ES2595362T3 - Anticuerpos LM, fragmentos funcionales, antígeno diana LM-1 y métodos para prepararlos y usarlos - Google Patents

Anticuerpos LM, fragmentos funcionales, antígeno diana LM-1 y métodos para prepararlos y usarlos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en el que: (a) la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera comprenden una secuencia que es al menos un 90 % idéntica a la región variable de la cadena pesada y una secuencia que es al menos un 90 % idéntica a la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo LM-1 producido mediante una línea celular depositada como depósito DSMZ n.º DSM ACC 2623; y (b) la región variable de cadena pesada comprende las tres regiones determinantes de la complementariedad 10 (CDR) de las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 1, y la región variable de la cadena ligera comprende las tres CDR de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11 para su uso en el tratamiento de metástasis de una neoplasia, un tumor o un cáncer en un sujeto que necesita tratamiento, o para reducir o inhibir la metástasis de una neoplasia un tumor o un cáncer primarios en uno o más sitios, ubicaciones o regiones diferentes de una neoplasia, un tumor o un cáncer primarios en un sujeto que necesita tratamiento, o para reducir o inhibir el crecimiento, la proliferación, la movilidad o la capacidad de invasión de células neoplásicas, células tumorales o células cancerosas que se pueden desarrollar u ocasionar una metástasis en un sujeto que necesita tratamiento.

Description

Anticuerpos LM, fragmentos funcionales, antígeno diana LM1 y métodos para prepararlos y usarlos
5 Campo de la invención
La invención se refiere a un anticuerpo, conocido como LM1 y a una diana, conocida cono diana o antígeno de LM
1. El anticuerpo denotado LM1 es una IgM y se une a diferentes tipos de neoplasia, cáncer, tumor y metástasis. LM1 inhibe el crecimiento de diversos tipos de células cancerosas y estimula o induce la apoptosis de diversos tipos de células cancerosas. LM1 reduce también la formación o el establecimiento de la metástasis en uno o más sitios que surgen de una neoplasia, un tumor o un cáncer primarios, o crecimiento o proliferación de una metástasis que se ha formado o se ha establecido en uno o más sitios.
Introducción
15 Enfermedad metastásica en los sitios periféricos del cáncer primario que contribuyen potencialmente a la progresión y recidiva del cáncer. Por consiguiente, la inhibición o el establecimiento o formación de la metástasis, o la reducción
o disminución del crecimiento de la metástasis, proliferación de o progresión de tumores metastásico que se han establecido es probable que reduzca o inhiba la progresión y la recidiva del cáncer. La invención satisface esta necesidad y proporciona también beneficios relacionados.
El documento WO 2004/081027 A2 describe anticuerpos para el uso en el tratamiento contra el cáncer que induzcan la apoptosis de las células neoplásicas pero que no induzcan la apoptosis de las células no neoplásicas. El documento US 6 159 702 describe un sistema de métodos de ensayo diagnósticos proporcionados para el
25 diagnóstico de un tumor de mama primario procedente de un sujeto individual que es un tumor clínicamente metastásico Sumario
La invención proporciona un anticuerpo sin conjugar o uno de sus fragmentos funcionales que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera:
(a) la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera comprenden una secuencia que es al menos un 90 % idéntica a la región variable de la cadena pesada y una secuencia que es al menos un 90 % idéntica a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo LM1 producido por una línea celular DSMZ depositada como N.º de registro DSM ACC 2623; y 
35 (b) la región variable de la cadena pesada comprende las tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1 y la región variable de la cadena ligera comprende las tres CDR de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 11, y en la que,
el anticuerpo o su fragmento funcional se une a la proteína NONO/nmt55,
para uso en el tratamiento de la metástasis de una neoplasia, tumor o cáncer en un sujeto que necesita tratamiento, o reducir o inhibir la metástasis de una neoplasia, un tumor o un cáncer primarios en uno o más sitios, localizaciones o regiones distintas de una neoplasia, un tumor o un cáncer primarios en un sujeto que
45 necesita tratamiento, o reducir o inhibir el crecimiento, la proliferación, la movilidad o la invasividad de las células neoplásicas, tumorales o cancerosas que pueden desarrollarse en o proporcionar un aumento de una metástasis en un sujeto que necesita tratamiento.
En aspectos concretos, un anticuerpo o fragmento funcional compite con el anticuerpo LM1, como se representa por un anticuerpo producido por la línea celular DSMZ N.º de depósito. DSM ACC 2623, o se representa por las secuencias de la cadena pesada y ligera que se muestran como SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13, para la unión a un antígeno (por ejemplo, proteína NONO/nmt55) en uno o más de un adenocarcinoma de estómago (por ejemplo, difuso o intestinal), cáncer colorrectal tal como adenocarcinoma, carcinoma de ovario, cáncer de pulmón, tal como adenocarcinomas de pulmón, carcinoma de pulmón escamocelular y carcinoma microcítico, melanoma, carcinomas 55 de mama lobulares y ductales, cáncer de mama tal como cáncer ductal o lobular invasivo, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, tales como adenocarcinomas de páncreas (por ejemplo, ductal), sarcomas, cáncer gastrointestinal tal como cáncer de estómago, tumor de tejido nervioso o tumor cerebral tal como un glioma, cáncer de esófago tal como carcinoma escamocelulares esofágicos y adenocarcinomas, osteosarcoma, fibrosarcomas, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de próstata tal como adenocarcinomas de próstata, cáncer de riñón tal como carcinoma renal, cáncer de ovario tal como adenocarcinomas, cáncer de testículo, cáncer de endometrio, cáncer de cuello de útero tal como escamocelular y adenocarcinomas, cánceres de útero tales como adenocarcinomas, enfermedad de Hodgkin, linfomas, y leucemias. Dichos polipéptidos son particularmente útiles para la detección y el tratamiento del adenocarcinoma de estómago (por ejemplo, difuso o intestinal) cáncer colorrectal tal como adenocarcinoma, carcinoma de ovario, cáncer de pulmón, tal como adenocarcinomas de pulmón, carcinoma de pulmón escamocelular 65 y carcinoma de pulmón microcítico, melanoma, carcinomas mamarios lobulares y ductales, cáncer de mama tal como cáncer ductal o lobular invasivo, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, tal como adenocarcinomas
pancreáticos(por ejemplo, ductal) sarcomas, cáncer gastrointestinal tal como cáncer de estómago, tumor de tejido nervioso o cerebral tal como glioma, cáncer de esófago tal como carcinomas y adenocarcinomas escamocelulares esofágicos, osteosarcoma, fibrosarcomas, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de próstata tal como adenocarcinomas de próstata, cáncer de riñón tal como carcinoma renal, cáncer de ovario tales como adenocarcinomas, cáncer de
5 testículo, cáncer de endometrio, cáncer de cuello de útero tal como escamocelular y adenocarcinomas, cánceres de útero tales como adenocarcinomas, enfermedad de Hodgkin, linfomas, y leucemias.
