KR20150143544A - Ｒｓｖ ｇ 단백질에 결합하는 인간 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 RSV의 G 단백질에 결합하며, RSV A 및 B 하위유형을 중화시킬 수 있는 분리된 항체 및 항원-결합 단편, 및 RSV 감염의 진단, 예방 및/또는 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

ＲＳＶ Ｇ 단백질에 결합하는 인간 항체{HUMAN ANTIBODIES BINDING TO RSV G PROTEIN}
본 발명은 약제에 관한 것이다. 본 발명은 특히 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 부착 당단백질(G 단백질)에 특이적으로 결합하며, RSV를 중화시키는 항체 및 항원-결합 단편에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항-RSV 항체를 이용하는 진단, 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.
인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)는 흔한 호흡기 바이러스, 예를 들어, 홍역 및 볼거리를 야기하는 것들도 포함하는 파라믹소바이러스과의 음성-센스, 단일-가닥 RNA 바이러스이다. 2가지 주요 RSV 하위유형, 하위유형 A 및 하위유형 B가 존재한다. RSV는 상기도에서 복제한 다음, 하기도로 확산되어, 세기관지염 또는 폐렴을 야기한다. 바이러스는 염증, 기도의 부종, 증가된 점액 생성 및 호흡기 상피의 파괴를 야기한다.
전세계적으로, 6,400만 건의 호흡기 병 및 160,000건의 사망이 RSV-유도 질병(disease) 때문인 것으로 추정된다. 중증 RSV 감염은 소아 및 유아, 특히 미숙아에서 가장 흔하게 발생한다. 근본적인 건강 문제, 예를 들어, 만성 폐 질병 또는 선천심장병은 심각한 병의 위험을 상당히 증가시킬 수 있다. 또한, RSV 감염은 노인, 만성 폐 질병이 있는 개체 및 면역약화 성인, 예를 들어, 골수 이식 수여자에서 심각한 병을 유발할 수도 있다.
RSV 감염의 예방 및 치료에 대한 몇몇의 방법이 조사되어 왔다. 공여자로부터 분리된 정맥내 면역글로불린(RSV-IGIV; RespiGam®) 및 모노클로널 항체 팔리비주맙(palivizumab)(SYNAGIS®)은 고위험 미숙아에서 RSV 예방을 위해 승인되었다. 그러나, RSV를 위한 백신 또는 상업적으로 입수가능한 치료는 아직 이용가능하지 않다. RNA 억제제인 리바비린(ribavirin)만이 RSV 감염의 치료를 위해 승인되어 있다. RSV 감염의 치료에 효율적이기 위하여, 낮은 효율성으로 인하여, 고용량, 반복 투여 및/또는 큰 부피의 항체 제품, 예를 들어, 팔리비주맙이 필요하다.
RSV는 2가지 주요 표면 당단백질, F 및 G를 갖는다. F 단백질은 융합을 매개하여, 세포질로의 바이러스의 유입을 가능하게 하고, 시험관내에서 융합체의 형성을 용이하게 한다. F 단백질 서열은 RSV 균주 간에 충분히(약 90%) 보존되어 있다(문헌[Johnson and Collins, J Gen Virol. (1988) 69: 2623-2628]). 오직 시판되는 모노클로널 항체 팔리비주맙만이 RSV의 F 단백질에 대하여 유도된다.
RSV의 G 단백질은 과도하게 글리코실화되며, 부착 단백질로서 기능하는 표면 단백질이다. G 단백질은 F 단백질과 대조적으로, RSV A2 균주의 G 단백질의 아미노산 잔기 153 내지 184, 또는 다른 균주에서의 상응하는 아미노산 잔기를 포함하는 중심 보존 도메인(CCD)을 제외하고, 균주들에 걸쳐 상당히 가변적이다. 중심 보존 도메인 및 인접 영역(잔기 145 내지 193) 둘 모두는 강성이며 많이 O-글리코실화된 뮤신-유사 영역에 의해 결합된다. 중심 보존 도메인의 N-말단 절반은 700개 초과의 균주 간에 보존되는 작은 영역을 함유한다. C-말단 절반은 1-4, 2-3 토폴로지에서 연결된 4개의 보존된 시스테인을 함유하며, 시스틴 누스(cystine noose)로 접힌다.
G 단백질에 대해 유도된 항체를 사용하는 수동면역이 일반적으로 균주들 간의 서열 보존의 결여로 인하여 실행가능하지 않은 것으로 여겨지지만, RSV G 단백질에 결합하는 중화 모노클로널 항체가 알려져 있다. 문헌[Anderson, L. J. et al (J. Virol. (1988) 62:4232-4238)]에는 F 및 G 쥣과 모노클로널 항체의 혼합물의 중화 능력이 기술되어 있으며, 그 중 하나는 RSV G 단백질(즉, 131-2G)에 결합한다. 이러한 항체의 항원 부위는 이후에 문헌[Sullender (Virol. (1995) 209:70-79)]에서 정의되었다. 이러한 항체는 RSV의 주요 균주를 나타내는 RSV 그룹 A 및 B 둘 모두에 결합하는 것으로 관찰되었다. 또한, WO 2009/055711호에는 RSV A2의 G 단백질 내의 보존된 모티프와 면역반응성이며, RSV A 및 B 하위유형에 대하여 중화 활성을 갖는 항체, 예를 들어, 3D3 및 3G12가 개시되어 있다. 이들 항체는 중심 보존 도메인 내의 선형 에피토프를 인식하는 것으로 나타났으나, RSV 항체 및 백신을 평가하기 위한 바람직한 동물 모델(즉, 코튼 랫트(cotton rat))에서 시험되지 않았다.
특히, 어린 소아 및 노인에서 RSV에 의해 야기되는 호흡기 병의 중증도의 관점에서, RSV 감염을 예방하고 치료하기 위한 효율적인 수단이 계속 요구되고 있다.
본 발명은 RSV G 단백질에 특이적으로 결합하며, RSV를 중화할 수 있는 분리된 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 항체 및 항원-결합 단편은 바람직하게는 하위유형 A 및 B 둘 모두의 RSV에 특이적으로 결합하고, 이를 중화시킬 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간 항체이다. 항체는 RSV G 단백질의 중심 보존 비글리코실화 영역(중심 보존 도메인, CCD로도 지칭) 내의 에피토프에 결합한다.
항체 및 항원-결합 단편은 G 단백질에 대한 높은 친화성을 가지며, 강력한 중화 능력을 갖는다. 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 단독으로, 및 다른 진단, 예방 및/또는 치료제와 병용하여, 진단, 예방 및/또는 치료제로서 유용하다.
추가로, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 항체 및/또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 항-RSV 항체를 사용하는 진단, 예방 및 치료 방법을 제공한다. 예방 및 치료 방법은 RSV 감염 및 RSV-매개의 질병 또는 질환의 예방 또는 치료 및/또는 RSV 감염의 하나 이상의 증상의 개선을 위해 항-RSV 항체 및/또는 그의 항원-결합 단편을 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 복수의 상이한 항-RSV 항체 및/또는 그의 항원-결합 단편 및/또는 다른 항-RSV 항체의 병용은 병용 요법에 사용될 수 있다. 다른 예방제 또는 치료제와 병용되는 항-RSV 항체 및/또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물도 또한 제공된다. 또한, 본 발명은 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 항체는 상기 항체가 적어도 시험관내 중화 분석법에서 임의의 알려져 있는 항-RSV G 항체보다, 특히, 알려져 있는 항-RSV G 모노클로널 항체 3D3보다 RSV 유형 A 및 B에 대하여 더욱 강력하다는 점에서 독특한 것이다.
본 발명의 항체는 RSV G 단백질상의 독특한 에피토프에 결합한다.
특정 실시형태에 있어서, 항체는 그의 아미노산 서열에서 CXXXXC 모티프를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다.
특정 실시형태에 있어서, 항체 및 그의 항원-결합 단편은 그들이 항-RSV F 항체와 상가적으로 및/또는 상승적으로 작용한다는 점에서 독특한 것이다.
도 1은 RSV Ga 및 RSV Gb 단백질에 대한 결합 프로파일을 보여준다. IgG를 재조합 RSV Ga 및 Gb 단백질의 엑토도메인에 결합하는 그들의 능력에 대하여 ELISA 분석법에서 시험하였다. 비어있는 원(open circle)(파선)은 Ga(RSV A/Long)로의 결합을 나타내고, 채워진 원(closed circle)(실선)은 Gb(RSV B/B1)로의 결합을 나타낸다.
도 2는 RSV-A 및 RSV-B 균주에 대한 중화 프로파일을 보여준다. IgG를 RSV-A 및 RSV-B 균주를 중화하는 그들의 능력에 대하여 중화 분석법에서 시험하였다. 비어있는 원(파선)은 RSV-A(RSV A/A2)의 중화를 나타내고, 채워진 원(실선)은 RSV-B(RSV B/18537)의 중화를 나타낸다.
도 3은 RSV G 펩티드로의 RSV G 특이적 모노클로널 항체의 결합을 보여준다(ELISA). 중심 보존 도메인에 걸쳐 있는 짧은 및 긴 RSV G 펩티드(표 15)를 다양한 농도의 RSV G 특이적 mAb를 사용하여, ELISA에서 결합 실험에 사용하였다: CB003.1(채워진 흑색 원, 실선), CB010.7(비어있는 흑색 원, 파선), 또는 모노클로널 항체 부재(채워진 연회색 원).
도 4: PepScan에 의한 최소 에피토프 맵핑. 중심 영역(RSV-G 유형 A 및 유형 B의 잔기 145 내지 201)의 모든 완전 중첩 5-mer, 8-mer, 10-mer, 14-mer, 18-mer, 25-mer 및 32-mer 펩티드에 대한 RSV G 단백질 특이적 항체의 결합 활성. 펩티드와의 결합 활성은 PepScan ELISA 신호에 비례하여 수직선으로 나타나 있다.
도 5: PepScan에 의한 CB003.1 및 CB010.7 에피토프의 완전 치환 분석. 각각 100 및 30 ng/㎖에서의 모노클로널 항체 CB003.1 및 CB010.7의 펩티드와의 결합 활성은 Pepscan ELISA 신호에 비례하여 수직선으로 나타나 있다. 20개의 선의 각 그룹은 원래 14-mer 펩티드(FHFEVFNFVPCSIC)에서의 각각의 아미노산 위치에 대한 완전한 대체 세트에 상응한다. 20개 선의 각 그룹에서, 치환은 1-문자 아미노산 코드에 기초한 알파벳 순서이며(ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY), 원래 14-mer 펩티드의 반응성은 회색 막대로 나타나 있다.
도 6: RSV G 단백질 중심 영역의 알라닌 스캐닝(PepScan). 유형 A(좌측 패널) 및 유형 B(우측 패널)의 RSV-G 중심 도메인의 잔기 161 내지 192에 상응하는 펩티드의 모든 위치에서의 알라닌 치환. 유형 A의 위치 180에서의 알라닌은 글리신으로 치환되었다. 원래 펩티드의 반응성은 회색 막대로 나타나 있다.
도 7은 RSV G 단백질 중심 영역의 천연 발생 변이체로의 모노클로널 항체의 결합을 보여준다. 이용가능한 유형 A(상측 패널) 및 유형 B(하측 패널) 변이체에 상응하는 상이한 펩티드와의 mAb CB003.1 및 CB010.7의 결합. 야생형 펩티드의 반응성은 회색 막대로 나타나 있다.
도 8은 코튼 랫트 RSV-A/Long 모델에서 시험감염(challenge) 4일 후에, 폐 및 비갑개 바이러스 로드(load)에 대한 항-RSV G mAb의 예방 효능을 보여준다.
도 9는 코튼 랫트 RSV-A/Long 모델에서 시험감염 4일 후에, 폐 및 비갑개 바이러스 로드에 대한 항-RSV G mAb의 치료 효능을 보여준다.
도 10은 코튼 랫트 RSV-A/Long 모델에서 시험감염 6일 후에, 조직병리학 점수에 대한 항-RSV G mAb의 치료 효능을 보여준다.
정의
본 발명에 사용되는 용어의 정의는 하기에 제공된다.
본 명세서에 사용되는 "포함되는" 또는 "포함하는"이라는 용어는 "제한없이"라는 용어가 뒤에 오는 것으로 여겨진다.
본원에 사용되는 "항체"라는 용어는 모노클로널 항체, 예를 들어, 키메라, 인간화 또는 인간 모노클로널 항체를 포함하는 면역글로불린 분자를 말한다. 용어 "항체"는 당업계에 알려져 있는 모든 면역글로불린 분류 및 하위분류를 포함한다. 항체는 그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 5가지 주요 분류의 무손상 항체, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 나뉠 수 있으며, 이들 중 몇몇은 하위분류(아이소형), 예를 들어, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 나뉠 수 있다.
항원-결합 단편이라는 용어는 면역글로불린의 결합 파트너, 즉, RSV G 단백질로의 특이적인 결합을 위해, 무손상 면역글로불린과 경쟁하는 면역글로불린의 항원-결합 및/또는 가변 도메인 함유 단편을 말한다. 항원-결합 단편은 구조와 상관 없이, 무손상 면역글로불린에 의해 인식되는 동일한 항원과 결합한다. 항원-결합 단편은 특히, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단쇄 항체(scFv), 2가 단쇄 항체, (단일) 도메인 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 적어도 (폴리) 펩티드로의 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 단편을 함유하는 (폴리) 펩티드 등을 포함한다. 항원-결합 단편은 항체의 아미노산 서열의 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 또는 250개의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 항원-결합 단편은 합성에 의해 또는 무손상 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있거나, 그들은 재조합 DNA 기술에 의해 유전자 조작될 수 있다. 생성 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며, 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Edited by: E. Harlow and D, Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York]에 기술되어 있다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하나 이상의 결합 부위를 가질 수 있다. 1개 초과의 결합 부위가 존재한다면, 결합 부위는 서로 동일하거나 서로 상이할 수 있다.
