Антигенсвязывающие фрагменты предпочтительно связываются с одним и тем же эпитопом.
Антитела и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению связываются с разными эпитопами при сравнении с эпитопами известных антител к G-белку RSV, таких как, например, антитело 3D3 к G RSV, которое, как было показано, также связывается с эпитопом в центральном консервативном домене G-белка RSV. Под связыванием с разными эпитопами подразумевают, что антитело связывается с разными критическими аминокислотными остатками по сравнению с известными антителами, такими как 3D3. Более того, показано, что антитела по настоящему изобретению являются более активными, чем любые другие известные антитела, связывающие G-белок RSV, при измерении в in vitro анализе нейтрализации; в частности, in vitro анализе нейтрализации, как описано в примере 7.
Согласно определенным вариантам осуществления антитела действуют синергически, когда применяются в комбинации с антителами, связывающими F-белок RVS. Используемый в настоящем документе термин синергический означает, что комбинированный эффект антител или антигенсвязывающих фрагментов, когда их применяют в комбинации, выше чем их аддитивные эффекты при отдельном применении. Способ расчета синергии осуществляют с помощью показателя аддитивности. Общее представление о показателе аддитивности (combination index, CI) было описано у Chou and Talalay (Adv Enzyme Regul., 22:27-55, 1984).
Согласно определенным вариантам осуществления антитела и антигенсвязывающие фрагменты предназначены для применения в качестве лекарственного препарата и предпочтительно для применения в диагностике, терапии и/или профилактике инфекции RSV, вызываемой подтипами A и/или B RSV. Используемый в настоящем документе термин лечить или лечение относится к снижению вирусной нагрузки у субъекта в случае, если он уже инфицирован RSV, и/или для уменьшения интенсивности симптомов заболевания у такого субъекта. Такие симптомы включают в себя, например, бронхиолит, воспаление дыхательных путей, застой в легких и затрудненное дыхание. Предупреждение или профилактика охватывает замедление или уменьшение распространения RSV, или замедление или снижение проявления, развития или прогрессирования одного или нескольких симптомов, ассоциированных с инфекцией RSV.
Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению. В определенных вариантах композиции являются фармацевтическими композициями, содержащими по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением и по меньшей мере фармацевтически приемлемое вспомогательное средство. Под фармацевтически приемлемым наполнителем подразумевают любое инертное вещество, которое сочетают с активной молекулой, такой как антитело, для получения удобной дозировочной формы. Фармацевтически приемлемое вспомогательное средство представляет собой вспомогательное средство, которое в применяемых дозах и концентрациях является нетоксичными для пациентов, и является совместимым с другими ингредиентами в составе, содержащем лекарственное средство, другое средство или антитело. Фармацевтически приемлемые наполнители широко применяются и известны из уровня техники.
- 6 035861
Согласно еще одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению антитела или антигенсвязывающего фрагмента настоящего изобретения в получении лекарственного препарата для диагностики, профилактики и/или лечения инфекции RSV. Настоящее изобретение также относится к способам предупреждения или лечения инфекции RSV путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества антитела в соответствии с настоящим изобретением. Термин терапевтически эффективное количество относится к количеству антител, как определено в данном документе, которое является эффективным для предупреждения, уменьшения интенсивности и/или лечения состояния, возникшего в результате инфекции RSV. Уменьшение интенсивности, используемое в данном документе, может относится к снижению видимых или заметных симптомов заболевания, вирусемии или любого другого заметного проявления инфекции RSV.
Для применения в терапии антитела или их фрагменты составляют в фармацевтическую композицию, используя подходящие вспомогательные средства, и вводят в соответствии со стандартными протоколами. Фармацевтические композиции могут включать одно или несколько антител или антигенсвязывающих фрагментов согласно данному изобретению. Могут присутствовать дополнительные терапевтические средства, включая одно или несколько антител, которые характеризуются иммунореактивностью в отношении F-белка RSV, или другие терапевтические средства, которые эффективны против RSV или воспаления. Таким образом, противовоспалительные средства, такие как стероидные и нестероидные противовоспалительные соединения, могут входить в состав композиции.
Согласно определенным вариантам осуществления можно применять полное антитело, т.е. содержащее комплемент-связывающий Fc-участок.
Согласно определенным вариантам осуществления, например, для уменьшения воспалительной реакции в легких, применяют только антигенсвязывающие фрагменты антител. Введение смесей иммуноспецифичных фрагментов и целых антител также включено в объем настоящего изобретения.
Лечение может быть целесообразным в группе пациентов, восприимчивой к инфекции RSV. Такая группа пациентов включает без ограничений, например, пожилых (например, >50 лет, >60 лет и предпочтительно >65 лет), молодых (например, <5 лет <1 лет), госпитализированных пациентов, пациентов с ослабленным иммунитетом и пациентов, которые получали лечение противовирусными соединениями, но показали недостаточный ответ на лечение противовирусными соединениями.
Введение композиций антител по настоящему изобретению, как правило, осуществляют посредством инъекции, обычно внутримышечной или внутривенной инъекции. Лекарственные формы получают способами, известными в данной области, для введения композиций антител. Подходящие лекарственные формы можно найти в стандартных справочниках, таких как Remington's Pharmaceutical Sciences, последнее издание, Mack Publishing Co., Easton, PA, включены в настоящий документ путем ссылки. Составы, как правило, представляют собой составы, которые подходят для парентерального введения, в том числе изотонические растворы, которые включают буферы, антиоксиданты и им подобные, а также эмульсии, которые включают системы доставки, такие как липосомы, мицеллы и наночастицы.
Использование необходимых протоколов и лекарственных форм зависят от заключения лечащего врача, а также от конкретного состояния субъекта. Уровни дозировок будут зависеть от возраста, общего состояния здоровья и тяжести инфекции, при необходимости, от субъекта.
Другой аспект настоящего изобретения включает в себя функциональные варианты антител, как определено в настоящем документе. Молекулы считаются функциональными вариантами антитела в соответствии с настоящим изобретением, если варианты способны конкурировать за специфическое связывание с эпитопом RSV или его фрагментом с исходными или эталонными антителами. Другими словами, молекулы считаются функциональными вариантами антитела в соответствии с настоящим изобретением, если функциональные варианты все еще способны связываться с одним и тем или перекрывающимся эпитопом RSV или его фрагментом. Функциональные варианты включают без ограничения производные, которые, по сути, подобны по основной структурной последовательности, включая те, которые имеют модификации в Fc-рецепторе или других участках, связанных с эффекторными функциями, и/или которые содержат, например, in vitro или in vivo модификации, химические и/или биохимические, не встречающиеся в исходном антителе. Такие модификации включают, помимо прочих, ацетилирование, ацилирование, ковалентное присоединение нуклеотидов или производных нуклеотидов, ковалентное присоединение липидов или производных липидов, перекрестное сшивание, формирование дисульфидных связей, гликозирование, гидроксилирование, метилирование, окисление, ПЭГилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование и им подобные.
В качестве альтернативы, функциональные варианты могут представлять собой антитела, которые определены в настоящем изобретении, содержащие аминокислотную последовательность, которая содержит замены, вставки, делеции или их комбинации по одной или более аминокислотам по сравнению с аминокислотными последовательностями исходных антител. Кроме того, функциональные варианты могут характеризоваться усечениями аминокислотной последовательности либо на амино-, либо на карбоксильном концах, либо на обоих концах. Функциональные варианты в соответствии с настоящим изобретением могут иметь одинаковую или различные, либо более высокую, либо более низкую аффинно
- 7 035861 сти связывания по сравнению с исходным антителом, но все еще способны связываться с RSV или его фрагментом. Например, функциональные варианты в соответствии с настоящим изобретением могут характеризоваться повышенной или пониженной аффинностью связывания в отношении RSV или его фрагменту по сравнению с исходными антителами. Функциональные варианты, подразумеваемые как подпадающие в объем настоящего изобретения, характеризуются по меньшей мере от приблизительно 50 до приблизительно 99%, предпочтительно по меньшей мере от приблизительно 60 до приблизительно 99%, более предпочтительно по меньшей мере от приблизительно 70 до приблизительно 99%, еще более предпочтительно по меньшей мере от приблизительно 80 до приблизительно 99%, наиболее предпочтительно по меньшей мере от приблизительно 90 до приблизительно 99%, в частности, по меньшей мере от приблизительно 95 до приблизительно 99% и, в частности, по меньшей мере от приблизительно 97 до приблизительно 99% идентичностью и/или гомологией аминокислотной последовательности с определенными в данном документе исходными антителами. Для оптимального выравнивания подлежащих сравнению аминокислотных последовательностей и для определения похожих или идентичных аминокислотных остатков можно применять компьютерные алгоритмы, такие как, помимо прочих, Gap или Bestfit, которые известны специалистам в данной области. Функциональные варианты можно получить путем изменения исходных антител или их частей с помощью общих способов молекулярной биологии, известных из уровня техники, включая без ограничений ПЦР сниженной точности, олигонуклеотиднаправленный мутагенез, сайт-направленный мутагенез или шаффлинг тяжелой и/или легкой цепи.
Настоящее изобретение также предлагает иммуноконъюгаты, т.е. молекулы, содержащие по меньшей мере одно антитело, антигенсвязывающий фрагмент или функциональный вариант или, дополнительно содержащее по меньшей мере одну метку, например, помимо прочего, выявляемый фрагмент/выявляемое средство. Также в настоящем изобретении предусмотрены смеси с иммуноконъюгатами в соответствии с настоящим изобретением или смеси по меньшей мере с одним иммуноконъюгатом в соответствии с настоящим изобретением или другой молекулой, такой как терапевтическое средство или другое антитело или иммуноконъюгат. В дополнительных вариантах осуществления иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут содержать более одной метки. Эти метки могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга, и они могут быть нековалентно присоединены к антителам/нековалентно конъюгированы с ними. Метка (метки) может быть непосредственно присоединена к антителам/конъюгирована с ними посредством ковалентного связывания. Альтернативно, метка(метки) может быть присоединена к антителам/конъюгирована с ними посредством одного или нескольких сшивающих соединений. Методики конъюгирования меток с антителами хорошо известны специалистам в данной области. Метки иммуноконъюгатов по настоящему изобретению могут представлять собой терапевтические средства, но также они могут представлять собой выявляемые фрагменты/средства. Метками, подходящими для применения в терапии и/или в предупреждении, могут быть токсины или их функциональные части, антибиотики, ферменты, другие антитела, которые повышают фагоцитоз и иммуностимуляцию. Иммуноконъюгаты, содержащие выявляемое средство, можно применять в диагностических целях, например, для оценки того, был ли субъект инфицирован RSV, или для отслеживания развития или прогресса инфекции RSV как части процедуры клинического тестирования, например, для определения эффективности данной схемы лечения. Тем не менее, их также можно применять для других связанных с выявлением, и/или аналитических, и/или диагностических целей. Выявляемые фрагменты/средства включают, но не ограничиваются ими, ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминисцентные материалы, биолюминисцентные материалы, радиоактивные материалы, металлы, испускающие позитроны, и не радиоактивные ионы парамагнитных металлов. Метки, применяемые для мечения антител для связанных с выявлением, и/или аналитических, и/или диагностических целей, зависят от конкретных применяемых, связанных с выявлением/аналитических/диагностических методик и/или способов, таких как, помимо прочих, иммуногистохимическое окрашивание образцов (ткани), выявление с помощью проточной цитометрии, выявление с помощью сканирующей лазерной цитометрии, флуоресцентные иммуноанализы, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), радиоиммунологические анализы (RIA), биоанализы (например, анализы фагоцитоза), применения вестерн-блоттинга и т.д. Подходящие метки для связанных с выявлением/аналитических/диагностических методик и/или способов хорошо известны из уровня техники и доступны специалистам в данной области.
Кроме того, антитела человека или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению также могут быть прикреплены к твердым подложкам, которые особенно пригодны для иммуноанализов in vitro или для очистки RSV или его фрагментов. Для облегчения очистки антитела по настоящему изобретению можно слить с маркерными последовательностями, такими как пептид. Примеры включают без ограничений гекса-гистидиновую метку, гемагглютининовую (HA) метку, myc-метку или flag-метку.
Альтернативно, антитело можно коньюгировать со вторым антителом с получением гетероконьюгата антител. Согласно другому аспекту антитела по настоящему изобретению можно конъюгировать с одним или несколькими антигенами/присоединены к ним. Предпочтительно, эти антигены представляют собой антигены, которые распознаются иммунной системой субъекта, которому вводят конъюгат антитело-антиген. Антигены могут быть одинаковыми, но также могут отличаться друг от друга. Способы конъюгации для присоединения антигенов к антителам хорошо известны из уровня техники и включают
- 8 035861 без ограничений применение сшивающих средств.
После получения иммуноконъюгатов химическим способом путем коньюгирования, непосредственно или опосредованно, посредством, например, линкера, иммуноконъюгаты можно получить в виде белков слияния, содержащих антитела по настоящему изобретению и подходящую метку. Белки слияния можно получить с помощью способов, известных из уровня техники, таких как, например, рекомбинантные способы, путем конструирования молекул нуклеиновых кислот, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела, в рамке с нуклеотидными последовательностями, кодирующими подходящую метку (метки), а затем экспрессии молекул нуклеиновых кислот.
Настоящее изобретение кроме того предлагает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих антитело, антигенсвязывающий фрагмент или функциональный вариант согласно настоящему изобретению. Такие молекулы нуклеиновых кислот можно применять в качестве промежуточных продуктов с целью клонирования, например, в описанном выше процессе созревания аффинности. Согласно предпочтительному варианту осуществления молекулы нуклеиновых кислот представляют собой выделенные или очищенные молекулы. Специалист в данной области поймет, что функциональные варианты данных молекул нуклеиновых кислот также предусмотрены как часть настоящего изобретения. Функциональные варианты представляют собой последовательности нуклеиновых кислот, которые могут непосредственно транслироваться с помощью стандартного генетического кода с получением аминокислотной последовательности, идентичной транслированной с исходных молекул нуклеиновых кислот. Предпочтительно молекулы нуклеиновых кислот кодируют антитела, содержащие описанные выше CDR-участки. В дополнительных вариантах осуществления молекулы нуклеиновых кислот кодируют антитела, которые содержат два, три, четыре, пять или даже шесть CDR-участков антител по настоящему изобретению.