En otra realización, un anticuerpo o fragmento funcional compite con el anticuerpo LM1, como se representa por un anticuerpo producido por la línea celular DSMZ N.º de depósito. DSM ACC 2623, o se representa por las secuencias de la cadena pesada y ligera que se muestran como SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13, para la unión a un adenocarcinoma de estómago (por ejemplo, difuso o intestinal), cáncer colorrectal tal como adenocarcinoma, carcinoma de ovario, cáncer de pulmón, tal como adenocarcinomas de pulmón, carcinoma de pulmón escamocelular y carcinoma microcítico, melanoma, carcinomas de mama lobulares y ductales, cáncer de mama tal como cáncer ductal o lobular invasivo, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, tales como adenocarcinomas de páncreas (por 15 ejemplo, ductal), sarcomas, cáncer gastrointestinal tal como cáncer de estómago, tumor de tejido nervioso o tumor cerebral tal como un glioma, cáncer de esófago tal como carcinoma escamocelulares esofágicos y adenocarcinomas, osteosarcoma, fibrosarcomas, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de próstata tal como adenocarcinomas de próstata, cáncer de riñón tal como carcinoma renal, cáncer de ovario tal como adenocarcinomas, cáncer de testículo, cáncer de endometrio, cáncer de cuello de útero tal como escamocelular y adenocarcinomas, cánceres de útero tales como adenocarcinomas, enfermedad de Hodgkin, linfomas, o leucemia. En una realización adicional, un anticuerpo o fragmento funcional compite con un anticuerpo LM1, como se representa por un anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representado por las secuencias de la cadena pesada y ligera que se muestran en las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11
o 13, para la unión de uno de la línea de células de adenocarcinoma de pulmón DV90 (DSMZ número de registro
25 ACC 307) línea de células EPLC272H de carcinoma de pulmón epidermoide (DSMZ número de registro ACC 383), línea de células LOUNH91 de carcinoma de pulmón escamocelular (DSMZ número de registro ACC 393), células HT29 (ATCC N.º de registro HTB38; DSMZ N.º de registro ACC 299), A549 (DSMZ N.º de registro ACC 107) o BXPC3 (ATCC N.º de registro CRL1687). En una realización, un anticuerpo o su fragmento funcional inhibe o reduce la proliferación o estimula o induce la apoptosis, de uno o más de un adenocarcinoma de estómago (por ejemplo, difuso o intestinal) cáncer colorrectal tal como adenocarcinoma, carcinoma de ovario, cáncer de pulmón, tal como adenocarcinomas de pulmón, carcinoma de pulmón escamocelular y carcinoma de pulmón microcítico, melanoma, carcinomas mamarios lobulares y ductales, cáncer de mama tal como cáncer ductal o lobular invasivo, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, tal como adenocarcinomas pancreáticos(por ejemplo, ductal) sarcomas, cáncer gastrointestinal tal como cáncer de estómago, tumor de tejido nervioso o cerebral tal como glioma, cáncer de
35 esófago tal como carcinomas y adenocarcinomas escamocelulares esofágicos, osteosarcoma, fibrosarcomas, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de próstata tal como adenocarcinomas de próstata, cáncer de riñón tal como carcinoma renal, cáncer de ovario tales como adenocarcinomas, cáncer de testículo, cáncer de endometrio, cáncer de cuello de útero tal como escamocelular y adenocarcinomas, cánceres de útero tales como adenocarcinomas, enfermedad de Hodgkin, linfoma, o leucemia o uno de una línea de células Colo699 de adenocarcinoma de pulmón (DSMZ número de registro ACC 196), línea de células DV90 de adenocarcinoma de pulmón (DSMZ número de registro ACC 307), línea de células EPLC272H de carcinoma de pulmón epidermoide (DSMZ número de registro ACC 383), o línea de células LOUNH91 de carcinoma de pulmón escamocelular (DSMZ número de registro ACC 393)
45 La invención proporciona también anticuerpos aislados y purificados y sus fragmentos funcionales que se unen a células o a un antígeno (por ejemplo, proteína NONO/nmt55) que se unen al anticuerpo LM1, como se representa por una línea de células DSMZ N.º de registro DSM ACC 2623, o representada por las secuencias de la cadena pesada y ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13. En una realización, un anticuerpo o fragmento funcional se une a una célula de adenocarcinoma o a un carcinoma escamocelular al cual se une el anticuerpo LM1, que se representa por un anticuerpo producido por una línea de células DSMZ N.º de registro DSM ACC 2623, o representada por las secuencias de la cadena pesada y ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13. En aspectos concretos, un anticuerpo o fragmento funcional se une a uno o más de un adenocarcinoma de estómago (por ejemplo, difuso o intestinal) cáncer colorrectal tal como adenocarcinoma, carcinoma de ovario, cáncer de pulmón, tal como adenocarcinomas de pulmón, carcinoma de pulmón escamocelular
55 y carcinoma de pulmón microcítico, melanoma, carcinomas mamarios lobulares y ductales, cáncer de mama tal como cáncer ductal o lobular invasivo, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, tal como adenocarcinomas pancreáticos(por ejemplo, ductal) sarcomas, cáncer gastrointestinal tal como cáncer de estómago, tumor de tejido nervioso o cerebral tal como glioma, cáncer de esófago tal como carcinomas y adenocarcinomas escamocelulares esofágicos, osteosarcoma, fibrosarcomas, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de próstata tal como adenocarcinomas de próstata, cáncer de riñón tal como carcinoma renal, cáncer de ovario tales como adenocarcinomas, cáncer de testículo, cáncer de endometrio, cáncer de cuello de útero tal como escamocelular y adenocarcinomas, cánceres de útero tales como adenocarcinomas, enfermedad de Hodgkin, linfoma, o leucemia al cual se une el anticuerpo LM1 como se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ número de registro ACC 2623 o representada por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como SEQ ID NO:1, 3, 5,
65 7 o 9, y 11 o 13. En otra realización, un anticuerpo o fragmento funcional se une a un adenocarcinoma de estómago (por ejemplo, difuso o intestinal) cáncer colorrectal tal como adenocarcinoma, carcinoma de ovario, cáncer de
pulmón, tal como adenocarcinomas de pulmón, carcinoma de pulmón escamocelular y carcinoma microcítico, melanoma, carcinomas de mama lobulares y ductales, cáncer de mama tal como cáncer ductal o lobular invasivo, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, tales como adenocarcinomas de páncreas (por ejemplo, ductal), sarcomas, cáncer gastrointestinal tal como cáncer de estómago, tumor de tejido nervioso o tumor cerebral tal como un glioma, 5 cáncer de esófago tal como carcinoma escamocelulares esofágicos y adenocarcinomas, osteosarcoma, fibrosarcomas, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de próstata tal como adenocarcinomas de próstata, cáncer de riñón tal como carcinoma renal, cáncer de ovario tal como adenocarcinomas, cáncer de testículo, cáncer de endometrio, cáncer de cuello de útero tal como escamocelular y adenocarcinomas, cánceres de útero tales como adenocarcinomas, enfermedad de Hodgkin, linfoma, o leucemia, al cual se une el anticuerpo LM1, como se representa por el anticuerpo producido por la línea de células DSMC cono N.º de registro DSM ACC 2623, o representada por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13. En una realización adicional, un anticuerpo o fragmento funcional se una a una línea de células Colo699 de adenocarcinoma de pulmón (DSMZ número de registro ACC 196), línea de células DV90 de adenocarcinoma de pulmón (DSMZ número de registro ACC 307), línea de células EPLC272H de carcinoma de 15 pulmón epidermoide (DSMZ número de registro ACC 383), o línea de células LOUNH91 de carcinoma escamocelular de pulmón (DSMZ número de registro ACC 393) a las que se une el anticuerpo LM1, como se representa por un anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro. DSM ACC 2623, o representado por las secuencias de la cadena pesada y ligera que se muestran como SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11
o 13,
En una realización, un anticuerpo de las invenciones o sus derivados incluye una secuencia al menos un 95 % o más idéntica a una secuencia de la región variable de la cadena pasada del anticuerpo producido por una línea de células DSMZ n.º de registro. DSM ACC 262, o una secuencia al menos un 95 % o más idéntica a la secuencia de una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por una línea de células DSMZ N.º de registro DSM