본원에 사용되는 "모노클로널 항체"라는 용어는 단일의 특이성이 있는 항체 분자를 말한다. 모노클로널 항체는 특정 에피토프에 대하여 단일의 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 따라서, "인간 모노클로널 항체"라는 용어는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래되거나, 그에 기초하거나, 완전 합성 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일의 결합 특이성을 나타내는 항체를 말한다. 모노클로널 항체의 생성 방법은 결합 특이성과 관련이 없다.
본원에 사용되는 "기능성 변이체"라는 용어는 참조 항체의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열과 비교하여, 하나 이상의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산이 변경되고, 결합 파트너, 즉, RSV로의 특이적인 결합을 위하여 참조 항체와 경쟁할 수 있는 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 포함하는 항체를 말한다. 다시 말하면, 참조 항체의 아미노산 및/또는 뉴클레오티드 서열 내의 변형은 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되거나 상기 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 상당하게 영향을 미치거나 이를 변경시키지 않으며, 다시 말하면, 항체는 여전히 그의 표적을 특이적으로 인식하고, 그에 결합할 수 있다. 기능성 변이체는 뉴클레오티드 및 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함하는 보존적 서열 변형을 가질 수 있다. 이들 변형은 당업계에 알려져 있는 표준 기술, 예를 들어, 위치-지정 돌연변이유발 및 무작위 PCR-매개의 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있으며, 천연 및 비-천연 뉴클레오티드 및 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체와 관련하여, 본원에 사용되는 "중화시키는"이라는 용어는 중화가 달성되는 메커니즘과 관련없이, 바이러스의 생물학적 영향을 중화시키거나 억제하고/거나 RSV의 감염 역가를 감소시킴으로써 바이러스에 의한 세포의 감염을 예방하거나 억제할 수 있는 항체를 말한다. 중화는 예를 들어, 세포 표면으로의 바이러스의 부착 또는 점착을 억제하거나, 표적 세포로의 바이러스의 부착 후의 바이러스 및 세포 막의 융합을 억제하는 등에 의해 달성될 수 있다.
항체 및 그의 결합 파트너, 예를 들어, 항원의 상호작용에 관련하여, 본원에 사용되는 "특이적으로 결합하는"이라는 용어는 상호작용이 결합 파트너상의 특정 구조, 예를 들어, 항원 결정인자 또는 에피토프의 존재에 좌우됨을 의미한다. 다시 말하면, 항체는 심지어 결합 파트너가 다른 분자의 혼합물 또는 유기체 중에 존재하는 경우에도, 우선적으로 결합 파트너에 결합하거나 이를 인식한다. 결합은 공유 또는 비공유 상호작용 또는 둘 모두의 조합에 의해 매개될 수 있다. 다시 말하면, "특이적으로 결합하는"이라는 용어는 항체가 항원 결정인자 또는 에피토프와 특이적으로 면역반응성이며, 다른 항원 결정인자 또는 에피토프와 면역반응성이 아님을 의미한다. 항원에 (면역)특이적으로 결합하는 항체는 예를 들어, 방사성면역분석법(RIA), 효소-연결 면역흡착 분석법(ELISA), BIACORE 또는 당업계에 알려져 있는 기타 분석법에 의해 결정시 보다 낮은 친화성으로 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편은 동일한 에피토프를 지니는 관련 항원과 교차-반응성일 수 있다. 바람직하게는, 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편은 다른 항원과 교차-반응하지 않는다.
발명의 상세한 설명
제1 양태에서, 본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 G 단백질에 특이적으로 결합할 수 있으며, RSV를 중화시킬 수 있는 항체 및 항원-결합 단편을 제공한다. 항체는 바람직하게는 하위유형 A 및 B 둘 모두의 RSV에 특이적으로 결합하고 이를 중화시킬 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간 모노클로널 항체이다.
본 발명에 따르면, 항체 및 항원-결합 단편은 RSV G 단백질의 중심 보존 도메인(CCD) 내의 에피토프에 결합한다. 중심 보존 도메인은 RSV A2 균주의 G 단백질의 아미노산 153 내지 184(또는 다른 균주에서의 상응하는 아미노산 잔기)를 포함하는 아미노산 서열에 걸쳐 있다. 특정 실시형태에 있어서, 항체 및 항원-결합 단편은 RSV A2 균주의 G 단백질(넘버링은 RSV 균주 A2 균주에 따름)의 아미노산 잔기 161 내지 169를 포함하는 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기, 특히, 아미노산 잔기 162 내지 168을 포함하는 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합한다.
이에 따라, 시스틴 누스의 N-말단인 부위에 위치하는 G 단백질 내의 에피토프에 결합하는 항체 및 항원-결합 단편이 제공된다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 중화 항체의 적어도 일부가 예를 들어, 이전에 기재된 모노클로널 항체 3D3(WO2009/055711)와 유사하나 동일하지 않은 선형 에피토프에 결합하는 점에도 불구하고, 본 발명의 항체는 시험관내 중화 분석법에서 측정시, 보다 높은 중화 효능을 갖는 것으로 나타났다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 항체가 독특한 방식으로 이러한 선형 에피토프에 결합하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따르면, 이들 항체가 RSV 유형 A 및 B의 161 내지 169 에피토프(넘버링은 RSV 균주 A2에 따름)에 대하여 상이한 측쇄 특이성을 갖는 것이 나타났다. 이는 예를 들어, 본 발명의 항체의 에피토프가 예를 들어, 3D3과 비교하여 상이한 필수 잔기를 갖는 것을 보여주는 치환 분석(실시예 11 참조)에 의해 반영된다.
본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 시험관내 중화 분석법에서, 특히, 실시예 7에 기술된 시험관내 분석법에서, RSV 유형 A 및 B에 대하여, 알려져 있는 항-RSV G 항체 중 임의의 것보다 더욱 강력한, 특히, 알려져 있는 항-RSV G 모노클로널 항체 3D3보다 더욱 강력한 것으로 나타났다.
특정 실시형태에 있어서, RSV 균주 A/A2(ATCC 카탈로그 번호 VR-1540)에 대한 항체 및 항원-결합 단편의 IC50(플라크 형성의 50% 중화에 효율적인 희석)은 40 ng/㎖ 미만이었고/거나, RSV 균주 B/18537(ATCC 카탈로그 번호 VR-1589)에 대한 IC50은 30 ng/㎖ 미만이었다.
일 실시형태에 있어서, 항체는 1F12, 3G12, 1A5, 3D3, 1G1, 2B11, 5D8, 2D10, 3F9, 1D4, 1G8, 6A12, 10C6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체가 아니다(WO 2009/055711호에 기술된 바와 같음).
특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 RSV G 단백질과의 경쟁을 위해 1F12, 3G12, 1A5, 3D3, 1G1, 2B11, 5D8, 2D10, 3F9, 1D4, 1G8, 6A12 및 10C6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체와 경쟁한다(WO 2009/055711호에 기술된 바와 같음).
특정 실시형태에 있어서, 항체는 그의 아미노산 서열에 CXXXXC 모티프를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다.
특정 실시형태에 있어서, 항체는 다음을 포함하는 중쇄를 포함한다:
a) SEQ ID NO: 1의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 2의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 3의 중쇄 CDR3 영역,
b) SEQ ID NO: 4의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 5의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 6의 중쇄 CDR3 영역,
c) SEQ ID NO: 7의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 8의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 9의 중쇄 CDR3 영역,
d) SEQ ID NO: 10의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 11의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 12의 중쇄 CDR3 영역,
e) SEQ ID NO: 25의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 26의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 27의 중쇄 CDR3 영역, 또는
f) SEQ ID NO: 31의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 32의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 33의 중쇄 CDR3 영역.
특정 실시형태에 있어서, 항체는 다음을 포함하는 경쇄를 포함한다:
a) SEQ ID NO: 13의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 14의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 15의 경쇄 CDR3 영역,
b) SEQ ID NO: 16의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 17의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 18의 경쇄 CDR3 영역,
c) SEQ ID NO: 19의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 20의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 21의 경쇄 CDR3 영역,
d) SEQ ID NO: 22의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 23의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 24의 경쇄 CDR3 영역,
e) SEQ ID NO: 28의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 29의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 30의 경쇄 CDR3 영역, 또는
f) SEQ ID NO: 34의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 35의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 36의 경쇄 CDR3 영역.
특정 실시형태에 있어서, 항체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
a) SEQ ID NO: 1의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 2의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 3의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 13의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 14의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 15의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체;
b) SEQ ID NO: 4의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 5의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 6의 중쇄 CDR3 영역 및 SEQ ID NO: 16의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 17의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 18의 경쇄 CDR3 영역;
c) SEQ ID NO: 7의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 8의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 9의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 19의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 20의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 21의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체;
d) SEQ ID NO: 10의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 11의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 12의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 22의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 23의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 24의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체;
e) SEQ ID NO: 25의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 26의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 27의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 28의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 29의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 30의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체; 및
f) SEQ ID NO: 31의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 32의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 33의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 34의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 35의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 36의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체.
특정 실시형태에 있어서, 항체는 SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 또는 SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시형태에 있어서, 항체는 SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 또는 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시형태에 있어서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
a) SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
b) SEQ ID NO: 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
c) SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
d) SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
e) SEQ ID NO: 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체; 및
f) SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
특정 실시형태에 있어서, 상기 기술된 항체의 항원-결합 단편이 제공된다. 항원-결합 단편은 바람직하게는 동일한 에피토프에 결합한다.
본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 또한, RSV G 단백질의 중심 보존 도메인 내의 에피토프에 결합하는 것으로 보이는 알려져 있는 항-RSV G 단백질, 예를 들어, 항-RSV G 항체 3D3의 에피토프와 비교하여 상이한 에피토프에 결합한다. 상이한 에피토프로의 결합이란, 항체가 알려져 있는 항체, 예를 들어, 3D3과 비교하여, 상이한 결정적인 아미노산 잔기에 결합하는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 항체가 시험관내 중화 분석법, 특히 실시예 7에 기술된 바와 같은 시험관내 중화 분석법에서 측정시, 알려져 있는 RSV G 단백질 결합 항체 중 임의의 것보다 더욱 강력한 것으로 나타났다.
특정 실시형태에 있어서, 항체는 RVS F 단백질에 결합하는 항체와 병용되는 경우, 상승적으로 작용한다. 본원에 사용되는 "상승적"이라는 용어는 병용되는 경우 항체 또는 항원-결합 단편의 병용 효과가 개별적으로 사용되는 경우의 그들의 상가적 효과보다 더 큰 것을 의미한다. 상승효과를 계산하는 방법은 병용 지수에 의한 것이다. 병용 지수(CI)의 개념은 문헌[Chou and Talalay (Adv Enzyme Regul., 22:27-55, 1984)]에 기재되어 있다.
특정 실시형태에 있어서, 항체 및 항원-결합 단편은 약제로서 사용하기 위한 것, 바람직하게는 RSV A 및/또는 B 하위유형에 의해 야기되는 RSV 감염의 진단적, 치료적 및/또는 예방적 처치에 사용하기 위한 것이다. 본원에 사용되는 "치료하다" 또는 "치료"라는 용어는 RSV로 이미 감염된 대상체에서 바이러스 부하량(viral burden)을 감소시키고/거나 이러한 대상체에서 질병의 증상을 개선시키는 것을 말한다. 이러한 증상은 예를 들어, 세기관지염, 기도 염증, 폐 내의 울혈 및 호흡 곤란을 포함한다. "방지" 또는 "예방"은 RSV의 확산을 억제하거나 감소시키거나, RSV로의 감염과 관련된 증상 중 하나 이상의 발병, 발생 또는 진행을 억제하거나 감소시키는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 조성물은 본 발명에 따른 적어도 하나의 항체 또는 항원-결합 단편 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이다. "약제학적으로 허용되는 부형제"는 간편한 투여형을 제조하기 위해 활성 분자, 예를 들어, 항체와 병용되는 임의의 비활성 물질을 의미한다. "약제학적으로 허용되는 부형제"는 사용되는 용량 및 농도에서 수여자에게 비-독성이며, 약물, 작용제 또는 항체를 포함하는 제형의 다른 성분과 상용성인 부형제이다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 광범위하게 적용되며, 당업계에 알려져 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 RSV 감염의 진단, 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명에 따른 항체를 RSV 감염의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여함에 의한, RSV 감염의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. "치료적 유효량"이라는 용어는 RSV로의 감염에서 야기되는 질환의 예방, 개선 및/또는 치료에 효과적인 본원에 정의된 바와 같은 항체의 양을 말한다. 본원에 사용되는 개선은 RSV 감염의 질병 증상, 바이러스혈증, 또는 임의의 다른 측정가능한 소견의 뚜렷한 또는 상당한 감소를 나타낼 수 있다.
항체 또는 그의 단편은 치료법에 사용하기 위하여 적당한 부형제를 사용하여 약제학적 조성물로 제형화되고, 표준 프로토콜에 따라 투여된다. 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. RSV의 F 단백질과 면역반응성인 하나 이상의 항체, 또는 RSV 또는 염증에 효과적인 다른 치료제를 포함하는 추가의 치료제가 존재할 수 있다. 따라서, 항-염증제, 예를 들어, 스테로이드성 및 비-스테로이드성 항-염증 화합물이 조성물에 포함될 수 있다.
특정 실시형태에 있어서, 다시 말하면, 보체-함유 Fc 영역을 함유하는 완전 항체가 사용된다.
특정 실시형태에 있어서, 예를 들어, 폐에서 염증 반응을 감소시키기 위하여, 오직 항체의 항원-결합 단편만이 사용된다. 면역특이적 단편 및 전체 항체의 혼합물의 투여도 본 발명의 범주 내에 포함된다.
