CN105189547B - 结合到rsv g蛋白的人类抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及结合到RSV的G蛋白并且能够中和RSV A和B亚型的分离的抗体和抗原结合片段，和其在诊断、预防、和/或治疗RSV感染中的用途。
Description
发明领域
本发明涉及医学。本发明尤其涉及特异性结合到呼吸道合胞体病毒(RSV)的附着糖蛋白(G蛋白)并且中和RSV的抗体和抗原结合片段。本发明还涉及使用抗RSV抗体的诊断、预防以及治疗方法。
发明背景
人类呼吸道合胞体病毒(RSV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)的一种负义单链RNA病毒，该科还包括常见呼吸道病毒，如导致麻疹和腮腺炎的呼吸道病毒。存在两种原始RSV亚型：亚型A和亚型B。RSV在上呼吸道中复制并且然后蔓延到下气道，导致细支气管炎或肺炎。该病毒引起炎症、气道水肿、粘液产生增加以及呼吸上皮破裂。
估计全世界有6400万例呼吸道疾病和160,000例死亡可归因于RSV诱发的疾病。严重RSV感染最通常出现在儿童和婴儿中、尤其早产儿中。潜在健康问题(如慢性肺病或先天性心脏病)可能会显著增加重病的风险。RSV感染还可能会在年老者、患有慢性肺病的个体以及免疫功能不全的成人(如骨髓移植接受者)中引起重病。
已经研究若干用以预防和治疗RSV感染的方法。从供体分离的静脉注射免疫球蛋白(RSV-IGIV；
)和单克隆抗体帕利珠单抗(
)已经得到批准用于在高风险早产儿中进行RSV预防。然而，用于RSV的疫苗或可商购治疗仍不可获得。仅利巴韦林(一种RNA抑制剂)得到批准用于治疗RSV感染。为了有效用于治疗RSV感染，高剂量、重复给药和/或大量的抗体产品(如帕利珠单抗)因低有效性而是所需的。
RSV具有两种主要表面糖蛋白，F和G。F蛋白介导融合，使得病毒进入到细胞的细胞质中并且促进体外合胞体的形成。F蛋白序列在RSV株之中是充分(约90％)保守的(约翰逊(Johnson)和柯林斯(Collins)，《普通病毒学杂志》(J Gen Virol)，(1988)69:2623-2628)。唯一市售的单克隆抗体帕利珠单抗针对RSV的F蛋白。
RSV的G蛋白是一种严重糖基化并且充当附着蛋白的表面蛋白。与F蛋白对比，G蛋白在病毒株中除中央保守域(CCD)外相当可变，该中央保守域包含RSV A2株的G蛋白的氨基酸残基153-184或其他病毒株中的相对应的氨基酸残基。中央保守域和相邻区(残基145-193)以刚性和重O-糖基化粘蛋白样区为边界。中央保守域的N末端那一半含有一个在多于700种病毒株之中保守的小区。C末端那一半含有4个以1-4、2-3布局连接的保守半胱氨酸并且折叠为一个胱氨酸套索。
尽管使用针对G蛋白的抗体进行的被动免疫一般由于在病毒株中缺乏序列保守性而被视为不切实际的，但中和结合到RSV G蛋白的单克隆抗体是已知的。安德森L.J.(Anderson,L.J.)等人(《病毒学杂志》(J.Virol.)(1988)62:4232-4238)描述了F和G鼠类单克隆抗体混合物的中和能力，这些抗体之一结合到RSV G蛋白(即131-2G)。这种抗体的抗原位点后来由萨伦德(Sullender)定义(《病毒学》(Virol.)(1995)209:70-79)。发现这种抗体结合代表RSV的主要病毒株的RSV组A和B。另外，WO 2009/055711披露了与RSV A2的G蛋白内的保守基元具有免疫反应性并且针对RSV A和B亚型具有中和活性的抗体，如3D3和3G12。这些抗体已经显示识别中央保守域中的线性表位，但尚未在优选动物模型(即棉花大鼠)中进行测试用于评估RSV抗体和疫苗。
鉴于特别是在幼儿和年老者中由RSV引起的呼吸道疾病的严重程度，持续需要用以预防和治疗RSV感染的有效手段。
发明概述
本发明提供了特异性结合到RSV G蛋白并且能够中和RSV的分离的抗体和其抗原结合片段。这些抗体和抗原结合片段优选地能够特异性结合到并且中和亚型A和B的RSV。优选地，这些抗体是人类抗体。这些抗体结合到该RSV G蛋白的中央保守未糖基化区(也称为中央保守域，CCD)中的表位。
这些抗体和抗原结合片段对于该G蛋白具有高亲和力并且具有有力的中和能力。这些本发明的抗体和抗原结合片段单独和与其他诊断、预防和/或治疗剂组合可用作诊断、预防和/或治疗剂。
本发明进一步提供了组合物，这些组合物包含一种或多种本发明的抗体和/或其抗原结合片段。本发明还提供了使用这些抗RSV抗体的诊断、预防以及治疗方法。预防和治疗方法包括将这些抗RSV抗体和/或其抗原结合片段给予人类受试者用于预防或治疗一种RSV感染和RSV介导的疾病或病状和/或改善一种RSV感染的一种或多种症状。多种不同抗RSV抗体和/或其抗原结合片段和/或与其他抗RSV抗体的组合可以用于组合疗法。还提供了包含这些抗RSV抗体和/或其抗原结合片段与其他预防或治疗剂组合的组合物。本发明还提供了编码这些抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
这些本发明的抗体是独特的，在于至少在一种体外中和分析中，针对RSV A和B型这些抗体比任何已知抗RSV G抗体、特别是比已知抗RSV G单克隆抗体3D3更有力。
这些本发明的抗体结合到该RSV G蛋白上的独特表位。
在某些实施例中，这些抗体包含一个在其氨基酸序列中包含一种CXXXXC基元的重链CDR3。
在某些实施例中，这些抗体和其抗原结合片段是独特的，在于它们与抗RSV F抗体叠加和/或协同地起作用。
附图说明
图1示出了针对RSV Ga和RSV Gb蛋白的结合特征曲线。在ELISA分析中测试IgG结合到重组RSV Ga和Gb蛋白的胞外域的能力。开口圈(虚线)表示结合到Ga(RSV A/长)并且闭口圈(实线)表示结合到Gb(RSVB/B1)。
图2示出了针对RSV-A和RSV-B株的中和特征曲线。在中和分析中测试IgG中和RSV-A和RSV-B株的能力。开口圈(虚线)表示中和RSV-A(RSV A/A2)并且闭口圈(实线)表示中和RSV-B(RSV B/18537)。
图3示出了RSV G特异性单克隆抗体与RSV G肽的结合(ELISA)。跨越中央保守域的短和长RSV G肽(表15)在一种ELISA中用于结合实验，其中RSV G特异性mAb的浓度不同：CB003.1(闭口黑色圈，实线)、CB010.7(开口黑色圈，虚线)，或无单克隆抗体(闭口浅灰色圈)。
图4：通过PepScan进行的最小表位定位。RSV G蛋白特异性抗体与中央区(RSV-G A型和B型的残基145-201)的所有完全重叠5聚体(mer)、8聚体、10聚体、14聚体、18聚体、25聚体以及32聚体肽的结合活性。与一种肽的结合活性以与PepScan ELISA信号成比例的垂直线形式示出。
图5：通过PepScan进行的CB003.1和CB010.7表位的完全取代分析。单克隆抗体CB003.1和CB010.7对应地在100和30ng/mL下与一种肽的结合活性以与Pepscan ELISA信号成比例的垂直线形式示出。具有20条线的每一组对应于针对初始14聚体肽(FHFEVFNFVPCSIC)中的每个氨基酸位置设定的完全置换。在每一组的20条线内，取代是基于单字母氨基酸代码按字母顺序的(ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY)并且初始14聚体肽的反应性以灰色条形式示出。
图6：RSV G蛋白中央区的丙氨酸扫描(PepScan)。对应于A型(左图)和B型(右图)的RSV-G中央域的残基161-192的肽的所有位置处的丙氨酸取代。A型的位置180处的丙氨酸被甘氨酸取代。初始肽的反应性以灰色条形式示出。
图7示出了单克隆抗体与RSV G蛋白中央区的天然存在的变体的结合。mAbCB003.1和CB010.7与对应于可用的A型(上图)和B型(下图)变体的不同肽的结合。野生型肽的反应性以灰色条形式示出。
图8示出了抗RSV G mAb在激发后第4天在棉花大鼠RSV-A/长模型中关于肺和鼻甲病毒负荷的预防功效。
图9示出了抗RSV G mAb在激发后第4天在棉花大鼠RSV-A/长模型中关于肺和鼻甲病毒负荷的治疗功效。
图10示出了在激发后第6天抗RSV G mAb在棉花大鼠RSV-A/长模型中关于组织病理学分数的治疗功效。
发明说明
定义
以下给出如本发明中所用的术语的定义。
如在此所用，术语“包括(included)”或“包括着(including)”被视为后面有措辞“无限制”。
如在此所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，包括单克隆抗体，如嵌合、人类化或人类单克隆抗体。术语“抗体”包括本领域中已知的所有免疫球蛋白类别和子类。取决于其重链的恒定域的氨基酸序列，抗体可以被分成五种主要完整抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，并且这些类别中的数种可以进一步被分成子类(同种型)，例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4。
术语抗原结合片段是指一种免疫球蛋白的包含抗原结合和/或可变域的片段，这些片段与完整免疫球蛋白为特异性结合到免疫球蛋白(即RSV G蛋白)的结合伴侣而竞争。无关于结构，抗原结合片段与由完整免疫球蛋白识别的相同抗原结合。抗原结合片段尤其包括Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、(单)域抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、至少含有一种免疫球蛋白的足以致使特异性抗原结合到(多)肽的一个片段的(多)肽等。一种抗原结合片段可以包含包括抗体的氨基酸序列的至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或250个连续氨基酸残基的一种氨基酸序列的一种肽或多肽。抗原结合片段可以合成地或通过使完整免疫球蛋白酶促或化学裂解而产生，或它们可以通过重组DNA技术而基因工程化。产生方法在本领域中是熟知的并且在例如《抗体：实验手册》(Antibodies:ALaboratory Manual)，E.哈洛(E.Harlow)和D莱恩(D,Lane)编(1988)，冷泉港实验室(ColdSpring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约(New York)中进行描述，该文献通过引用结合在此。一种抗体或其抗原结合片段可以具有一个或多个结合位点。如果存在多于一个结合位点，那么这些结合位点可以与彼此相同或它们可以是不同的。