25 ACC 262.
Los anticuerpos de la invención incluyen IgG, IgA, IgM, IgE e IgD. En diversos aspectos, un IgG es una IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4. En aspectos concretos, un fragmento funcional o un derivado es un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, Fvs (sdFv) unido a disulfuro, VL,VH, triespecifico (Fab3), biespecífico (Fab2), diacuerpo ((VLVH)2 o (VHVL)2), triacuerpo (trivalente), tetracuerpo (tetravalente), minicuerpo ((scFvCH3)2), Fv monocatenario biespecífico (BisscFv), IgGdeltaCH2, scFvFc y (scFv)2Fc. En aspectos adicionales, un fragmento funcional o un derivado de longitud completa de la cadena pesada o ligera, o una región variable de la cadena pesado o ligera, incluye una o más CDR de una secuencia de la cadena pesada o ligera del anticuerpo LM1, como se representa por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestra como las SEQ ID NO:1, y 11 (por ejemplo, los aminoácidos 2435,
35 5267 o 100118 de la SEQ ID NO:1, o los aminoácidos 2335, 5158 o 90101 de la SEQ ID NO:11). En aspectos adicionales, un fragmento funcional o un derivado de un anticuerpo de longitud completa de cadena pesada o ligera ,o una región variable de la cadena pesada o ligera, tiene una longitud de aproximadamente 2030, 3050, 50100, 100150, 150200, 200250, 250300, 300400, 400500, restos aminoácidos.
La invención proporciona también anticuerpos y sus derivados, que incluyen un dominio heterólogo. En una realización, un dominio heterólogo incluye, una marca, etiqueta o agente citotóxico detectable. En aspectos concretos, una marca o etiqueta detectable es una enzima, sustrato de enzima, ligando, receptor, radionucleido, una etiqueta T7, His, myc, HA o FLAG, reactivo denso en electrones, molécula de transferencia de energía, marca paramagnética, fluoróforo, cromóforo, agente quimioluminiscente, o un agente bioluminiscente.
45 Se describen también en el presente documento secuencias de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos y sus fragmentos funcionales. En una realización, una secuencia de ácido nucleico es al menos un 75100 % complementaria o idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de la región variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo LN1, que se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ N.º de registro DSM ACC 2623 o representado por las secuencias de la cadena pesada y ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13 o una de sus derivadas (por ejemplo, los aminoácidos 2435, 5267 o 100118 de SEQ ID NO:1, 3, 5 o 7, o los aminoácidos 2335, 5158 o 90101 of SEQ ID NO:9). En otra realización un ácido nucleico codifica un derivado del anticuerpo LM1, que se representa por un anticuerpo producido por una línea de células DSMZ N.º de registro DSM ACC 2623 o representado por las secuencias de la
55 cadena pesada y ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13 (por ejemplo, los aminoácidos 2435, 5267 o 100118 de la SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, o los aminoácidos 2335, 5158 o 90101 de la SEQ ID NO:11 o 13). En aspectos concretos, una secuencia de ácido nucleico que tiene una longitud de aproximadamente 1020, 2030, 3050, 50100, 100150, 150200, 200250, 250300, 300400, 400500, o 5001000 nucleótidos En aspectos adicionales, una secuencia de ácido nucleico se hibrida específicamente con un ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13 o una derivada de la misma, o que se hibrida específicamente con una secuencia complementaria a un ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13 o un derivado de la SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13. En aspectos adicionales, un ácido nucleico es un polinucleótido de sentido contrario, un ARN interferente pequeño, o un ácido nucleico de ribozima que se hibrida específicamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementaria a la SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13 o es una de
65 sus derivadas. Los polinucleótidos de sentido contrario, el ARN interferente pequeño, y los polinucleótidos de ribozimas pueden tener una longitud de entre aproximadamente 1020, 2030, 3050, 50100, 100150, 150200,
200250, 250300, 300400, 400500, 5001000, 10002000 nucleótidos y tener al menos un 90 % de complementariedad o ser idénticos a una secuencia de ácido nucleico que codifica las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13 o uno de sus derivados (por ejemplo, 2435, 5267 o 100118 de la SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, o los aminoácidos 2335, 5158 o 90101 de la SEQ ID NO:11 o 13). En otros aspectos más, la secuencia de ácido
5 nucleico puede incluir una secuencia control de la expresión o un vector (por ejemplo, un vector vírico, bacteriano, fúngico o de mamífero).
Se describen kits. En diversas realizaciones, un kit incluye un anticuerpo o su fragmento funcional que compite con el anticuerpo LM1 que se representa por el anticuerpo produce una línea de células DSMZ N.º de registro DSM ACC 2623 o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3,5, 7 o 9, y 11 o 13 para la unión a un antígeno (por ejemplo, la proteína NONO/nmt55 ) o a una célula (por ejemplo, una célula neoplásica, cancerosa, tumoral o metastásica). En aspectos concretos, un kit incluye un anticuerpo o su fragmento funcional que compite con el anticuerpo LM1, como se representa por un anticuerpo producido por la línea celular DSMZ N.º de registro DSM ACC 2623, o se representa por las secuencias de la 15 cadena pesada y ligera que se muestran como SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13, para la unión a un adenocarcinoma de estómago (por ejemplo, difuso o intestinal), cáncer colorrectal tal como adenocarcinoma, carcinoma de ovario, cáncer de pulmón, tal como adenocarcinomas de pulmón, carcinoma de pulmón escamocelular y carcinoma microcítico, melanoma, carcinomas de mama lobulares y ductales, cáncer de mama tal como cáncer ductal o lobular invasivo, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, tales como adenocarcinomas de páncreas (por ejemplo, ductal), sarcomas, cáncer gastrointestinal tal como cáncer de estómago, tumor de tejido nervioso o tumor cerebral tal como un glioma, cáncer de esófago tal como carcinoma escamocelulares esofágicos y adenocarcinomas, osteosarcoma, fibrosarcomas, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de próstata tal como adenocarcinomas de próstata, cáncer de riñón tal como carcinoma renal, cáncer de ovario tal como adenocarcinomas, cáncer de testículo, cáncer de endometrio, cáncer de cuello de útero tal como escamocelular y 25 adenocarcinomas, cánceres de útero tales como adenocarcinomas, enfermedad de Hodgkin, linfomas, o leucemia. En una realización adicional, un kit incluye un anticuerpo o su fragmento funcional que compite con un anticuerpo LM1, como se representa por un anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representado por las secuencias de la cadena pesada y ligera que se muestran en las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7