치료는 RSV 감염에 감수성인 환자 그룹을 표적으로 할 수 있다. 그러한 환자 그룹에는 예를 들어, 노인(예를 들어, 50세 이상, 60세 이상, 바람직하게는 65세 이상), 유아(예를 들어, 5세 이하, 1세 이하), 입원 환자, 면역-약화 환자 및 항바이러스 화합물로 처치된 적이 있지만, 부적당한 항바이러스 반응을 나타낸 환자가 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체 조성물의 투여는 전형적으로 주사, 일반적으로, 근육내 또는 정맥내 주사에 의한 것이다. 제형은 일반적으로 항체 조성물을 투여하기 위한 당업계에 일반적으로 알려져 있는 방식으로 제조된다. 적당한 제형은 본원에 참조로 포함되는 표준 처방서, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition, Mack Publishing Co., Easton, PA]에서 찾을 수 있다. 제형은 전형적으로, 완충제, 산화방지제 등을 포함하는 등장성 용액, 및 전달 비히클, 예를 들어, 리포좀, 미셀 및 나노입자를 포함하는 에멀젼을 포함하여, 비경구 투여에 적당한 것들이다.
요망되는 프로토콜 및 제형은 전문의의 판단 및 대상체의 구체적인 상태에 따라 달라진다. 용량 수준은 적절한 경우, 대상체의 연령, 일반적인 건강 및 감염의 중증도에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본원에 정의된 바와 같은 항체의 기능성 변이체를 포함한다. 변이체가 RSV 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하기 위해 "모체" 또는 "참조" 항체와 경쟁할 수 있다면, 분자는 본 발명에 따른 항체의 기능성 변이체인 것으로 여겨진다. 다시 말하면, 분자는 기능성 변이체가 RSV 또는 그의 단편의 동일한 또는 중첩 에피토프에 여전히 결합할 수 있는 경우, 본 발명에 따른 항체의 기능성 변이체인 것으로 고려된다. 기능성 변이체는 일차 구조 서열이 실질적으로 유사한 유도체를 포함하나 이들에 한정되지 않으며, Fc 수용체 또는 이펙터 기능과 관련된 다른 영역의 변형을 갖고/거나 모체 항체에서 발견되지 않는 예를 들어, 화학적 및/또는 생화학적 시험관내 또는 생체내 변형을 함유하는 것들을 포함한다. 그러한 변형은 특히 아세틸화, 아실화, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유적 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유적 부착, 가교-결합, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 히드록실화, 메틸화, 산화, PEG화, 단백질 분해 과정, 인산화 등을 포함한다.
대안적으로, 기능성 변이체는 모체 항체의 아미노산 서열에 비하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실 또는 그들의 조합을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 본 발명에서 정의된 바와 같은 항체일 수 있다. 또한, 기능성 변이체는 어느 하나 또는 둘 모두의 아미노 또는 카복실 말단에서 아미노산 서열의 절단을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 기능성 변이체는 모체 항체와 비교하여 동일하거나 상이한, 더 크거나 더 낮은 결합 친화성을 가질 수 있지만 여전히 RSV 또는 그의 단편에 결합할 수 있다. 예를 들어 본 발명에 따른 기능성 변이체는 모체 항체에 비하여, RSV 또는 그의 단편에 대한 증가되거나 감소된 결합 친화성을 가질 수 있다. 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 의도되는 기능성 변이체는 본원에 정의된 바와 같은 모체 항체와 적어도 약 50% 내지 약 99%, 바람직하게는 적어도 약 60% 내지 약 99%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70% 내지 약 99%, 더더욱 바람직하게는 적어도 약 80% 내지 약 99%, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 내지 약 99%, 특히 적어도 약 95% 내지 약 99%, 특히 적어도 약 97% 내지 약 99% 아미노산 서열 동일성 및/또는 상동성을 갖는다. 당업자에게 알려진 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어, 특히 Gap 또는 Bestfit을 사용하여, 비교될 아미노산 서열을 최적으로 정렬하고 유사하거나 동일한 아미노산 잔기를 정의할 수 있다. 기능성 변이체는 오류-유발 PCR, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발, 위치-지정 돌연변이유발 및 중쇄 및/또는 경쇄 셔플링(shuffling)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 당업계에 알려진 일반 분자 생물학 방법에 의해 모체 항체 또는 그의 부분을 변경시킴으로써 수득될 수 있다.
또한, 본 발명은 면역컨쥬게이트(immunoconjugate), 즉, 적어도 하나의 항체, 항원-결합 단편 또는 기능성 변이체를 포함하며, 적어도 하나의 태그, 예를 들어, 특히 검출가능한 모이어티(moiety)/작용제를 추가로 포함하는 분자를 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 면역컨쥬게이트의 혼합물 또는 본 발명에 따른 적어도 하나의 면역컨쥬게이트 및 다른 분자, 예를 들어, 치료제 또는 다른 항체 또는 면역컨쥬게이트의 혼합물이 본 발명에 고려된다. 추가의 실시형태에 있어서, 본 발명의 면역컨쥬게이트는 1개 초과의 태그를 포함할 수 있다. 이들 태그는 서로 동일하거나 다를 수 있으며, 항체에 비공유적으로 연결/컨쥬게이트될 수 있다. 또한, 태그(들)는 공유 결합을 통해 인간 항체에 직접 연결/컨쥬게이트될 수 있다. 대안적으로, 태그(들)는 하나 이상의 연결 화합물에 의해 항체에 연결/컨쥬게이트될 수 있다. 태그를 항체에 컨쥬게이트시키는 기술은 당업자에게 널리 알려져 있다. 본 발명의 면역컨쥬게이트의 태그는 치료제일 수 있으나, 그들은 또한 검출가능한 모이어티/작용제일 수도 있다. 치료법 및/또는 예방에 적당한 태그는 독소 또는 그의 기능성 부분, 항생제, 효소, 식세포작용 또는 면역 자극을 증진시키는 다른 항체일 수 있다. 검출가능한 작용제를 포함하는 면역컨쥬게이트를 진단적으로 사용하여, 예를 들어, 대상체가 RSV로 감염되었는지를 평가하기 위해 또는 임상 시험 절차의 부분으로서 RSV 감염의 발생 또는 진행을 모니터링하여, 예를 들어 주어진 치료 계획의 효능을 측정할 수 있다. 그러나 그들은 다른 검출 및/또는 분석 및/또는 진단 목적을 위해 사용될 수도 있다. 검출가능한 모이어티/작용제는 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 물질, 양전자 방출 금속, 및 비-방사성 상자성 금속 이온을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 검출 및/또는 분석 및/또는 진단 목적을 위해 항체를 표지하기 위해 사용되는 태그는 사용되는 특정 검출/분석/진단 기술 및/또는 방법, 예를 들어, 특히 (조직) 시료의 면역조직화학 염색, 유세포계수 검출, 주사 레이저 세포계수 검출, 형광 면역분석법, 효소-연결 면역흡착 분석법(ELISA), 방사성면역분석법(RIA), 생물분석법(예를 들어, 식세포작용 분석법), 웨스턴 블롯팅 응용 등에 좌우된다. 당업계에 알려진 검출/분석/진단 기술 및/또는 방법에 적당한 표지는 충분히 당업자 범위 내에 있다.
또한, 본 발명의 인간 항체 또는 면역컨쥬게이트는 RSV 또는 그의 단편의 시험관내 면역분석법 또는 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 본 발명의 항체는 마커 서열, 예를 들어, 정제를 용이하게 하기 위한 펩티드에 융합될 수 있다. 예에는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌(HA) 태그, myc 태그 또는 flag 태그가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 대안적으로, 항체는 제2 항체에 컨쥬게이트되어, 항체 헤테로컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항원에 컨쥬게이트/부착될 수 있다. 바람직하게는 이들 항원은 항체-항원 컨쥬게이트가 투여되는 대상체의 면역계에 의해 인식되는 항원이다. 항원은 동일할 수 있지만 서로 상이할 수도 있다. 항원 및 항체를 부착시키는 컨쥬게이션 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 교차-결합제의 사용을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어 링커를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 컨쥬게이트시킴으로써 화학적으로 면역컨쥬게이트를 생성한 후에, 면역컨쥬게이트는 본 발명의 항체 및 적당한 태그를 포함하는 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 융합 단백질은 당업계에 알려져 있는 방법에 의해, 예를 들어, 적당한 태그(들)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 프레임 내에, 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 작제한 다음, 핵산 분자를 발현시킴으로써 재조합에 의해 생성될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항체, 항원-결합 단편 또는 기능성 변이체를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 이러한 핵산 분자는 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 친화성 성숙의 과정에서 클로닝 목적을 위해 중간체로서 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 분리되거나 정제된다. 당업자는 이들 핵산 분자의 기능성 변이체도 또한 본 발명의 일부인 것으로 의도되는 것을 인지할 것이다. 기능성 변이체는 표준 유전자 코드를 사용하여 직접적으로 번역되어 모체 핵산 분자로부터 번역되는 것과 동일한 아미노산 서열을 제공할 수 있는 핵산 서열이다. 바람직하게는 핵산 분자는 상기 기재된 바와 같은 CDR 영역을 포함하는 항체를 인코딩한다. 추가의 실시형태에서 핵산 분자는 본 발명의 항체의 2, 3, 4, 5, 또는 심지어 모든 6개 CDR 영역을 포함하는 항체를 인코딩한다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 벡터, 즉, 핵산 작제물을 제공하는 것이다. 벡터는 플라스미드, 예를 들어, 특히, F, R1, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti 등; 코스미드; 파지, 예를 들어, 람다, 람다형, M13, Mu, P1, P22, Qβ, T-even, T-odd, T2, T4, T7 등; 식물 바이러스로부터 유도될 수 있다. 벡터는 본 발명의 항체의 클로닝 및/또는 발현을 위해 사용될 수 있고, 심지어 유전자 치료법 목적을 위해 사용될 수 있다. 하나 이상의 발현-조절 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 벡터도 또한 본 발명에 의해 포함된다. 벡터 선택은 따르는 재조합 절차 및 사용된 숙주에 좌우된다. 숙주 세포에서 벡터의 도입은 특히 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 야기될 수 있다. 벡터는 자율적으로 복제할 수 있거나 그들이 통합된 염색체와 함께 복제할 수 있다. 바람직하게는 벡터는 하나 이상의 선택 마커를 함유한다. 마커의 선택은 당업자에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 본 발명에 결정적이지 않더라도 선택된 숙주 세포에 좌우될 수 있다. 그들은 카나마이신, 네오마이신, 퓨로마이신, 히그로마이신, 제오신, 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 유전자(HSV-TK), 마우스로부터의 디히드로폴레이트 환원효소 유전자(dhfr)를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 인간 항체를 분리하기 위해 사용될 수 있는 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 상기 기재된 바와 같은 인간 항체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 벡터도 또한 본 발명에 포함된다. 이들 단백질 또는 펩티드는 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 말토스 결합 단백질, 금속-결합 폴리히스티딘, 녹색 형광 단백질, 루시퍼라제 및 베타-갈락토시다제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 언급된 벡터의 하나 이상의 카피를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 포유류, 식물, 곤충, 진균 또는 박테리아 기원의 세포를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 박테리아 세포는 그람(Gram)-양성 박테리아 또는 그람-음성 박테리아, 예를 들어, 에스케리키아(Escherichia) 속의 몇몇 종, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이(E. coli) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 유래의 세포를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 진균 세포 군에서, 바람직하게는 효모 세포가 사용된다. 효모에서의 발현은 효모 균주, 예를 들어, 특히, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)를 사용해 달성될 수 있다. 또한, 곤충 세포, 예를 들어, 드로소필라(Drosophila) 및 Sf9 유래의 세포가 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 그 외에, 숙주 세포는 식물 세포, 예를 들어, 특히 농식물, 예를 들어, 삼림 식물 유래의 세포, 또는 식품 및 원료를 제공하는 식물, 예를 들어, 곡물 식물, 약용 식물 유래의 세포, 또는 관상식물 유래의 세포, 또는 꽃 뿌리 작물 유래의 세포일 수 있다. 형질전환된(트랜스제닉) 식물 또는 식물 세포는 알려진 방법, 예를 들어 아그로박테리움-매개의 유전자 전달, 잎 디스크(disc)의 형질전환, 폴리에틸렌 글리콜-유도 DNA 전달에 의한 원형질체 형질전환, 전기천공법, 초음파분해, 미세주입 또는 볼리스틱(bolistic) 유전자 잔딜에 의해 생성된다. 또한, 적당한 발현 시스템은 배큘로바이러스 시스템일 수 있다. 포유류 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, BHK 세포, NSO 세포 또는 Bowes 흑색종 세포를 이용한 발현 시스템이 본 발명에서 바람직하다. 포유류 세포는 포유류 기원의 천연 분자와 가장 유사한 번역후 변형을 갖는 발현된 단백질을 제공한다. 본 발명이 인간에게 투여되어야 하는 분자를 다루기 때문에 완전한 인간 발현 시스템이 특히 바람직할 것이다. 그러므로 더더욱 바람직하게는 숙주 세포는 인간 세포이다. 인간 세포의 예는 특히, HeLa, 911, AT1080, A549, 293 및 HEK293 세포이다. 바람직한 실시형태에 있어서 인간 생성자 세포는 발현가능한 형식의, 적어도 아데노바이러스 E1 영역을 인코딩하는 핵산 서열의 기능성 부분을 포함한다. 더더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 숙주 세포, 예를 들어, 911 세포 또는 1996년 2월 29일에, 유럽 세포 배양 은행(European Collection of Cell Cultrues, ECACC)(CAMR, Salibury, Wiltshire SP4 OJG, Great Britain)에, 번호 96022940 하에 수탁되고 상품명 PER.C6®(PER.C6은 크루셀 홀란드 비.브이.(Crucell Holland B.V.)의 등록된 상표) 하에서 시판되는 세포주는 인간 망막으로부터 유래되고, 아데노바이러스 E1 서열을 포함하는 핵산으로 불멸화된다. 본 출원의 목적을 위해, "PER.C6 세포"는 번호 96022940 하에 수탁된 세포 또는 조상, 계대(passage) 상류 또는 하류뿐만 아니라 수탁된 세포의 조상으로부터의 후손 및 전술된 것 중 임의의 것의 유도체를 말한다. 숙주 세포에서의 재조합 단백질의 생성은 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다. 관심 단백질을 위한 생성 플랫폼으로서 상품명 PER.C6® 하에 시판되는 세포의 이용은 개시내용의 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO 00/63403호에 기술되어 있다.