如在此所用，术语“克隆抗体”是指具有单一特异性的抗体分子。一种单克隆抗体对于一种具体表位呈现一种单一结合特异性和亲和力。因此，术语“人类单克隆抗体”是指一种呈现一种单一结合特异性的抗体，该抗体具有衍生自或基于人类生殖系免疫球蛋白序列或衍生自完全合成序列的可变和恒定区。制备单克隆抗体的方法与结合特异性不相关。
如在此所用，术语“功能变体”是指一种抗体，该抗体包含与一种参考抗体的核苷酸和/或氨基酸序列相比通过一个或多个核苷酸和/或氨基酸而改变的一种核苷酸和/或氨基酸序列并且能够与参考抗体为特异性结合到结合伴侣(即RSV)而竞争。换句话说，参考抗体的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由该核苷酸序列编码或含有该氨基酸序列的抗体的结合特征，即该抗体仍能够特异性识别并且结合其标靶。功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加以及缺失。这些修饰可以通过本领域中已知的标准技术(如定点诱变和随机PCR介导的诱变)引入，并且可以包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。
如在此关于本发明的抗体所用，术语“中和”是指能够通过中和或抑制其生物效应和/或降低RSV的感染滴度而防止或抑制一种细胞受病毒感染的抗体，无关于实现中和的机制。中和可以例如通过抑制病毒与细胞表面的附着或粘着或通过抑制病毒与细胞膜在病毒与标靶细胞附着之后的融合等来实现。
如在此关于一种抗体与其结合伴侣(例如一种抗原)的相互作用所用，术语“特异性结合”意指相互作用取决于该结合伴侣上一种具体结构(例如一种抗原決定子或表位)的存在。换句话说，即使当该结合伴侣存在于其他分子或生物体的混合物中时，该抗体也优先结合或识别该结合伴侣。结合可以由共价或非共价相互作用或两者的组合介导。又换句话说，术语“特异性结合”意指该抗体与一种抗原決定子或表位具有特异性免疫反应性并且与其他抗原決定子或表位不具有免疫反应性。(免疫)特异性结合到一种抗原的一种抗体可以按较低亲和力结合到其他肽或多肽，如通过例如放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、BIACORE或本领域中已知的其他分析测定。特异性结合到一种抗原的抗体或其片段可以与携带相同表位的相关抗原具有交叉反应性。优选地，特异性结合到一种抗原的抗体或其片段与其他抗原不交叉反应。
发明详细说明
在一个第一方面，本发明提供了能够特异性结合到呼吸道合胞体病毒(RSV)的G蛋白并且能够中和RSV的抗体和抗原结合片段。这些抗体优选地能够特异性结合到并且中和亚型A和B的RSV。优选地，这些抗体是人类单克隆抗体。
根据本发明，这些抗体和抗原结合片段结合到RSV G蛋白的中央保守域(CCD)中的表位。该中央保守域跨越包含RSV A2株的G蛋白的氨基酸153-184(或其他病毒株中相对应的氨基酸残基)的氨基酸序列。在某些实施例中，这些抗体和抗原结合片段结合到包括包含氨基酸残基161-169的氨基酸序列内的一个或多个氨基酸残基、特别是包含RSV A2株的G蛋白(根据RSV A2株编号)的氨基酸残基162-168的氨基酸序列内的一个或多个氨基酸的一种表位。
因此提供了结合到G蛋白中的位于是胱氨酸套索的N末端的一个位点处的一种表位的抗体和抗原结合片段。根据本发明，已经显示，尽管至少一些本发明的中和抗体如例如先前描述的单克隆抗体3D3(WO 2009/055711)般结合到一种类似但不相同的线性表位，但本发明的抗体具有一种更高的中和效能，如一种体外中和分析中所测量。根据本发明，已经显示，本发明的抗体以一种独特方式结合这种线性表位。因此，根据本发明，已经显示，这些抗体对于RSV A和B型(根据RSV A2株编号)的161-169表位具有不同侧链特异性。这例如通过取代分析(参看实例11)反映，该分析显示，本发明的抗体的表位与例如3D3相比具有不同必需残基。
已经显示，在一种体外中和分析、特别是一种如实例7中所述的体外分析中，针对RSV A和B型本发明的抗体和抗原结合片段比已知抗RSV G抗体中任一者更有力，特别是比已知抗RSV G单克隆抗体3D3更有力。
在某些实施例中，抗体和抗原结合片段针对RSV株A/A2(ATCC目录号VR-1540)的IC50(用于50％中和空斑形成的有效稀释度)低于40ng/ml和/或针对RSV株B/18537(ATCC目录号VR-1589)的IC50低于30ng/ml。
在一个实施例中，抗体不是一种选自下组的抗体，该组由以下各项组成：1F12、3G12、1A5、3D3、1G1、2B11、5D8、2D10、3F9、1D4、1G8、6A12、10C6(如WO 2009/055711中所述)。
在某些实施例中，本发明的抗体或抗体片段与一种选自下组的抗体为结合到RSVG蛋白而竞争，该组由以下各项组成：1F12、3G12、1A5、3D3、1G1、2B11、5D8、2D10、3F9、1D4、1G8、6A12以及10C6(如WO 2009/055711中所述)。
在某些实施例中，这些抗体包含一个在其氨基酸序列中包含一种CXXXXC基元的重链CDR3。
在某些实施例中，该抗体包含一个包含以下各项的重链：
a)一个SEQ ID NO:1的重链CDR1区、一个SEQ ID NO:2的重链CDR2区以及一个SEQID NO:3的重链CDR3区，
b)一个SEQ ID NO:4的重链CDR1区、一个SEQ ID NO:5的重链CDR2区以及一个SEQID NO:6的重链CDR3区，
c)一个SEQ ID NO:7的重链CDR1区、一个SEQ ID NO:8的重链CDR2区以及一个SEQID NO:9的重链CDR3区，
d)一个SEQ ID NO:10的重链CDR1区、一个SEQ ID NO:11的重链CDR2区以及一个SEQ ID NO:12的重链CDR3区，
e)一个SEQ ID NO:25的重链CDR1区、一个SEQ ID NO:26的重链CDR2区以及一个SEQ ID NO:27的重链CDR3区，或
f)一个SEQ ID NO:31的重链CDR1区、一个SEQ ID NO:32的重链CDR2区以及一个SEQ ID NO:33的重链CDR3区。
在某些实施例中，该抗体包含一个包含以下各项的轻链：
a)一个SEQ ID NO:13的轻链CDR1区、一个SEQ ID NO:14的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:15的轻链CDR3区，
b)一个SEQ ID NO:16的轻链CDR1区、一个SEQ ID NO:17的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:18的轻链CDR3区，
c)一个SEQ ID NO:19的轻链CDR1区、一个SEQ ID NO:20的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:21的轻链CDR3区，
d)一个SEQ ID NO:22的轻链CDR1区、一个SEQ ID NO:23的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:24的轻链CDR3区，
e)一个SEQ ID NO:28的轻链CDR1区、一个SEQ ID NO:29的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:30的轻链CDR3区，或
f)一个SEQ ID NO:34的轻链CDR1区、一个SEQ ID NO:35的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:36的轻链CDR3区。
在某些实施例中，该抗体选自下组，该组由以下各项组成：
a)一种抗体，包含一个SEQ ID NO:1的重链CDR1区、一个SEQ ID NO:2的重链CDR2区以及一个SEQ ID NO:3的重链CDR3区，一个SEQ ID NO:13的轻链CDR1区、一个SEQ ID NO:14的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:15的轻链CDR3区；
b)一种抗体，包含一个SEQ ID NO:4的重链CDR1区、一个SEQ ID NO:5的重链CDR2区以及一个SEQ ID NO:6的重链CDR3区，和一个SEQ ID NO:16的轻链CDR1区、一个SEQ IDNO:17的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:18的轻链CDR3区；
c)一种抗体，包含一个SEQ ID NO:7的重链CDR1区、一个SEQ ID NO:8的重链CDR2区以及一个SEQ ID NO:9的重链CDR3区，一个SEQ ID NO:19的轻链CDR1区、一个SEQ ID NO:20的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:21的轻链CDR3区；
d)一种抗体，包含一个SEQ ID NO:10的重链CDR1区、一个SEQ ID NO:11的重链CDR2区以及一个SEQ ID NO:12的重链CDR3区，一个SEQ ID NO:22的轻链CDR1区、一个SEQID NO:23的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:24的轻链CDR3区；
e)一种抗体，包含一个SEQ ID NO:25的重链CDR1区、一个SEQ ID NO:26的重链CDR2区以及一个SEQ ID NO:27的重链CDR3区，一个SEQ ID NO:28的轻链CDR1区、一个SEQID NO:29的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:30的轻链CDR3区；以及
f)一种抗体，包含一个SEQ ID NO:31的重链CDR1区、一个SEQ ID NO:32的重链CDR2区以及一个SEQ ID NO:33的重链CDR3区，一个SEQ ID NO:34的轻链CDR1区、一个SEQID NO:35的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:36的轻链CDR3区。