Другим аспектом настоящего изобретение является обеспечение векторов, т.е. конструкций на основе нуклеиновых кислот, содержащих одну или несколько молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Векторы могут быть получены из плазмид, таких как, помимо прочих, F, R1, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti и т.д.; космид, фагов, таких как лямбда, лямбдоидный, M13, Mu, P1, P22, Qe, T-even, Todd, T2, T4, T7 и т.д.; растительных вирусов. Векторы можно применять для клонирования и/или для экспрессии антител по настоящему изобретению и даже можно применять для генной терапии. Также настоящим изобретением охватываются векторы, содержащие одну или несколько молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, функционально связанные с одной или несколькими регулирующими экспрессию молекулами нуклеиновых кислот. Выбор вектора зависит от соблюдаемых процедур рекомбинации и используемого хозяина. Введение векторов в клетки-хозяева может быть произведено с помощью, помимо прочего, трансфекции с использованием фосфата кальция, вирусной инфекции, трансфекции, опосредованной DEAE-декстраном, трансфекции с использованием липофектамина или электропорации. Векторы могут автономно реплицироваться или могут реплицироваться вместе с хромосомой, в которую они были интегрированы. Предпочтительно векторы содержат один или несколько маркеров для отбора. Выбор маркеров может зависеть от выбранных клеток хозяев, хотя это не является решающим для настоящего изобретения, что хорошо известно специалистам в данной области. Они включают без ограничения канамицин, неомицин, пуромицин, гигромицин, зеоцин, ген тимидин-киназы из вируса простого герпеса (HSV-TK), ген дигидрофолат-редуктазы из мыши (dhfr). Векторы, содержащие одну или несколько молекул нуклеиновых кислот, кодирующих антитела человека, которые описаны выше, функционально связанные с одной или несколькими молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими белки или пептиды, которые можно использовать для выделения антител человека, также охватываются настоящим изобретением. Эти белки или пептиды включают без ограничения глутатион-Sтрансферазу, мальтоза-связывающий белок, металл-связывающий полигистидин, зеленый флуоресцентный белок, люциферазу и бета-галактозидазу.
Настоящее изобретение также предоставляет клетки хозяина, содержащие одну или несколько копий векторов, упоминающихся ранее. Клетки-хозяева включают без ограничения клетки, происходящие из млекопитающего, растения, насекомого, клетки грибного или бактериального происхождения. Бактериальные клетки включают без ограничения клетки из грамположительных бактерий или грамотрицательных бактерий, таких как некоторые виды из рода Escherichia, как например, Е.соН, и Pseudomonas. В группе грибных клеток предпочтительно используют клетки дрожжей. Экспрессии в дрожжах можно достичь при использовании штаммов дрожжей, таких как, помимо прочего, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae и Hansenula polymorpha. Более того, в качестве клеток-хозяев можно использовать клетки насекомых, такие как клетки из Drosophila и Sf9. Кроме того, клетки хозяева могут представлять собой растительные клетки, такие как, помимо прочего, клетки из сельскохозяйственных растений, таких как лесные растения, или клетки из растений, обеспечивающих пищевые и сырьевые материалы, таких как зерновые растения, или лекарственных растений, или клеток из декоративных растений, или клеток из цветочных луковичных культур. Трансформированные (трансгенные) растения или растительные клетки получают с помощью известных способов, например, опосредованного Agrobacterium переноса генов, трансформации листовых дисков, трансформации протопластов с помощью индуцированного полиэтиленгликолем переноса ДНК, электропорации, обработки ультразвуком, микроинъекции или биолистического переноса генов. Кроме того, подходящая система экспрессии может представлять собой бакуловирусную систему.
- 9 035861
Системы экспрессии, использующие клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки COS, клетки BHK, клетки NSO или клетки меланомы Боуэса, являются предпочтительными в настоящем изобретении. Клетки млекопитающих обеспечивают экспрессируемые белки с посттрансляционными модификациями, которые являются наиболее подобными природным молекулам, происходящим из млекопитающих. Поскольку настоящее изобретение касается молекул, которые можно вводить людям, особенно предпочтительной будет человеческая система экспрессии. Таким образом, даже более предпочтительно, клетки-хозяева представляют собой клетки человека. Примерами клеток человека являются, помимо прочего, клетки HeLa, 911, AT1080, A549, 293 и HEK293. Согласно предпочтительным вариантам осуществления человеческие клетки-продуценты содержат, по меньшей мере, функциональную часть последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аденовирусный участок E1 в экспрессируемом формате. Согласно еще более предпочтительным вариантам осуществления указанные клетки-хозяева являются полученными из сетчатки человека и иммортализированы нуклеиновыми кислотами, содержащими последовательности из аденовируса E1, такими как клетки 911 или клеточная линия, депонированная в Европейской коллекции клеточных культур (ECACC), CAMR, Солсбери, Уилтшир SP4 OJG, Великобритания, 29 февраля 1996 г. под номером 96022940 и представленная на рынке под торговым названием PER.C6® (PER.C6 является зарегистрированным торговым названием Crucell Holland B.V.). В контексте данной заявки клетки PER.C6 относятся к клеткам, депонированным под номером 96022940, или к их предкам, более ранним или более поздним пассажам, а также к потомкам предков депонированных клеток, а также к производных любого из следующего. Получение рекомбинантных белков в клетках-хозяевах можно осуществлять согласно способам, известным из уровня техники. Применение клеток, представленных на рынке под торговым названием PER.C6®, в качестве платформы для получения белков, представляющих интерес, было описано в документе WO 00/63403, раскрытие которого включено в данный документ с помощью ссылки в полном объеме.
Антитела данного изобретения можно получать различными способами. Способ получения антитела согласно настоящему изобретению представляет собой дополнительный аспект настоящего изобретения. Способ включает этапы:
a) культивирование хозяина согласно настоящему изобретению в условиях, приспособленных для экспрессии антитела, и
b) необязательно выделение экспрессированного антитела. Экспрессированные антитела можно выделять из бесклеточных экстрактов, но предпочтительно их выделяют из среды культивирования. Вышеописанный способ получения также можно использовать для создания функциональных вариантов антител и/или иммуноконъюгатов согласно настоящему изобретению. Способы извлечения белков, таких как антитела, из бесклеточных экстрактов или среды культивирования хорошо известны специалисту в данной области.
В качестве альтернативы, после экспрессии в хозяевах, таких как клетки-хозяева, антитела и иммуноконъюгаты согласно настоящему изобретению можно получать путем синтеза с использованием общепринятых синтезаторов пептидов или в бесклеточных трансляционных системах с использованием нуклеиновой кислоты РНК, полученной из молекул ДНК согласно настоящему изобретению. Антитела согласно настоящему изобретению можно получать с помощью трансгенных млекопитающих, отличных от человека, таких как, например, трансгенные мыши или кролики, которые экспрессируют гены иммуноглобулинов человека. Предпочтительно, трансгенные млекопитающие, отличные от человека, имеют геном, содержащий трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи человека, кодирующий все антитела или их часть, которые описаны выше. Трансгенных млекопитающие, отличные от человека, можно иммунизировать очищенным или обогащенным препаратом с RSV или его фрагментом. Протоколы иммунизации млекопитающих, отличных от человека, хорошо известны из уровня техники. См., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Edited by: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, и Current Protocols in Immunology, Edited by: J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., New York, раскрытия которых включены в данный документ с помощью ссылки. Протоколы иммунизации часто включают несколько иммунизаций либо с адъювантами, либо без адъювантов, таких как полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда, но могут также включать иммунизации оголенной ДНК. Согласно другим вариантам осуществления человеческие антитела продуцируются B-клетками, плазматическими клетками и/или клетками памяти, полученными из трансгенных животных. Согласно еще одному варианту осуществления человеческие антитела продуцируются гибридомами, которые получают путем слияния Bклеток, полученных из вышеописанных трансгенных млекопитающих, отличных от человека, с иммортализированными клетками. B-клетки, плазматические клетки и гибридомы, которые можно получать из вышеописанных трансгенных млекопитающих, отличных от человека, и человеческие антитела, которые можно получать из вышеописанных трансгенных млекопитающих, отличных от человека, B-клеток, плазматических клеток и/или клеток памяти и гибридом, также являются частью настоящего изобретения.
Настоящее изобретение дополнительно предлагает наборы, содержащие, по меньшей мере, антите
- 10 035861 ло, антигенсвязывающий фрагмент, иммуноконъюгат, функциональный вариант и/или по меньшей мере нуклеиновую кислоту в соответствии с настоящим изобретением. Необязательно, вышеописанные компоненты наборов в соответствии с настоящим изобретением запакованы в подходящие контейнеры и промаркированы для диагностики, профилактики и/или лечения указанных состояний. Вышеупомянутые компоненты можно хранить в однодозных или многодозных контейнерах в виде водного, предпочтительно стерильного раствора или в виде лиофилизированного, предпочтительно стерильного состава для восстановления. Набор может дополнительно содержать больше контейнеров, содержащих фармацевтически приемлемый буфер. Он может дополнительно включать другие материалы, желаемые с коммерческой или пользовательской точки зрения, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы, среду культивирования для одного или нескольких из подходящих хозяев и, возможно, даже по меньшей мере одно другое терапевтическое, профилактическое или диагностическое средство. К набору могут прилагаться инструкции, обычно включенные в коммерческие упаковки терапевтических, профилактических или диагностических продуктов, которые содержат информацию например, о показаниях, по применению, дозировке, производстве, введению, противопоказаниям и/или предупреждению, относящиеся к применению таких терапевтических, профилактических или диагностических продуктов.
Антитела в соответствии с настоящим изобретением можно также преимущественно применять в качестве диагностического средства в in vitro способе обнаружения RSV. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно предлагает способ выявления RSV в образце, где способ предусматривает этапы: (a) анализирование в образце уровня антигена RSV, т.е. приведение образца в контакт с диагностически эффективным количеством антитела (или его фрагментов) или иммуноконъюгата в соответствии с настоящим изобретением, и (b) сравнение анализируемого уровня антигена RSV с контрольным уровнем; при этом увеличение анализируемого уровня антигена RSV по сравнению с контрольным уровнем указывает на инфекцию, вызванную RSV. Образец может представлять собой биологический образец, включая без ограничения кровь, сыворотку, кал, мокроту, смывы с носоглотки, бронхиальный лаваж, мочу, ткань или другой биологический материал от (потенциально) инфицированных субъектов, образец, не являющийся биологическим, такой как вода, напиток и т.д. Образец можно сперва обработать, чтобы сделать его более подходящим для способа выявления. Обработка означает, помимо прочего, воздействие на образец, который предположительно содержит и/или содержащий вирус, таким образом, что вирус будет распадаться на антигенные компоненты, такие как белки, (поли)пептиды или другие антигенные фрагменты. Предпочтительно антитела или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению приводят в контакт с образцом в условиях, которые дают возможность формировать иммуннный комплекс между антителом и вирусом или его антигенными компонентами, которые могут присутствовать в образце. Образование иммунного комплекса, если это имеет место, указывающее на присутствие вируса в образце, затем обнаруживают и измеряют с помощью подходящих средств. Такие способы включают, помимо прочего, гомогенный и гетерогенный иммунологические анализы связывания, такие как радиоиммунологические анализы (RIA), ELISA, иммунофлуоресцентный анализ, иммуногистохимический анализ, FACS, BIACORE и вестерн-блоттинг. Предпочтительными методиками анализа, особенно для крупномасштабного клинического скрининга сывороток крови и крови пациентов, и продуктов, получаемых из крови пациентов, являются методики ELISA и вестерн-блоттинг. ELISA-тесты являются особенно предпочтительными.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано в следующих примерах, которые не предназначены для ограничения изобретения.
Примеры
Пример 1. Получение и мечение антигена
В отличие от белка слияния (RSV F), экспрессируемого на поверхности вирусной мембраны, белок связывания (RSV G) является высоковариабельным, определяя, таким образом, два обширных подтипа RSV (т.е. подтипы A и B). Несмотря на вариабельность последовательности, G RSV содержит центральный и высококонсервативный участок. С целью получения моноклональных антител с широким спектром активности RSV G, соответствующий репрезентативной подгруппе A (RSV A/Long) и подгруппе штамма B (RSV B/B1), экспрессировали рекомбинантно в клетках Freestyle 293, очищенных и меченных для использования в экспериментах по сортировке отдельных клеток.
Экспрессия Ga и Gb RSV
Рекомбинантный белок связывания (G-белок) RSV, который аналогичен RSV A/Long (№ доступа P20895) и RSV B/B1 (№ доступа NP_056862), указанных в данном документе Ga и Gb RSV, экспрессировали путем использования предназначенного для трансфекции клеток млекопитающих вектора экспрессии с промотором CMV (Invitrogen Corp., pcDNA3.1) с Myc-меткой (EQKLISEEDL) и 6Х гистидиновой меткой (табл. 1). Лидерную последовательность, соответствующую V каппа I сигнальному пептиду человека, встраивали в аминоконцы для содействия секреции. Как Ga, так и Gb RSV экспрессировались без трансмембранного домена и содержали аминокислоты 65-288 и 65-299 из Ga и Gb RSV соответственно.