본 발명의 항체는 다양한 수단에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 생성 방법은 본 발명의 추가의 부분이다. 상기 방법은 a) 본 발명에 따른 숙주 세포를 항체의 발현에 도움이 되는 조건하에 배양하는 단계 및 b) 임의로, 발현된 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 발현된 항체는 무세포 추출물로부터 회수될 수 있지만, 바람직하게는, 그들은 배양 배지로부터 회수된다. 또한, 상기 생성 방법을 사용하여, 본 발명의 항체 및/또는 면역컨쥬게이트의 기능성 변이체를 제조할 수 있다. 무세포 추출물 또는 배양 배지로부터 단백질, 예를 들어, 항체를 회수하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다.
대안적으로, 숙주, 예를 들어, 숙주 세포에서의 발현 다음에, 본 발명의 항체 및 면역컨쥬게이트는 통상의 펩티드 합성기에 의해 합성으로, 또는 본 발명에 따른 DNA 분자로부터 유래된 RNA 핵산을 사용하여 무세포 번역 시스템에서 생성될 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 또한, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 트랜스제닉 비-인간 포유류, 예를 들어, 트랜스제닉 마우스 또는 토끼에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게는, 트랜스제닉 비-인간 포유류는 상기 기술된 바와 같은 인간 항체의 전부 또는 일부를 인코딩하는 인간 중쇄 트랜스진(transgene) 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는다. 트랜스제닉 비-인간 포유류는 RSV 또는 그의 단편의 정제된 또는 농축된 제제로 면역화될 수 있다. 비-인간 포유류를 면역화시키기 위한 프로토콜은 당업계에 널리 확립되어 있다. 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Using Antibodies: A Laboratory Manual, Edited by: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York] 및 문헌[Current Protocols in Immunology, Edited by: J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., New York]을 참조한다. 면역화 프로토콜은 프로인트 완전 애쥬번트(adjuvant) 및 프로인트 불완전 애쥬번트와 같은 애쥬번트를 사용하거나 그것을 사용하지 않는 다수의 면역화를 종종 포함하지만, 또한 네이키드(naked) DNA 면역화를 포함할 수도 있다. 다른 실시형태에 있어서, 인간 항체는 트랜스제닉 동물로부터 유도되는 B-세포, 형질 및/또는 메모리 세포에 의해 생성된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 인간 항체는 하이브리도마에 의해 생성되며, 하이브리도마는 상기-기재된 트랜스제닉 비-인간 포유류로부터 수득되는 B-세포를 불멸화 세포로 융합시킴으로써 제조된다. 상기 기재된 트랜스제닉 비-인간 포유류로부터 수득가능한 B-세포, 형질 세포 및 하이브리도마, 및 상기 기재된 트랜스제닉 비-인간 포유류, B-세포, 형질 및/또는 메모리 세포 및 하이브리도마로부터 수득가능한 인간 항체도 또한 본 발명의 일부이다.
본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 항체, 항원-결합 단편, 면역컨쥬게이트, 기능성 변이체 및/또는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 키트를 추가로 제공한다. 임의로, 본 발명의 키트의 상기 기술된 구성성분은 적당한 용기에 포장되고, 지정된 질환의 진단, 예방 및/또는 치료용으로 표지된다. 상기 언급된 구성성분은 수성, 바람직하게는, 멸균, 용액으로서, 또는 재구성을 위한 동결건조, 바람직하게는 멸균 제형으로서 단위 또는 다중-용량 용기에 보관될 수 있다. 키트는 약제학적으로 허용되는 완충제를 포함하는 더 많은 용기를 추가로 포함할 수 있다. 그것은 적당한 숙주 중 하나 이상을 위한 다른 완충제, 희석제, 충전제, 주사바늘, 주사기, 배양 배지, 및 아마도 심지어는 적어도 하나의 다른 치료, 예방 또는 진단제를 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 키트와 관련하여, 그러한 치료, 예방 또는 진단 제품의 이용에 관한 예를 들어, 표시, 용도, 용량, 제조, 투여, 사용금지 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 치료, 예방 또는 진단 제품의 상업적 패키지에 지침이 관례적으로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 또한, RSV의 검출을 위한 시험관내 방법에서 진단제로서 유리하게 사용될 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 시료 중 RSV의 검출 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 (a) 예를 들어, 시료를 본 발명에 따른 진단적 유효량의 항체(또는 그의 단편) 또는 면역컨쥬게이트와 접촉시킴으로써 시료 중 RSV 항원의 수준을 분석하는 단계, 및 (b) 분석된 RSV 항원의 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계로서, 대조군 수준에 비한 분석된 RSV 항원의 수준의 증가가 RSV 감염을 나타내는 단계를 포함한다. 시료는 (잠재적으로) 감염된 대상체로부터의 혈액, 혈청, 대변, 가래, 비인두 흡인물, 기관지 세척액, 소변, 조직 또는 다른 생물학적 물질을 포함하나 이들에 한정되지 않는 생물학적 시료, 또는 비-생물학적 시료, 예를 들어, 물, 음료 등일 수 있다. 시료를 먼저 조작하여, 그것을 검출 방법에 더욱 적당하게 만들 수 있다. 조작은 특히, 바이러스가 항원 성분, 예를 들어, 단백질, (폴리)펩티드 또는 다른 항원 단편으로 분해될 방식으로 바이러스를 함유하고/거나 함유하는 것으로 의심되는 시료를 처리하는 것을 의미한다. 바람직하게는 본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트는 항체와, 시료에 존재할 수 있는 바이러스 또는 그의 항원 성분 간에 면역 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건하에서 시료와 접촉된다. 존재한다면, 시료에서 바이러스의 존재를 나타내는 면역 복합체의 형성은 이후에 적당한 방식에 의해 검출되고 측정된다. 그러한 방법은 특히, 동종 및 이종 결합 면역분석법, 예를 들어, 방사성-면역분석법(RIA), ELISA, 면역형광법, 면역조직화학, FACS, BIACORE 및 웨스턴 블롯 분석을 포함한다. 특히 환자 혈청 및 혈액 및 혈액-유래 산물의 대규모 임상 스크리닝에 바람직한 분석 기술은 ELISA 및 웨스턴 블롯 기술이다. ELISA 시험이 특히 바람직하다.
본 발명은 본 발명을 제한하고자 하지 않는 하기의 실시예에서 더욱 예시되어 있다.
실시예
실시예 1
항원 생성 및 표지화
바이러스 막의 표면에서 발현되는 융합 단백질(RSV F)과 달리, 부착 단백질(RSV G)은 매우 가변적이어서, RSV의 2개의 넓은 하위유형이 나타난다(즉, 하위유형 A 및 B). RSV G는 서열 가변성에도 불구하고, 중심 및 고도 보존 영역을 함유한다. 광범위 중화 모노클로널 항체를 수득하기 위한 노력으로, 대표적인 하위군 A(RSV A/Long) 및 하위군 B 균주(RSV B/B1)에 해당하는 RSV G를 293 프리스타일(freestyle) 세포에서 재조합에 의해 발현시키고, 정제하고, 단일 세포 분류 실험에서 이용하기 위해 표지화하였다.
RSV Ga 및 Gb의 발현
본원에 RSV Ga 및 Gb로 지칭되는 RSV A/Long(수탁 번호 P20895) 및 RSV B/B1(수탁 번호 NP_056862)에 상응하는 재조합 RSV 부착 단백질(G 단백질)을 Myc(EQKLISEEDL) 및 6× 히스티딘 태그 둘 모두가 있는 CMV-기반의 프로모터 포유류 발현 벡터(인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.), pcDNA3.1)로부터 발현시켰다(표 1). 인간 V 카파 I 신호 펩티드에 해당하는 리더 서열을 아미노 말단에 도입하여, 분비를 촉진시켰다. 막횡단 도메인이 결여되고, 각각 RSV Ga 및 Gb의 아미노산 65 내지 288 및 65 내지 299가 포함되는 RSV Ga 및 Gb 둘 모두를 발현시켰다.
RSV Ga 및 Gb를 제조처 지침에 따라 트랜스펙션시켰다. 재조합에 의해 발현되는 RSV Ga 및 Gb 단백질을 니켈 NTA 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 트랜스펙션 72시간 후에, 상청액을 수집하고, 20 mM Tris-HCl pH8 및 300 mM NaCl에 대하여 하룻밤 투석하였다. 다음날, 신선한 완충제로 추가 6시간 동안 투석을 반복하였다. 그 다음, 투석된 상청액에 5% 글리세롤 및 10 mM 이미다졸(VWR, 카탈로그 번호 EM-5720)을 보충하고, 2 ㎖의 Ni-NTA 아가로스 비드(퀴아젠(Qiagen), 카탈로그 번호 30310)가 팩킹된 컬럼에 로딩하였다. 결합된 단백질을 이후에 20 mM Tris-HCl, pH8, 300 mM NaCl, 5% 글리세롤 및 20 mM 이미다졸로 이루어진 세척 완충제 2 컬럼 부피로 세척하였다. 그 다음, 단백질을 20 mM Tris-HCl, pH8, 300 mM NaCl, 5% 글리세롤 및 50 mM 이미다졸을 함유하는 용리 완충제 5 ㎖로 용리시켰다. 마지막으로, 용리액을 4℃에서 하룻밤 4 ℓ의 인산염 완충 염수(PBS)에 대하여 투석하였다. 그 다음, 투석된 단백질을 30K MWCO 농축기(밀리포어(Millipore), 아미콘 울트라셀(Amicon Ultracel) 농축기)에서 0.5 내지 1.0 ㎖로 농축시키고, 제조처 지침에 따라 비신콘닌산 분선법(BCA 분석법; 써모 피셔(Thermo Fisher))에 의해 정량화하였다. 또한, 정제된 단백질을 각각 SDS-PAGE/쿠마시(Coomassie)에 의해 품질 조절하였다.
RSV Ga를 제조처의 지침에 따라 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647 미소규모 단백질 표지화 키트(인비트로겐 카탈로그 번호 A30009)를 사용하여 알렉사 플루오르 647(AF 647)로 형광 표지하였다. 정제 후에, 표지화 정도는 나노드롭(NanoDrop) UV 분광광도계(제조처)를 사용하여 단백질 몰당 1.2 몰의 AF 647인 것으로 결정되었다. 유사하게, RSV Gb 단백질을 제조처의 지침에 따라 미소규모 단백질 표지화 키트(인비트로겐 카탈로그 번호 A30006)를 사용하여 알렉사 플루오르 488(AF 488)로 표지화시키고, 최종 정제 후에, 표지화 정도는 나노드롭 분광광도계를 사용하여 단백질 몰당 약 2 몰의 AF 488인 것으로 결정되었다.
[표 1]
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실시예 2
항- RSV G-특이적 항체의 확인
RSV G 단백질에 대한 광범위 중화 모노클로널 항체를 샌 디에고 혈액 은행을 통해 수득된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 분리된 메모리 B-세포(CD19+CD27+IgG+)로부터 회수하였다. 약술하면, CD22+ 풍부 B-세포를 메모리 B 세포 표면 마커에 대한 형광 표지된 항체로 염색하고, RSV Ga, Gb(각각 알렉사 플루오르 647 및 488로 표지, 실시예 1에 기술된 바와 같음), 또는 RSV G 중심 보존 도메인(CCD) 비오틴-컨쥬게이트된 펩티드(SYM-1706)와 인큐베이션시켰다.
CD19/CD27/IgG/RSVGa/RSVGb 또는 CD19/CD27/IgG/SYM-1706(특정 분류 실험에 사용). 양성 세포를 분류하고, 단일 세포를 FACSAria II(비디 바이오사이언스즈(BD Biosciences)) 또는 MoFlo XDP(베크만 쿨터(Beckman Coulter))를 사용하여 96-웰 플레이트의 개별 웰에 배치하였다. 플레이트를 처리될 때까지 -80℃에 보관하였다. 평균하여, 공여자마다 대략 10 내지 25×106개 B-세포를 조사하였다.
실시예 3
RSV Ga 및 Gb에 특이적인 단일 B-세포로부터의 중쇄 및 경쇄 유전자의 회수
실시예 2에 기술된 바와 같이, RSV에 대한 광범위 중화 모노클로널 항체를 RSV Ga 및 Gb 단백질 또는 RSV G 중심 보존 도메인(CCD) 비오틴-컨쥬게이트된 펩티드(SYM-1706)에 대하여 반응성이 있는 메모리 B-세포(CD19+CD27+IgG+)로부터 분리하였다. 그 다음, 중쇄 및 경쇄 유전자를 2-단계 PCR 방법에 의해 개별 B-세포로부터 회수하고, 클로닝하고, Fab 항체로서 시험관내에서 발현시켰다.
제1 가닥 cDNA 합성
상보적 DNA(cDNA)를 인비트로겐의 슈퍼스크립트(Superscript) III 제1 가닥 합성 키트(슈퍼스크립트 III 키트, 카탈로그 번호 18080-051)를 사용하여 개별적으로 분류된 세포로부터 생성하였다.