在某些实施例中，该抗体包含一个包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链可变区、一个包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区、一个包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区、一个包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链可变区、一个包含SEQ IDNO:45的氨基酸序列的重链可变区或一个包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链可变区。
在某些实施例中，该抗体包含一个包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链可变区、一个包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区、一个包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变区、一个包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链可变区、一个包含SEQ IDNO:46的氨基酸序列的轻链可变区或一个包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施例中，该抗体选自下组，该组由以下各项组成：
a)一种抗体，包含一个包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链可变区和一个包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链可变区；
b)一种抗体，包含一个包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区和一个包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区；
c)一种抗体，包含一个包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区和一个包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变区；
d)一种抗体，包含一个包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链可变区和一个包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链可变区；
e)一种抗体，包含一个包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链可变区和一个包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链可变区；以及
f)一种抗体，包含一个包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链可变区和一个包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施例中，提供了以上描述的抗体的抗原结合片段。这些抗原结合片段优选地结合到相同表位。
本发明的抗体和抗原结合片段结合到与已知抗RSV G蛋白(如例如抗RSV G抗体3D3，还已经展示它结合到RSV G蛋白的中央保守域中的一种表位)的表位相比不同的表位。结合到一种不同表位意指该抗体与已知抗体(如3D3)相比结合到不同的关键氨基酸残基。此外已经显示，当在一种体外中和分析、特别是一种如实例7中所述的体外中和分析中测量时，本发明的抗体比已知RSV G蛋白结合抗体中任一者都更有力。
在某些实施例中，这些抗体当与结合到RVS F蛋白的抗体组合使用时协同地起作用。如在此所用，术语“协同”意指这些抗体或抗原结合片段当组合使用时的组合效应大于其当单独地使用时的叠加效应。一种计算协同作用的方式是借助于组合指数。组合指数(CI)的概念已经由周(Chou)和塔拉利(Talalay)(《酶调节进展》(Adv Enzyme Regul.)，22:27-55,1984)进行了描述。
在某些实施例中，这些抗体和抗原结合片段用作一种药剂，并且优选地用于诊断性、治疗性和/或预防性治疗由RSV A和/或B亚型引起的RSV感染。如在此所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指降低一名已经感染了RSV的受试者的病毒负担和/或改善这样的受试者的疾病的症状。这样的症状包括例如细支气管炎、气道炎症、肺充血以及呼吸困难。“预防(prevention)”或“预防(prophylaxis)”涵盖了抑制或减少RSV的扩散或抑制或减少一种或多种与RSV感染相关的症状的发作、发展或进展。
本发明还涉及包含至少一种本发明的抗体或抗原结合片段的组合物。在某些实施例中，这些组合物是包含至少一种根据本发明的抗体或抗原结合片段以及至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。“药学上可接受的赋形剂”意指与一种活性分子(如一种抗体)组合用于制备一种适宜剂型的任何惰性物质。“药学上可接受的赋形剂”是一种在所用剂量和浓度下对接受者无毒并且与包含药物、药剂或抗体的配制品的其他成分相容的赋形剂。药学上可接受的赋形剂广泛适用并且在本领域中是已知的。
在又另一个实施例中，本发明涉及一种本发明的抗体或抗原结合片段的用途，用于制备一种用于诊断、预防和/或治疗RSV感染的药剂。本发明还涉及通过将治疗有效量的一种根据本发明的抗体给予一名对其有需要的受试者来预防或治疗RSV感染的方法。术语“治疗有效量”是指如在此定义的抗体的有效预防、改善和/或治疗一种由RSV感染引起的病状的量。如在此所用，改善可以是指减少RSV感染的可见或可察觉的疾病症状、病毒血症或任何其他可测量的表现形式。
为了用于治疗，抗体或其片段使用适合赋形剂而调配成药物组合物并且根据标准方案而给予。药物组合物可以包含一种或多种根据本发明的抗体或抗原结合片段。可以存在另外的治疗剂，包括一种或多种与RSV的F蛋白具有免疫反应性的抗体或其他针对RSV或炎症有效的治疗剂。因此，消炎剂(如类固醇和非类固醇消炎化合物)可以包括于组合物中。
在某些实施例中，使用完全抗体，即含有含补体的Fc区。
在某些实施例中，例如为了减少肺中的炎症应答，仅使用抗体的抗原结合片段。给予免疫特异性片段与完整抗体的混合物也包括在本发明的范围内。
治疗可以靶向易受RSV感染的患者群组。这样的患者群组包括(但不限于)例如年老者(例如≥50岁、≥60岁并且优选地≥65岁)、年幼者(例如≤5岁、≤1岁)、住院的患者、免疫功能不全的患者以及已经用一种抗病毒化合物进行治疗但已经显示一种不充分抗病毒应答的患者。
本发明的抗体组合物的给予典型地通过注射、一般肌肉内或静脉内注射进行。配制品以本领域中一般已知用于给予抗体组合物的方式制备。适合配制品可以见于标准配方，如《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，最新版本，马克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿(Easton)，宾夕法尼亚州(PA)，通过引用结合在此。配制品典型地是适用于不经肠给予的配制品，包括包含缓冲剂、抗氧化剂等的等渗溶液；以及包含递送媒剂(如脂质体、胶束以及纳米颗粒)的乳液。所希望的方案和配制品取决于主治医生的判断以及受试者的具体病状。适当时，剂量水平将取决于受试者的年龄、一般健康和感染严重程度。
本发明的另一个方面包括了如在此定义的抗体的功能变体。如果变体能够与“母体”或“参考”抗体为特异性结合到RSV或其一个片段而竞争，那么分子被视为一种根据本发明的抗体的功能变体。换句话说，当功能变体仍能够结合到RSV或其一个片段的相同或重叠表位时，分子被视为一种根据本发明的抗体的功能变体。功能变体包括(但不限于)一级构造序列实质上类似的衍生物，包括在Fc受体或效应功能涉及的其他区中具有修饰的衍生物，和/或含有例如未见于母体抗体中的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这样的修饰尤其包括乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化等。
可替代地，功能变体可以是如本发明中定义的包含一种氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列与母体抗体的氨基酸序列相比含有一种或多种氨基酸的取代、插入、缺失或其组合。此外，功能变体可以包含氨基酸序列在氨基或羧基末端任一者或两者处的截短。根据本发明的功能变体与母体抗体相比可以具有相同或不同、或者更高或者更低的结合亲和力但仍能够结合到RSV或其一个片段。举例来说，对于RSV或其一个片段，根据本发明的功能变体与母体抗体相比可以具有增大或减小的结合亲和力。旨在属于本发明的范围内的功能变体与如在此定义的母体抗体具有至少约50％到约99％、优选地至少约60％到约99％、更优选地至少约70％到约99％、甚至更优选地至少约80％到约99％、最优选地至少约90％到约99％、特别是至少约95％到约99％并且特别是至少约97％到约99％氨基酸序列一致性和/或同源性。本领域的普通技术人员已知的计算机算法(尤其如Gap或Bestfit)可以用以最佳地比对待比较的氨基酸序列并且定义类似或相同氨基酸残基。功能变体可以通过以本领域中已知的一般分子生物学方法(包括(但不限于)易错PCR、寡核苷酸定向诱变、定点诱变以及重和/或轻链改组)改变母体抗体或其部分而获得。