Ga и Gb RSV трансфицировали в соответствии с протоколами производителя. Рекомбинантно экспрессируемые Ga- и Gb-белки RSV очищали при помощи хроматографии на Nickel NTA. Через 72 ч после трансфекции собирали супернатант и подвергали его диализу в течение ночи против 20 мМ Tris-HCL
- 11 035861 при pH8 и 300 мМ NaCl. На следующий день диализ повторяли со свежим буфером в течение дополнительных 6 ч. Супернатант после диализа дополняли 5% глицерином и 10 мМ имидазолом (VWR, № по кат. EM-5720) и загружали в колонку, заполненную 2 мл гранул агарозы Ni-NTA (Qiagen, № по кат. 30310). Связанный белок затем промывали с помощью буфера для промывки, взятого в количестве 2-х объемов колонки и состоящего из 20 мМ Tris-HCl, pH8, 300 мМ NaCl, 5% глицерина и 20 мМ имидазола. Белок элюировали с помощью 5 мл элюирующего буфера, содержащего 20 мМ Tris-HCl, pH8, 300 мМ NaCl, 5% глицерина и 50 мМ имидазола. Наконец, элюат подвергали диализу против 4 л фосфатносолевого буфера (PBS) при 4°C в течение ночи. Полученный в результате диализа белок концентрировали до 0,5-1,0 мл в концентраторе 30 К MWCO (Millipore, концентратор Amicon Ultracel) и его определяли количественно при помощи анализа с бицинхониновой кислотой (анализ BCA; Thermo Fisher, по протоколам производителя). Кроме того, качество очищенных белков контролировали с помощью SDSPAGE/Coomassie.
Проводили флуоресцентное мечение Ga RSV при помощи Alexa Fluor 647 (AF 647), используя набор Alexa Fluor 647 microscale protein labelling kit (Invitrogen № по кат. A30009) согласно протоколам производителя. После очистки определяли уровень мечения, который составил 1,2 моль AF 647 на моль белка, используя УФ-спектрофотометр NanoDrop (производственный). Аналогичным образом провели мечение Gb-белка RSV при помощи Alexa Fluor 488 (AF 488), используя микромаштабный набор для мечения малых количеств белка (Invitrogen, № по кат. A30006) согласно протоколам производителя, и после завершающей очистки уровень мечения определяли с использованием спектрофотометра NanoDrop, который составлял приблизительно 2 моль AF 488 на моль белка.
Таблица 1. Используемые последовательности рекомбинантного G-белка RSV
Белок (№ доступа) | Аминокислотная последовательность |
RSV G A/Long (Р20895) | ANHKVTLTTAIIQDATSQIKNTTPTYLTQDPQLGISFSNLSEITSQTTTILASTTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQT QPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDLKPQ TTKPKEVPTTKPTEEPTINTTKTNITTTLLTNNTTGNPKLTSQMETFHSTSSEGNLSPSQVSTTSEHPSQPSSPPNT TRQQAYVEQ KLISEEDLNSAVDHHHHHH (SEQ ID NO: 49) |
RSV G B/Bl (NP_056862) | ANHKVTLTTVTVQTIKNHTEKNITTYLTQVPPERVSSSKQPTTTSPIHTNSATTSPNTKSETHHTTAQTKGRTTTST QTNKPSTKPRLKNPPKKPKDDYHFEVFNFVPCSICGNNQLCKSICKTIPSNKPKKKPTIKPTNKPTTKTTNKRDPKT PAKTTKKETTTNPTKKPTLTTTERDTSTSQSTVLDTTTLEHTIQQQSLHSTTPENTPNSTQTPTASEPSTSNSTQNT QSHAQAYVE QKLISEEDLNSAVDHHHHHH (SEQ ID NO: 50) |
Пример 2. Идентификация антител, специфичных к G-белку RSV
Нейтрализующие моноклональные антитела с широким спектром активности к G-белку RSV получали из B-клеток памяти (CD19+CD27+IgG+), выделенных мононуклеаров периферической крови (PBMC), полученных через банк крови в Сан Диего (the San Diego Blood Bank). Вкратце, B-клетки, обогащенные CD22+, окрашивали флуоресцентно меченными антителами к маркерам памяти поверхности B-клеток и инкубировали с Ga, Gb RSV (меченые Alexa Fluor 647 и 488, соответственно, как описано в примере 1), или пептидом (SYM-1706) центрального консервативного домена (CCD) G-белка RSV, конъюгированным с биотином.
CD19/CD27/IgG/RSVGa/RSVGb или CD19/CD27/IgG/SYM-1706 (используемые в определенных сортировочных экспериментах). Положительные клетки сортировали и отдельные клетки помещали в индивидуальные лунки 96-луночного планшета, используя FACSAria II (BD Biosciences) или MoFlo XDP (Beckman Coulter). Планшеты хранили при -80°C до проведения анализа. В среднем исследовали примерно 10-25x106 B-клеток с донора.
Пример 3. Выделение генов из тяжелой и легкой цепи из одиночных B-клеток, специфичных к RSV Ga и Gb
Как описано в примере 2, нейтрализующие моноклональные антитела с широким спектром активности к RSV выделяли из B-клеток памяти (CD19+CD27+IgG+) с реактивностью к Ga- и Gb-белкам RSV или к пептиду (SYM-1706) центрального консервативного домена (CCD) G-белка RSV, конъюгированному с биотином. Гены тяжелой и легкой цепи выделяли при помощи подхода на основе двух-стадийной ПЦР из отдельных B-клеток, клонировали и экспрессировали in vitro, в виде Fab-фрагментов антител.
Синтез первой цепи кДНК
Комплементарную ДНК (кДНК) получали из отдельных подвергнутых сортировке клеток, используя набор Invitrogen's Superscript III First Strand Synthesis (набор Superscript III, № по кат. 18080-051).
Амплификация тяжелой и легкой цепи IgG с помощью гнездовой ПЦР
Вариабельные участки тяжелой и легкой цепи IgG (и каппа, и лямбда цепей) амплифицировали из ранее полученной кДНК, используя подход на основе двух-стадийной гнездовой ПЦР. Далее ПЦРфрагменты тяжелой и легкой цепи подвергали сборке в одну кассету для облегчения последующего клонирования, используя ПЦР с перекрывающимися праймерами.
Стадия I. Амплификация
Для стадии I 2,5 мкл ранее полученной кДНК, синтезированной, как упоминалось выше, использо
- 12 035861 вали в качестве матрицы для амплификации тяжелой, легких каппа- и лямбда-цепей. Использовали пул праймеров, специально сконструированных для лидерных участков тяжелой цепи антитела (праймеры CB-5'LVH), легкой каппа-цепи (праймеры CB-5'LVk) и легкой лямбда-цепи (праймеры СВ-5' LVlam) (табл. 2-4). Один обратный праймер, специально сконструированный для для CH1-участка, Ck- и CLучастка тяжелой цепи, легкой каппа-цепи и легкой лямбда-цепи, соответственно, использовали в стадии I реакции ПЦР.
Таблица 2 VH, стадия 1, прямые праймеры (5'-3')
Название | Последовательность |
СВ-5'LVHla | ATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTC (SEQ ID NO: 51) |
СВ-5'LVHlb | ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTC (SEQ ID NO: 52) |
CB-5'LVHlc | ATGGACTGGACCTGGAGGGTCTTC (SEQ ID NO: 53) |
СВ-5'LVHld | ATGGACTGGACCTGGAGCATCC (SEQ ID NO: 54) |
СВ-5'LVH2 | GGACATACTTTGTTCCACGCTCCTGC (SEQ ID NO: 55) |
СВ-5'LVH3a | AGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGC (SEQ ID NO: 56) |
СВ-5'LVH3b | AGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGC (SEQ ID NO: 57) |
СВ-5'LVH3C | AGGTGTCCAGTGTCAGGTACAGC (SEQ ID NO: 58) |
СВ-5'LVH4 | GCAGCTCCCAGATGGGTCCTG (SEQ ID NO: 59) |
СВ-5'LVH5 | TCAACCGCCATCCTCGCCCTC (SEQ ID NO: 60) |
СВ-5'LVH6 | GTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGC (SEQ ID NO: 61) |
3 'CgCHl | GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC (SEQ ID NO: 62) |
Таблица 3 Vk, стадия I, прямые праймеры (5'-3')
Название | Последовательность |
CB-5'LVkla | ATGAGGGTCCCCGCTCAGCTC (SEQ ID NO: 63) |
CB-5'LVklb | ATGAGGGTCCCTGCTCAGCTC (SEQ ID NO: 64) |
CB-5'LVklc | ATGAGAGTCCTCGCTCAGCTC (SEQ ID NO: 65) |
CB-5'LVk2 | TGGGGCTGCTAATGCTCTGG (SEQ ID NO: 66) |
CB-5'LVk3 | CCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG (SEQ ID NO: 67) |
CB-5'LVk4 | TCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGC (SEQ ID NO: 68) |
CB-5'LVk5 | CTCCTCAGCTTCCTCCTCCTTTGG (SEQ ID NO: 69) |
CB-5'LVk6 | AACTCATTGGGTTTCTGCTGCTCTGG (SEQ ID NO: 70) |
3'Ck-Rev494 | GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCTC (SEQ ID NO: 71) |
Таблица 4 VL, стадия I, прямые праймеры (5'-3')
Название | Последовательность |
CB-5' LVlaml | CTCCTCGCTCACTGCACAGG (SEQ ID NO: 72) |
CB-5' LVlam2 | CTCCTCTCTCACTGCACAGG (SEQ ID NO: 73) |
CB-5' LVlam3 | CTCCTCACTCGGGACACAGG (SEQ ID NO: 74) |
CB-5' LVlam4 | ATGGCCTGGACCCCTCTCTG (SEQ ID NO: 75) |
CB-5' LVlam5 | ATGGCATGGATCCCTCTCTTCCTC (SEQ ID NO: 76) |
3'Clam-Rev | CAAGCCAACAAGGCCACACTAGTG (SEQ ID NO: 77) |
Стадия II. Аплификация
1) Для стадии II 2,5 мл продукта ПЦР стадии I ПЦР, синтезированного в результате реакции, как было описано выше, использовали в качестве матрицы для амплификации генов тяжелой, легкой каппаи лямбда-цепей. Использовали пул прямых праймеров, специально сконструированных для рамки 1 участка тяжелой цепи, легкой каппа-цепи и легкой лямбда-цепи (табл. 5-7). Использовали пул обратных праймеров, специально сконструированных для участка стыка тяжелой цепи (праймеры 3'SalIJH), участка стыка легкой каппа-цепи (праймеры 3'Jk) и специфичный к участку 5'праймер, соответствующий легкой лямбда-цепи (праймеры CB-VL). Кроме того, прямые праймеры стадии II сконструировали для введения сайта рестрикции SfiI, тогда как обратные праймеры стадии II для тяжелых цепей сконструировали для введения сайта рестрикции SalI.