네스티드 (nested) PCR에 의한 IgG 중쇄 및 경쇄 증폭
IgG 중쇄 및 경쇄 가변 영역(카파 및 람다 사슬 둘 모두)을 2-단계 네스티드 PCR 방법을 사용하여 신선하게 제조된 cDNA로부터 증폭시켰다. 이후에, 중쇄 및 경쇄 PCR 단편을 단일의 카세트로 조립하여, 중첩 연장 PCR을 사용하여 다운스트림 클로닝을 용이하게 하였다.
단계 I 증폭
단계 I을 위하여, 상기 언급된 바와 같이 생성된, 2.5 ㎕의 신선하게 제조된 cDNA를 주형으로 사용하여, 중쇄, 카파 및 람다 경쇄를 증폭시켰다. 항체 중쇄(CB-5'LVH 프라이머), 카파 경쇄(CB-5'LVk 프라이머) 및 람다 경쇄(CB-5'LVlam 프라이머)의 리더 서열에 대하여 특이적으로 설계된 프라이머의 풀을 사용하였다(표 2-4). 각각 중쇄, 카파 경쇄 및 람다 경쇄의 CH1 영역, Ck 및 CL 영역에 대하여 특이적으로 설계된 단일의 역방향 프라이머를 단계 I PCR 반응에서 사용하였다.
[표 2]
Figure pct00002
[표 3]
Figure pct00003
[표 4]
Figure pct00004
단계 II 증폭
1) 단계 II를 위하여, 상기 반응으로부터 생성된 2.5 ㎕의 단계 I PCR 생성물을 중쇄, 카파 및 람다 경쇄 유전자를 증폭시키기 위한 주형으로 사용하였다. 항체 중쇄, 카파 경쇄 및 람다 경쇄의 프레임워크 1 영역에 대하여 특이적으로 설계된 정방향 프라이머의 풀을 사용하였다(표 5 내지 7). 중쇄 연결부(3'SalIJH 프라이머), 카파 경쇄 연결부(3'Jk 프라이머)에 대하여 특이적으로 설계된 역방향 프라이머의 풀 및 람다 경쇄에 상응하는 5' 영역-특이적 프라이머(CB-VL 프라이머)를 사용하였다. 또한, 단계 II 정방향 프라이머를 SfiI 제한 부위를 도입하도록 설계하는 한편, 단계 II 중쇄 역방향 프라이머를 SalI 제한 부위를 도입하도록 설계하였다.
[표 5]
Figure pct00005
Figure pct00006
[표 6]
Figure pct00007
[표 7]
Figure pct00008
단계 III 증폭: 중첩 연장 PCR
단계 III을 위하여, 중쇄 및 경쇄 DNA 단편(단계 II 생성물)을 다음을 사용하여 중첩 연장 PCR을 통해 단일의 카세트에 연결시켰다: 1) 경쇄 단계 II 단편의 3' 말단 및 중쇄 단계 II 단편의 5' 말단에 어닐링되며, 카파 또는 람다 불변 영역 중 어느 하나를 함유하는 하기 약술된 바와 같이 증폭되는 Fab 링커(카파 또는 람다; 표 8), 2) 경쇄의 5' 말단에 어닐링되는 SfiI 제한 부위가 있는 정방향 중첩 프라이머, 및 3) 중쇄 단계 II 단편의 3' 말단에 어닐링되는 SalI 제한 부위가 있는 역방향 프라이머(표 9). 이러한 반응으로, 경쇄-링커-중쇄로 이루어진 1200 bp 단편(즉, 카세트)을 야기하였다. 증폭 후에, PCR 링커 반응 생성물 또는 중첩 연장 PCR 반응 생성물을 1% 아가로스 겔에서 분리하고, 제조처의 지침에 따라 겔 추출하였다(퀴아젠 겔 익스트랙션 키트(Qiagen Gel Extraction Kit); 카탈로그 번호 28706).
[표 8]
Figure pct00009
[표 9]
분해 및 박테리아 발현 벡터로의 클로닝
중첩 연장 PCR의 PCR 정제(퀴아젠) 후에, 단편을 분해한 다음, 분해된 중첩 생성물을 1% 아가로스 겔에서 분리하였다. 중첩 카세트에 해당하는 밴드(약 1.1 kb)를 겔 추출(퀴아젠)에 의해 정제하였다. 마지막으로, 분해된 중첩 연장 생성물을 라이게이션시키고, pCB-Fab 박테리아 발현 벡터로 클로닝하였다. 모든 형질전환을 DH5a 맥스 에피션시(Max Efficiency) 세포(인비트로겐 코포레이션, 카탈로그 번호 18258-012)에서 수행하였다. 대략 100 ㎕의 회수된 세포를 20 mM 글루코스가 보충된 100 ㎍/㎖의 카르베니실린 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 하룻밤 인큐베이션시켜, 콜로니 성장을 가능하게 하였다.
실시예 4
RSV G로의 Fab 결합 및 모노클로널 항체 구제
실시예 3에서 클로닝된 Fab 항체를 박테리아에서 발현시키고, RSV Ga, RSV Gb 또는 RSV G 중심 보존 도메인(CCD) 펩티드(SYM-1706: 아미노산 서열: 비오틴-KQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKR; SEQ ID NO: 125)에 결합하는 그들의 능력에 대하여 다시 시험하였다.
박테리아 상청액을 RSV Ga, Gb, CCD 펩티드, 음성 대조군 액틴 및 항-인간 F(ab)2 코팅 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다(스트렙트아비딘 코팅된 플레이트에서 인큐베이션시키고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 CCD 펩티드는 제외). CR9514(3D3을 기반으로 한, 즉, WO 2009/055711호에 개시된 바와 같이 3D3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체)를 0.4% NFDM/PBS/0.05% Tween20 중 0.1 ㎍/㎖의 희석으로, RSV Ga, Gb, CCD 펩티드 및 항-인간 F(ab)2 코팅된 플레이트에 대하여 양성 대조군으로 사용하였다. 마우스 항-액틴(시그마, 카탈로그 번호 A3853)을 소 액틴 코팅된 플레이트에 대하여 양성 대조군으로서 1.25 ㎍/㎖로 사용하였다. 항-HA HRP(로슈(Roche), 카탈로그 번호 12013819001)를 박테리아 상청액에 대한 2차 항체로 사용하였다. 항-인간 Fab(잭슨 랩스(Jackson Labs), 카탈로그 번호 109-036-097)를 CR9514(3D3의 가변 영역 포함) 대조군 웰을 위해 사용하였다. 마지막으로, 염소 항-마우스 HRP(잭슨 랩스, 카탈로그 번호 115-035-072)를 액틴 양성 대조군으로 사용하였다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS/0.05% Tween20에서 4회 세척하고, 50 ㎕ 1:1 v/v TMB:퍼옥시드 용액(피어스, 카탈로그 번호 34021)으로 대략 5분 동안 발색시켰다. 50 ㎕ 2N H2SO4의 첨가에 의해 반응을 즉시 정지시키고, 450 nm에서 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 양성 결합이 0.5 초과의 OD450에 의해 나타났으며(0.5 내지 0.9는 중등의 결합이며, 1 초과는 강력한 결합임), 반응은 백그라운드보다 3배 더 높았다.
ELISA 결과에 기초하여, 항원을 표적으로 하는 반응성을 갖는, 평균하여 약 6개의 클론을 선택하였다. 각각의 Fab 항체가 원래 프레임워크 1-특이적 및 연결부-특이적 프라이머의 풀을 사용하여 클로닝되었기 때문에, 교차-프라이밍, 특히 고도로 관련된 프라이머의 가능성이 높았다. 이러한 이유로, 서열에 대하여 각각의 중첩된 생성물을 나타내는 몇몇 박테리아 클론을 선택하였다. 플라스미드 미니프렙(miniprep) DNA를 제조처의 지침(퀴아젠 미니프렙 키트 카탈로그 번호 27106)에 따라 제조하였다. 선택된 각각의 클론에 상응하는 중쇄 및 경쇄를 표 10에 표시된 프라이머를 사용하여 시퀀싱하였다. 서열을 분석하고, 가장 근접한 생식계열을 확인하고, CDR 및 프레임워크 영역을 결정하였다. 이후에, 이러한 정보를 사용하여, 프라이머를 설계하여, 후보 항체를 클로닝하고 IgG로 전환시켰다.
[표 10]
Figure pct00011
실시예 5
IgG의 클로닝 , 시퀀싱 및 정제
실시예 4에 약술된 박테리아 ELISA에서 확인된 RSV Ga, Gb 및 CCD 펩티드에 대해 반응성인 Fab 항체를 클로닝하고, 인간 배아 신장 세포(293-F 세포)에서 IgG로 발현시켰다. 이후에, IgG를 정제하고, 농도 결정, SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 품질-조절하였다.
A. IgG 클로닝 및 시퀀싱 정보
박테리아 ELISA(실시예 4에서 약술)에서 확인된 Fab 항체를 이후에 제한 분해에 의하여, 가변 중쇄 및 경쇄 도메인(카파 및 람다)을 pCP9-카파(SEQ ID NO: 127) 및 pCP9-람다(SEQ ID NO: 128) 발현 벡터로 클로닝함으로써 IgG로 전환시켰다. 교차-프라이밍(실시예 4에서 상기 언급됨) 가능성을 고려해 볼 때, IgG로의 전환을 위해 선택된 각 박테리아 클론에 대한 FR1의 초기 아미노산 및 연결부 영역의 마지막 아미노산은 그의 상응하는 생식계열 서열의 것과 종종 상이하였다. 이러한 이유로, 각 항체에 대하여 특이적인 프라이머를 설계하여, 선택된 각 박테리아 클론의 중쇄 및 경쇄 유전자 둘 모두에 대한 FR1 및 연결부 영역을 복구하였다. 중쇄 및 경쇄를 상응하는 박테리아 클론을 사용하여 증폭시키고(실시예 4에서 pCB-Fab 벡터로부터 발현), 순차적 방식으로 pCP9 발현 벡터로 클로닝하였다.
중쇄의 증폭으로, 370 bp의 평균 크기의 단편을 야기하고, 이를 1% 아가로스 겔에서 분리하고, 제조처의 지침(퀴아젠)에 따라 겔 추출하였다. 그 다음, 중쇄 단편을 사용하여 중첩 연장 PCR에 의해 HAVT20 리더 서열(5'-ATGGCCTGCCCTGGCTTTCTCTGGGCACTTGTGATCTCCACCTGTCTTGAATTTTCCATGGCT-3'; MACPGFLWALVISTCLEFSMA)을 부착시켰다.
이후에, 상응하는 중첩 HAVT20-중쇄 생성물을 제조처의 지침(퀴아젠)에 따라 PCR 정제하였다. 라이게이션을 순차적으로 수행하였으며; 즉, 어느 하나의 경쇄를 먼저 분해하고, 라이게이션시키거나, 상응하는 중쇄를 분해하고 삽입하였다. 일단 경쇄 또는 중쇄 삽입물을 시퀀싱 확인하면, 대표적인 박테리아 클론을 선택하고, 미니프렙을 준비하고, 이를 사용하여 제2 쇄를 클로닝하였다(즉, 무엇이 먼저 클로닝되는지에 따라 경쇄 또는 중쇄). 중쇄 단편을 클로닝하기 위하여, pCP9 벡터 및 PCR 정제된 중쇄 중첩 생성물을 제한 효소 BamHI HF(NEB, 카탈로그 번호 R3136L) 및 XhoI(NEB, 카탈로그 번호 R0146L)으로 분해하였다. 그 다음, 분해된 pCP9 벡터 및 중쇄 중첩 생성물을 1% 아가로스 겔에서 분리하고, 겔 추출하였다(pCP9 벡터에 대하여 약 9.5 kB 초과). 라이게이션을 1:3 벡터-대-삽입물 비로 수행하고, DH5a 맥스 에피션시 세포(인비트로겐 코포레이션, 카탈로그 번호 18258-012)로 형질전환시켰다. 서열 확인 시에, 제2 쇄(예를 들어, 경쇄)를 클로닝하였다. 경쇄 단편의 클로닝을 위하여, 상응하는 중쇄 및 경쇄 PCR 생성물을 함유하는 pCP9 클론을 NotI HF(NEB, 카탈로그 번호 R3189L) 및 XbaI(NEB, 카탈로그 번호 R0145L)로 분해하였다. 그 다음, 경쇄를 상응하는 중쇄 유전자를 함유하는 pCP9 벡터로 라이게이션시키고, DH5a 맥스 에피션시 세포로 형질전환시켰다. 몇몇 콜로니를 시퀀싱을 위해 선택하고, 분석하였다. 표 11 및 표 12는 항체 중쇄 및 경쇄 CDR 영역의 서열을 보여준다.
[표 11]
Figure pct00012
[표 12]
Figure pct00013
B. IgG 발현 및 정제
각각의 IgG를 발현하기 위하여, 대상의 중쇄 및 경쇄 유전자를 함유하는 pCP9 벡터의 미디-프렙(midi-preps)을 준비하고(퀴아젠), 제조처의 지침(인비트로겐, 카탈로그 번호 51-0031)에 따라 293fectin을 사용하여 293-F 세포를 트랜스펙션시키는데 사용하였다. 트랜스펙션 후에, 세포를 72시간 동안 인큐베이션시켜, 충분한 IgG 생성을 가능하게 하였다. 그 다음, 세포 배지를 수집하고, 원심분리하여, 세포를 제거하였다. 정제를 단백질 A 컬럼(단백질 A 세파로스 비드; 아머샴(Amersham), 카탈로그 번호 17-0963-03)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 야기하였다. 그 다음, 용리액을 4 ℓ의 20 mM Tris-HCl pH7.2, 150 mM NaCl에 대하여 2회 투석하였다. 마지막으로, 투석된 시료를 10 kDa 아미콘 울트라 컬럼(Amicon Ultra column)(밀리포어)을 사용하여 약 1 ㎖로 농축시켰다.