o 9, y 11 o 13, para la unión a un antígeno (por ejemplo, la proteína NONO/nmt55) o una de la línea de células de adenocarcinoma de pulmón Colo699 (DSMZ número de registro ACC 196), la línea de células de adenocarcinoma de pulmón DV90 (DSMZ número de registro ACC 307) línea de células EPLC272H de carcinoma de pulmón epidermoide (DSMZ número de registro ACC 383), línea de células LOUNH91 de carcinoma de pulmón escamocelular (DSMZ número de registro ACC 393), células HT29 (ATCC N.º de registro HTB38;
35 El kit incluye también anticuerpos y sus fragmentos funcionales que se unen a células o a un antígeno (por ejemplo, proteína NONO/nmt55) que se unen al anticuerpo LM1, como se representa por una línea de células DSMZ N.º de registro DSM ACC 2623, o representado por las secuencias de la cadena pesada y ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13. En una realización, un kit incluye un anticuerpo o fragmento funcional que se une a una célula de adenocarcinoma o a una célula de carcinoma escamocelular a la cual se une el anticuerpo LM1 que se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ n.º de registro DSM ACC 2623 o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13, tal como una célula de adenocarcinoma de estómago (por ejemplo, difuso o intestinal, una célula de adenocarcinoma de páncreas, una célula de adenocarcinoma de colon, una célula de adenocarcinoma de mama, una célula de carcinoma escamocelular de esófago, a la cual se une el anticuerpo LM1, que se representa por el
45 anticuerpos producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representada por las líneas de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o13 En otra realización, un kit incluye un anticuerpo o fragmento funcional que se une a un adenocarcinoma de estómago (por ejemplo, difuso o intestinal) cáncer colorrectal tal como adenocarcinoma, carcinoma de ovario, cáncer de pulmón, tal como adenocarcinomas de pulmón, carcinoma de pulmón escamocelular y carcinoma microcítico, melanoma, carcinomas de mama lobulares y ductales, cáncer de mama tal como cáncer ductal o lobular invasivo, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, tales como adenocarcinomas de páncreas (por ejemplo, ductal), sarcomas, cáncer gastrointestinal tal como cáncer de estómago, tumor de tejido nervioso o tumor cerebral tal como un glioma, cáncer de esófago tal como carcinoma escamocelulares esofágicos y adenocarcinomas, osteosarcoma, fibrosarcomas, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de próstata tal como adenocarcinomas de próstata, cáncer de riñón tal como
55 carcinoma renal, cáncer de ovario tal como adenocarcinomas, cáncer de testículo, cáncer de endometrio, cáncer de cuello de útero tal como escamocelular y adenocarcinomas, cánceres de útero tales como adenocarcinomas, enfermedad de Hodgkin, linfoma, o leucemia. al cual se une el anticuerpo LM1, como se representa por el anticuerpo producido por la línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representada por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13. En una realización adicional, un kit incluye un anticuerpo o fragmento funcional que se une a una línea de células Colo699 de adenocarcinoma de pulmón (DSMZ número de registro ACC 196), línea de células DV90 de adenocarcinoma de pulmón (DSMZ número de registro ACC 307), línea de células EPLC272H de carcinoma de pulmón epidermoide (DSMZ número de registro ACC 383), o línea de células LOUNH91 de carcinoma escamocelular de pulmón (DSMZ número de registro ACC 393) a las que se une el anticuerpo LM1, como se representa por un anticuerpo producido
65 por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representado por las secuencias de la cadena pesada y ligera que se muestran como SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13.
El kit incluye también anticuerpos y sus fragmentos funcionales que incluyen una secuencia de la región variable de la cadena pesada o ligera con aproximadamente un 60 % o más de identidad con las regiones variables de la secuencia de la cadena pesada o ligera del anticuerpo LM1, como se representa por un anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representado por las secuencias de la cadena 5 pesada y ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13. En una realización, un kit incluye un anticuerpo o su derivado con una secuencia al menos del 60 % o más (por ejemplo 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, etc.) idéntica de la secuencia de la región variable de la cadena pesada que se muestra como la SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, o a una secuencia al menos un 60 % o más (por ejemplo, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, etc.) idéntica a una secuencia de la región variable de la cadena ligera que se muestra como la SEQ ID NO:11 10 o 13. En otra realización, un kit incluye un anticuerpo o un derivado con una secuencia al menos del 60 % o más (por ejemplo, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, etc.) idéntica a una secuencia de la región variable de la cadena pesada que se muestra como la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 o 9, y a una secuencia al menos un 60 % o más (por ejemplo, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, etc.) idéntica a la secuencia de la región variable de la cadena pesada que se muestra como la SEQ ID NO:11 o 13. En realizaciones adicionales, un kit incluye un anticuerpo o 15 derivado con una secuencia al menos 8085 %, 8590 %, 9095 %, 95100 % idéntica a una o más de las CDR en la secuencia de la región variable de la cadena pesada que se muestra como SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, (por ejemplo, los aminoácidos 2435, 5267 o 100118 de la SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9), o una o más de las CDR en la región variable de la cadena pesada del anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 262, o una secuencia al menos un 8085 %, 8590 %, 9095 %, 95100 % idéntica a una o más CDR en la secuencia
20 de la región variable de la cadena ligera que se muestra como la SEQ ID NO:11 o 13 (por ejemplo, los aminoácidos 2335, 5158 o 90101 de la SEQ ID NO:11), o una o más CDR en la región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 262.
En realizaciones adicionales, un kit incluye también un tratamiento proliferativo anticelular o un tratamiento
25 inmunopotenciador o el agente terapéutico, o un agente antineoplásico un agente anticanceroso o un agente antitumoral o un agente antimetastásico, o un artículo de fabricación (por ejemplo, para la administración del anticuerpo, un tratamiento o terapia proliferativa anticelular o un tratamiento o terapia inmunopotenciadora en un sujeto por vía local, regional o sistémica). En aspectos concretos, las instrucciones son para tratar la proliferación celular indeseable o un trastorno proliferativo celular (por ejemplo, una neoplasia, cáncer o metástasis tumoral).