- 13 035861
Таблица 5 VH, стадия II, праймеры (5'-3')
Название | Последовательность |
CB-VHla | GCTCGCAGCATAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTC (SEQ ID NO: 78) |
CB-VHlb | GCTCGCAGCATAGCCGGCCATGGCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTC (SEQ ID NO: 79) |
СВ-VH1с | GCTCGCAGCATAGCCGGCCATGGCCCAGGTTCAGCTGGTGCAGTC (SEQ ID NO: 80) |
CB-VHld | GCTCGCAGCATAGCCGGCCATGGCCCAGGTCCAGCTTGTGCAGTC (SEQ ID NO: 81) |
CB-VH2a | GCTCGCAGCATAGCCGGCCATGGCCCAGGTCACCTTGAGGGAGTCTGG (SEQ ID NO: 82) |
CB-VH2b | GCTCGCAGCATAGCCGGCCATGGCCCAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGG (SEQ ID NO: 83) |
CB-VH3a | GCTCGCAGCATAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTC (SEQ ID NO: 84) |
CB-VH3b | GCTCGCAGCATAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTC (SEQ ID NO: 85) |
CB-VH3c | GCTCGCAGCATAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC (SEQ ID NO: 86) |
CB-VH3d | GCTCGCAGCATAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGGTGGAGTCTG (SEQ ID NO: 87) |
CB-VH4a | GCTCGCAGCATAGCCGGCCATGGCCCAGSTGCAGCTGCAGGAG (SEQ ID NO: 88) |
CB-VH4b | GCTCGCAGCATAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGG (SEQ ID NO: 89) |
CB-VH5 | GCTCGCAGCATAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTC (SEQ ID NO: 90) |
CB-VH6 | GCTCGCAGCATAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAG (SEQ ID NO: 91) |
CB-VH7 | GCTCGCAGCATAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAATCTG (SEQ ID NO: 92) |
3'SallJH 1/2/4/5 | TGC GAAG T C GAC G С T GAG GAGAC G G T GAC CAG (SEQ ID NO: 93) |
3 'SallJH3 | TGC GAAG T C GAC G С T GAAGAGAC G G T GAC CAT T G (SEQ ID NO: 94) |
3 'SallJH6 | TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCGTG (SEQ ID NO: 95) |
- 14 035861
Таблица 6 VK, стадия II, праймеры (5'-3')
Название | Последовательность |
CB-VKla | CTACCGTGGCCTAGGCGGCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCC (SEQ ID NO: 96) |
CB-VKlb | CTACCGTGGCCTAGGCGGCCGACATCCAGTTGACCCAGTCTCC (SEQ ID NO: 97) |
CB-VKlc | CTACCGTGGCCTAGGCGGCCGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCC (SEQ ID NO: 98) |
CB-VK2a | CTACCGTGGCCTAGGCGGCCGATRTTGTGATGACTCAGTCTCCACTC (SEQ ID NO: 99) |
CB-VK3a | CTACCGTGGCCTAGGCGGCCGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAG (SEQ ID NO: 100) |
CB-VK3b | CTACCGTGGCCTAGGCGGCCGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAG (SEQ ID NO: 101) |
CB-VK3c | CTACCGTGGCCTAGGCGGCCGAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAG (SEQ ID NO: 102) |
CB-Vk4 | CTACCGTGGCCTAGGCGGCCGACATCGTGATGACCCAGTCTCC (SEQ ID NO: 103) |
CB-Vk5 | CTACCGTGGCCTAGGCGGCCGAAACGACACTCACGCAGTCTCC (SEQ ID NO: 104) |
CB-Vk6 | CTACCGTGGCCTAGGCGGCCGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAG (SEQ ID NO: 105) |
3'Jkl/4 Rev Ila-L | GAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATYTCCACCTTGGTC (SEQ ID NO: 106) |
3' Jk2 Ilb-L | Rev | GAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATCTCCAGCTTGGTC (SEQ ID NO: 107) |
3' Jk3 IIc-L | Rev | GAAGACAGATGGT GCAGС CACAGTTCGTTTGATATCCAC Τ Τ T GGT C (SEQ ID NO: 108) |
3' Jk5 Ild-L | Rev | GAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTAATCTCCAGTCGTGTC (SEQ ID NO: 109) |
Таблица 7 VL, стадия II, праймеры (5'-3')
Название | Последовательность |
CB-VL1 | CTACCGTGGCCTAGGCGGCCAATTTTATGCTGACTCAGCCCCACTC (SEQ ID NO: 110) |
CB-VL2 | CTACCGTGGCCTAGGCGGCCTCCTATGTGCTGACTCAGCC (SEQ ID NO: 111) |
CB-VL3 | CTACCGTGGCCTAGGCGGCCCAGTCTGTGCTGACGCAGCC (SEQ ID NO: 112) |
CB-VL4 | CTACCGTGGCCTAGGCGGCCCAGTCTGTCGTGACGCAGCC (SEQ ID NO: 113) |
CB-VL5 | CTACCGTGGCCTAGGCGGCCCAGTCTGCCCTGACTCAGCC (SEQ ID NO: 114) |
CB-VL6 | CTACCGTGGCCTAGGCGGCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACC (SEQ ID NO: 115) |
CB-VL7 | CTACCGTGGCCTAGGCGGCCTCCTATGAGCTGACTCAGCCACC (SEQ ID NO: 116) |
3'Clam- Стадия II | CTCAGAGGAGGGYGGGAACAGAGTGAC (SEQ ID NO: 117) |
Стадия III. Амплификация: ПЦР с перекрывающимися праймерами
Для стадии III ПЦР-фрагменты тяжелых и легких цепей (продукты стадии II) соединяли в одну кассету с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами, используя: 1) Fab-линкер (каппа или лямбда; табл. 8), амплифицированный, как описано ниже, который отжигается на 3'-конце фрагмента легкой цепи из стадии II и на 5'-конце фрагмента тяжелой цепи из стадии II, и содержит константные участки как каппа-, так и лямбда-легкой цепи, 2) прямой перекрывающийся праймер с сайтом рестрикции SfiI, который отжигается на 5'-конце легкой цепи, и 3) обратный праймер с сайтом рестрикции SalI, который отжигается на 3'-конце фрагмента тяжелой цепи из стадии II (табл. 9). Результатом данной реакции является фрагмент в 1200 п.о (т.е., кассета), состоящий из легкой цепи-линкера-тяжелой цепи. После амплифи- 15 035861 кации продукт реакции ПЦР с линкером или продукт ПЦР с перекрывающимися праймерами разделяли в 1% агарозном геле и экстрагировали из геля согласно протоколам производителя (набор Qiagen Gel
Extraction; № № 28706).
Таблица 8. Нуклеотидная последовательность каппа- и лямбда-линкера
Ген | Последовательность |
IGKC | CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGCTTA AATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTTCTAAATAACTTCTATCCCCGTGAGGC CAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGT GTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTTACGC Т ТAG СAAAG СAGAC TAG GAGAAACACAAAG TCTACGCCTGC GAAG Т САС С САТ СА GGGCCTCAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGAGAGTGTTAATCTAGA AATAAGGAGGATATAATTATGAAATACCTGCTGCCGACCGCAGCCGCTGGTCTGC TGCTGCTCGCAGCATAGCCGGCCATGGCC (SEQ ID NO: 118) |
IGLC2 | GTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGG TGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGA TAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAAC AACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCC ACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGT GGC С С С Т ACAGAAT G Т Т CAT ААТ С Т AGAAAT AAGGAGGAT АТ ААТ Т AT GAAATАС CTGCTGCCGACCGCAGCCGCTGGTCTGCTGCTGCTCGCAGCATAGCCGGCCATGG СС (SEQ ID NO: 119) |
Таблица 9. Линкерные праймеры для (5'-3')
Название | Последовательность |
FabLinker-F | CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC (SEQ ID NO: 120) |
FabLinker-R | GGCCATGGCCGGCTATGCTGCGAGC (SEQ ID NO: 121) |
Lambda-Fab Linker F | GTCACTCTGTTCCCRCCCTCCTCTGAG (SEQ ID NO: 122) |
Overlap-F | CTACCGTGGCCTAGGCGGCC (SEQ ID NO: 123) |
Overlap-R | TGCGAAGTCGACGCTGARGAG (SEQ ID NO: 124) |
Расщепление и клонирование в бактериальный вектор экспресии
После очистки продукта ПЦР (Qiagen), полученного в результате ПЦР с перекрывающимися праймерами, фрагмент расщепляли и расщепленный перекрывающийся продукт затем отделяли в 1 % агарозном геле. Полосу, соответствующую перекрывающейся кассете (~1,1 т.п.о.), очищали путем экстрагирования из геля (Qiagen). В конце, расщепленный перекрывающийся продукт лигировали и клонировали в бактериальный вектор экспрессии pCB-Fab. Все трансформации проводились с использованием клеток Max Efficiency DH5a (Invitrogen Corp., № № 18258-012). Примерно 100 мкл выделенных клеток высевали на чашки, содержащие 100 мкг/мл карбенициллина и дополненные 20 мМ глюкозы. Планшеты инкубировали в течение ночи при 37°C для обеспечения роста колонии.
Пример 4. Связывание Fab-фрагмента с G RSV и создание моноклональных антител
Fab-фрагменты антител, клонированных в примере 3, экспрессировали в бактериях и снова тестировали их способность связываться с Ga, Gb RSV, или пептидом, содержащим центральный консервативный домен из G RSV (CCD) (SYM-1706: аминокислотная последовательность: биотинKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKR; SEQ ID NO: 125).
Бактериальный супернатант вносили в планшеты, лунки которых покрывали Ga, Gb RSV, содержащим CCD пептидом, актином в качестве негативного контроля и антителом к F(ab)2 человека и инкубировали в течение 2 ч при 37°C (за исключением содержащего CCD пептида, который инкубировали в планшете, покрытом стрептавидином, в течение 2 ч при комнатной температуре). CR9514 (антитело на основе 3D3, т.е. содержащее вариабельные участки тяжелой и легкой цепей 3D3), как раскрыто в WO 2009/055711), использовали в качестве позитивного контроля для Ga, Gb RSV, содержащего CCD пептида и антитела к F(ab)2 человека, и вносили в планшет в разведении 0,1 мг/мл в 0,4% NFDM/PBS/0,05% Tween20. Мышиное антитело к актину (Sigma, № по кат. A3853) использовали в концентрации 1,25
- 16 035861 мг/мл как позитивный контроль для планшетов, покрытых бычьим актином. Антитело к HA, конъюгированное с пероксидазой хрена (Roche, № по кат. 12013819001), использовали как вторичное антитело для бактериальных супернатантов. Антитела к Fab человека (Jackson Labs, № по кат. 109-036-097) использовали для контрольных лунок с CR9514 (содержащее вариабельные участки из 3D3). Наконец, козье антитело к мышиному IgG, конъюгированное с пероксидазой хрена (Jackson Labs, № по кат. 115-035-072), использовали для позитивного контроля в виде актина. После инкубации планшеты промывали четыре раза в PBS/0,05% Tween20 и проявляли 50 мкл 1:1 объем/объем TMB:раствора пероксида (Pierce, № по кат. 34021) на протяжении примерно 5 мин. Реакцию сразу же останавливали 50 мкл 2N H2SO4 и измеряли поглощение при 450 нм, используя планшет-ридер для ELISA. На позитивное связывание указывало значение при OD450, составлявшее более 0,5 (0,5-0,9 указывает на умеренное связывание, >1 указывает на сильное связывание), и сигнал превышал более чем в 3 раза фоновое значение.
Исходя из результатов ELISA, отбирали в среднем приблизительно шесть клонов, характеризовавшихся реактивностью к антигенам-мишеням. Поскольку каждый Fab-фрагмент антител исходно клонировали с использованием пула праймеров, специфичных к рамке 1 и специфичных к участку стыка, потенциал для перекрестной реакции между праймерами, особенно для праймеров с высокой степенью подобия, был высоким. По этой причине для секвенирования выбрали несколько бактериальных клонов, представляющих каждый продукт перекрывания. Плазмидную минипреп ДНК выделяли согласно протоколам производителя (Набор Qiagen Miniprep Kit № по кат. 27106). Тяжелые и легкие цепи, соответствующие каждому выбранному клону, секвенировали с праймерами, вынесенными в табл. 10. Последовательности анализировали, выявляли ближайшие зародышевые линии и определяли CDR и каркасные участки. Эту информацию в дальнейшем использовали для конструирования праймеров для клонирования и преобразования антител-кандидатов в IgG.
Таблица 10. Праймеры для секвенирования Fab из бактериальных клонов (5'-3')
Ген | Последовательность |
SeqpCBFab-HCF | TGAAATACCTGCTGCCGACC (SEQ ID NO: 126) |
Seq-PelB-Rev | CAGCAGACCAGCGGCTGC (SEQ ID NO: 127) |
Пример 5. Клонирование, секвенирование и очистка IgG
Fab-фрагменты антител, характеризующихся реактивностью к Ga, Gb RSV и CCD пептиду, выявленной у бактериальных клонов посредством ELISA, описанного в примере 4, клонировали и экспрессировали в виде IgG в клетках почки эмбриона человека (клетки 293-F). IgG в дальнейшем очищали и контролировали их качество путем определения концентрации, SDS-PAGE и с помощью гель-проникающей хроматографии.
A. Информация по клонированию и секвенированию IgG
Fab-фрагменты антител, выявленные у бактериальных клонов посредством ELISA (описан в примере 4), в дальнейшем превращали в IgG путем клонирования вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи (каппа и лямбда) с помощью рестрикционного расщепления в векторы экспрессии pCP9-каппа (SEQ ID NO: 127) и pCP9-лямбда (SEQ ID NO: 128). Учитывая возможность перекрестной реакции между праймерами (упомянутыми в примере 4), первичные аминокислоты из FR1 и конечные аминокислоты из участка стыка для каждого бактериального клона, выбранные для превращения в IgG, часто отличаются от таковых соответствующих им в последовательности зародышевого типа. По этой причине сконструировали праймеры, являющиеся специфичными для каждого антитела, чтобы восстановить участки FR1 и стыка для генов как тяжелой, так и легкой цепи у каждого выбранного бактериального клона. Тяжелую и легкую цепи амплифицировали с использованием соответствующего бактериального клона (экспрессировавшегося с вектора pCB-Fab в примере 4) и клонировали в последовательном порядке в вектор экспрессии pCP9.
Результатом амплификации тяжелой цепи был фрагмент со средним размером 370 п.о., который разделяли в 1% агарозном геле и экстрагировали из геля согласно протоколам производителя (Qiagen). Фрагмент тяжелой цепи затем использовали для присоединения лидерной последовательности HAVT20 (5'-ATGGCCTGCCCTGGCTTTCTCTGGGCACTTGTGATCTCCACCTGTCTTGAATTTTCCATGGCT-3'; MACPGFLWALVISTCLEFSMA) посредством ПЦР с перекрывающимися праймерами.
Соответствующий продукт перекрывания HAVT20-тяжелая цепь в дальнейшем очищали посредством ПЦР согласно протоколам производителя (Qiagen). Лигирования проводили последовательно; то есть, либо сперва легкую цепь расщепляли и лигировали, либо расщепляли и встраивали соответствующую тяжелую цепь. Как только посредством секвенирования подтверждали встраивание либо легкой, либо тяжелой цепи, отбирали репрезентативный бактериальный клон, выделяли и использовали минипреп для клонирования второй цепи (т.е. либо легкой, либо тяжелой цепи, в зависимости от того какую клонировали в первую очередь). Для клонирования фрагмента тяжелой цепи вектор pCP9 и очищенный продукт ПЦР с перекрывающимися праймерами в виде тяжелой цепи расщепляли рестрикционными ферментами BamHI HF (NEB, № по кат. R3136L) и XhoI (NEB, № по кат. R0146L). Расщепленный вектор pCP9 и продукт перекрывания в виде тяжелой цепи разделяли в 1% агарозном геле и экстрагировали из
- 17 035861 геля (более -9,5 т.п.о для вектора pCP9). Реакции лигирования проводили при соотношении векторвставка 1:3 и продукты реакции трансформировали в клетки DH5a Max Efficiency (Invitrogen Corp., №№ 18258-012). После подтверждения последовательности клонировали вторую цепь (например, легкую цепи). Для клонирования фрагмента легкой цепи клоны pCP9, содержащие соответствующие продукты в виде тяжелой и легкой цепи, полученные в результате ПЦР, расщепляли с помощью NotI HF (NEB, № по кат. R3189L) и XbaI (NEB, № по кат. R0145L. Легкие цепи затем лигировали в вектор pCP9, содержащий ген соответствующей тяжелой цепи и трансформировали в клетки DH5a Max Efficiency. Отбирали несколько колоний для сквенирования и анализировали. В табл. 11 и 12 приведены последовательности CDR-участков тяжелой и легкой цепей антитела.