일련의 품질 조절 단계를 각 IgG에 대하여 시행하여, 농도 및 순도를 결정하고, 크기를 평가하였다. IgG 농도를 먼저 210,000 M-1 ㎝-1의 IgG에 대한 몰 흡광 계수를 사용하여 나노드롭 판독을 통해 결정하였다. 또한, IgG 농도를 공급처의 지침에 따라 BCA 분석법(써모 피셔)에 의해, 그리고 Octet Red384(포르테바이오(ForteBio))에서의 단백질 A 센서 팁을 사용한 측정에 의해 확인하였다. 추가의 품질 조절 단계로서, SDS-PAGE를 비-환원 및 환원 조건(즉, ±DTT)하에 수행한 후에 바이오-세이프(Bio-Safe) 쿠마시 염색(바이오라드(Biorad))으로, 무손상 IgG 또는 환원된 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 가시화시켰다. 마지막으로, IgG를 크기 배제 크로마토그래피 슈퍼덱스 200 10/300 GL 겔 여과 컬럼(파마시아)에 의해 품질 조절하였다.
실시예 6
IgG 결합 분석법
상기 실시예 5에 기술된 바와 같이 생성되고 품질 조절된 IgG, 및 항-RSV G 항체 CR9514(3D3의 가변 영역 포함)를 재조합 RSV Ga 및 Gb 단백질에 결합하는 그들의 능력에 대하여 ELISA 분석법에서 시험하였다. 약술하면, 96 하프-웰(half-well) ELISA 플레이트(코스타(Costar))를 1× PBS 중 50 ㎕의 항원으로 하룻밤 코팅하였다[RSV Ga: 0.5 ㎍/㎖; RSV Gb: 0.5 ㎍/㎖; 소 액틴: 1 ㎍/㎖(시그마(Sigma)); 아피니퓨어(affinipure) 염소 항-인간 F(ab)2: 2 ㎍/㎖(잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch))]. 플레이트를 4℃에서 하룻밤 인큐베이션시키고, 다음날에 PBS 중 4% 무-지방 건조유(NFDM, 바이오라드) 135 ㎕로 블로킹하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, mAb를 100 ng/㎖에서 시작하여, 0.4% NFDM/PBS/0.05% Tween20 중에 희석하고, 5배 희석으로 적정하고, 37℃에서 2시간 동안 플레이트에 첨가하였다. CR9514(3D3) mAb를 RSV Ga 및 Gb에 대한 양성 대조군으로 사용하고, 유사한 방식으로 적정하였다. 또한, 마우스 항-액틴(시그마, 카탈로그 번호 A3853)을 소 액틴 코팅된 플레이트에 대한 양성 대조군으로서 1.25 ㎍/㎖로 사용하였다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS/0.05% Tween20으로 4회 세척하였다. 2차 항체를 각각 0.4% NFDM/PBS/0.05% Tween20 중 1:1000으로 첨가하고, 37℃에서 40분 동안 인큐베이션시켰다. 항-Fc HRP(잭슨 랩스, 카탈로그 번호 109-035-008)를 mAb에 대한 이차 항체로 사용하였다. 마지막으로, 염소 항-마우스 HRP(잭슨 랩스, 카탈로그 번호 115-035-072)를 액틴 양성 대조군을 위해 사용하였다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS/0.05% Tween20으로 4회 세척하고, 대략 5분 동안 50 ㎕ 1:1 v/v TMB:퍼옥시드 용액(피어스, 카탈로그 번호 34021)으로 발색시켰다. 50 ㎕ 2N H2SO4의 첨가에 의해, 반응을 즉시 중단하고, 450 nm에서의 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 본 발명에 따른 항체에 대한 결합(각 IgG를 적정함으로써 결정)에 대하여 추산된 EC50 값은 RSV 균주 A/Long에 대하여 1.0 내지 2.0 ng/㎖ 및 균주 B/B1에 대하여 0.5 내지 2.5 ng/㎖ 범위였다.
실시예 7
IgG 중화 분석법
항-RSV 항체를 플라크 감소 분석법에 의해 결정시, 용액 중 RSV에 결합하고 그를 중화시키는 그들의 능력에 대하여 분석하였다. 이러한 실험에서, 바이러스 및 항체를 표적 세포의 부재 하에 사전-인큐베이션시켰다. 그 다음, 혼합물을 세포에 첨가하고, 바이러스 감염을 본원에 기술된 표준 플라크 감소 분석법에 의해 측정하였다. 항-RSV 항체를 RSV A/A2(ATCC 카탈로그 번호 VR-1540), RSV B/18537(ATCC 카탈로그 번호 VR-1580) 및 RSV A/Long(ATCC 카탈로그 번호 VR-26)를 포함하는 RSV의 몇몇 균주를 중화시키는 그들의 능력에 대하여 분석하였다. 항체 CR9514(3D3) 및 CR9505(131-2G를 기반으로 한, 즉, WO 2009/055711호에 개시된 바와 같은 131-2G의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체)를 참조물질로 사용하였다.
베로(Vero) 세포(ATCC, 카탈로그 번호: CCL-81; Manassas)를 숙주 세포 감염을 위해 사용하였다. 베로 세포를 1% L-글루타민(하이클론(HyClone), 카탈로그 번호: SH30034.01) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액(하이클론, 카탈로그 번호: SV30010)이 보충된 10% 우태아혈청(FBS)(하이클론, 카탈로그 번호: SH30070.03)이 있는 DMEM(하이클론, 카탈로그 번호: SH 30285.01)에서 성장시켰다. 베로 세포를 5% CO2가 있는 37℃ 인큐베이터에서 유지하고, 주마다 2회 계대하였다.
실험 제1일에, 베로 세포를 24-웰 세포 배양 플레이트에서 배양하였다. 세포를 제2일까지 세포 단층(80% 초과의 컨플루언스(confluence))의 형성을 가능하게 하는 밀도(웰마다 대략 9×104개 세포)로 플레이팅하였다. 제2일에, 각각의 항체를 10% 새끼 토끼 보체(AbD Serotec, 카탈로그 번호 C12CAX)를 함유하는 플레인(plain) 이글스(Eagle's) 최소 필수 배지(EMEM, ATCC, 카탈로그 번호: 30-2003)에서 단계 희석하였다. 시험한 최종 항체 농도는 10 ㎍/㎖, 1.3 ㎍/㎖, 156 ng/㎖, 19.5 ng/㎖, 2.4 ng/㎖ 및 0.3 ng/㎖(2.5 ㎍/㎖, 312.5 ng/㎖, 39.1 ng/㎖, 4.9 ng/㎖, 0.61 ng/㎖ 및 0.08 ng/㎖의 항체 농도를 사용한 CB010.7은 제외)였다. 또한, 바이러스를 플레인 EMEM에 2000 내지 3000 pfu/㎖(100 내지 150 pfu/50 ㎕)의 농도로 희석하고, 85 ㎕의 희석된 RSV를 각각의 희석된 항체 용액 85 ㎕에 첨가하고, 피펫팅에 의해 혼합하였다. 바이러스 대조군 시료에 대하여, 85㎕의 희석된 바이러스를 85 ㎕의 플레인 EMEM에 첨가하였다. 항체-바이러스 또는 바이러스 대조군 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 배양 배지를 베로 숙주 세포를 함유하는 24-웰 세포 배양 플레이트로부터 경사 분리한 다음, 150 ㎕의 사전-인큐베이션된 바이러스-항체 또는 바이러스-대조군 혼합물을 각 웰로 옮겼다. 각각의 시험 및 대조군 시료를 3벌로 제조하였다. 그 다음, 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키면서, 15분마다 혼합하였다.
인큐베이션 기간 후에, 1 ㎖의 오버레이 배지를 각 웰에 첨가하였다(오버레이 배지는 EMEM, 2% FBS, 1% L-글루타민, 0.75% 메틸셀룰로스를 함유함). 그 다음, 24-웰 세포 배양 플레이트를 대략 96 내지 120시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다(5% CO2와 함께). 세포 플레이트를 10% 포르말린으로 실온에서 1시간 동안 고정시키고, ddH20로 10회 세척하고, 37℃에서 1시간 동안 PBS 중 5% 무지방 건조유(NFDM)로 블로킹하였다. 인큐베이션 후에, 블로킹 용액을 경사분리하고, 200 ㎕의 HRP-컨쥬게이트된 마우스 항-RSV 항체(ab20686, 아브캄(Abcam), 1% NFDM 중에 1:750 희석)를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키고, ddH20로 10회 세척하였다. 세척 후에, 200 ㎕의 트루블루(TrueBlue)® 퍼옥시다제 기질(KPL 카탈로그 번호 50-78-02)을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 발색시켰다. 플레이트를 ddH20로 2회 세척하고, 페이퍼 타올(paper towel)에서 건조시키고, 청색 플라크의 개수를 계수하였다.
IC50(플라크 형성의 50% 중화에 효율적인 희석)을 윈도우용 SPSS를 사용하여 계산하였다. 플라크 감소율을 하기의 식에 따라 계산하였다:
플라크 감소율(백분위수) = 1-[(각 항체 희석에서의 평균 플라크 개수)/(바이러스 대조군 웰에서의 평균 플라크 개수)]*100.
표 13은 RSV 균주 A/A2(ATCC 카탈로그 번호 VR-1540) 및 RSV B/18537(ATCC 카탈로그 번호 VR-1580)에 대한 항체의 패널에 대한 IC50을 열거한 것이다.
[표 13]
Figure pct00014
표 13은 RSV 균주 A/A2(ATCC 카탈로그 번호 VR-1540)에 대한 항체 및 항원-결합 단편의 IC50(플라크 형성의 50% 중화에 효과적인 희석)이 40 ng/㎖ 미만이었고/거나, RSV 균주 B/18537(ATCC 카탈로그 번호 VR-1589)에 대한 IC50이 30 ng/㎖ 미만이었음을 보여준다.
또한, RSV 균주 A/Long(ATCC 카탈로그 번호 VR-26)에 대한 항체 CB003.1, CB010.7 및 대조군 항체 CR9505(131-2G) 및 CR9514(3D3)에 대한 IC50은 각각 16, 12, 18 및 17 ng/㎖이었다.
실시예 8
코돈 최적화를 포함하는 완전 인간 면역글로불린 분자(인간 모노클로널 항체)의 작제 및 위험 회피(de-risking) 분석
상기 실시예 5에서 분리된 각각의 항체 클론에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 영역(VH 및 VL)을 유리 시스테인의 존재 및 글리코실화, 탈아미드화 및 산화 부위를 포함하는 잠재적인 번역후 변형 부위에 대하여 시험하였다. 이들 부위를 제거하기 위하여, 구조적 보존성 및/또는 생식계열-기반의 치환으로 이루어진 아미노산 돌연변이가 사용된다(표 14). 가변 영역 내의 비-보존적 시스테인을 세린으로 돌연변이시켰다. 글리코실화 부위에 대하여, 보존적 글루타민 대신 아스파라긴의 대체 또는 생식계열 돌연변이를 포함하는 몇몇 돌연변이가 사용될 수 있다. 탈아미드화 부위에 대한 변형은 아스파라긴 대신 아스파르트산의 대체 및 글리신 대신 세린 또는 알라닌의 대체를 포함한다. 잠재적인 산화 부위는 변형되지 않는다. 그 다음, 항체 클론의 각각의 VH 및 VL로부터 수득된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 진아트(GeneArt)/인비트로겐에서 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화시켰다. 이들 기능성 변이체의 가변 영역을 이후에, IgG 발현 벡터 pCP9-카파(SEQ ID: 127 참조) 및 pCP9-감마(SEQ ID: 128 참조)에서의 발현을 위해, 제한 분해에 의해 직접 클로닝하였다. BamHI, XhoI 및/또는 SrfI을 사용하여 가변 중쇄를 클로닝하고, NotI 및 AscI을 사용하여, 가변 경쇄를 클로닝하였다. 모든 작제물에 대한 뉴클레오티드 서열을 당업자에게 알려져 있는 표준 기술에 따라 입증하였다.
[표 14]
Figure pct00015
실시예 9
ELISA 및 Octet에 의한 펩티드 결합 연구
상세한 에피토프 맵핑을 확인된 RSV G 단백질 특이적 mAb, 예를 들어, CB010.7 및 CB030.1에 대하여 수행하였다. 펩티드를 Fmoc 화학물질에 의해 합성하고, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제하였다. 펩티드-펩티드 상호작용 연구를 위하여, 일부 펩티드를 아미노헥산산(Ahx) 스페이서를 통해 N-말단 비오티닐화시켰다. 펩티드를 전기분무 질량 분석기에 의해 아이덴티티(identity)에 대하여 분석하였다. 시료를 C18 역상 컬럼과 함께 울트라-성능 액체 크로마토그래피(UPLC, Alliance, Waters, Milford, MA, USA)에 의해 분석하고, 포토다이오드 어레이 검출기 및 질량 민감성 검출기로 검출하였다. 용매 A(H2O + 0.05% 트리플루오로아세트산[TFA]) 및 용매 B(ACN + 0.05% TFA)와 함께 25 내지 100% 아세토니트릴(ACN)에 대하여 25%/분의 기울기를 사용하였다. 모든 시약은 적어도 HPLC 등급이었다.
mAb를 RSV-G 유형 A 및 유형 B의 중심 보존 영역을 함유하는 비오티닐화된 펩티드로의 결합에 대하여 시험하였다(표 15). 아비딘-코팅된 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 세척하고, 실온에서 1시간 동안 ELISA 완충제(PBS + 1% FBS + 0.05% Tween20) 중 100 ㎕ 비오티닐화된 펩티드(2.37 × 10-7 M)와 인큐베이션시켰다. 다음으로, 세척 후에, 웰마다 180 ㎕의 블로킹 완충제(PBS + 10% FBS)를 웰에 전달하고, 실온에서 1시간 인큐베이션시켰다. 이후에, 플레이트를 세척하고, 실온에서 1시간 동안 항-인간-HRP(잭슨 이뮤노리서치)와 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후에, 100 ㎕의 o-페닐렌디아민 서양고추냉이 퍼옥시다제 기질(써모 사이언티픽)을 각 웰에 첨가하였다. 100 ㎕ 1 M H2SO4를 사용하여 10분 후에 반응을 중단시켰다. 흡광을 490 nm에서 판독하였다.