30 Los anticuerpos, fragmentos funcionales y el antígeno (por ejemplo, la proteína NONO/nmt55), y las formas modificadas son útiles para tratar un sujeto que necesita tratamiento. La invención proporciona por tanto métodos de utilizar anticuerpos, fragmentos funcionales, un antígeno (por ejemplo, la proteína NONO/nmt559 en el tratamiento (por ejemplo, terapéutico o profiláctico) de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener una proliferación células
35 indeseable, tal como un trastorno proliferativo celular o un trastorno hiperproliferativo. En una realización, un método incluye administrar un anticuerpo o su fragmento funcional (por ejemplo, una anticuerpo LM1, que se representa por el anticuerpo produce una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623 o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 5, 7 o 9, y 11 o 13 o un antígeno (por ejemplo, la proteína NONO/nmt55 ) a un sujeto que tiene o está en riesgo de tener una proliferación
40 celular indeseable (por ejemplo, un trastorno proliferativo celular) una cantidad eficaz para tratar la proliferación celular indeseable. En aspectos concretos, un trastorno proliferativo celular es una neoplasia maligna, tumor o cáncer, sólido o líquido, metastásico o no metastásico En diversos aspectos, la proliferación celular indeseable (por ejemplo, un trastorno proliferativo celular) afecta o está presente al menos en parte en el cerebro, cabeza o cuello, mama, esófago, boca, nasofaringe, nariz o senos, estómago, duodeno, íleon, yeyuno, pulmón, hígado, páncreas,
45 riñón, glándula adrenal, tiroides, vejiga, colon, recto, próstata, útero, endometrio, cuello del útero, ovario, médula ósea, ganglios linfáticos, sangre, huesos, testículos, piel o músculo, o sistema hematopoyético. En aspectos adicionales, la proliferación celular indeseable (por ejemplo, un trastorno proliferativo celular) incluye una neoplasia, tumor, cáncer o metástasis que afecta o está al menos en parte presente en la mama, pulmón, tiroides, cabeza y cuello, nasofaringe, nariz o senos, cerebro, médula espinal, glándula adrenal, ganglios linfáticos, tracto
50 gastrointestinal boca, esófago, estómago, duodeno, íleon, yeyuno, intestino delgado, colon, recto, tracto genitourinario, útero, endometrio, ovario, cuello del útero, vejiga, testículo, pene, próstata, riñón, páncreas, glándula adrenal, hígado, hueso, médula ósea, ganglios linfáticos, sangre, músculo, piel o es hematopoyético. En aspectos más concretos, una neoplasia, tumor, cáncer o metástasis es un sarcoma, carcinoma, adenocarcinoma, melanoma, mieloma, blastoma, glioma, linfoma o leucemia. En aspectos concretos adicionales, una neoplasia, tumor o cáncer
55 es un adenocarcinoma de estómago (por ejemplo, difuso o intestinal) cáncer colorrectal tal como adenocarcinoma, carcinoma de ovario, cáncer de pulmón, tal como adenocarcinomas de pulmón, carcinoma de pulmón escamocelular y carcinoma de pulmón microcítico, melanoma, carcinomas mamarios lobulares y ductales, cáncer de mama tal como cáncer ductal o lobular invasivo, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, tal como adenocarcinomas pancreáticos (por ejemplo, ductal) sarcoma, cáncer gastrointestinal tal como cáncer de estómago, tumor de tejido nervioso o
60 cerebral tal como glioma, cáncer de esófago tal como carcinoma y adenocarcinoma escamocelular esofágico, osteosarcoma, fibrosarcoma, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de próstata tal como adenocarcinoma de próstata, cáncer de riñón tal como carcinoma renal, cáncer de ovario tal como adenocarcinoma, cáncer de testículo, cáncer de endometrio, cáncer de cuello de útero tal como escamocelular o adenocarcinoma, cáncer de útero tal como adenocarcinoma, enfermedad de Hodgkin, o una de sus metástasis.
En otra realización, se describe en el presente documento administrar un anticuerpo o fragmento funcional (por ejemplo, un anticuerpo LM1, como se representa por un anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representado por las secuencias de la cadena pesada y ligera que se muestran como SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13) o un antígeno (por ejemplo, la proteína NONO/nmt55) a un sujeto que 5 tiene o está en riesgo de tener una metástasis, una cantidad eficaz para reducir o inhibir la dispersión o diseminación de un tumor, cáncer o neoplasia a otros sitios, localizaciones o regiones en el sujeto. En diversos aspectos, el método reduce o inhibe la metástasis de un tumor o un cáncer primarios en uno o más sitios diferentes, la formación
o el establecimiento de una metástasis en uno o más sitios diferentes, inhibiendo o reduciendo por tanto la recidiva del tumor o el cáncer o la progresión del tumor o el cáncer, En aspectos adicionales, el método reduce o inhibe el crecimiento, la proliferación, la movilidad o la invasividad de las células tumorales o cancerosas que potencialmente
o desarrollan, forman o establecen las metástasis; reduce o inhibe la formación o el establecimiento de las metástasis que surgen de un tumor o un cáncer primarios en uno o más sitios, localizaciones o regiones diferentes distintas del tumor o del cáncer primarios; reduce o inhibe el crecimiento o la proliferación de la metástasis en uno o más sitios, localizaciones o regiones distintas del tumor o del cáncer primarios después de la metástasis que se ha
15 formado o se ha establecido, o reduce o inhibe la formación o el establecimiento de metástasis adicionales después que se ha formado o establecido la metástasis.
En otros aspectos concretos, la neoplasia, tumor o cáncer, o la metástasis empeora progresivamente o está en remisión En aspectos más adicionales, el tratamiento da como resultado el alivio o la mejora de uno o más síntomas físicos adversos asociados con un trastorno proliferativo celular, o una neoplasia, tumor o cáncer, o reduce o disminuye el volumen de la neoplasia, tumor o cáncer, inhibe o previene un aumento en el volumen de la neoplasia, tumor o cáncer, inhibe la progresión o el empeoramiento de la neoplasia, tumor o cáncer, estimula la lisis ola apoptosis de las células de la neoplasia, tumor o cáncer, o inhibe, reduce o disminuye la proliferación o metástasis de la neoplasia, tumor o cáncer, o prolonga o amplía el lapso de vida del sujeto, o mejora la calidad de vida del
25 sujeto.
Los métodos incluyen la administración a un sujeto por vía local, regional, o sistémica. Los sujetos ilustrativos (por ejemplo, mamíferos tales como seres humanos) incluyen candidatos para, y aquellos que experimentan, o que han experimentado un trastorno proliferativo anticelular o un trastorno antihiperproliferativo (por ejemplo, antineoplásico, antitumoral, anticanceroso o antimetastásico) o un tratamiento o terapia inmunopotenciador.
En diversos aspectos, un tratamiento proliferativo anticelular o un tratamiento o terapia inmunopotenciador incluye la resección quirúrgica, radioterapia, tratamiento con radiación, quimioterapia, inmunoterapia, hipertermia, un agente alquilante, antimetabolitos, extractos vegetales, alcaloides vegetales, nitrosourea, hormona, análogos de nucleósidos
35 o nucleótidos, un linfocito, una célula plasmática, un macrófago, una célula dendrítica, un linfocito NK o un linfocito B, un anticuerpo, un factor de crecimiento celular, un factor de supervivencia celular, un factor diferenciativo celular, una citoquina, un interferón o una quimioquina.
Los anticuerpos y sus fragmentos funcionales son útiles para detectar, seleccionar para e identificar la presencia de células o un antígeno (por ejemplo, la proteína NONO/nmt55) que se une al anticuerpo LM1. Se describen en el presente documento métodos para detectar o seleccionar células y antígenos (por ejemplo, la proteína NONO/nmt55) que se une al anticuerpo LM1, como se representa por el anticuerpo por la línea celular DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13 y los métodos para identificar un sujeto que sean 45 respetuosos con el tratamiento de acuerdo con los métodos de la invención. En una realización, el método incluye poner en contacto un material o muestra biológica con un anticuerpo o fragmento funcional en condiciones que permitan al unión entre el anticuerpo o fragmento celular y la célula o el antígeno que se une al anticuerpo LM1, como se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con n.º de registro DSM ACC 2623 o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13, y evaluar la unión del anticuerpo o fragmento funcional a una célula o antígeno que se une al anticuerpo LM1, como se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representada por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o13 La unión del anticuerpo o fragmento funcional a una célula o antígeno que se une al anticuerpo LM1, como se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con n.º de
55 registro DSM ACC 2623 o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13, indica que el material biológico contiene la célula o antígeno que se une al anticuerpo LM1, como se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representada por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o13 En otra realización, el método incluye analizar una muestra biológica para la presencia de un antígeno al cual se une LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55). La presencia de una célula o antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55) que se une a LM1 identifica a un sujeto que es adecuado para el tratamiento de acuerdo con los métodos de la invención. En un aspecto, el material o muestra biológica se obtiene de un sujeto mamífero (por ejemplo, primate, tal como un ser humano).