本发明还提供了免疫结合物，即包含至少一种抗体、抗原结合片段或功能变体并且进一步包含至少一种标签(尤其如一种可检测部分/药剂)的分子。本发明中还涵盖根据本发明的免疫结合物的混合物或至少一种根据本发明的免疫结合物与另一种分子(如一种治疗剂或另一种抗体或免疫结合物)的混合物。在另一个实施例中，本发明的免疫结合物可以包含多于一种标签。这些标签可以与彼此相同或不同并且可以非共价连接/结合到抗体。该或这些标签也可以通过共价键结而直接连接/结合到人类抗体。可替代地，该或这些标签可以借助于一种或多种键联化合物而连接/结合到抗体。用于使标签结合到抗体的技术为熟练的业内人士所熟知。本发明的免疫结合物的标签可以是治疗剂，但它们还可能是可检测部分/药剂。适合于治疗和/或预防中的标签可以是毒素或其功能部分、抗生素、酶、增强吞噬作用或免疫刺激的其他抗体。包含一种可检测药剂的免疫结合物可以用以例如诊断上评估一名受试者是否已经感染RSV，或监测RSV感染的发展或进展作为一种临床测试程序的一部分以例如测定一种既定治疗方案的功效。然而，它们还可以用于其他检测和/或分析和/或诊断目的。可检测部分/药剂包括(但不限于)酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、发射正电子的金属以及非放射性顺磁性金属离子。用以标记抗体用于检测和/或分析和/或诊断目的的标签取决于具体检测/分析/诊断技术和/或所用方法，尤其如(组织)样品的免疫组织化学染色、流式细胞术检测、扫描激光细胞术检测、荧光免疫分析、酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、生物分析(例如吞噬作用分析)、蛋白质印迹应用等。用于本领域中已知的检测/分析/诊断技术和/或方法的适合标记充分为熟练的业内人士力所能及。
此外，本发明的人类抗体或免疫结合物还可以连接到尤其可用于体外免疫分析或纯化RSV或其片段的固体载体。本发明的抗体可以融合到标记序列(如一种肽)以促进纯化。实例包括(但不限于)六聚组氨酸标签、血球凝集素(HA)标签、myc标签或flag标签。可替代地，一种抗体可以结合到一种第二抗体以形成一种抗体杂结合物。在另一个方面，本发明的抗体可以结合/连接到一种或多种抗原。优选地，这些抗原是由一名被给予抗体-抗原结合物的受试者的免疫系统识别的抗原。这些抗原可以是相同的，但也可以与彼此不同。用于连接抗原与抗体的结合方法在本领域中是熟知的并且包括(但不限于)使用交联剂。
次于通过直接或经由例如一个连接子间接结合以化学方式产生免疫结合物，免疫结合物可以产生为包含本发明的抗体与一种适合标签的融合蛋白。融合蛋白可以通过本领域中已知的方法而产生，这些方法如例如通过构造在框架中包含编码这些抗体的核苷酸序列与编码该或这些适合标签的核苷酸序列的核酸分子并且然后表达这些核酸分子来重组地进行。
本发明此外提供了编码一种根据本发明的抗体、抗原结合片段或功能变体的核酸分子。这样的核酸分子可以用作中间物用于克隆目的，例如用于如上文所述的亲和力成熟过程中。在一个优选实施例中，这些核酸分子经分离或纯化。熟练的业内人士应理解，这些核酸分子的功能变体也旨在是本发明的一部分。功能变体是可以使用标准遗传密码来直接翻译以提供一种与翻译自母体核酸分子的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核酸序列。优选地，这些核酸分子编码包含如上文所述的CDR区的抗体。在另一个实施例中，这些核酸分子编码包含本发明的抗体的两个、三个、四个、五个或甚至全部六个CDR区的抗体。
本发明的另一个方面是提供包含一种或多种根据本发明的核酸分子的载体(即核酸构建体)。载体可以衍生自质粒，尤其如F、R1、RP1、Col、pBR322、TOL、Ti等；粘粒；噬菌体，如λ、λ形、M13、Mu、P1、P22、Qβ、T偶、T奇、T2、T4、T7等；植物病毒。载体可以用于克隆和/或用于表达本发明的抗体并且甚至可以用于基因治疗目的。可操作地连接到一种或多种表达调节核酸分子、包含一种或多种根据本发明的核酸分子的载体也由本发明涵盖。载体的选择取决于所遵循的重组程序和所用的宿主。在宿主细胞中引入载体可以尤其通过磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-右旋糖酐介导的转染、脂染胺转染或电穿孔来实现。载体可以自主地复制或可以与它们已经被整合进入的染色体一起复制。优选地，这些载体含有一种或多种选择标记。这些标记的选择可能取决于所选宿主细胞，但如本领域的普通技术人员所熟知，这对本发明不是关键的。它们包括(但不限于)卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、博莱霉素、来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)、来自小鼠的二氢叶酸还原酶基因(dhfr)。可操作地连接到一种或多种编码可用于分离人类抗体的蛋白或肽的核酸分子、包含一种或多种编码如上文所述的人类抗体的核酸分子的载体也由本发明涵盖。这些蛋白或肽包括(但不限于)谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、金属结合聚组氨酸、绿色荧光蛋白、荧光素酶以及β-半乳糖苷酶。
本发明还提供了含有上文所提及的载体的一个或多个复本的宿主细胞。宿主细胞包括(但不限于)哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细菌来源的细胞。细菌细胞包括(但不限于)来自革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌的细胞，这些细菌如埃希氏杆菌属(Escherichia)(如大肠杆菌(E.coli))和假单胞菌属(Pseudomonas)的若干物种。在真菌细胞的群组中，优选地使用酵母细胞。酵母中的表达可以通过使用酵母菌株(尤其如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha))来实现。此外，昆虫细胞(如来自果蝇的细胞和Sf9)可以用作宿主细胞。除此之外，宿主细胞可以是植物细胞，尤其如来自作物植物(如林业植物)的细胞，或来自供应食物和原料的植物(如谷类植物或药用植物)的细胞，或来自观赏植物的细胞，或来自花苞作物的细胞。转化的(转基因)植物或植物细胞通过已知方法来产生，这些方法例如土壤杆菌属介导的基因转移、叶盘片的转化、通过聚乙二醇诱发的DNA转移进行的原生质体转化、电穿孔、声处理、显微注射或弹道基因转移。另外，一种适合表达系统可以是一种杆状病毒系统。使用哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、BHK细胞、NSO细胞或Bowes黑色素瘤细胞)的表达系统在本发明中是优选的。哺乳动物细胞为表达的蛋白提供了最类似于哺乳动物来源的天然分子的翻译后修饰。因为本发明处理可能必须被给予人类的分子，所以一种完全人类表达系统将尤其优选。因此，甚至更优选地，宿主细胞是人类细胞。人类细胞的实例尤其是海拉、911、AT1080、A549、293以及HEK293细胞。在优选实施例中，人类生产细胞至少包含编码一种腺病毒E1区的一种核酸序列(呈可表达形式)的一个功能部分。在甚至更优选实施例中，所述宿主细胞衍生自一个人类视网膜并且用包含腺病毒E1序列的核酸永生化，如911细胞或1996年2月29日以编号96022940寄存在欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC)，应用微生物研究中心(CAMR)，索尔兹伯里(Salisbury)，威尔特郡SP4OJG(Wiltshire SP4OJG)，大不列颠(Great Britain)并且以商标
(PER.C6是荷兰库赛尔私人公司(Crucell Holland B.V.)的一个注册商标)市售的细胞系。出于这一应用的目的，“PER.C6细胞”是指以编号96022940寄存的细胞或所寄存细胞的原种、上游或下游代以及来自原种的后代以及前述中任一者的衍生物。在宿主细胞中产生重组蛋白可以根据本领域中熟知的方法来进行。使用以商标
市售的细胞作为用于所关注的蛋白的生产平台已经在WO 00/63403中进行描述，该文献的披露内容通过引用以其全文结合在此。
本发明的抗体可以通过不同的方法来制备。一种制造一种根据本发明的抗体的方法是本发明的一个另外的部分。该方法包括以下步骤：a)在有助于该抗体的表达的条件下培养一种根据本发明的宿主细胞，和b)任选地回收表达的抗体。表达的抗体可以从无细胞抽提液回收，但优选地它们从培养基回收。以上制造方法还可以用以制造本发明的抗体的功能变体和/或免疫结合物。用以从无细胞抽提液或培养基回收蛋白(如抗体)的方法为本领域中熟练的业内人士所熟知。
可替代地，次于在宿主(如宿主细胞)中表达，本发明的抗体和免疫结合物可以通过常规肽合成器或在无细胞翻译系统中使用衍生自根据本发明的DNA分子的RNA核酸合成地制造。根据本发明的抗体还可以由表达人类免疫球蛋白基因的转基因非人类哺乳动物(如例如转基因小鼠或兔)产生。优选地，转基因非人类哺乳动物具有一种基因组，包含一种人类重链转基因和一种人类轻链转基因，编码如上文所述的人类抗体的全部或一部分。转基因非人类哺乳动物可以用RSV或其一个片段的一种纯化或富集的制剂免疫。用于使非人类哺乳动物免疫的方案在本领域中是明确的。参看《使用抗体：实验手册》(UsingAntibodies:A Laboratory Manual)，E.哈洛，D莱恩编(1998)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约和《现行免疫学方案》(Current Protocols in Immunology)，J.E.科利根(J.E.Coligan)，A.M.克鲁斯贝克(A.M.Kruisbeek)，D.H.马古利斯(D.H.Margulies)，E.M.席瓦赫(E.M.Shevach)，W.斯特劳伯(W.Strober)编(2001)，约翰威利父子公司(John Wiley&SonsInc.)，纽约，这些文献的披露内容通过引用结合在此。免疫方案通常包括或者有或者无佐剂(如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)情况下的多次免疫，但还可以包括裸DNA免疫。在其他实施例中，人类抗体由衍生自转基因动物的B细胞、浆细胞和/或记忆细胞产生。在又另一个实施例中，人类抗体由融合瘤产生，这些融合瘤通过将获自上文所述的转基因非人类哺乳动物的B细胞与永生化的细胞融合而制备。如可获自上文所述的转基因非人类哺乳动物的B细胞、浆细胞和融合瘤以及如可获自上文所述的转基因非人类哺乳动物的人类抗体、B细胞、浆细胞和/或记忆细胞和融合瘤也是本发明的一部分。