[표 15]
Figure pct00016
상기 기술된 모든 mAb는 RSV Ga 및 Gb 단백질(실시예 6)에, 그리고, 중심 영역 유형 A 및 유형 B 펩티드(데이터 미도시)에 결합한다. 항체 CB003.1 및 CB010.7의 적정에 의해, 이들 mAb가 모든 4개의 펩티드에 대하여 약 20 ng/㎖의 IC50을 갖는 것으로 나타났다(도 3). 또한, RSV G 펩티드로의 mAb의 결합을 Octet Red384(포르테바이오)에서 스트렙트아비딘 센서 팁을 사용하여 결정하였다. 다시, mAb는 유형 A 및 유형 B 펩티드 둘 모두에 대하여 교차-반응성을 보였다(표 16). CB003.1은 유형 A 및 유형 B 펩티드 둘 모두에 대하여 가장 높은 반응을 보였다. CB010.7은 유형 A 펩티드에 비하여 유형 B에 대하여 약간 더 높은 결합을 보였다.
[표 16]
Figure pct00017
실시예 10
최소 에피토프의 맵핑 ( PepScan )
mAb에 의해 인식되는 최소 에피토프를 맵핑하기 위하여, PepScan 분석을 사용하여 RSV-G 유형 A 및 유형 B의 중심 영역(잔기 145 내지 201)에 상응하는 다중의 길이(5, 8, 10, 14, 18, 25 또는 32-mer)의 펩티드에 대하여 반응성을 시험하였다. 펩티드로의 항체의 결합을 PepScan-기반의 ELISA에서 평가하였다. 각각의 mAb를 적정하여, 최적의 결합이 달성되었고, 비특이적인 결합이 회피되었음을 보장하였다. 크레딧-카드(credit card)-형식 폴리프로필렌 플레이트의 각각은 5% 말 혈청(v/v), 5% OVA(w/v) 및 1%(v/v) Tween 80을 함유하는 PBS, 또는 4% 말 혈청(v/v) 및 1%(v/v) Tween 80을 함유하는 PBS의 대체 블로킹 완충제 중에 1 내지 10 ng/㎖의 mAb와 하룻밤 4℃에서 인큐베이션시킨 공유 결합 펩티드를 함유하였다. 세척 후에, 플레이트를 25℃에서 1시간 동안 HRP-결합 토끼 항-mAb(DakoCytomation)와 함께 인큐베이션시켰다. 추가의 세척 후에, 퍼옥시다제 활성을 ABTS 기질을 사용하여 평가하고, CCD(charge-coupled device) 카메라 및 이미지-처리 시스템을 사용하여 발색을 정량화하였다.
분석에 의해, 에피토프의 강력한 코어에 상응하는 항체에 결합하는 최소 펩티드, 및 또한, 결합에 기여하며, 완전한 에피토프를 함유하는 추가의 인접 잔기를 함유하는 가장 높은 결합을 갖는 펩티드가 나타났다. 펩티드에 대한 항체의 반응성은 표 17에 요약되어 있다(잔기는 대문자로 표기되어 있음). 모든 항체가 중심 보존 도메인에 결합하지만, 그들의 결합에 결정적인 잔기는 상이하다. 2개의 항체(CB003.1 및 CB010.7)에 있어서, 최소 에피토프는 N-말단 CCD 영역에 제한된다(3D3와 유사, WO2009/055711호에 개시).
실시예 11
완전 치환 분석( PepScan )
결합에 결정적인 측쇄를 확인하고, 알려져 있는 RSV 균주에 대한 인식 범위를 연구하기 위하여, 전용 세트의 펩티드를 합성하였다. 항체 CB003.1 및 CB010.7에 의해 인식되는 서열 FHFEVFNFVPCSIC(SEQ ID NO: 132)의 각 위치에 대한 280개의 단일 치환 변이체 펩티드의 전용 펩티드 어레이를 사용하는 완전 치환 분석을 수행하고, 이에 의해, 이들 항체로의 결합에 중요한 잔기가 드러났다(도 5). 이들 항체의 에피토프는 3D3 에피토프와 유사하지만 완전히 상이한 방식으로 인식된다. 이는 본 발명자들의 항체의 에피토프가 3D3과 비교하여 완전히 상이한 필수 잔기를 갖는 것을 보여주는 치환 분석에 의해 반영된다. 따라서, 인식 및 결합 방식은 매우 상이하다. 실시예 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체는 3D3보다 더 큰 중화 능력을 갖는다.
Figure pct00018
또한, 결합에 결정적인 보존된 잔기는 표 17에 요약되어 있다(중요 잔기는 볼드체로 도시되어 있음).
실시예 12
알라닌 스캐닝( PepScan )
일련의 펩티드를 시험하였으며, 여기서, 각 위치는 알라닌 잔기로 치환되었다(도 6). 항체 결합에 결정적인 측쇄는 표 17에 요약되어 있다(흑색 볼드체로 나타나 있음).
실시예 13
천연 변이체 펩티드로의 결합( PepScan )
다음으로, 항체를 그것이 2012년 1월 1일에 유전자 은행에 존재하는 바와 같이 완전한 다양성의 RSV-G 중심 도메인을 포함하는 31개 펩티드의 패널에 대하여 시험하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 유형 A 및 유형 B의 거의 모든 천연 발생 변이체 펩티드가 인식된다. CB003.1은 유형 B 펩티드에 대해서보다 유형 A에 대하여 보다 낮은 결합을 보여준다. CB010.7은 유형 A 및 유형 B 펩티드 둘 모두에 동일하게 잘 결합한다. 항체는 유형 A 변이체 펩티드 내의 위치 180의 돌연변이에 결정적이다. Ser170Cys의 돌연변이는 CB010.7에 결정적이지 않았다. Ile171Thr 돌연변이는 CB003.1 결합에 결정적이었으며, Gln175Arg 돌연변이는 CB003.1에 결정적이었다. 또한, 이중 돌연변이 Ile181Phe; Ile184Ala은 CB003.1에 결정적이었다. 4개의 항체 결합에 결정적인 천연 발생 변이체는 표 17에 요약되어 있다(밑줄로 표시).
[표 17]
Figure pct00019
실시예 14
항-G mAb의 예측 효능
항-G mAb가 생체내 예방 효능을 보이는지를 결정하기 위하여, mAb CB0003.1 및 CB010.7을 RSV-A/Long 코튼 랫트 모델에서 시험하였다. 시험감염 24시간 전에, 근친교배, 파라믹소바이러스에 대한 음성 혈청, 6 내지 8주령, 제1일에 60 내지 80g의 중량 범위의 수컷 코튼 랫트에 5 ㎎/㎏의 CB003.1, CB010.7, Synagis® 또는 비히클(그룹마다 n=5)을 뒷다리 허벅지(대퇴사두근)에 근육내 주사하였다. 제0일에, 코튼 랫트에 105.4 pfu RSV-A/Long를 100 ㎕(각 콧구멍에 50 ㎕)의 비강내 적하에 의해 시험감염시켰다. 96시간 후에, 동물을 희생시켜, 폐 및 비갑개를 수집하였다: 설측엽은 qPCR에 의한 총 바이러스 RNA 로드 결정을 위한 전체 RNA의 분리를 위한 것이고, 나머지 폐 및 비갑개는 pfu 시험에 의한 감염성 바이러스 로드 결정을 위한 것이다. 혈액 시료를 시험감염 전 0일(mAb 투여 후 24시간) 및 연구 종료시(시험감염 후 96시간)에 수집하여, 적당한 용량을 확인하였다. G mAb는 비히클에 비하여 폐 및 비갑개 감염성 바이러스 역가, 및 폐 RNA 바이러스 로드를 감소시켰다(도 8). 폐 감염성 바이러스 역가(log10 PFU/g)는 각각 항체 CB003.1 및 CB010.7에 의해 2.456 및 1.559 log10으로 감소되는 한편, CR9514(3D3)를 사용한 예방적 처치는 오직 0.801 log10 감소만을 야기하였다.
실시예 15
항-G mAb의 치료 효능
항-G mAb가 생체내 치료 효능을 보이는지를 결정하기 위하여, mAb CB003.1 및 CB010.7을 RSV-A/Long 코튼 랫트 모델에서 시험하였다. 제0일에, 근친교배, 파라믹소바이러스에 대한 음성 혈청, 6 내지 8주령, 제1일에 60 내지 80g의 중량 범위의 수컷 코튼 랫트에 106.1 pfu RSV-A/Long를 100 ㎕(각 콧구멍 50 ㎕)의 비강내 적하에 의해 시험감염시켰다. 시험감염 후 1일에, 50 ㎎/㎏ CB003.1, CB010.7, Synagis®(그룹마다 n=14) 또는 비히클(그룹마다 n=23)을 심장내 주사에 의해 투여하였다. 제4일에, 그룹마다 5마리 동물을 무작위로 선택하고, 희생시켜, 폐 및 비갑개를 수집하였다: 설측엽은 qPCR에 의한 총 바이러스 RNA 로드 결정을 위한 전체 RNA의 분리를 위한 것이고, 나머지 폐 및 비갑개는 pfu 시험에 의한 감염성 바이러스 로드 결정을 위한 것이다. 제6일에, 모든 남아 있는 동물(그룹마다 n=9 또는 18)을 희생시켜, 폐 조직병리학을 위해 폐를 수집하였다. 혈액 시료를 시험감염 후 2일(mAb 투여 후 24시간) 및 연구 종료시(시험감염 후 4일 또는 6일)에 수집하여, 적당한 용량을 확인하였다. G mAb는 비히클에 비하여, 폐 및 비갑개 감염성 바이러스 역가를 감소시켰으나, 폐 RNA 바이러스 로드를 감소시키지 않았다(도 9). 폐 감염성 바이러스 역가(log10 PFU/g)는 각각 항체 B003.1 및 CB010.7에 의해 2.348 및 1.736 log10으로 감소되는 한편, CR9514(3D3)로의 치료적 처치는 오직 1.369 log10 감소만을 야기하였다. 또한, 신규한 G mAb는 세기관지주위염, 혈관주위염, 간질성 폐렴 및 폐포염에 대한 조직병리학 점수를 감소시킨 한편(도 10), CR9514(3D3)는 오직 간질성 폐렴만을 감소시켰다.