Таблица 11. Аминокислотные последовательности вариабельных участков тяжелой цепи (SEQ ID NO:)
Клон | VH Зародышевая линия | CDR1 | CDR2 | CDR3 |
СВ002.1 | IGHV4-59 | SYFWN (25) | YIYGSGSADYNPSLKS (26) | SGFCTNDACYRRGSWFDP (27) |
СВ003.1 | IGHV1-46 | TYYIH (10) | MINTGSGVTSYAQKFQG (11) | MYSGSWYPFDY (12) |
СВОЮ.7 | IGHV3-30 | THGMH (7) | VMSYDGTKKYHADSVKG (8) | VGELRSFDWLLADGTAYYYYGMDV (9) |
СВ028.2 | IGVH1-18 | TYGIT (31) | WISGDSDNTNYAQNLQG (32) | ALAKWYCSSSSCFCGGGSCYSDY (33) |
СВ048.3 | IGHV3-30 | NHGMH (4) | VISYDGNKKYYADSVKG (5) | TTFYFDDSNYYEYLDY (6) |
СВ058.1 | IGHV3-23 | SYAMS (1) | AIRGSVDNTYYADSVKG (2) | DPALYCSGETCFSDLTD (3) |
Таблица 12. Аминокислотные последовательности вариабельных участков легкой цепи (SEQ ID NO:)
Клон | VK/VL Зародышевая линия | CDR1 | CDR2 | CDR3 |
СВ002.1 | IGKV1-39 | RASQSIDNYLN (28) | AASSLQS (29) | QQSYSTLT (30) |
СВ003.1 | GKV3-20 | RASQNINGNYLA (22) | EASSRAT (23) | QQYGTSPF (24) |
СВОЮ . 7 | IGKV4-1 | KSSQSVLYSSNNKNYLA (19) | WASTREF (20) | HQYYSIP (21) |
СВ028.2 | IGKV1-39 | RASQGMSNYLN (34) | AASTLQS (35) | QQSFSTP (36) |
СВ048.3 | IGKV1-9 | RASQGIRSYLA (16) | AASTLQS (17) | QQLNTSPP (18) |
СВ058.1 | IGKV1-16 | RASQGINNYLA (13) | AASTLPS (14) | QHYIRYP (15) |
B. Экспрессия и очистка IgG
Для экспрессии каждого IgG получали миди-препы плазмидной ДНК (Qiagen) из векторов pCP9, содержащих представляющие интерес гены как тяжелой, так и легкой цепи, и их использовали для трансфицирования клеток 293-F, применяя 293fectin согласно протоколам производителя (Invitrogen, № № 51-0031). После трансфекции клетки инкубировали в течение 72 ч, чтобы обеспечить достаточное продуцирование IgG. Клеточную культуру затем собирали и центрифугировали, чтобы удалить клетки. Очистку проводили с помощью колоночной хроматографии, используя колонку с белком A (гранулы сефарозы с белком A; Amersham, № по кат. 17-0963-03). Элюат дважды подвергали диализу против 4 литров, содержащих 20 мМ Tris-HCl pH7,2, 150 мМ NaCl. В заключение, диализированные образцы концентрировали до приблизительно 1 мл с помощью 10 кДа-колонки Amicon Ultra (Millipore).
Серии стадий проведения контроля качества проводили для каждого IgG для определения концентрации и чистоты, а также определения размера. Исходно концентрацию IgG определяли посредством считывания показаний на NanoDrop, используя молярный коэффициент экстинкции для IgG с 210000 М1 см-1. Кроме того, концентрацию IgG подтверждали с помощью BCA анализа (Thermo Fisher) согласно протоколам производителя, и путем измерений с помощью сенсорных наконечников с иммобилизованным белком A на Octet Red384 (ForteBio). В качестве дополнительной стадии контроля качества проводили SDS-PAGE при невосстанавливающих и восстанавливающих условиях (т.е., ±DTT) с последующим окрашиванием Bio-Safe Coomassie (Biorad) для визуального контроля на присутствие интактного IgG или уменьшения полипептидов тяжелых и легких цепей. И наконец, качество IgG контролировали с использованием гель-проникающей хроматографии на колонке для гель-фильтрации Superdex 200 10/300 GL (Pharmacia).
Пример 6. Анализ связывания с IgG
Получали IgG и контролировали их количество как описано выше в примере 5, и антитело CR9514 к G RSV (содержащие вариабельные участки 3D3) тестировали в анализах ELISA в отношении их способности связываться с рекомбинантными Ga- и Gb-белками RSV. Вкратце, 96-луночные планшеты с половинным объемом лунки для ELISA (Costar) покрывали 50 мкл антигена в 1X PBS в течение ночи [RSV Ga: 0,5 мг/мл; RSV Gb: 0,5 мг/мл; бычьего актина: 1 мг/мл (Sigma); козье антитело к F(ab)2фрагменту человека, очищенное аффинной хроматографией: 2 мг/мл (Jackson Immunoresearch). Планшеты инкубировали в течение ночи при 4°C и блокировали на следующий день с помощью 135 мкл 4% обезжиренного сухого молока (NFDM, Biorad) в PBS и инкубировали на протяжении 2 ч при 37°C. Затем mAb разбавляли в 0,4% NFDM/PBS/0,05% Tween20, начиная со 100 нг/мл, и титровали с уменьшением
- 18 035861 концентрации в 5-кратных разведениях и добавляли в планшеты, инкубируя в течение 2 ч при 37°C. mAb CR9514 (3D3) использовали в качестве позитивного контроля к Ga и Gb RSV, и титровали аналогичным образом. Дополнительно использовали мышиное антитело к актину (Sigma, № по кат. A3853) использовали в концентрации 1,25 мг/мл как позитивный контроль для планшетов, покрытым бычьим актином. После инкубации планшеты четыре раза промывали с помощью PBS/0,05% Tween20. Каждое вторичное антитело вносили при 1:1000 в 0,4% NFDM/PBS/0,05% Tween20 и инкубировали в течение 40 мин при 37°C. Антитело к Fc HRP (Jackson Labs, № по кат. 109-035-008) использовали в качестве вторичного антитела к mAb. Наконец, козье антитело к мышиному IgG, конъюгированное с пероксидазой хрена (Jackson Labs, № по кат. 115-035-072), использовали для позитивного контроля в виде актина. После инкубации планшеты промывали четыре раза в PBS/0,05% Tween20 и проявляли 50 мкл 1:1 объем/объем TMB:раствора пероксида (Pierce, № по кат. 34021) на протяжении примерно 5 мин. Реакцию сразу же останавливали 50 мкл 2N H2SO4 и измеряли поглощение при 450 нм, используя планшет-ридер для ELISA. Оценочные значения EC50 для связывания (определяемые титрованием каждого IgG) для антител в соответствии с настоящим изобретением изменялись в пределах от 1,0 до 2,0 нг/мл в случае A/Long штамма RSV и от 0,5 до 2,5 нг/мл в случае B/B1 штамма.
Пример 7. Анализ нейтрализации с IgG
Антитела к RSV анализировали в отношении их способности связывать и нейтрализовать RSV в растворе, что оценивали посредством анализа подавления бляшкообразования. В данном эксперименте вирус и антитела предварительно инкубировали в отсутствие клеток-мишеней. Затем смесь добавлялась к клеткам и вирусную инфекцию измеряли посредством стандартного анализа подавления бляшкообразования, описанного в данном документе. Антитела к RSV анализировали в отношение их способности нейтрализовать несколько штаммов RSV, в том числе RSV A/A2 (ATCC № по кат. VR-1540), RSV B/18537 (ATCC № по кат. VR-1580) и RSV A/Long (ATCC № по кат. VR-26). Антитела CR9514 (3D3) и CR9505 (антитело на основе 131-2G, т.е. содержащее вариабельный участок тяжелой и легкой цепей из 131-2G, как раскрывается в WO 2009/055711) использовали в качестве опорных.
Клетки Vero (ATCC, № по кат. CCL-81; Манассас) использовали как клетки-хозяева при инфицировании. Клетки Vero выращивали в DMEM (HyClone, № по кат. SH 30285.01) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (HyClone, № по кат. SH30070.03), дополненной 1% L-глутамином (HyClone, № SH30034.01) и 1% раствором пенициллина со стрептомицином (HyClone, № по кат. SV30010). Клетки Vero поддерживали при 37°C в термостате с 5% CO2 и пассажировали их дважды в неделю.
В день 1 эксперимента клетки Vero культивировали в 24-луночных планшетах для культуры клеток. Клетки высевали при плотности (примерно 9х104 клетки на лунку), что позволило сформировать клеточный монослой (конфлюентность >80%) ко 2 дню. В день 2 каждое антитело серийно разводили в простой минимальной поддерживающей среде Игла без добавок (EMEM, ATCC, № по кат. 30-2003), которая содержала 10% кроличьей сыворотки (AbD Serotec, № по кат. C12CAX). Конечные концентрации тестируемых антител составляли: 10, 1,3 мг/мл, 156, 19,5, 2,4 и 0,3 нг/мл (за исключением CB010.7, которое использовали в следующих концентрациях: 2,5 мг/мл, 312,5, 39,1, 4,9, 0,61 и 0,08 нг/мл). Вирус также разбавляли в EMEM без добавок до концентрации 2000-3000 БОЕ/мл (100-150 БОЕ/50 мкл) и 85 мкл разведенного RSV добавляли к 85 мкл раствора каждого разведенного антитела и перемешивали пипетированием. Для контрольного образца вируса добавляли 85 мкл разведенного вируса добавляли к 85 мкл ЕМЕМ без добавок. Смеси антитело-вирус или вирус-контроль инкубировали при 37°C на протяжении 2 ч. После инкубации культуральную среду сливали из 24-луночных планшетов для культивирования клеток, содержащих клетки-хозяева Vero, и 150 мкл предварительно инкубированной смеси вирус-антитело или смеси вирус-контроль вносили затем в каждую лунку. Каждый тестовый и контрольный образец готовили в трех повторах. Затем клетки инкубировали при 37°C на протяжении часа, перемешивая каждые 15 мин.
После периода инкубирования в каждую лунку добавляли 1 мл покрывающей среды (покрывающая среда содержала EMEM, 2% FBS, 1% L-глутамина, 0,75% метилцелюллозы). 24-Луночные планшеты для культивирования клеток инкубировали при 37°C (с 5% CO2) на протяжении 96-120 ч. Клеточные планшеты фиксировали с помощью 10% формалином на протяжении 1 ч при комнатной температуре, промывали 10 раз бидистиллированной H2O и блокировали с помощью 5% обезжиренного молока (NFDM) в PBS при 37°C на протяжении часа. После инкубирования блокирующий раствор сливали и в каждую лунку добавляли 200 мкл конъюгированого с пероксидазой хрена мышиного антитела к RSV (ab20686, Abcam, разведение 1:750 в 1% NFDM). Планшеты инкубировали при 37°C на протяжении 2 ч и промывали 10 раз бидистиллированной H2O. После промывания в каждую лунку добавляли 200 мкл субстрата TrueBlue® для пероксидазы (KPL № кат. 50-78-02). Планшеты проявляли в течение 10 мин при комнатной температуре. Планшеты дважды промывали бидистиллированной H2O, высушивали на бумажном полотенце и подсчитывали число голубых бляшек.
IC50 (эффективное разведение для 50% нейтрализации бляшкообразования) рассчитывали с использованием SPSS для Windows. Уровень подавления бляшкообразования рассчитывали по следующей формуле: Уровень подавления бляшкообразования (в процентах)=1-[(среднее количество бляшек в каж- 19 035861 дом разведении антитела)/(среднее количество бляшек в лунках с вирус-контролем)]х100.
В табл. 13 перечислены IC50 для каждого антитела к A/A2 штаммам RSV (ATCC № по кат. VR1540) и RSV В/18537 (ATCC № по кат. VR-1580).
Таблица 13. Результаты анализа нейтрализации для моноклональных антител с наивысшей специфичностью к G-белку RSV
RSV А | RSV В | |
Штамм | А/А2 | В/18537 |
Анализ | Нейтрализация | Нейтрализация |
IC50 (нг/мл) | IC50 (нг/мл) | |
CR9514 (3D3) | 40, 7 | 33, 0 |
СВ002.1 | 35, 5 | 23, 4 |
СВ003.1 | 31,5 | 24, 6 |
СВОЮ.7 | 16, 5 | 14, 1 |
СВ028.2 | 11, 0 | 19, 6 |
СВ048.3 | 16, 7 | 8, 0 |
СВ058.1 | 14,4 | 4,2 |
Из табл. 13 видно, что IC50 (эффективное разведение для 50%-ной нейтрализации бляшкообразования) антител и антигенсвязывающих фрагментов к A/A2 штамму RSV (ATCC № по кат. VR-1540) было ниже 40 нг/мл и/или IC50 для штамма B/18537 RSV (ATCC № по кат. VR-1589) был ниже 30 нг/мл. Кроме того, IC50 для антител CB003.1, CB010.7 и контрольных антител CR9505 (131-2G) и CR9514 (3D3) в случае A/Long штамма RSV (ATCC № по кат. VR-26) составляли 16, 12, 18 и 17 нг/мл соответственно.