65 Se describen en el presente documento métodos para diagnosticar un sujeto que tiene o está en riesgo aumentado de tener una proliferación celular indeseable o un trastorno proliferativo celular (por ejemplo, neoplasia, tumor o
cáncer, o metástasis),métodos para determinar o discernir la presencia o la extensión de una proliferación celular indeseable o anómala o un trastorno hiperproliferativo celular (por ejemplo, neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis), así como los métodos para identificar un sujeto adecuado para el tratamiento con un anticuerpo LM1, o un anticuerpo que se une a un antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55). En diversas realizaciones, el método 5 incluye poner en contacto un material o muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo o fragmento funcional que compite con el anticuerpo LM1, como se representa por el anticuerpo producido por la línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623) o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13 para la unión o un anticuerpo o fragmento funcional que se une a una célula o antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55) al cual se une el anticuerpo LM1, como se representa por el anticuerpo producido por la línea de células DSMZ con N.º registro. DSM ACC 2623, o representado por las secuencias de la cadena pesada y ligera que se muestra como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13, o un anticuerpo o fragmento funcional que incluye la secuencia de la región variable de la cadena pesada o la cadena ligera, como se representa por el anticuerpo producido por la línea de células DSMZ con N.º de registro. DSM ACC 2623, o representada por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID 15 NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13 en condiciones que permitan la unión del anticuerpo o fragmento funcional, y evaluar la unión del anticuerpo a una célula o antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55) que se une al anticuerpo LM1, como se representa por un anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representada por las secuencias que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13. La presencia o la cantidad de una célula o un antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55) puede estar correlacionada con la presencia o extensión de una neoplasia, tumor o cáncer, diagnosticando por tanto a un sujeto que tiene o está en riesgo aumentado de tener una proliferación celular indeseable o un trastorno proliferativo (por ejemplo, neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis), o establecer la presencia o extensión de una neoplasia, tumor o cáncer. La presencia
o cantidad de una célula o un antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55) pueden identificar también un sujeto adecuado para el tratamiento con un anticuerpo LM1, o un anticuerpo que se une a un antígeno de LM1 (por ejemplo,
25 NONO/nmt55), debido a una probabilidad de responder a tratamiento. En aspectos concretos, los métodos para diagnosticar a un sujeto identifican aquellos que tienen (por ejemplo, la presencia o extensión) o están en riesgo creciente de tener una proliferación celular indeseable o un trastorno proliferativo celular (por ejemplo neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis). En un aspecto, el material o muestra biológica se obtiene de un sujeto mamífero (por ejemplo, primate, tal como un ser humano). En aspectos adicionales, el material o la muestra biológica comprende una biopsia, tal como biopsia de pulmón, páncreas, estómago, mama, esófago, ovario o útero.
Descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una gráfica que representa el análisis funcional del anticuerpo LM1 in vitro. Se midieron las
35 consecuencias del tratamiento con el anticuerpo sobre la proliferación de líneas de células de carcinoma diferentes utilizando un ensayo de proliferación del bromuro de 3(4,5dimetiltiazol2il)2,5difeniltetrazolio ("MTT"), que muestra una inhibición dependiente de la concentración de la proliferación celular de LM1 en la línea de células LOUNH91 de carcinoma de pulmón o carcinoma de páncreas. El control para estos estudios agotó el sobrenadante del cultivo celular con anticuerpos IgM no relacionados añadidos a concentraciones similares.
Las Figuras 2A y 2B muestran una serie de gráficas de los resultados de los ensayos de reducción de MTT para la actividad de la deshidrogenasa mitocondrial que muestra que el anticuerpo monoclonal LM1 inhibe la proliferación celular y disminuye la supervivencia, o induce la apoptosis del carcinoma de células epidermoide
45 EPLC272H de las células pulmonares tras A) 24 horas de incubación; y B) 48 horas de incubación.
La Figura 3 muestra una gráfica que muestra que el anticuerpo LM1 induce la apoptosis. En estos estudios se detectó la apoptosis de la línea de células LOUNH91 de carcinoma de pulmón utilizando el ensayo de apoptosis ELISA.sup.PLUS para la detección de la muerte celular. El control en estos estudios agotó el sobrenadante del cultivo celular a una concentración similar.
Las Figuras 4A y 4B muestran una serie de gráficas de los resultados de un ELISA de muerte celular que muestran que el anticuerpo monoclonal LM1 induce la apoptosis de las células LOUNH91 después de A) 24 horas de incubación; y B) 48 horas de incubación.
55 Las Figuras 5A-5F muestras A) los espectros MALDITOF para LM1; y los resultados de la selección para la unión del anticuerpo LM1 a B) monosacáridos, C) disacáridos, D) trisacáridos, E) tetrasacáridos y F) oligosacáridos.
La Figura 6 muestra el peso corporal de ratones a los que se había inyectado LM1, que se mantuvo durante 8 semanas después de la inyección. El peso corporal en el control sin inyección y el control inyectado sin IgM específica se redujo en casi un 20 % debido a la mala salud producida por la metástasis del hígado
La Figura 7 muestra los datos que indican que el anticuerpo LM1 puede reducir el establecimiento de la 65 metástasis, formación, o proliferación tumoral (crecimiento).
La Figura 8A-8B muestra el análisis de preparación de la membrana de células BxPC3 mediante electroforesis en gel de poliacrilamida 2D (PAGE). A) Proteínas fraccionadas transferidas a una membrana de PVDF y teñidas con anticuerpo LM1; y B) Manchas de la membrana de PVDF que se unen a LM1, que se superpusieron sobre un PAGE teñido de plata, y las manchas correspondientes se escindieron del gel y se sometieron a un análisis
5 MALDITOF.
Las Figuras 9A-9D muestran la identificación de la diana de LM1. A) Cromatografía en gel de extractos de BXPC3; B)D) se seleccionaron las fracciones 9 y 10 y se sometieron a cromatografía de intercambio aniónico y a la inmunotransferencia posterior con el anticuerpo LM1.
Las Figuras 10A-10C muestran el ARNip transfectado a células BxPc3 para regular por defecto la expresión de NONO/nmt55 y la unión reducida de LM1. A) expresión de NONO/nmt55 regulada por defecto por el ARNip; B) Se redujo la unión de LM1 a las células transfectadas con ARNip (flecha) y C) Control de la carga.
15 Las Figuras 11A-11D muestran la inmunoprecipitación de las células MKN con un anticuerpo dirigido contra nmt55, y la posterior tinción con A) mAb dirigido contra NONO/nmt55 de ratón/ HRP dirigido contra IgG de ratón; B), HRP dirigido contra IgG de ratón; C), LM1 / HR dirigido contra IgM humana y D) HRP dirigido contra IgM humana. La flecha superior (peso molecular más elevado) es NONO, y la flecha inferior (peso molecular más bajo) es la cadena pesada de ratón.