本发明进一步提供了试剂盒，包含至少一种根据本发明的抗体、一种抗原结合片段、一种免疫结合物、一种功能变体和/或至少一种核酸。任选地，本发明的试剂盒的上文所述的组分被包装在适合容器中并且被标记用于诊断、预防和/或治疗指定的病状。以上提及的组分可以按一种水性、优选地无菌溶液形式或按一种用于复原的冻干、优选地无菌配制品形式储存在单位或多剂量容器中。试剂盒可以进一步包含更多包含一种药学上可接受的缓冲剂的容器。它可以进一步包括从一种商业和用户立场出发令人希望的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器、用于一种或多种适合宿主的培养基以及可能地甚至至少一种其他治疗剂、预防剂或诊断剂。与试剂盒相关的说明书习惯上可以包括在治疗、预防或诊断产品的商业包装中，这些商业包装含有关于例如适应症、用法、剂量、制造、给药、禁忌症的信息和/或关于这样的治疗、预防或诊断产品的用途的警告。
根据本发明的抗体还可以有利地用作一种用于检测RSV的体外方法中的一种诊断剂。本发明因此进一步提供了一种检测一种样品中的RSV的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)例如通过使一种样品与诊断有效量的一种根据本发明的抗体(或其片段)或免疫结合物接触来分析一种样品中RSV抗原的水平，和(b)将RSV抗原的分析水平与一种对照水平比较，由此RSV抗原的该分析水平与该对照水平相比的增加指示RSV感染。该样品可以是一种生物样品，包括(但不限于)来自(可能地)被感染的受试者的血液、血清、大便、痰、鼻咽吸出物、支气管灌洗液、尿液、组织或其他生物物质；或一种非生物样品，如水、饮料等。该样品可以首先被操纵以使得其更适用于检测方法。操纵尤其意指以一种使得病毒将分解为抗原成分(如蛋白、(多)肽或其他抗原片段)的方式处理疑似含有和/或含有病毒的样品。优选地，本发明的抗体或免疫结合物在使得可在抗体与可能存在于样品中的病毒或其抗原成分之间形成一种免疫复合物的条件下与样品接触。指示样品中的病毒存在的一种免疫复合物的形成(若有的话)然后通过适合方法来检测和测量。这样的方法尤其包括均质和异质结合免疫分析，如放射免疫分析(RIA)、ELISA、免疫荧光、免疫组织化学、FACS、BIACORE以及蛋白质印迹分析。尤其用于大规模临床筛检患者血清和血液和血液衍生的产物的优选分析技术是ELISA和蛋白质印迹技术。ELISA测试是尤其优选的。
在以下不旨在限制本发明的实例中进一步展示本发明。
实例
实例1
抗原产生和标记
不同于病毒膜表面上表达的融合蛋白(RSV F)，附着蛋白(RSV G)高度可变，因此定义RSV的两种广泛亚型(即亚型A和B)。尽管具有序列可变性，但RSV G含有一个中央的并且高度保守的区。为试图获得广泛中和单克隆抗体，将对应于一种代表性A子组(RSV A/长)和B子组株(RSV B/B1)的RSV G重组地表达于293自由式细胞中，纯化，并且标记以用于单细胞分选实验中。
RSV Ga和Gb的表达
对应于在此称为RSV Ga和Gb的RSV A/长(寄存编号P20895)和RSV B/B1(寄存编号NP_056862)的重组RSV附着蛋白(G蛋白)由具有一种Myc(EQKLISEEDL)和6X组氨酸标签的一种基于CMV的启动子哺乳动物表达载体(英杰公司(Invitrogen Corp.)，pcDNA3.1)表达(表1)。将对应于人类VκI信号肽的前导序列引入到氨基末端处以促进分泌。RSV Ga和Gb都缺乏跨膜域地表达并且对应地包括RSV Ga和Gb的氨基酸65-288和65-299。
将RSV Ga和Gb根据制造商指南转染。将重组地表达的RSV Ga和Gb蛋白使用镍NTA色谱法来纯化。在转染后七十二小时，将上清液收集并且针对20mM Tris-HCL pH 8和300mMNaCl透析过夜。第二天，将透析用新鲜缓冲液重复并且持续另外的6小时。然后将透析的上清液补充以5％甘油和10mM咪唑(VWR，目录号EM-5720)，并且加载到一个填充有2mL Ni-NTA琼脂糖珠粒(凯杰(Qiagen)，目录号30310)的柱上。接着将结合蛋白用2柱体积的由以下各项组成的洗涤缓冲液洗涤：20mM Tris-HCl，pH 8、300mM NaCl、5％甘油以及20mM咪唑。然后将蛋白用5mL含有以下各项的洗脱缓冲液洗脱：20mM Tris-HCl，pH 8、300mM NaCl、5％甘油以及50mM咪唑。最终，将洗脱液在4℃下针对四升磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)透析过夜。然后将透析的蛋白在一个30K MWCO浓缩器(密理博(Millipore)，Amicon Ultracel浓缩器)中浓缩到0.5-1.0mL，并且通过二辛可宁酸分析(BCA分析；赛默飞世尔(Thermo Fisher)，根据制造商说明书)来定量。另外，将纯化的蛋白各自通过SDS-PAGE/库马斯(Coomassie)来进行品质控制。
将RSV Ga根据制造商说明书使用Alexa Fluor 647微尺度蛋白标记试剂盒(英杰目录号A30009)用Alexa Fluor 647(AF 647)荧光标记。在纯化之后，使用一台NanoDrop UV分光光度计(制造商)将标记程度测定为1.2摩尔AF 647/摩尔蛋白。类似地，将RSV Gb蛋白根据制造商说明书使用一种微尺度蛋白标记试剂盒(英杰目录号A30006)用Alexa Fluor488(AF 488)标记，并且在最终纯化之后，使用一台NanoDrop分光光度计将标记程度测定为约2摩尔AF 488/摩尔蛋白。
实例2
抗RSV G特异性抗体的鉴别
将针对RSV G蛋白的广泛中和单克隆抗体从分离自通过圣地亚哥血库(San DiegoBlood Bank)获得的外周血液单核细胞(PBMC)的记忆B细胞(CD19+CD27+IgG+)回收。简单地说，将CD22+富集的B细胞用荧光标记的抗体染色为记忆B细胞表面标记，并且与RSV Ga、Gb(如实例1中所述，对应地用Alexa Fluor 647和488标记)或RSV G中央保守域(CCD)生物素结合的肽(SYM-1706)一起孵育。CD19/CD27/IgG/RSVGa/RSVGb或CD19/CD27/IgG/SYM-1706(用于某些分选实验中)。将阳性细胞分选，并且将单细胞使用一个FACSAria II(BD生物科学(BD Biosciences))或MoFloXDP(贝克曼库尔特(Beckman Coulter))放置到一个96孔板的单独的孔中。将板储存在-80℃下直到处理。平均每一供体研究约10-25x 106个B细胞。
实例3
从对RSV Ga和Gb具特异性的单B细胞回收重和轻链基因
如实例2中所述，将针对RSV的广泛中和单克隆抗体从与RSV Ga和Gb蛋白或RSV G中央保守域(CCD)生物素结合的肽(SYM-1706)具反应性的记忆B细胞(CD19+CD27+IgG+)分离。然后将重和轻链基因通过一种两步PCR方法从单独的B细胞回收，克隆，并且以Fab抗体形式体外表达。
第一链cDNA合成
使用英杰的Superscript III第一链合成试剂盒(Superscript III试剂盒，目录号18080-051)从单独分选的细胞产生互补DNA(cDNA)。
通过巢式PCR进行IgG重和轻链扩增
使用一种两步巢式PCR方法使IgG重和轻链可变区(κ和λ链)从新鲜制备的cDNA扩增。接着，将重和轻链PCR片段汇集到一个单盒中以促进使用一种重叠延伸PCR的下游克隆。
步骤I扩增
在步骤I中，将2.5μL如上所述产生的新鲜制备的cDNA用作模板以扩增重、κ以及λ轻链。使用针对抗体重链(CB-5′LVH引物)、κ轻链(CB-5′LVk引物)以及λ轻链(CB-5′LVlam引物)的前导区具体设计的引物池(表2-4)。将针对对应地重链、κ轻链以及λ轻链的CH1区、Ck以及CL区具体设计的单反向引物用于步骤I PCR反应中。
步骤II扩增
1)在步骤II中，将2.5μL由以上反应产生的步骤I PCR产物用作一种模板以扩增重、κ以及λ轻链。使用针对抗体重链、κ轻链以及λ轻链的构架1区具体设计的正向引物池(表5-7)。使用针对重链切接点(3’SalIJH引物)、κ轻链切接点(3’Jk引物)以及对应于λ轻链的5’区特异性引物(CB-VL引物)具体设计的反向引物池。此外，将步骤II正向引物工程化以引入一个SfiI限制位点，而将步骤II重链反向引物设计以引入一个SalI限制位点。
步骤III扩增：重叠延伸PCR
在步骤III中，使重和轻链DNA片段(步骤II产物)经由重叠延伸PCR使用以下各项连接到一个单盒中：1)如下文概述而扩增的Fab连接子(κ或λ；表8)，该连接子退火到轻链步骤II的3’端和重链步骤II片段的5’端并且含有或者κ或者λ恒定区，2)一种具有一个SfiI限制位点的正向重叠引物，该引物退火到轻链的5’端，以及3)一种具有一个SalI限制位点的反向引物，该引物退火到重链步骤II片段的3’端(表9)。这个反应产生一个由轻链-连接子-重链组成的1200bp片段(即盒)。在扩增之后，将PCR连接子反应产物或重叠延伸PCR反应产物在一种1％琼脂糖凝胶上分离并且根据制造商说明书凝胶提取(凯杰凝胶提取试剂盒；目录号28706)。
消化和克隆到细菌表达载体中
在PCR纯化(凯杰)重叠延伸PCR之后，将片段消化，并且然后将消化的重叠产物在一种1％琼脂糖凝胶上分离。将对应于重叠盒的频带(约1.1kb)通过凝胶提取来纯化(凯杰)。最终，将消化的重叠延伸产物连接并且克隆到pCB-Fab细菌表达载体中。所有转化都使用DH5a最大效率细胞(英杰公司，目录号18258-012)进行。将约100μl回收的细胞涂布到一个补充以20mM葡萄糖的100μg/ml卡比西林板上。将板在37C下孵育过夜以允许集落生长。
实例4
Fab结合到RSV G和单克隆抗体拯救
将实例3中克隆的Fab抗体表达于细菌中，并且再次测试其结合到RSVGa、RSV Gb或RSV G中央保守域(CCD)肽(SYM-1706：氨基酸序列：生物素-KQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKR；SEQ ID NO:125)的能力。