Пример 8. Конструирование молекул полностью человеческих иммуноглобулинов (человеческие моноклональные антитела), включая оптимизацию кодонов и анализ рисков возникновения мутаций
Вариабельные участки тяжелой и легкой цепи (VH и VL) для каждого клона антител, выделенных в примере 5 выше, исследовали на присутствие свободных остатков цистеина и сайтов потенциальных пост-трансляционных модификаций, включая сайты гликозилирования, дезамидирования и окисления. Для удаления этих сайтов использовали мутации в аминокислотах, включающие структурно консервативные замены и/или замены в зародышевой линии (табл. 14). Неконсервативные цистеины в вариабельных участках мутировали в серин. Для сайтов гликозилирования можно использовать несколько мутаций, включая замену аспарагина на консервативный глютамин или мутации в зародышевой линии. Модификации в сайтах дезамидирования включают замену аспарагиновой кислоты на аспарагин и серина или аланина на глицин. Сайты потенциального окисления не подвергали модификации. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности получали из каждого VH и VL клона антитела, и оптимизировали их кодоны для экспрессии в клетках человека в GeneArt/Invitrogen. Вариабельные участки этих функциональных вариантов в дальнейшем непосредственно клонировали путем расщепления рестриктазами для экспрессии в векторах, экспрессирующих IgG, pCP9-каппа (See SEQ ID: 127) и pCP9-гамма (см. SEQ ID: 128). BamHI, XhoI и/или SrfI использовали для клонирования вариабельных участков тяжелых цепей и NotI и AscI использовали для клонирования вариабельных участков легких цепей. Нуклеотидные последовательности для всех конструкций проверяли согласно стандартным методикам, известным специалистам в данной области.
Таблица 14. Анализ рисков возникновения мутаций в моноклональных антителах, специфичных к G-белку RSV
Идентификация IgG | Вариабельный участок, цепь | Мутация | Причина |
СВ002.1 | Тяжелая цепь | C102S C107S | Свободный цистеин |
СВ003.1 | Легкая цепь | N30D | Дезаминирование |
СВОЮ.7 | Нет данных | Нет данных | Нет данных |
СВ028.2 | Тяжелая цепь | C105S C110S C112S C117S | Свободный цистеин |
СВ048.3 | Легкая цепь | N92D | Гликозилирование |
СВ058.1 | Тяжелая цепь | C104S C109S | Свободный цистеин |
- 20 035861
Пример 9. Исследования связывания пептида с помощью ELISA и Octet
Подробное эпитопное картирование проводили для выявленных mAb, специфичных к G-белку RSV, таких как CB017.5 и CB030.1. Пептиды синтезировали с помощью химического состава на основе Fmoc (9-флуоренилметоксикарбонил) и очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (HPLC). Для исследования пептид-пептидных взаимодействий некоторые пептиды подвергали биотинилированию по N-концу посредством спейсера на основе аминогексановой кислоты (Ahx). Пептиды анализировали в отношении идентичности с помощью масс-спектрометрии с электрораспылением. Образцы анализировали с помощью сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (UPLC, Alliance, Waters, Милфорд, Массачусетс, США) с колонкой C18 для хроматографии обращенной фазой, и детектирование проводили с помощью диодно-матричного детектора и массочувствительного детектора. Использовали градиент, составлявший 25%/мин, для 25-100% ацетонитрила (ACN) с растворителем A (H2O+0,05% трифторуксусной кислоты [ТФУ]) и с растворителем В (ACN+0,05% TFA). Все растворители были со степенью очистки, по меньшей мере, для HPLC.
Тестировали mAb в отношении связывания с биотинилированными пептидами, которые содержат центральный консервативный участок RSV-G типа A и B (табл. 15). Покрытые авидином титрационные 96-луночные планшеты промывали и инкубировали с помощью 100 мкл биотинилированного пептида (2,37х10-7 М) в буфере для ELISA (PBS+1% FBS+0,05% Tween 20) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем после промывки вносили в лунки по 180 мкл блокирующего буфера (PBS+10% FBS) и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. В дальнейшем планшеты промывали и инкубировали с антителом к иммуноглобулину человеку, конъюгированным с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch), в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания в каждую лунку добавляли 100 мкл субстрата о-фенилендиамина для пероксидазы хрена (Thermo Scientific). Реакцию останавливали через 10 мин с помощью 100 мкл 1 М H2SO4. Поглощение считывали при 490 нм.
Таблица 15. Пептиды RSV-G, используемые для изучения связывания антител
Тип А, центральный участок | |
S ут-17 05 | 6hothh-i45KQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKK2oi (SEQ ID NO: 12 9) |
S ут-17 0 6 | 6hothh-i45KQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRi84 (SEQ ID NO: 125) |
Тип В, центральный участок | |
S ут-17 8 8 | 6hothh-i45KPRPKSPPKKPKDDYHFEVFNFVPCSICGNNQLCKSICKTIPSNKPKKKPTIKPTNK2oi (SEQ ID NO: 130) |
S ут-17 8 9 | 6hothh-i45KPRPKSPPKKPKDDYHFEVFNFVPCSICGNNQLCKSICKTi84 (SEQ ID NO: 131) |
Примечание: подчеркнутые остатки относятся к негликозилированному центральному консервативному домену
Все mAb, описанные выше, связываются с Ga- и Gb-белками RSV (пример 6) и с центральным участком пептидов типа A и типа B (данные не показаны). Титрование антител CB003.1 и CB010.7 показало, что эти mAbs имеют IC50, равные ~20 нг/мл для всех четырех пептидов (фиг. 3). Связывание mAbs с RSV G пептидов определяли, используя сенсорные наконечники Streptavidin на Octet Red384 (ForteBio). И снова, mAb показали перекрестную реактивность в отношении пептидов как типа A, так и типа B (табл. 16). CB003.1 показало самую высокую ответную реакцию как к пептиду типа A, так и к пептиду типа B. CB010.7 показало несколько более высокую степень связывания с типом B по сравнению с пептидами типа A.
Таблица 16. Связывание mAb, специфичных к G RSV, с пептидам RSV-G (октет) [RU]
Пептид | СВОЮ.7 | CB003.1 |
S ym-17 05 | 1,25 | 3,48 |
S ym-17 0 6 | 1,74 | 3,36 |
S ym-17 8 8 | 1,94 | 3,28 |
S ym-17 8 9 | 2,96 | 3,20 |
RU: единицы ответа
Пример 10. Картирование минимальных эпитопов (PepScan)
С целью картирования минимального эпитопа, распознаваемого mAb, тестировали реакционность в отношении пептидов разной длины (5, 8, 10, 14, 18, 25, или 32-мерные), соответствующих центральному участку RSV-G типа A и B (остатки 145-201), используя анализ PepScan. Связывание антител с пептидами оценивали в ELISA на основе PepScan. Каждое mAb титровали с тем, чтобы удостовериться в достижении оптимального связывания, и что неспецифическое связывание было устранено. Каждый из полипропиленовых планшетов размером с кредитную карту содержали ковалентно связанные пептиды, которые инкубировали в течение ночи при 4°C с mAb, от 1 до 10 нг/мл в PBS, содержащем 5% лошадиной сыворотки (объем/объем), 5% OVA (мас./об.) и 1% (об./об.) Tween 80 или в альтернативном блокирующем буфере PBS, содержащем 4% лошадиной сыворотки (об./об.) и 1% (об./об.) Tween 80. После про- 21 035861 мывки планшеты инкубировали с кроличьим антителом к mAb, конъюгированным с пероксидазой хрена (DakoCytomation) в течение 1 часа при 25°C. После дополнительной промывки активность пероксидазы оценивали с помощью субстрата ABTS и количественно оценивали проявление цвета, используя камеру на базе прибора с зарядовой связью и систему обработки изображений.
С помощью данного анализа выявили минимальный пептид, который связывается с антителом, соответствуя энергичному ядру эпитопа, и пептид с наивысшей степенью связывания, содержащий дополнительные прилегающие остатки, которые также способствуют связыванию, и содержит полный эпитоп. Реактивность антител по отношению к пептидам изложена в табл. 17 (остатки изображены в виде заглавных букв). В то время как все антитела связываются с центральным консервативным доменом, критические для их связывания остатки отличаются. Для двух антител (CB003.1 и CB010.7) минимальный эпитоп сводится к N-концевому CCD участку (сходному с 3D3, раскрытому в публикации WO 2009/055711).
Пример 11. Анализ полных замен (PepScan)
С целью идентификации боковых цепей, критических для связывания, и для исследования широты распознавания для известных штаммов RSV, синтезировали специально предназначенные для этого наборы пептидов. Был выполнен анализ полных замен с использованием специально предназначенного для этого комплекта из 280 вариантных пептидов с одной заменой для каждого положения в последовательности FHFEVFNFVPCSIC (SEQ ID NO: 132), распознаваемого антителами CB003.1 и CB010.7, что выявило остатки, имеющие важное значение для связывания с этими антителами (фиг. 5). Эпитоп этих антител сравним с эпитопом 3D3, но распознается он совершенно другим образом. Это отражено в результатах анализа замен, которые показывают, что эпитоп наших антител имеет совершенно другие основные остатки по сравнению с 3D3. Поэтому процесс распознавания и связывания отличается значительно. Как показано в примере 7, антитела настоящего изобретения обладают более высокой нейтрализующей способностью, чем 3D3.
3D3: 159FHFEVFNFVPCSIC172
CB010.7: 159FHFEVFNFVPCSIC172
CB003.1: 159FHFEVFNFVPCSIC172
Консервативные остатки, имеющие важное значение для связывания, также приведены в табл. 17 (критические остатки выделены жирным шрифтом).
Пример 12. Аланиновое сканирование (PepScan)
Тестировали набор пептидов, у которых каждое положение заменяли остатком аланина (фиг. 6). Боковые цепи критических для связывания четырех mAb приведены в табл. 17 (выделены черным жирным шрифтом).
Пример 13. Связывание с вариантными пептидами (PepScan)
Далее антитела тестировали с панелью из 31 пептида, которые охватывают полное разнообразие центрального домена RSV-G, как это представлено в базе GenBank на 1 января 2012 г. Как показано на фиг. 7, распознаются практически все встречающиеся в природе вариантные пептиды типа A и B. CB003.1 демонстрирует более низкую степень связывания с пептидами типа A, чем с типом B. CB010.7 в равной степени хорошо связывается с пептидами как типа A, так и типа B. Антитела являются критичными к мутациям в положении 180 в вариантных пептидах типа A. Мутация Ser170Cys не была критичной для CB010.7. Мутация Ile171Thr была критичной для связывания CB003.1, и мутация Gln175Arg была критичной для CB003.1. Двойная мутация Ile181Phe; Ile184Ala также была критичной для CB003.1. Встречающиеся в природе варианты, которые являются критическими для связывания четырьмя антителами, изложены в табл. 17 (обозначены подчеркиванием).
Таблица 17. Эпитопное картирование с использованием моноклональных антител, специфичных к G-белку RSV (PepScan)
mAb | Тип | Критические остатки в центральном консервативном домене | Эпитоп |
RSV-A | i58DFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKi92 | ||
RSV-B | 158DYHFEVFNFVPCSICGNNQLCKSICKTIPSNKPKKi92 | ||
3D3 | RSV-A | -FHFEVFNFVPcs-c--n--c-aick-i----р-- | I |
RSV-B | -YHFEVFNFVPcs-c-----c--ic---------- | ||
СВ002.1 | RSV-A | -FHFEVFNFVPc--c-nn--c-aick---n--p-- | I |
RSV-B | -YHFEVFNFVPcs-c--n--c--ick--------- | ||
СВ003.1 | RSV-A | - FHFEVFNFVP CSI----------c--------g- | I |
RSV-B | -YHFEVFNFVPCSI----q-----c---------- | ||
СВОЮ.7 | RSV-A | ---FEVFNFVPCSIc-----c-ai----------- | I |
RSV-B | ---FEVFNFVPCSYc-----c-------------- | ||
СВ028.2 | RSV-A | ---FEVFNFVpc--c-----c---c---------- | I |
RSV-B | ---FEVFNFVP---c-----c-------------- | ||
СВ048.3 | RSV-A | -FHFEVFNFVP------------------------ | I |
RSV-B | -YHFEVFNFVP-si-g-nqlc--ic-t-------- | ||
СВ058.1 | RSV-A | --HFEVFNFVP------------------------ | I |
RSV-B | --HFEVFNFVPcsicgnnqlck-ic-tip------ |
- 22 035861
Пояснение: ЗАГЛАВНЫЕ БУКВЫ=минимальный эпитоп (наиболее короткий реактивный пептид), ЗАГЛАВНЫЕ БУКВЫ КУРСИВОМ=дополнительные остатки, которые способствуют связыванию, ЖИРНЫМ ШРИФТОМ БЕЛОГО ЦВЕТА=критические остатки, идентифицированные с помощью анализа полных замен, буквы жирным шрифтом черного цвета=(дополнительные) критические остатки, идентифицированные с использованием аланинового сканирования, подчеркнуто=(дополнительные) критические остатки, идентифицированные с использованием доступных центральных участков вариантных пептидов.
Пример 14. Профилактическая эффективность mAb к G-белку
Для определения того, проявляет ли mAb к G профилактическую эффективность in vivo, mAb CB0003.1 и CB010.7 исследовали на модели хлопкового хомяка с заражением штаммом RSV-A/Long. За 24 ч. до заражения инбредным самцам хлопкового хомяка, серонегативным по парамиксовирусам, возрастом 6-8 недель, с массой 60-80 г в день 1, вводили внутримышечно 5 мг/кг CB003.1, CB010.7, Synagis® или среду-носитель (n=5 в группе) в верхнюю часть задней конечности (четырехглавую мышцу). В день 0 хлопковых хомяков заражали 105,4 БОЕ штамма RSV-A/Long путем интраназальной инстилляции 100 мкл (50 мкл в каждую ноздрю). Через 96 ч животных умерщвляли для отбора легких и носовых раковин: язычковый сегмент доли легкого использовали для выделения общей РНК для определения нагрузки общей вирусной РНК с использованием кПЦР, остальные легкие и носовые раковины использовали для определения инфекционную вирусной нагрузки с помощью теста БОЕ. Образцы крови отбирали в день 0 перед заражением (24 ч после введения mAb), и при завершении исследования (на 96 день или 6 день после заражения), чтобы эффективность дозирования. MAb к G по сравнению со средойносителем уменьшают инфекционные титры вируса в легких и носовых раковинах и нагрузку вирусной РНК (фиг. 8). Инфекционные титры вируса в легких (log10 БОЕ/г) снижались до 2,456 и 1,559 log10 при использовании антител CB003.1 и CB010.7, соответственно, тогда как результатом терапевтической обработки с использованием CR9514 (3D3) было уменьшение лишь до 0,801 log10.