Las Figuras 12A-12B muestran la inmunoprecipitación de las células BxPC3 con anti nmt55, y la posterior tinción con A) LM1; y B) anti NONO/nmt55. Las flechas indican nmt55 y la cadena pesada de la IgG de ratón.
Las Figuras 13A-13B muestran la inmunoprecipitación de las células A549 con anti nmt55 y la posterior tinción
25 con A) anti NONO/nmt55; y B) LM1. Las flechas indican las posiciones de nmt55 y la cadena pesada de la IgG de ratón.
Las Figuras 14A-14B muestran los datos indicativos de la unión de LM1 a la proteína NONO/nmt556xHis expresada de forma recombinante.
La Figura 15 muestra los datos indicativos de la unión de LM1 a la proteína NONO/nmt556xHis expresada de forma bacteriana.
Las Figuras 16A-16C muestran el análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) de A) expresión de
35 nmt55 Banda 1) marcador de pesos moleculares Novex Sharp Banda 2) Muestrear el nivel del valor inicial que muestra la expresión de la proteína, Banda 3) TFINAL que muestra el nivel de expresión de nmt55 posterior a la inducción térmica; B) nmt55 tras la purificación de Profina™ Banda 1) Marcador de pesos moleculares Novex Sharp, Banda 2) nmt55 purificado y concentrado a partir de la expresión periplásmica; y C) transferencia western de nmt55 tras la purificación con Profina™ Banda 1) marcador de pesos moleculares Novex Sharp, Banda 2) nmt55 purificado y concentrado detectado utilizando LMlopt scFv.
Descripción detallada
La invención se basa, al menos en parte, en los anticuerpos que se unen a diversas células neoplásicas, 45 cancerosas, tumorales y metastásicas.
La invención se basa también, al menos en parte, en la identificación de una diana de LM1, es decir, un antígeno que se une a LM1. Como se divulga en el presente documento, el anticuerpo LM1 se une a la proteína de unión al octámero que contiene el dominio nonpou (NONO), conocida también como proteína de unión al ADN y al ARN nuclear de 54 kDa (p54nrb) y proteína nuclear de 55 kDa (nmt55) NONO/nmt55 se puede dirigir para el tratamiento de una neoplasia, cáncer, tumor o metástasis. NONO/nmt55 puede ser un indicador diagnóstico de una neoplasia, cáncer, tumor o metástasis. Por ejemplo, la detección de NONO/nmt55 sobre la superficie celular puede indicar la presencia de una neoplasia, cáncer, tumor o metástasis. NONO/nmt55 puede ser también una vacuna. Por ejemplo, NONO/nmt55 puede administrarse a un sujeto con una neoplasia, cáncer, tumor o metástasis que expresa la 55 superficie celular de NONO/nmt55 a fin de estimular una respuesta inmunitaria contra una neoplasia, cáncer, tumor
o metástasis.
Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos son proteínas que incluyen aminoácidos, o "restos" unidos covalentemente mediante un enlace amida o equivalente. El término "monoclonal", cuando se usa en referencia a un anticuerpo, se refiere a un anticuerpo que se basa en, obtenido o derivado de un clon único, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota, o fago. Un anticuerpo "monoclonal" se define por tanto en el presente documento estructuralmente, y no el método por el cual se produce.
Los anticuerpos de la invención pueden pertenecer a cualquier clase de anticuerpo, IgM, IgG, IgE, IgA, IgD, o a 65 cualquier subclase. Las subclases ilustrativas de IgG son IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
Los anticuerpos de la invención pueden tener secuencias de la cadena ligera kappa lambda tanto de anticuerpos de longitud completa como de anticuerpos que se producen naturalmente, sus mezclas (es decir, fusiones de secuencias de cadenas kappa y lambda), y sus subsecuencias/fragmentos. Las moléculas de anticuerpos que se producen naturalmente contienen dos cadenas ligera kappa o dos cadenas ligeras lambda
5 Las secuencias de aminoácidos y las secuencias de ácidos nucleicos del anticuerpo LM1, como se representan por diversas secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera, las SEQ ID Nos:110, son como sigue:
La región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano LM1, como se representa por las
10 secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 y 9) y las secuencias de ácidos nucleicos (SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 y 10), respectivamente, con diferencias que se muestran en negrita:
La secuencia de aminoácidos de la secuencia de la región variable de la cadena pesada (VH) de LM1, como se representa por la SEQ ID NO:1:
La secuencia de aminoácidos de la secuencia de la región variable de la cadena pesada (VH) de LM1, como se representa por la SEQ ID NO:3 (1BTA1.16VH):
La secuencia de aminoácidos de la secuencia de la región variable de la cadena pesada (VH) de LM1, como se representa por la SEQ ID NO:5 (1BTA1.7VH):
La secuencia de aminoácidos de la secuencia de la región variable de la cadena pesada (VH) de LM1, como se representa por la SEQ ID NO:7 (1BTA2.5 VH):
La secuencia de aminoácidos de la secuencia de la región variable de la cadena pesada (VH) de LM1, como se representa por la SEQ ID NO:9 (VHL1opt):
La secuencia de nucleótidos de la secuencia de la región variable de la cadena pesada (VH) de LM1, como se representa por la SEQ ID NO:2:
La secuencia de nucleótidos de la secuencia de la región variable de la cadena pesada (VH) de LM1, como se representa por la SEQ ID NO:4:
La secuencia de nucleótidos de la secuencia de la región variable de la cadena pesada (VH) de LM1, como se representa por la SEQ ID NO:6:
La secuencia de nucleótidos de la secuencia de la región variable de la cadena pesada (VH) de LM1, como se representa por la SEQ ID NO:8:
La secuencia de nucleótidos de la secuencia de la región variable de la cadena pesada (VH) de LM1, como se representa por la SEQ ID NO:10:
10 Las regiones variables de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano LM1, como se representa por las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 11 y 13) y las secuencias de ácidos nucleicos (SEQ ID NO:12 y 14), respectivamente, son como sigue
15 La secuencia de aminoácidos de la secuencia de la región variable de la cadena ligera (VL) de LM1, como se representa por la SEQ ID NO:11:
La secuencia de aminoácidos de la secuencia de la región variable de la cadena ligera (VL) de LM1, como se 20 representa por la SEQ ID NO:13 (VKL1opt):
La secuencia de aminoácidos de la secuencia de la región variable de la cadena ligera (VL) de LM1, como se representa por la SEQ ID NO: 15:
La secuencia de nucleótidos de la secuencia de la región variable de la cadena ligera (VL) de LM1, como se representa por la SEQ ID NO: 12 (1BTA1.16 VL):
La secuencia de nucleótidos de la secuencia de la región variable de la cadena ligera (VL) de LM1, como se 10 representa por la SEQ ID NO: 14 (VKL1opt),
Las CDR previstas, de las cuales existen tres en cada una de la cadena pesada y la cadena ligera, se denotan
15 convenientemente en el presente documento como HCCDR1, HCCDR2 y HCCDR3; y LCCDR1, LCCDR2 y LCCDR3. Las posiciones de las CDR se basan en las definiciones de Kabat (por ejemplo, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service (1987), y Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. US Department of Health and Human Services, Public Health Service (1991)), excepto que la numeración de las CDR se base en el número de restos de
20 aminoácidos de las secuencias que se muestran en el presente documento comenzando desde el extremo amino y no sigan el sistema de numeración de Kabat. Se modeló la colocación de la CDR de la región variable de la cadena pesada después de la región variable del anticuerpo herceptina (archivo PDB 1N8Z) debido a un 95 % de identidad de la secuencia cono los restos del marco, y se modeló la colocación de la CDR de la región variable de la cadena ligera después del archivo PDB 1RHEa debido a un 82 % de identidad de la secuencia con los restos del marco.