将细菌上清液添加到RSV Ga、Gb、CCD肽、阴性对照肌动蛋白以及抗人类F(ab)2涂布的板中，并且在37℃下孵育2小时(除CCD肽外，它在一个抗生蛋白链菌素涂布的板上进行孵育并且在室温下孵育2小时)。将CR9514(一种抗体，基于3D3，即包含3D3的重和轻链可变区，如WO 2009/055711中披露)以0.1μg/mL的稀释度在0.4％NFDM/PBS/0.05％Tween20中用作针对RSV Ga、Gb、CCD肽以及抗人类F(ab)2涂布的板的阳性对照。将小鼠抗肌动蛋白(西格玛(Sigma)，目录号A3853)以1.25μg/mL用作牛肌动蛋白涂布的板的阳性对照。将抗HA HRP(罗氏(Roche)，目录号12013819001)用作细菌上清液的二级抗体。将抗人类Fab(杰克逊实验室(Jackson Labs)，目录号109-036-097)用于CR9514(包含3D3的可变区)对照孔。最终，将山羊抗小鼠HRP(杰克逊实验室，目录号115-035-072)用于肌动蛋白阳性对照。在孵育之后，将板在PBS/0.05％Tween20中洗涤四次，并且用50μL 1:1v/v TMB:过氧化物溶液(Pierce，目录号34021)显影约5分钟。通过添加50μL 2N H2SO4使反应立即停止，并且使用一台ELISA板读取器测量450nm下的吸光度。阳性结合由大于0.5的OD450(0.5-0.9是适度结合，>1是强结合)和高于背景3倍的应答指示。
基于ELISA结果，平均选择约六种与标靶抗原具有反应性的无性系。因为最初使用构架1特异性和切接点特异性引物池克隆每种Fab抗体，所以尤其高度相关引物的交叉激活的可能性较高。由于这个原因，选择若干代表每种重叠的产物的细菌无性系以测序。根据制造商准则(凯杰小量制备试剂盒目录号27106)制备质粒小量制备DNA。将对应于每种所选无性系的重和轻链用表10中突显的引物进行测序。对序列进行分析，鉴别最接近生殖系，并且测定CDR和构架区。接着将这个信息用以设计引物以将候选抗体克隆并且转化为IgG。
实例5
IgG的克隆、测序以及纯化
将实例4中概述的细菌ELISA中鉴别的与RSV Ga、Gb以及CCD肽具有反应性的Fab抗体克隆并且在人类胚肾细胞(293-F细胞)中表达为IgG。接着将IgG通过测定浓度、SDS-PAGE以及通过尺寸排阻色谱法来纯化并且品质控制。
A. IgG克隆和测序信息
接着将细菌ELISA(实例4中概述)中鉴别的Fab抗体通过以下方式转化为IgG：通过限制消化到pCP9-κ(SEQ ID NO:127)和pCP9-λ(SEQ ID NO:128)表达载体中来克隆可变重和轻域(κ和λ)。考虑到交叉激活的可能性(实例4中前述)，经选择用于转化为IgG的每种细菌无性系的FR1的初始氨基酸与切接点区的最终氨基酸经常与其相对应的生殖系序列的氨基酸不同。由于这个原因，设计对每种抗体具有特异性的引物以针对每种所选细菌无性系的重和轻链基因恢复FR1和切接点区。将重和轻链使用相对应的细菌无性系(由实例4中的pCB-Fab载体表达)扩增并且以一种连续方式克隆到pCP9表达载体中。
重链的扩增产生一个平均大小是370bp的片段，将该片段在一种1％琼脂糖凝胶上拆分并且根据制造商说明书(凯杰)凝胶提取。然后通过重叠延伸PCR将重链片段用以连接HAVT20前导序列(5'-ATGGCCTGCCCTGGCTTTCTCTGGGCACTTGTGATCTCCACCTGTCTTGAATTTTCCATGGCT-3'；MACPGFLWALVISTCLEFSMA)。
接着将相对应的重叠HAVT20-重链产物根据制造商说明书(凯杰)进行PCR纯化。连接是连续进行的；就是说，或者轻链首先被消化并且连接或者相对应的重链被消化并且插入。在或者轻或者重链插入被测序证实后，选择一种代表性细菌无性系，制备小量制备物并且将其用以克隆第二链(即或者轻或者重链，取决于首先克隆的链)。为了克隆重链片段，将pCP9载体和PCR纯化的重链重叠产物用限制酶BamHI HF(NEB，目录号R3136L)和XhoI(NEB，目录号R0146L)消化。然后将消化的pCP9载体和重链重叠产物在一种1％琼脂糖凝胶上拆分并且凝胶提取(对于pCP9载体，较高的约9.5kB)。以1:3载体与插入物比进行连接，并且转化为DH5a最大效率细胞(英杰公司，目录号18258-012)。在测序证实后，克隆第二链(例如轻链)。为了克隆轻链片段，将含有相对应的重链的pCP9无性系和轻链PCR产物用NotI HF(NEB，目录号R3189L)和XbaI(NEB，目录号R0145L)消化。然后将轻链连接到含有相对应的重链基因的pCP9载体中并且转化为DH5a最大效率细胞。选择若干集落用于测序和分析。表11和12示出了抗体重和轻链CDR区的序列。
B. IgG表达和纯化
为了表达每种IgG，制备(凯杰)含有所关注的重和轻链基因的pCP9载体的中量制备物，并且根据制造商说明书使用293fectin(英杰，目录号51-0031)将其用以转染293-F细胞。在转染之后，将细胞孵育72小时以允许充足IgG产生。然后将细胞培养基收集并且离心以移出细胞。通过使用一个蛋白A柱(蛋白A琼脂糖珠粒；安玛西亚(Amersham)，目录号17-0963-03)进行柱色谱法来实现纯化。然后将洗脱液针对4升20mM Tris-HCl pH 7.2、150mMNaCl透析两次。最终，将透析的样品用一个10kDa Amicon Ultra柱(密理博)浓缩降到约1mL。
对每种IgG进行一系列品质控制步骤以测定浓度和纯度并且评估大小。最初经由NanoDrop读数使用210,000M-1cm-1的IgG摩尔消光系数测定IgG浓度。另外，通过根据供应商说明书进行BCA分析(赛默飞世尔)和通过使用蛋白A传感器端在Octet Red384(福特生物(ForteBio))上测量来证实IgG浓度。作为一个另外的品质控制步骤，在非还原和还原条件(即±DTT)下进行SDS-PAGE，接着进行生物安全库马斯染色(伯乐(Biorad))，以使完整IgG或减小的重和轻多肽链可见。最终，通过尺寸排阻色谱法用一个Superdex 20010/300GL凝胶过滤柱(法玛西亚(Pharmacia))对IgG进行品质控制。
实例6
IgG结合分析
在ELISA分析中测试如以上实例5中所述而产生并且进行品质控制的IgG和抗RSVG抗体CR9514(包含3D3的可变区)结合到重组RSV Ga和Gb蛋白的能力。简单地说，将96半孔ELISA板(Costar)用1X PBS中的50μL抗原涂布过夜[RSV Ga：0.5μg/mL；RSV Gb：0.5μg/mL；牛肌动蛋白：1μg/mL(西格玛)；亲和纯化山羊抗人类F(ab)2：2μg/mL(杰克逊免疫研究(Jackson Immunoresearch))]。将板在4℃下孵育过夜，并且在第二天用135μL于PBS中的4％脱脂奶粉(NFDM，伯乐)阻断，并且在37℃下孵育2小时。然后将mAb在0.4％NFDM/PBS/0.05％Tween20中稀释，起始于100ng/mL，并且以5倍稀释度滴定下降，并且添加到板中后在37℃下持续2小时。将CR9514(3D3)mAb用作针对RSV Ga和Gb的阳性对照，并且以类似方式滴定。另外，将小鼠抗肌动蛋白(西格玛，目录号A3853)以1.25μg/mL用作牛肌动蛋白涂布的板的阳性对照。在孵育之后，将板用PBS/0.05％Tween20洗涤四次。将二级抗体各自以1:1000于0.4％NFDM/PBS/0.05％Tween20中添加，并且在37℃下孵育40分钟。将抗Fc HRP(杰克逊实验室，目录号109-035-008)用作mAb的二级抗体。最终，将山羊抗小鼠HRP(杰克逊实验室，目录号115-035-072)用于肌动蛋白阳性对照。在孵育之后，将板在PBS/0.05％Tween20中洗涤四次，并且用50μL 1:1v/v TMB:过氧化物溶液(Pierce，目录号34021)显影约5分钟。通过添加50μL 2N H2SO4使反应立即停止，并且使用一台ELISA板读取器测量450nm下的吸光度。根据本发明的抗体的估计的结合EC50值(通过滴定每种IgG而测定)对于RSV株A/长来说在1.0与2.0ng/ml之间的范围内并且对于株B/B1来说在0.5与2.5ng/ml之间的范围内。
实例7
IgG中和分析
如通过一种空斑减少分析来评估，分析抗RSV抗体结合到并且中和溶液中的RSV的能力。在这个实验中，将病毒和抗体在不存在标靶细胞的情况下预孵育。然后将混合物添加到细胞中，并且通过一种在此描述的标准空斑减少分析来测量病毒感染。分析抗RSV抗体中和若干RSV株的能力，这些病毒株包括RSV A/A2(ATCC目录号VR-1540)、RSV B/18537(ATCC目录号VR-1580)以及RSV A/长(ATCC目录号VR-26)。将抗体CR9514(3D3)和CR9505(一种抗体，基于131-2G，即包含131-2G的重和轻链可变区，如WO 2009/055711中披露)用作参考。
将Vero细胞(ATCC，目录号：CCL-81；马纳萨斯(Manassas))用于宿主细胞感染。使Vero细胞在具有10％胎牛血清(FBS)(海克隆(HyClone)，目录号：SH30070.03)、补充以1％L-谷氨酰胺(海克隆，目录号：SH30034.01)和1％青霉素-链霉素溶液(海克隆，目录号：SV30010)的DMEM(海克隆，目录号：SH 30285.01)中生长。将Vero细胞维持在一个具有5％CO2的37℃孵育箱中，并且每周两次进行传代。
在实验第1天，将Vero细胞在24孔细胞培养板中培养。将细胞以使得到第2天可形成细胞单层(>80％汇合)的密度(约9×104个细胞/孔)涂布。在第2天，将每种抗体在含有10％幼兔补体(AbD赛洛特克(AbD Serotec)，目录号C12CAX)的普通伊格尔最低必需培养基(EMEM，ATCC，目录号：30-2003)中连续稀释。所测试的最终抗体浓度是：10μg/mL、1.3μg/mL、156ng/mL、19.5ng/mL、2.4ng/mL以及0.3ng/mL(例外是CB010.7，它使用抗体浓度：2.5μg/mL、312.5ng/mL、39.1ng/mL、4.9ng/mL、0.61ng/mL以及0.08ng/mL)。还将病毒在普通EMEM中稀释到2000-3000pfu/mL(100-150pfu/50μL)的浓度，并且添加85μL稀释的RSV到85μL每种稀释的抗体溶液中并且通过吸取来混合。对于病毒对照样品来说，添加85μL稀释的病毒到85μL普通EMEM中。将抗体-病毒或病毒对照混合物在37℃下孵育2小时。在孵育之后，将培养基从含有Vero宿主细胞的24孔细胞培养板倾析，并且然后将150μL预孵育的病毒-抗体或病毒-对照混合物转移到每个孔中。一式三份地制备每种测试和对照样品。然后将细胞在37℃下在每隔15分钟混合下孵育一小时。