Пример 15. Терапевтическая эффективность mAb к G
Для определения того, проявляет ли mAb к G терапевтическую эффективность in vivo, mAb CB003.1 и CB010.7 исследовали на модели хлопкового хомяка с заражением штаммом RSV-A/Long. В день 0 инбредных самцов хлопкового хомяка, серонегативных по парамиксовирусам, возрастом 6-8 недель, с диапазоном массы 60-80 г в день 1, заражали 106,1 БОЕ штамма RSV-A/Long путем интраназальной инстилляции 100 мкл (50 мкл в каждую ноздрю). Через 1 день после заражения посредством внутрисердечной инъекции вводили 50 мг/кг CB003.1, CB010.7, Synagis® (n=14 на группу) или среды-носителя (n=23 на группу). В день 4 отбирали в случайном порядке 5 животных в группе, умерщвляли для отбора легких и носовых раковин: язычковый сегмент доли легкого использовали для выделения общей РНК для определения нагрузки общей вирусной РНК с использованием кПЦР, остальные легкие и носовые раковины использовали для определения инфекционную вирусной нагрузки с помощью теста БОЕ. В день 6 всех оставшихся животных (n=9 или 18 в группе) умерщвляли для отбора легких для гистопатологического исследования легких. Образцы крови отбирали во 2 день после заражения (24 ч после введения mAb), и при завершении исследования (в день 4 или день 6 после заражения), чтобы подтвердить эффективность дозирования. MAb к G по сравнению со средой-носителем уменьшают инфекционные титры вируса в легких и носовых раковинах, но не нагрузку вирусной РНК в легких (фиг. 9). Инфекционные титры вируса в легких (log10 БОЕ/г) снижались до 2,348 и 1,736 log10 при использовании антител CB003.1 и CB010.7, соответственно, тогда как результатом терапевтической обработки с использованием CR9514 (3D3) было уменьшение лишь до 1,369 log10. Кроме того, новые mAb к G снижали баллы гистопатологической оценки перибронхиолита, периваскулита, интерстициальной пневмонии и альвеолита (фиг. 10), тогда как CR9514 (3D3) снижало баллы лишь в отношении интерстициальной пневмонии.
- 23 035861
Последовательности >СВ058.1 VH - SEQ ID NO: 37
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIRGSVDNT YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCAKDPALYCSGETCFSDLTDWGQGTL VTVSS >CB058.1 VK - SEQ ID NO: 38
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASTLPSGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYFCQHYIRYPHTFGQGTKLEIK >CB048.3 VH - SEQ ID NO: 39
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSNHGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGNKK YYADSVKGRFTVSRDNSKNTLSLQMDSLRAEDTAIYYCAKTTFYFDDSNYYEYLDYWGQGTLV TVSS >CB048.3 VK - SEQ ID NO: 40
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGIRSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGV
PSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDSATYYCQQLNTSPPYTFGQGTKLEIK >CB010.7 VH - SEQ ID NO: 41
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFNTHGMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGTKK
YHADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAIYYCAKVGELRSFDWLLADGTAYYYYGMD VWGQGTTVTVSS >CB010.7 VK - SEQ ID NO: 42
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWFQQKPGQPPRLLINWAS
TREFGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAIYYCHQYYSIPLTFGGGTKVEIK >CB003.1 VH - SEQ ID NO: 43
QVQLVQSGPELRKPGASVTVSCKASGYTFTTYYIHWVRQAPGGGLDWMGMINTGSGVT
SYAQKFQGRVAMTRDTSTSTVFMELSSLRFEDTALYYCARMYSGSWYPFDYWGQGALVTVSS >CB003.1 VK - SEQ ID NO: 44
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQNINGNYLAWYQQKPGLAPRLLIYEASSRATG
IPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFGVYYCQQYGTSPFFTFGPGTKVDIK >CB028.2 VH -SEQ ID NO: 45
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGITWVRQAPGQGLEWMGWISGDSDNT NYAQNLQGRVTLTTDISTRTAYMELRSLKPDDTAMYYCARALAKWYCSSSSCFCGGGSCYSDY WGQGTLVTVSS >CB028.2 VK -SEQ ID NO: 46
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGMSNYLNWYQQKPGKAPELLIYAASTLQSGV
PSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYFCQQSFSTPLTFGGGTKVEIK > CB002.1 VH - SEQ ID NO: 47
- 24 035861
QVQLQESGPRLVKPSETLSLTCTVSGGSTSSYFWNWIRQPPGKGLEWIGYIYGSGSAD YNPSLKSRVTISIDTSKTQFSLKLTSVTAADTAVYYCARSGFCTNDACYRRGSWFDPWGQGTL VTVSS > CB002.1 VK - SEQ ID NO: 48
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTVSSLHPEDFATYYCQQSYSTLTWTFGQGTKVEIK
SEQ ID: 127 (рСР9-каппа последовательность)
TACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGG ATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAA AGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACA ATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCT GAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAG AATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCTAGGTGGTCAATATTGGCCATTAGCCA TATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATC CATATCATAATATG TAGAT TTATATTGGCTCATGTC GAAGAT TACCGCCATGTT GACAT T GAT TATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGT TCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCAT T GAC G T СAATAAT GAC GTATGTTCCCATAG TAAC G С СAATAG G GAC T T T С CAT T GAC G T СAAT GGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTA CGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCT TATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGC GGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCC ACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTC GTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAA GCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCC ATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAAGCTTGGTAC CGAGCTCGGATCCTTAATTAACTCGAGGCCCGAGCCCGGGCGAGCCCAGACACTGGACGCTGA ACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGCCTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCG CGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAG AGAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCGCTCC TGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGTCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCT CTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCC
- 25 035861
CCAGGCTCTGGGCAGGCACGGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGG TGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACC CCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAAC TCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCC AGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTG CATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTG AACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCT CCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGT ACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCA AAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCC TCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTG GTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTC ACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGCTAGCGAATTC ACCGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCC ATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCT TTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGG TGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGC GGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGC GCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACT TGCCAGCGCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGC TTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCAC CTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACG GTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGA ACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCC TATTGGTTAAAAAATGAGСTGATTTAAGAAAAATTTAAGGCGAATTAATTСTGTGGAATGTGT GTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATC TCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAA GCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAA CTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGG CCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAG GCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGGATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGAT
- 26 035861
GAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGG AGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCC GGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATG AACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTG TGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGG ATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGC GGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGC GAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGG GGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCG TCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGAT TCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTG ATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCG CTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCT GGGGTTCGGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAA TCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCG CCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATT TCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTAT CTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGT TTCCTGTGT GAAAT TGTTATCCGCT СACAAT T C GAGACAACATAC GAG С C G GAAG CATAAAG T GTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCG CTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTT TTGCGCTGCTTCGCTAGGTGGTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGC ATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTA TATTGGCTCATGTC CAACAT TACCGCCATGTT GAGAT T GAT TAT T GAG TAGTTATTAATAGTA ATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGT AAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGT TCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAAC TGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGA CGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCA GTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGG GCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAG TTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGAC GCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCG TCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATC CAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAAGCTTGGTACCGGTGAATTCGGCGCGCCAGAT CTGCGGCCGCTAGGAAGAAACTCAAAACATCAAGATTTTAAATACGCTTCTTGGTCTCCTTGC
- 27 035861
TATAATTATCTGGGATAAGCATGCTGTTTTCTGTCTGTCCCTAACATGCCCTGTGATTATCCG СAAACAAGACACСCAAGGGCAGAACΤTTGTTACTTAAACACCATСCTGΤTTGСTTСTTTССTС AGGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGG AACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAA GGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGA CAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGT CTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGG AGAGTGTTAGTTAACGGATCGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACCGCTGATCAG CCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGA CCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTC TGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGG AAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCA GCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGC TTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTC AAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAA AGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCG CCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACT ATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCC GCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACG CTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCC CGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACA CGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGG TGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTAT CTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACA AACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGG ATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACG Τ TAAGGGAT Τ Τ T GG T CAT GAGAT TAT CAAAAAGGAT С T T CAC С TAGAT С С Τ Τ Τ Τ ΑΑΆΤ ΤΑΑΆΆ AT GAAG Τ Τ Τ ΤΑΑΆΤ CAAT С TAAAG TATATAT GAG TAAAC Τ T G G T С T GACAG T TAC CAAT G С Τ T AATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCC CGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACC GCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGA GCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGC TAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGT GGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGT TACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAG AAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGT
- 28 035861
CATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATA GTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAG CAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTT ACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTT TACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAAT AAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCA
SEQ ID: 128 (рСР9-лямбда последовательность)
TACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGG ATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAA AGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACA ATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCT GAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAG AATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCTAGGTGGTCAATATTGGCCATTAGCCA TATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATC CATATCATAATATG TACAT TTATATTGGCTCATGTC CAACAT TACCGCCATGTT GACAT T GAT TATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGT TCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCAT T GAC G T CAATAAT GAC GTATGTTCCCATAG TAAC G С CAATAG G GAC T T T С CAT T GAC G T CAAT GGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTA CGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCT TATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGC GGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCC ACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTC GTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAA GCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCC ATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAAGCTTGGTAC CGAGCTCGGATCCTTAATTAACTCGAGGCCCGAGCCCGGGCGAGCCCAGACACTGGACGCTGA ACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGCCTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCG CGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAG AGAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCGCTCC TGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGTCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCT CTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCC
- 29 035861
CCAGGCTCTGGGCAGGCACGGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGG TGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACC CCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAAC TCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCC AGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTG CATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTG AACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCT CCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGT ACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCA AAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCC TCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTG GTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTC ACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGCTAGCGAATTC ACCGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCC ATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCT TTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGG TGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGC GGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGC GCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACT TGCCAGCGCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGC TTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCAC CTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACG GTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGA ACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCC TATTGGTTAAAAAATGAGСTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTСTGTGGAATGTGT GTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATC TCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAA GCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAA CTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGG CCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAG GctTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGGATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGAT
- 30 035861
GAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGG AGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCC GGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATG AACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTG TGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGG ATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGC GGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGC GAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGG GGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCG TCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGAT TCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTG ATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCG CTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCT GGGGTTCGGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAA TCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCG CCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATT TCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTAT CTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGT TTCCTGTGT GAAAT TGTTATCCGCT СACААТ T С CACACAACATAC GAG С C G GAAG CATAAAG T GTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCG CTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTT TTGCGCTGCTTCGCTAGGTGGTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGC ATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTA TATTGGCTCATGTC CAACAT TACCGCCATGTT GACAT T GAT TAT T GAC TAGTTATTAATAGTA ATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGT AAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGT TCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAAC TGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGA CGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCA GTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGG GCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAG TTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGAC GCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCG TCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATC CAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAAGCTTGGTACCGGTGAATTCGGCGCGCCAGAT CTGCGGCCGCTAGGAAGAAACTCAAAACATCAAGATTTTAAATACGCTTCTTGGTCTCCTTGC
- 31 035861
TATAATTATCTGGGATAAGCATGCTGTTTTCTGTCTGTCCCTAACATGCCCTGTGATTATCCG СAAACAACACACСCAAGGGCAGAACTTTGTTACTTAAACACCATСCTGTTTGСTTСTTTССTС AGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGC CAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTG GAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAA CAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAG CTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATG TTCATAGAGTTAACGGATCGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACCGCTGATCAGC CTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGAC CCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCT GAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGA AGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAG CTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCT TCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCA AAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAA GGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGC CCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTA TAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCG CTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGC TGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCC GTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACAC GACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGT GCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATC TGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAA ACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGA TCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGT TAAGGGAT T T T GG T CAT GAGAT TAT CAAAAAGGAT С T T CAC С TAGAT С С T T T TAAAT TAAAAA T GAAG T T T TAAAT СAAT С TAAAG TATATAT GAG TAAAC T T G G T С T GACAG T TAC СAAT G С T TA ATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCC GTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCG CGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAG CGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCT AGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTG GTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTT ACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGA AGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTC ATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAG TGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGC AGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTСTTCGGGGCGAAAACTСTCAAGGATСTTA CCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTT ACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATA AGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCA
Claims (19)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Антитело, способное специфично связываться с G-белком респираторного синцитиального вируса (RSV) и способное нейтрализовать A и B штаммы RSV, где антитело связывается с эпитопом в центральном консервативном домене G-белка RSV и где указанный эпитоп содержит одну или более аминокислот из аминокислот 161-169, в частности аминокислот 162-168 G-белка RSV A2 штамма RSV, где антитело содержит CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 1, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2 и CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 3, CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 13, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 14 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 15.
- 2. Антитело, способное специфично связываться с G-белком респираторного синцитиального вируса (RSV) и способное нейтрализовать A и B штаммы RSV, где антитело связывается с эпитопом в цен- 32 035861 тральном консервативном домене G-белка RSV и где указанный эпитоп содержит одну или более аминокислот из аминокислот 161-169, в частности аминокислот 162-168 G-белка RSV A2 штамма RSV или соответствующие аминокислоты других штаммов, где антитело содержит CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 4, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 5 и CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 6, CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 16, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 17 и CDR3участок легкой цепи с SEQ ID NO: 18.