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
SEQUENCE LISTING <110> Crucell Holland B.V. <120> Human antibodies binding to RSV G protein <130> 0204EPP00PRI <140> EP13179241.8 <141> 2013-08-05 <160> 132 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB058.1 HCDR1 <400> 1 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB058.1 HCDR2 <400> 2 Ala Ile Arg Gly Ser Val Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB058.1 HCDR3 <400> 3 Asp Pro Ala Leu Tyr Cys Ser Gly Glu Thr Cys Phe Ser Asp Leu Thr 1 5 10 15 Asp <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB048.3 HCDR1 <400> 4 Asn His Gly Met His 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB048.3 HCDR2 <400> 5 Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB048.3 HCDR3 <400> 6 Thr Thr Phe Tyr Phe Asp Asp Ser Asn Tyr Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB010.7 HCDR1 <400> 7 Thr His Gly Met His 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB010.7 HCDR2 <400> 8 Val Met Ser Tyr Asp Gly Thr Lys Lys Tyr His Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB010.7 HCDR3 <400> 9 Val Gly Glu Leu Arg Ser Phe Asp Trp Leu Leu Ala Asp Gly Thr Ala 1 5 10 15 Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 20 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB003.1 HCDR1 <400> 10 Thr Tyr Tyr Ile His 1 5 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB003.1 HCDR2 <400> 11 Met Ile Asn Thr Gly Ser Gly Val Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD003.1 HCDR3 <400> 12 Met Tyr Ser Gly Ser Trp Tyr Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB058.1 LCDR1 <400> 13 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB058.1 LCDR2 <400> 14 Ala Ala Ser Thr Leu Pro Ser 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB058.1 LCDR3 <400> 15 Gln His Tyr Ile Arg Tyr Pro 1 5 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB048.3 LCDR1 <400> 16 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB048.3 LCDR2 <400> 17 Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB048.3 LCDR3 <400> 18 Gln Gln Leu Asn Thr Ser Pro Pro 1 5 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB010.7 LCDR1 <400> 19 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB010.7 LCDR2 <400> 20 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Phe 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB010.7 LCDR3 <400> 21 His Gln Tyr Tyr Ser Ile Pro 1 5 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB003.1 LCDR1 <400> 22 Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Gly Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB003.1 LCDR2 <400> 23 Glu Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB003.1 LCDR3 <400> 24 Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Phe 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB002.1 HCDR1 <400> 25 Ser Tyr Phe Trp Asn 1 5 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB002.1 HCDR2 <400> 26 Tyr Ile Tyr Gly Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 27 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB002.1 HCDR3 <400> 27 Ser Gly Phe Cys Thr Asn Asp Ala Cys Tyr Arg Arg Gly Ser Trp Phe 1 5 10 15 Asp Pro <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB002.1 LCDR1 <400> 28 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB002.1 LCDR2 <400> 29 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB002.1 LCDR3 <400> 30 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Thr 1 5 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB028.2 HCDR1 <400> 31 Thr Tyr Gly Ile Thr 1 5 <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB028.2 HCDR2 <400> 32 Trp Ile Ser Gly Asp Ser Asp Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Leu Gln 1 5 10 15 Gly <210> 33 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB028.2 HCDR3 <400> 33 Ala Leu Ala Lys Trp Tyr Cys Ser Ser Ser Ser Cys Phe Cys Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Cys Tyr Ser Asp Tyr 20 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB028.2 LCDR1 <400> 34 Arg Ala Ser Gln Gly Met Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB028.2 LCDR2 <400> 35 Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB028.2 LCDR3 <400> 36 Gln Gln Ser Phe Ser Thr Pro 1 5 <210> 37 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB058.1 VH <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Arg Gly Ser Val Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Pro Ala Leu Tyr Cys Ser Gly Glu Thr Cys Phe Ser Asp 100 105 110 Leu Thr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 38 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB058.1 VK <400> 38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Tyr Ile Arg Tyr Pro His 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 39 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB048.3 VH <400> 39 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys 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Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Met Ser Tyr Asp Gly Thr Lys Lys Tyr His Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Gly Glu Leu Arg Ser Phe Asp Trp Leu Leu Ala Asp Gly 100 105 110 Thr Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 115 120 125 Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 42 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB010.7 VK <400> 42 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Arg Leu Leu Ile Asn Trp Ala Ser Thr Arg Glu Phe Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 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Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro 85 90 95 Phe Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 45 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CB028.2 VH <400> 45 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Gly Asp Ser Asp Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ile Ser Thr Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Leu Ala Lys Trp Tyr Cys Ser Ser Ser Ser Cys Phe Cys 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 46 <211> 107 <212> PRT 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Asn Pro Thr Lys Lys Pro Thr Leu Thr Thr Thr 165 170 175 Glu Arg Asp Thr Ser Thr Ser Gln Ser Thr Val Leu Asp Thr Thr Thr 180 185 190 Leu Glu His Thr Ile Gln Gln Gln Ser Leu His Ser Thr Thr Pro Glu 195 200 205 Asn Thr Pro Asn Ser Thr Gln Thr Pro Thr Ala Ser Glu Pro Ser Thr 210 215 220 Ser Asn Ser Thr Gln Asn Thr Gln Ser His Ala Gln Ala Tyr Val Glu 225 230 235 240 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His 245 250 255 His His His His 260 <210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CB-5?LVH1a <400> 51 atggactgga cctggaggtt cctc 24 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CB-5?LVH1b <400> 52 atggactgga cctggaggat cctc 24 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CB-5?LVH1c <400> 53 atggactgga cctggagggt cttc 24 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CB-5?LVH1d <400> 54 atggactgga cctggagcat cc 22 <210> 55 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CB-5?LVH2 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Sequence <220> <223> CB-5?LVk1b <400> 64 atgagggtcc ctgctcagct c 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CB-5?LVk1c <400> 65 atgagagtcc tcgctcagct c 21 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CB-5?LVk2 <400> 66 tggggctgct aatgctctgg 20 <210> 67 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CB-5?LVk3 <400> 67 cctcctgcta ctctggctcc cag 23 <210> 68 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CB-5?LVk4 <400> 68 tctctgttgc tctggatctc tggtgc 26 <210> 69 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CB-5?LVk5 <400> 69 ctcctcagct tcctcctcct ttgg 24 <210> 70 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CB-5?LVk6 <400> 70 aactcattgg gtttctgctg ctctgg 26 <210> 71 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'Ck-Rev494 <400> 71 gtgctgtcct tgctgtcctg ctc 23 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CB-5? 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tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa 6960 taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg 7020 gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg 7080 gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 7140 cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 7200 gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 7260 ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 7320 ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 7380 atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 7440 aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 7500 gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 7560 ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 7620 ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 7680 acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 7740 gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat 7800 ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 7860 ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 7920 gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 7980 ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 8040 agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 8100 ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 8160 gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 8220 catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 8280 cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 8340 cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 8400 gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 8460 tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 8520 gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 8580 tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 8640 gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 8700 gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 8760 taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 8820 tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 8880 ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 8940 taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 8970 <210> 128 <211> 8969 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCP9-lambda sequence <400> 128 tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 60 acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 120 aagtgccacc tgacgtcgac ggatcgggag atctcccgat cccctatggt gcactctcag 180 tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtatctg ctccctgctt gtgtgttgga 240 ggtcgctgag tagtgcgcga gcaaaattta agctacaaca aggcaaggct tgaccgacaa 300 ttgcatgaag aatctgctta gggttaggcg ttttgcgctg cttcgctagg tggtcaatat 360 tggccattag ccatattatt cattggttat atagcataaa tcaatattgg ctattggcca 420 ttgcatacgt tgtatccata tcataatatg tacatttata ttggctcatg tccaacatta 480 ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta 540 gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc 600 tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 660 ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 720 gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 780 tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac 840 atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 900 cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 960 agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 1020 ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 1080 gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 1140 cgggaccgat ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg gaagcttggt accgagctcg 1200 gatccttaat taactcgagg cccgagcccg ggcgagccca gacactggac gctgaacctc 1260 gcggacagtt aagaacccag gggcctctgc gccctgggcc cagctctgtc ccacaccgcg 1320 gtcacatggc accacctctc ttgcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc 1380 accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta 1440 cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac 1500 cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc 1560 ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac 1620 caaggtggac aagagagttg gtgagaggcc agcacaggga gggagggtgt ctgctggaag 1680 ccaggctcag cgctcctgcc tggacgcatc ccggctatgc agtcccagtc cagggcagca 1740 aggcaggccc cgtctgcctc ttcacccgga ggcctctgcc cgccccactc atgctcaggg 1800 agagggtctt ctggcttttt ccccaggctc tgggcaggca cgggctaggt gcccctaacc 1860 caggccctgc acacaaaggg gcaggtgctg ggctcagacc tgccaagagc catatccggg 1920 aggaccctgc ccctgaccta agcccacccc aaaggccaaa ctctccactc cctcagctcg 1980 gacaccttct ctcctcccag attccagtaa ctcccaatct tctctctgca gagcccaaat 2040 cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag gcctcgccct 2100 ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag gccccagccg 2160 ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcacctg aactcctggg gggaccgtca 2220 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 2280 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 2340 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 2400 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 2460 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 2520 aaaggtggga cccgtggggt gcgagggcca catggacaga ggccggctcg gcccaccctc 2580 tgccctgaga gtgaccgctg taccaacctc tgtccctaca gggcagcccc gagaaccaca 2640 ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg 2700 cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc 2760 ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta 2820 tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt 2880 gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa 2940 atgagctagc gaattcaccg gtaccaagct taagtttaaa ccgctgatca gcctcgactg 3000 tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 3060 aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 3120 gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 3180 aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa 3240 ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg 3300 gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgcctagcgc ccgctccttt 3360 cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 3420 ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 3480 ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 3540 gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 3600 tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa 3660 aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattaattc tgtggaatgt gtgtcagtta 3720 gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 3780 tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc 3840 atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta 3900 actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca 3960 gaggccgagg ccgcctctgc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga 4020 ggcctaggct tttgcaaaaa gctcccggga gcttggatat ccattttcgg atctgatcaa 4080 gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg 4140 gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct 4200 gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac 4260 ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg 4320 acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg 4380 ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa 4440 gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca 4500 ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt 4560 gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc 4620 aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc 4680 ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg 4740 ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt 4800 ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag 4860 cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg gggttcggtg 4920 ctacgagatt tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc 4980 cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac 5040 cccaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 5100 acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta 5160 tcttatcatg tctgtatacc gtcgacctct agctagagct tggcgtaatc atggtcatag 5220 ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 5280 ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 5340 tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccaga attgcatgaa gaatctgctt 5400 agggttaggc gttttgcgct gcttcgctag gtggtcaata ttggccatta gccatattat 5460 tcattggtta tatagcataa atcaatattg gctattggcc attgcatacg ttgtatccat 5520 atcataatat gtacatttat attggctcat gtccaacatt accgccatgt tgacattgat 5580 tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 5640 agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 5700 gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 5760 gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 5820 atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 5880 cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 5940 ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 6000 cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 6060 atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 6120 ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct 6180 ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca ccgggaccga tccagcctcc 6240 gcggccggga acggtgcatt ggaagcttgg taccggtgaa ttcggcgcgc cagatctgcg 6300 gccgctagga agaaactcaa aacatcaaga ttttaaatac gcttcttggt ctccttgcta 6360 taattatctg ggataagcat gctgttttct gtctgtccct aacatgccct gtgattatcc 6420 gcaaacaaca cacccaaggg cagaactttg ttacttaaac accatcctgt ttgcttcttt 6480 cctcaggtca gcccaaggct gccccctcgg tcactctgtt cccgccctcc tctgaggagc 6540 ttcaagccaa caaggccaca ctggtgtgtc tcataagtga cttctacccg ggagccgtga 6600 cagtggcctg gaaggcagat agcagccccg tcaaggcggg agtggagacc accacaccct 6660 ccaaacaaag caacaacaag tacgcggcca gcagctacct gagcctgacg cctgagcagt 6720 ggaagtccca cagaagctac agctgccagg tcacgcatga agggagcacc gtggagaaga 6780 cagtggcccc tacagaatgt tcatagagtt aacggatcga tccgagctcg gtaccaagct 6840 taagtttaaa ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 6900 gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 6960 aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 7020 tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 7080 tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 7140 ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 7200 ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 7260 cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 7320 gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 7380 tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 7440 ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 7500 atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 7560 gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 7620 tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 7680 cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 7740 cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 7800 tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 7860 cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 7920 cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 7980 gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 8040 gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 8100 gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 8160 ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 8220 atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 8280 agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 8340 ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 8400 tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 8460 ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 8520 caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 8580 gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 8640 atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 8700 accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 8760 aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 8820 gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 8880 tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 8940 aagggcgaca cggaaatgtt gaatactca 8969 <210> 129 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sym-1705 <400> 129 Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Asp Phe His 1 5 10 15 Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro 20 25 30 Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys 50 55 <210> 130 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sym-1788 <400> 130 Lys Pro Arg Pro Lys Ser Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp Asp Tyr His 1 5 10 15 Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln 20 25 30 Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys 35 40 45 Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys 50 55 <210> 131 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sym-1789 <400> 131 Lys Pro Arg Pro Lys Ser Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp Asp Tyr His 1 5 10 15 Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln 20 25 30 Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr 35 40 <210> 132 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE sequence <400> 132 Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys 1 5 10

Claims (16)

  1. 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 G 단백질에 특이적으로 결합할 수 있으며, RSV A 및 B 균주를 중화시킬 수 있는 항체로서, 항체가 RSV G 단백질의 중심 보존 도메인 내의 에피토프에 결합하며, 상기 에피토프가 RSV G 단백질 RSV A2 균주의 아미노산 161 내지 169, 특히, 아미노산 162 내지 168 또는 다른 균주에서의 상응하는 아미노산 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 항체.
  2. 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 G 단백질에 특이적으로 결합할 수 있으며, RSV A 및 B 균주를 중화시킬 수 있는 항체로서, 항체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체:
    a) SEQ ID NO: 1의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 2의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 3의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체,
    b) SEQ ID NO: 4의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 5의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 6의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체,
    c) SEQ ID NO: 7의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 8의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 9의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체,
    d) SEQ ID NO: 10의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 11의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 12의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체,
    e) SEQ ID NO: 25의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 26의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 27의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체, 및
    f) SEQ ID NO: 31의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 32의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 33의 중쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체:
    a) SEQ ID NO: 1의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 2의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 3의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 13의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 14의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 15의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체;
    b) SEQ ID NO: 4의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 5의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 6의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 16의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 17의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 18의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체;
    c) SEQ ID NO: 7의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 8의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 9의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 19의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 20의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 21의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체;
    d) SEQ ID NO: 10의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 1의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 12의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 22의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 23의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 24의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체;
    e) SEQ ID NO: 25의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 26의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 27의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 28의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 29의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 30의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체; 및
    f) SEQ ID NO: 31의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 32의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 33의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 34의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 35의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 36의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체.
  4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 항체가 인간 항체인 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체의 기능성 변이체.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체 및/또는 제5항에 따른 항원-결합 단편 및/또는 제6항에 따른 기능성 변이체를 포함하는 면역컨쥬게이트(Immunoconjugate)로서, 면역컨쥬게이트가 적어도 하나의 치료제 및/또는 검출가능한 작용제를 추가로 포함하는 면역컨쥬게이트.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제5항에 따른 항원-결합 단편 및/또는 제6항에 따른 기능성 변이체를 인코딩하는 핵산 분자.
  9. 제8항에 따른 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  10. 제9항에 따른 적어도 하나의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  11. a) 제10항에 따른 숙주 세포를 항체의 발현에 도움이 되는 조건하에서 배양하는 단계, 및 선택적으로,
    b) 발현된 항체, 항원-결합 단편 및/또는 기능성 변이체를 회수하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제5항에 따른 항원-결합 단편 및/또는 제6항에 따른 기능성 변이체의 생성 방법.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제5항에 따른 항원-결합 단편 및/또는 제6항에 따른 기능성 변이체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 약제학적 조성물이 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  13. 약제로 이용하기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제5항에 따른 항원-결합 단편, 제6항에 따른 기능성 변이체 또는 제12항에 따른 약제학적 조성물.
  14. RSV 감염의 예방 또는 치료 또는 그들의 조합에 이용하기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제5항에 따른 항원-결합 단편, 제6항에 따른 기능성 변이체 또는 제12항에 따른 약제학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 항체, 제5항에 따른 항원-결합 단편, 제6항에 따른 기능성 변이체 또는 제12항에 따른 약제학적 조성물 또는 그들의 조합을 포함하는 키트.
  16. (a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제5항에 따른 항원-결합 단편, 제6항에 따른 기능성 변이체 및/또는 제7항에 따른 면역컨쥬게이트를 이용하여, 시료 중 RSV 항원의 수준을 분석하는 단계; 및 (b) 분석된 RSV 항원의 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계로서, 대조군 수준에 비한 분석된 RSV 항원의 수준의 증가가 RSV 감염을 나타내는 단계를 포함하는, RSV 감염의 검출 방법.
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