在孵育期之后，添加1mL覆盖培养基到每个孔中(覆盖培养基含有EMEM、2％FBS、1％L-谷氨酰胺、0.75％甲基纤维素)。然后将24孔细胞培养板在37℃下(在5％CO2下)孵育约96-120小时。将细胞板在室温下用10％福马林固定1小时，用ddH2O洗涤10次，并且在37℃下用PBS中的5％脱脂乳粉(NFDM)阻断一小时。在孵育之后，倾析阻断溶液，并且添加200μLHRP结合的小鼠抗RSV抗体(ab20686，艾碧康(Abcam)，在1％NFDM中1:750稀释)到每个孔中。将板在37℃下孵育2小时，并且用ddH2O洗涤10次。在洗涤之后，添加200μL
过氧化物酶底物(KPL目录号50-78-02)到每个孔中。将板在室温下显影10分钟。将板用ddH2O洗涤两次，并且在一个纸巾上干燥，并且对蓝色空斑数目进行计数。
使用SPSS for Windows计算IC50(用于50％中和空斑形成的有效稀释度)。根据下式计算空斑减少率：
空斑减少率(百分位数)＝1-[(每种抗体稀释度下的平均空斑数目)/(病毒对照孔中的平均空斑数目)]*100。
表13列出了一组抗体针对RSV株A/A2(ATCC目录号VR-1540)和RSV B/18537(ATCC目录号VR-1580)的IC50。
表13显示，抗体和抗原结合片段针对RSV株A/A2(ATCC目录号VR-1540)的IC50(用于50％中和空斑形成的有效稀释度)低于40ng/ml和/或针对RSV株B/18537(ATCC目录号VR-1589)的IC50低于30ng/ml。
另外，抗体CB003.1、CB010.7以及对照抗体CR9505(131-2G)和CR9514(3D3)针对RSV株A/长(ATCC目录号VR-26)的IC50对应地是16、12、18以及17ng/mL。
实例8
完全人类免疫球蛋白分子(人类单克隆抗体)的构造，包括密码子最佳化和去风险化分析
检查以上实例5中分离的每种抗体无性系的重和轻链可变区(VH和VL)中游离半胱氨酸和可能的翻译后修饰位点(包括糖基化、脱酰胺以及氧化位点)的存在。为了移除这些位点，使用由结构保守和/或基于生殖系的取代组成的氨基酸突变(表14)。可变区中的非保守半胱氨酸突变为丝氨酸。对于糖基化位点来说，可以使用若干突变，包括用天冬酰胺置换保守谷氨酰胺或生殖系突变。对脱酰胺位点的修饰包括用天冬氨酸置换天冬酰胺以及用丝氨酸或丙氨酸置换甘氨酸。不对可能的氧化位点进行修饰。然后将获自抗体无性系的每个VH和VL的核苷酸和氨基酸序列在基因技术/英杰进行密码子最佳化以便在人类细胞中表达。接着将这些功能变体的可变区通过限制消化而直接克隆，以便在IgG表达载体pCP9-κ(参看SEQ ID:127)和pCP9-γ(参看SEQ ID:128)中表达。将BamHI、XhoI和/或SrfI用以克隆可变重链，并且将NotI和AscI用以克隆可变轻链。根据熟练的业内人士已知的标准技术来验证用于所有构建体的核苷酸序列。
实例9
通过ELISA和Octet进行的肽结合研究
对所鉴别的RSV G蛋白特异性mAb(如CB010.7和CB030.1)进行详细表位定位。将肽通过Fmoc化学过程合成，并且通过反相高效液相色谱法(HPLC)纯化。在肽-肽相互作用研究中，经由一种氨基己酸(Ahx)间隔基将一些肽N末端生物素化。通过电喷雾质谱法来分析肽的一致性。将样品通过超高效液体色谱法(UPLC，Alliance，沃特斯(Waters)，米尔福德(Milford)，马萨诸塞州(MA)，美国(USA))用一个C18反相柱来分析，并且用一台光二极管矩阵检测器和一台质量敏感检测器来检测。使用溶剂A(H2O+0.05％三氟乙酸[TFA])和溶剂B(ACN+0.05％TFA)情况下的25％-100％乙腈(ACN)，梯度是25％/分钟。所有试剂都至少是HPLC级。
测试mAb与含有RSV-G A和B型的中央保守区的生物素化的肽的结合(表15)。将抗生物素蛋白涂布的96孔微量滴定板洗涤并且在室温下与100μL生物素化的肽(2.37×10-7M)在ELISA缓冲液(PBS+1％FBS+0.05％Tween20)中一起孵育1小时。接着，在洗涤之后，将180μL阻断缓冲液(PBS+10％FBS)/孔转移到孔中，并且在室温下孵育1小时。接着，将板洗涤并且在室温下与抗人类HRP(杰克逊免疫研究)一起孵育1小时。在洗涤之后，添加100μL邻苯二胺辣根过氧化物酶底物(赛默科学(Thermo Scientific))到每个孔中。在10分钟之后用100μL1M H2SO4停止反应。在490nm下读取吸光度。
所有上文所述的mAb结合到RSV Ga和Gb蛋白(实例6)并且结合到中央区A型和B型肽(数据未示出)。滴定抗体CB003.1和CB010.7显示，这些mAb对于所有四种肽来说都具有约20ng/mL的IC50(图3)。还使用抗生蛋白链菌素传感器端在Octet Red384(福特生物)上测定mAb与RSV G肽的结合。再次，这些mAb显示了与A型和B型肽的交叉反应性(表16)。CB003.1显示了与A型和B型肽的最高应答。CB010.7显示了与A型肽相比与B型的稍微更高结合。
RU：应答单位
实例10
最小表位定位(PepScan)
为了定位由mAb识别的最小表位，使用PepScan分析测试对于具有多倍对应于RSV-G A和B型的中央区(残基145-201)的长度(5、8、10、14、18、25或32聚体)的肽的反应性。在一种基于PepScan的ELISA中评估抗体与肽的结合。滴定每种mAb以确保实现最佳结合并且避免非特异性结合。每个信用卡形式的聚丙烯板含有共价键联的肽，这些肽在4℃下与1与10ng/mL之间的mAb在含有5％马血清(v/v)、5％OVA(w/v)以及1％(v/v)Tween 80的PBS中或在一种含有4％马血清(v/v)和1％(v/v)Tween 80的替代PBS阻断缓冲液中一起孵育过夜。在洗涤之后，将板在25℃下与一种HRP连接的兔抗mAb(达科细胞信息(DakoCytomation))一起孵育1小时。在进一步洗涤之后，使用ABTS底物评估过氧化物酶活性，并且使用一台电荷耦合装置摄影机和一台图像处理系统定量彩色显影。
该分析展示了结合抗体、对应于表位的高能核心的最小肽，和具有最高结合、含有也促进结合的额外相邻残基并且含有完全表位的肽。抗体与肽的反应性概述于表17中(残基描绘为大写)。虽然所有抗体都结合中央保守域，但对其结合关键的残基是不同的。对于两种抗体(CB003.1和CB010.7)来说，最小表位限于N末端CCD区(类似于3D3，WO 2009/055711中披露)。
实例11
完全取代分析(PepScan)
为了鉴别对结合关键的侧链和研究已知RSV株的识别广泛度，合成专用肽组。针对由抗体CB003.1和CB010.7识别的序列FHFEVFNFVPCSIC(SEQ ID NO:132)的每个位置对一个专用肽矩阵的280种单取代变体肽进行一种完全取代分析，并且展现了对结合到这些抗体重要的残基(图5)。这些抗体的表位可与3D3表位相当但以一种完全不同的方式识别。这由取代分析反映，该取代分析显示，我们的抗体的表位具有与3D3相比完全不同的必需残基。因此，识别和结合模式非常不同。如实例7中所示，本发明的抗体具有比3D3更高的中和能力。
3D3：159 
H
V
CSIC172
CB010.7：159FHF
CSIC172
CB003.1：159F
V
NF
CSIC172
对结合重要的保守残基也概述于表17中(关键残基以粗体描绘)。
实例12
丙氨酸扫描(PepScan)
测试一组肽，其中每个位置都被一个丙氨酸残基取代(图6)。对结合抗体关键的侧链概述于表17中(以粗体黑色指示)。
实例13
与天然变体肽的结合(PepScan)
接着，针对31种涵盖RSV-G中央域的在2012年1月1日在GenBank出现的完全多样性的肽的小组测试抗体。如图7中所示，识别A和B型的几乎所有天然存在的变体肽。CB003.1显示比与B型肽更低的与A型的结合。CB010.7同样好地结合A型和B型肽。抗体对A型变体肽中的位置180处的突变是关键的。Ser170Cys的突变对CB010.7并不关键。Ile171Thr突变对CB003.1结合是关健的，并且Gln175Arg突变对CB003.1是关健的。二重突变Ile181Phe；Ile184Ala对CB003.1也是关键的。对结合四种抗体关键的天然存在的变体概述于表17中(由下划线指示)。
注释：大写＝最小表位(最短反应性肽)，斜体大写＝促进结合的另外的残基，
＝使用完全取代分析鉴别的关键残基，粗体黑色＝使用丙氨酸扫描鉴别的(另外的)关键残基，下划线＝使用可用中央区变体肽鉴别的(另外的)关键残基。
实例14
抗G mAb的预防功效
为了确定抗G mAb是否显示体内预防功效，在RSV-A/长棉花大鼠模型中测试mAbCB003.1和CB010.7。在激发之前24小时，向近亲交配、副粘病毒血清阴性、6-8周大、第-1天体重范围是60-80 g的雄性棉花大鼠在后腿上部(股四头肌)中肌肉内注射5 mg/kg的CB003.1、CB010.7、
或媒剂(n＝5/组)。在第0天，将棉花大鼠用105.4 pfu RSV-A/长通过鼻内滴注100μL(每个鼻孔50μL)而激发。在96小时之后，将动物杀死以收集肺和鼻甲：舌叶用于分离总RNA以便通过qPCR进行总病毒RNA负荷测定，剩余肺和鼻甲用于通过pfu测试进行感染病毒负荷测定。在第0天在激发之前(在mAb给药之后24小时)和在研究终止时(在激发之后96小时)收集血液样品以证实充足投药。G mAb与媒剂相比降低肺和鼻甲感染病毒滴度和肺RNA病毒负荷(图8)。肺感染病毒滴度(log10 PFU/g)对应地由抗体CB003.1和CB010.7降低2.456和1.559 log10，而用CR9514(3D3)预防性治疗仅产生0.801 log10降低。
实例15
抗G mAb的治疗功效
为了确定抗G mAb是否显示体内治疗功效，在RSV-A/长棉花大鼠模型中测试mAbCB003.1和CB010.7。在第0天，向近亲交配、副粘病毒血清阴性、6-8周大、第-1天体重范围是60-80 g的雄性棉花大鼠用106.1 pfu RSV-A/长通过鼻内滴注100μL(每个鼻孔50μL)而激发。在激发后1天之后，通过心脏内注射给予50 mg/kg CB003.1、CB010.7、(n＝14/组)或媒剂(n＝23/组)。在第4天，随机挑选5只动物/组，将其杀死以收集肺和鼻甲：舌叶用于分离总RNA以便通过qPCR进行总病毒RNA负荷测定，剩余肺和鼻甲用于通过pfu测试进行感染病毒负荷测定。在第6天，将所有剩余动物(n＝9或18/组)杀死以收集肺用于肺组织病理学。在激发后第2天(在mAb给药之后24小时)和在研究终止时(在激发之后第4天或第6天)收集血液样品以证实充足投药。G mAb与媒剂相比降低肺和鼻甲感染病毒滴度，但不降低肺RNA病毒负荷(图9)。肺感染病毒滴度(log10PFU/g)对应地由抗体CB003.1和CB010.7降低2.348和1.736log10，而用CR9514(3D3)治疗性治疗仅产生1.369log10降低。此外，新G mAb降低细支气管周围炎、血管周围炎、间质性肺炎以及肺泡炎的组织病理学分数(图10)，而CR9514(3D3)仅降低间质性肺炎。