- 3. Антитело, способное специфично связываться с G-белком респираторного синцитиального вируса (RSV) и способное нейтрализовать А и В штаммы RSV, где антитело связывается с эпитопом в центральном консервативном домене G-белка RSV и где указанный эпитоп содержит одну или более аминокислот из аминокислот 161-169, в частности аминокислот 162-168 G-белка RSV A2 штамма RSV или соответствующие аминокислоты других штаммов, где антитело содержит CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 7, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 8 и CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 9, CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 19, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 20 и CDR3участок легкой цепи с SEQ ID NO: 21.
- 4. Антитело, способное специфично связываться с G-белком респираторного синцитиального вируса (RSV) и способное нейтрализовать A и B штаммы RSV, где антитело связывается с эпитопом в центральном консервативном домене G-белка RSV и где указанный эпитоп содержит одну или более аминокислот из аминокислот 161-169, в частности аминокислот 162-168 G-белка RSV A2 штамма RSV или соответствующие аминокислоты других штаммов, где антитело содержит CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 10, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 1 и CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 12, CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 22, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 23 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 24.
- 5. Антитело, способное специфично связываться с G-белком респираторного синцитиального вируса (RSV) и способное нейтрализовать A и B штаммы RSV, где антитело связывается с эпитопом в центральном консервативном домене G-белка RSV и где указанный эпитоп содержит одну или более аминокислот из аминокислот 161-169, в частности аминокислот 162-168 G-белка RSV A2 штамма RSV или соответствующие аминокислоты других штаммов, где антитело содержит CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 25, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 26 и CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 27, CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 28, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 29 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 30.
- 6. Антитело, способное специфично связываться с G-белком респираторного синцитиального вируса (RSV) и способное нейтрализовать A и B штаммы RSV, где антитело связывается с эпитопом в центральном консервативном домене G-белка RSV и где указанный эпитоп содержит одну или более аминокислот из аминокислот 161-169, в частности аминокислот 162-168 G-белка RSV A2 штамма RSV или соответствующие аминокислоты других штаммов, где антитело содержит CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 31, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 32 и CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 33, CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 34, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 35 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 36.
- 7. Антитело по любому из пп.1-6, где антитело представляет собой антитело человека.
- 8. Антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из пп.1-7.
- 9. Иммуноконъюгат, содержащий антитело по любому из пп.1-7 или антигенсвязывающий фрагмент по п.8 и по меньшей мере одно терапевтическое средство и/или выявляемое средство.
- 10. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по любому из пп.1-7 или антигенсвязывающий фрагмент по п.8.
- 11. Экспрессионный вектор, содержащий по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты по п.10.
- 12. Клетка-хозяин для получения антитела по любому из пп.1-7 или антигенсвязывающего фрагмента по п.8, содержащая по меньшей мере один вектор по п.11.
- 13. Способ получения антитела по любому из пп.1-7 или антигенсвязывающего фрагмента по п.8, где способ предусматривает следующие этапы:a) культивирование клетки-хозяина по п.12 в условиях, способствующих экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, иb) выделение экспрессированого антитела и/или антигенсвязывающего фрагмента.
- 14. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения инфекции RSV, содержащая антитело по любому из пп.1-7 или антигенсвязывающий фрагмент по п.8 и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное средство.
- 15. Применение антитела по любому из пп.1-7 в профилактике или лечении инфекции RSV.
- 16. Применение антигенсвязывающего фрагмента по п.8 в профилактике или лечении инфекции RSV.
- 17. Применение фармацевтической композиции по п.14 в профилактике или лечении инфекции RSV.
- 18. Набор для профилактики или лечения инфекции RSV, содержащий по меньшей мере одно анти-- 33 035861 тело по любому из пп.1-7, или антигенсвязывающий фрагмент по п.8, или фармацевтическую композицию по п.14, или их комбинацию и инструкции по применению.
- 19. Способ выявления инфекции RSV, предусматривающий:(a) анализ в образце уровня антигена RSV путем приведения образца в контакт с диагностически эффективным количеством антитела по любому из пп.1-7, антигенсвязывающего фрагмента по п.8 и/или иммуноконъюгата по п.9 и (b) сравнение анализируемого уровня антигена RSV с контрольным уровнем, где увеличение анализируемого уровня антигена RSV по сравнению с контрольным уровнем указывает на инфекцию RSV.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361812098P | 2013-04-15 | 2013-04-15 | |
EP13179241 | 2013-08-05 | ||
PCT/EP2014/057499 WO2014170257A1 (en) | 2013-04-15 | 2014-04-14 | Human antibodies binding to rsv g protein |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201591973A1 EA201591973A1 (ru) | 2016-04-29 |
EA035861B1 true EA035861B1 (ru) | 2020-08-21 |
Family
ID=48914151
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201591973A EA035861B1 (ru) | 2013-04-15 | 2014-04-14 | Антитела человека, связывающиеся с g-белком rsv |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10196438B2 (ru) |
EP (2) | EP2986637A1 (ru) |
JP (1) | JP6412107B2 (ru) |
KR (1) | KR102201554B1 (ru) |
CN (1) | CN105189547B (ru) |
AU (1) | AU2014255864B2 (ru) |
CA (1) | CA2908878C (ru) |
EA (1) | EA035861B1 (ru) |
TW (1) | TWI637965B (ru) |
WO (1) | WO2014170257A1 (ru) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10196438B2 (en) | 2013-04-15 | 2019-02-05 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Human antibodies binding to RSV G protein |
US10035842B2 (en) | 2013-04-15 | 2018-07-31 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Human antibodies binding to RSV G proteins |
CN110590916A (zh) | 2013-04-25 | 2019-12-20 | 扬森疫苗与预防公司 | 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽 |
MY171210A (en) | 2013-06-17 | 2019-10-02 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides |
ZA201608812B (en) | 2014-06-26 | 2019-08-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau |
EP3486256A3 (en) | 2014-06-26 | 2019-08-28 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau |
WO2016154572A1 (en) * | 2015-03-26 | 2016-09-29 | Vanderbilt University | Antibody-mediated neutralizaton of ebolaviruses |
WO2016205641A2 (en) * | 2015-06-17 | 2016-12-22 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Respiratory syncytial virus having cleavage-resistant g protein and related materials and methods |
EP3319634B1 (en) | 2015-07-07 | 2019-08-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides |
IL288541B (en) | 2015-07-07 | 2022-08-01 | Janssen Vaccines Prevention B V | vaccine against rsv |
MY190320A (en) | 2016-04-05 | 2022-04-13 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Stabilized soluble pre-fusion rsv f proteins |
KR102401247B1 (ko) | 2016-04-05 | 2022-05-25 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | Rsv에 대한 백신 |
EA039124B1 (ru) | 2016-05-30 | 2021-12-08 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Стабилизированные f-белки rsv до слияния |
US10259865B2 (en) | 2017-03-15 | 2019-04-16 | Adma Biologics, Inc. | Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection |
US11229692B2 (en) | 2017-05-17 | 2022-01-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against RSV infection |
CN111163800A (zh) | 2017-09-15 | 2020-05-15 | 扬森疫苗与预防公司 | 用于安全诱导针对rsv的免疫的方法 |
US11781248B2 (en) | 2019-06-13 | 2023-10-10 | Allogene Therapeutics, Inc. | Anti-TALEN antibodies and uses thereof |
WO2024017682A1 (en) * | 2022-07-18 | 2024-01-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Rsv immunogens |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009055711A2 (en) * | 2007-10-25 | 2009-04-30 | Trellis Bioscience, Inc. | Anti-rsv g protein antibodies |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100457914C (zh) | 1999-04-15 | 2009-02-04 | 荷兰克鲁塞尔公司 | 用编码腺病毒e1蛋白的序列在人体细胞中生产重组蛋白 |
CN102131830A (zh) | 2008-07-18 | 2011-07-20 | 魁北克益得生物医学公司 | 嵌合呼吸道合胞病毒多肽抗原 |
WO2010075491A2 (en) | 2008-12-24 | 2010-07-01 | University Of Rochester | Recombinant expression of self-folding neutralizing epitope-bearing subdomains of the respiratory syncytial virus attachment and fusion proteins |
TWI577238B (zh) | 2012-04-25 | 2017-04-01 | 群康科技(深圳)有限公司 | 有機發光二極體及包含其之顯示裝置 |
US10196438B2 (en) | 2013-04-15 | 2019-02-05 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Human antibodies binding to RSV G protein |
US10035842B2 (en) | 2013-04-15 | 2018-07-31 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Human antibodies binding to RSV G proteins |
-
2014
- 2014-04-14 US US14/784,937 patent/US10196438B2/en active Active
- 2014-04-14 JP JP2016508114A patent/JP6412107B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2014-04-14 EP EP14717446.0A patent/EP2986637A1/en not_active Ceased
- 2014-04-14 WO PCT/EP2014/057499 patent/WO2014170257A1/en active Application Filing
- 2014-04-14 KR KR1020157031166A patent/KR102201554B1/ko active IP Right Grant
- 2014-04-14 EA EA201591973A patent/EA035861B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-04-14 EP EP19179323.1A patent/EP3567051A1/en not_active Withdrawn
- 2014-04-14 AU AU2014255864A patent/AU2014255864B2/en not_active Ceased
- 2014-04-14 CA CA2908878A patent/CA2908878C/en active Active
- 2014-04-14 CN CN201480021372.0A patent/CN105189547B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2014-04-15 TW TW103113803A patent/TWI637965B/zh not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009055711A2 (en) * | 2007-10-25 | 2009-04-30 | Trellis Bioscience, Inc. | Anti-rsv g protein antibodies |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
E. E. WALSH, C. B. HALL, J. J. SCHLESINGER, M. W. BRANDRISS, S. HILDRETH, P. PARADISO: "Comparison of Antigenic Sites of Subtype-specific Respiratory Syncytial Virus Attachment Proteins", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, SOCIETY FOR GENERAL MICROBIOLOGY �ETC.|, vol. 70, no. 11, 1 November 1989 (1989-11-01), pages 2953 - 2961, XP055103541, ISSN: 00221317, DOI: 10.1099/0022-1317-70-11-2953 * |
LARRY J ANDERSON, PATRICIA BINGHAM, JOHN C HIERHOLZER: "NEUTRALIZATION OF RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS BY INDIVIDUAL AND MIXTURES OF F AND G PROTEIN MONOCLONAL ANTIBODIES", JOURNAL OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 62, no. 11, 1 November 1988 (1988-11-01), US, pages 4232 - 4238, XP002661211, ISSN: 0022-538X * |
POWER, U.F. ; PLOTNICKY-GILQUIN, H. ; GOETSCH, L. ; CHAMPION, T. ; BECK, A. ; HAEUW, J.F. ; NGUYEN, T.N. ; BONNEFOY, J.Y. ; CORVAI: "Identification and characterisation of multiple linear B cell protectopes in the respiratory syncytial virus G protein", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 19, no. 17-19, 21 March 2001 (2001-03-21), AMSTERDAM, NL, pages 2345 - 2351, XP027349942, ISSN: 0264-410X * |
WAYNE SULLENDER: "Antigenic Analysis of Chimeric and Truncated G Proteins of Respiratory Syncytial Virus", VIROLOGY, ACADEMIC PRESS, vol. 209, no. 1, 1 May 1995 (1995-05-01), pages 70 - 79, XP055102753, ISSN: 00426822, DOI: 10.1006/viro.1995.1231 * |
YOUNGJOO CHOI, CALEB S. MASON, LES P. JONES, JACKELYN CRABTREE, PATRICIA A. JORQUERA, RALPH A. TRIPP: "Antibodies to the Central Conserved Region of Respiratory Syncytial Virus (RSV) G Protein Block RSV G Protein CX3C-CX3CR1 Binding and Cross-Neutralize RSV A and B Strains", VIRAL IMMUNOLOGY, MARY ANN LIEBERT, INC. PP, pages 120502120244005, XP055102546, ISSN: 08828245, DOI: 10.1089/vim.2011.0094 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6412107B2 (ja) | 2018-10-24 |
EA201591973A1 (ru) | 2016-04-29 |
US20160145321A1 (en) | 2016-05-26 |
AU2014255864B2 (en) | 2019-07-18 |
JP2016521969A (ja) | 2016-07-28 |
WO2014170257A1 (en) | 2014-10-23 |
CN105189547A (zh) | 2015-12-23 |
AU2014255864A1 (en) | 2015-10-22 |
KR102201554B1 (ko) | 2021-01-12 |
TW201522367A (zh) | 2015-06-16 |
TWI637965B (zh) | 2018-10-11 |
EP3567051A1 (en) | 2019-11-13 |
CN105189547B (zh) | 2020-01-17 |
CA2908878C (en) | 2021-06-29 |
CA2908878A1 (en) | 2014-10-23 |
EP2986637A1 (en) | 2016-02-24 |
KR20150143544A (ko) | 2015-12-23 |
US10196438B2 (en) | 2019-02-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2908878C (en) | Human antibodies binding to rsv g protein | |
CA2908921C (en) | Human antibodies binding to rsv g protein | |
JP2010534057A (ja) | 呼吸器合胞体ウイルス感染症を治療するための組換え抗体 | |
JP2009528828A (ja) | 消化器多核体ウイルス感染症の治療のための組み換えポリクローナル抗体 | |
US11370829B2 (en) | Antibodies that potently neutralize RSV and uses thereof | |
CN114644708A (zh) | 呼吸道合胞病毒特异性结合分子 | |
CN114174331A (zh) | 结合人类偏肺病毒融合蛋白的抗体及其用途 | |
CN108472343B (zh) | 抗rsv融合前f蛋白的免疫球蛋白单可变结构域抗体 | |
KR20240017940A (ko) | 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 항체 및 이의 사용 | |
US20220340658A1 (en) | NEUTRALIZING ANTI-SARS-CoV-2 ANTIBODIES AND USE THEREOF | |
EP4230650A1 (en) | Antibodies capable of binding to the spike protein of coronavirus sars-cov-2 | |
WO2023172881A1 (en) | Hmpv antibodies and their use |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KZ KG TJ TM |