序列
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SEQ ID：127(pCP9-κ序列)
TACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCTAGGTGGTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCTTAATTAACTCGAGGCCCGAGCCCGGGCGAGCCCAGACACTGGACGCTGAACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGCCTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGTCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACGGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGCTAGCGAATTCACCGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGGATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCTAGGTGGTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAAGCTTGGTACCGGTGAATTCGGCGCGCCAGATCTGCGGCCGCTAGGAAGAAACTCAAAACATCAAGATTTTAAATACGCTTCTTGGTCTCCTTGCTATAATTATCTGGGATAAGCATGCTGTTTTCTGTCTGTCCCTAACATGCCCTGTGATTATCCGCAAACAACACACCCAAGGGCAGAACTTTGTTACTTAAACACCATCCTGTTTGCTTCTTTCCTCAGGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGTTAACGGATCGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCA
SEQ ID：128(pCP9-λ序列)
TACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCTAGGTGGTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCTTAATTAACTCGAGGCCCGAGCCCGGGCGAGCCCAGACACTGGACGCTGAACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGCCTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGTCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACGGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGCTAGCGAATTCACCGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGGATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCTAGGTGGTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAAGCTTGGTACCGGTGAATTCGGCGCGCCAGATCTGCGGCCGCTAGGAAGAAACTCAAAACATCAAGATTTTAAATACGCTTCTTGGTCTCCTTGCTATAATTATCTGGGATAAGCATGCTGTTTTCTGTCTGTCCCTAACATGCCCTGTGATTATCCGCAAACAACACACCCAAGGGCAGAACTTTGTTACTTAAACACCATCCTGTTTGCTTCTTTCCTCAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAGAGTTAACGGATCGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCA
Claims (13)
1.能够特异性结合到呼吸道合胞体病毒(RSV)的G蛋白并且能够中和RSV A和B株的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段结合到该RSV G蛋白的中央保守域内的一种表位，并且其中所述表位包含RSV G蛋白RSV A2株的氨基酸161-169中的一个或多个氨基酸或其他病毒株中的相对应的氨基酸，其中该抗体或其抗原结合片段选自下组，该组由以下各项组成：
a)一种抗体或其抗原结合片段，包含一个SEQ ID NO:1的重链CDR1区、一个SEQ ID NO:2的重链CDR2区以及一个SEQ ID NO:3的重链CDR3区，一个SEQ ID NO:13的轻链CDR1区、一个SEQ ID NO:14的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:15的轻链CDR3区；
b)一种抗体或其抗原结合片段，包含一个SEQ ID NO:4的重链CDR1区、一个SEQ ID NO:5的重链CDR2区以及一个SEQ ID NO:6的重链CDR3区，一个SEQ ID NO:16的轻链CDR1区、一个SEQ ID NO:17的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:18的轻链CDR3区；
c)一种抗体或其抗原结合片段，包含一个SEQ ID NO:7的重链CDR1区、一个SEQ ID NO:8的重链CDR2区以及一个SEQ ID NO:9的重链CDR3区，一个SEQ ID NO:19的轻链CDR1区、一个SEQ ID NO:20的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:21的轻链CDR3区；
d)一种抗体或其抗原结合片段，包含一个SEQ ID NO:10的重链CDR1区、一个SEQ IDNO:11的重链CDR2区以及一个SEQ ID NO:12的重链CDR3区，一个SEQ ID NO:22的轻链CDR1区、一个SEQ ID NO:23的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:24的轻链CDR3区；
e)一种抗体或其抗原结合片段，包含一个SEQ ID NO:25的重链CDR1区、一个SEQ IDNO:26的重链CDR2区以及一个SEQ ID NO:27的重链CDR3区，一个SEQ ID NO:28的轻链CDR1区、一个SEQ ID NO:29的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:30的轻链CDR3区；以及
f)一种抗体或其抗原结合片段，包含一个SEQ ID NO:31的重链CDR1区、一个SEQ IDNO:32的重链CDR2区以及一个SEQ ID NO:33的重链CDR3区，一个SEQ ID NO:34的轻链CDR1区、一个SEQ ID NO:35的轻链CDR2区以及一个SEQ ID NO:36的轻链CDR3区。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位包含RSV G蛋白RSV A2株的氨基酸162-168中的一个或多个氨基酸或其他病毒株中的相对应的氨基酸。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体是一种人类抗体。
4.免疫结合物，包含根据权利要求1至3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，该免疫结合物进一步包含至少一种治疗剂和/或可检测药剂。
5.核酸分子，编码根据权利要求1至3任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
6.载体，包含至少一种根据权利要求5所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，包含至少一种根据权利要求6所述的载体。
8.一种制造根据权利要求1至3任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其中该方法包括以下步骤：
a)在有助于该抗体或其抗原结合片段的表达的条件下培养根据权利要求7所述的宿主细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
b)回收该表达的抗体和/或抗原结合片段。
10.一种药物组合物，包含根据权利要求1至3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，该药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂。
11.根据权利要求1至3任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求10所述的药物组合物用于制备对RSV感染进行预防或治疗或其组合的药物的用途。
12.一种试剂盒，包含以下中的至少一者：根据权利要求1至3任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求10所述的药物组合物、或其组合。
13.根据权利要求1至3任一项所述的抗体或其抗原结合片段、和/或根据权利要求4所述的免疫结合物用于制备检测RSV感染的药物的用途。
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