25 Las secuencias de las CDR previstas de la cadena de la región variable de la cadena pesada ilustrativa son la CDR1; VSGGSISSGGYY, CDR2; YIYYSGSTYYNPSLKS, y CDR3; VDARYDYVWGSYRYDAFDI. La CDR1 de la
cadena pesada expande los nucleótidos 72105 que codifican los aminoácidos 2435, la CDR2 expande los nucleótidos 156201 que codifican los aminoácidos 5267 y la CDR3 expande los nucleótidos 300354 que codifican los aminoácidos 100118.
5 Las secuencias de las CDR previstas de la cadena ligera de la región variable son 90101, CDR1; SGSSSNIGNNYVS, CDR2; DNNKRPSG, y CDR3; GTWDSSLSAGWV. La CDR1 de la cadena ligera lambda expande los nucleótidos 69105 que codifica los aminoácidos en las posiciones 2335. La CDR2 expande los nucleótidos 153174 que codifican los aminoácidos 5158 y la CDR3 expande los nucleótidos 270303 y codifica los aminoácidos 90101.
10 De acuerdo con la invención, se proporcionan anticuerpos aislados y purificados y fragmentos funcionales (por ejemplo, unión a célula o a antígeno) estructural y/o funcionalmente relacionados con el anticuerpo LM1, como ha definido en las SEQ ID NO:1, 3, 5,7 o 9, y 11 o 13, respectivamente. En diversas realizaciones, los anticuerpos y fragmentos funcionales compiten con el anticuerpo LM1 que se representa por el anticuerpo producido por una
15 línea de células DSMZ N.º de registro DSM ACC 2623 o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 5, 7 o 9, y 11 o 13 para la unión a una célula o antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55). En realizaciones adicionales, los anticuerpos y fragmentos funcionales compiten con el anticuerpo LM1 que se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ N.º de registro DSM ACC 2623 o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las
20 SEQ ID NO:1, 5, 7 o 9, y 11 o 13 para la unión a un antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55) o a una célula de adenocarcinoma o a una célula escamosa.
De acuerdo con la invención, se proporcionan también anticuerpos aislados y purificados y fragmentos funcionales (por ejemplo., unión a célula o unión a antígeno) que se unen a la proteína NONO/nmt55. En diversas realizaciones,
25 los anticuerpos y fragmentos funcionales se unen a una región de la secuencia de aminoácidos NONOnmt55 del extremo N (por ejemplo, aminoácidos 1300 de NONOnmt55). En un aspecto, NONOnmt55 incluye una secuencia que se muestra como:
En otro aspecto, NONOnmt55 incluye una secuencia que se muestra como:
35 El término "unido," o "unión," cuando se usa en referencia a un anticuerpo o fragmento funcional, significa que el anticuerpo o fragmento funcional interactúa a nivel molecular con un epítopo correspondiente (determinante antigénico) presente en una célula o en un antígeno (por ejemplo, NONOnmt55) Los epítopos de antígenos que comprende aminoácidos incluyen normalmente secuencias relativamente cortas, por ejemplo, de aproximadamente cinco a 15 aminoácidos de longitud. Los epítopos pueden ser contiguos o no contiguos. Se forma un epítopo de una
40 secuencia de aminoácidos no contigua debido al plegamiento de la proteína. Los expertos en la técnica conocen las técnicas para identificar epítopos e incluyen seleccionar los oligopéptidos que se solapan para la unión a un anticuerpo (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.º 4.708.871), kits de bibliotecas de péptidos de expresión en fagos, que están comercialmente disponibles para la cartografía de epítopos (New England BioLabs). Los epítopos pueden identificarse también por inferencia cuando se usan secuencias peptídicas para lo longitud del epítopo con el
45 fin de inmunizar animales a partir de los cuales se obtienen los anticuerpos que se unen a la secuencia peptídica y se pueden prever utilizando programas informáticos tales como BEPITOPE (Odorico et al., J. Mol. Recognit. 16:20 (2003)).
La invención proporciona además anticuerpos y fragmentos funcionales que inhiben, disminuyen o reducen el 50 crecimiento o la proliferación celular o estimulan o inducen la muerte celular, la lisis o la apoptosis.
El término "identidad" y sus variaciones gramaticales significa que dos o más entidades a las que se hace referencia son iguales. De esta manera, cuando son idénticas dos secuencias de anticuerpos, tienen la misma secuencia de aminoácidos, al menos en la región o parte a la que se hace referencia. Cuando son idénticas dos secuencias de ácidos nucleicos, tienen la misma secuencia de polinucleótidos, al menos en la región o parte a la que se hace 5 referencia. La identidad puede ser sobre un área definida (región o dominio) de la secuencia. Un "área de identidad" se refiere a una parte de dos o más entidades a las que se hace referencia que son iguales. De esta manera, dos secuencias de proteínas o de ácidos nucleicos son idénticas en una o más regiones de la secuencia, comparten identidad en esta región. Las identidades ilustrativas son anticuerpos y fragmentos funcionales con una secuencia de aminoácidos con un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o más de identidad de secuencia con un anticuerpo o
10 fragmento funcional de referencia, por ejemplo, el anticuerpo LM1, como se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, y representado por las secuencias de la cadena pesada y ligera que se muestran como las SEQ ID NO: 1, y 11 o una de sus subsecuencias.
Los términos "homólogo" u "homología" significan que dos o más entidades a las que se hace referencia comparten
15 al menos una identidad parcial sobre una región o parte dada. "Áreas, regiones o dominios" de homología o identidad significan que una parte de dos o más entidades a las que se hace referencia comparten homología o son iguales. De esta manera, cuando dos secuencias de anticuerpos son idénticas en una o más regiones de la secuencia, comparten identidad en estas regiones. "Homología sustancial" significa que una molécula se conserva estructural o funcionalmente de tal manera que tiene o está previsto que tenga al menos una estructura o función
20 parcial de una o más de las estructuras o funciones (por ejemplo, una función biológica) de la molécula de referencia, o de la región relevante/correspondiente de la molécula de referencia con la comparte homología.
La extensión de la identidad (homología) entre dos secuencias puede discernirse utilizando un programa informático y un algoritmo matemático conocido en la técnica. Dichos algoritmos que calculan el porcentaje de identidad de la 25 secuencia (homología) tiene en cuenta generalmente huecos de secuencia y emparejamientos incorrectos sobre la región o área comparativa. Por ejemplo, un algoritmo de búsqueda BLAST (por ejemplo, BLAST 2.0) (véase, por ejemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990), públicamente disponible a través de NCBI) tiene parámetros de búsqueda ilustrativos, como sigue: Emparejamiento incorrecto 2; apertura de hueco 5; extensión de hueco 2 Para comparaciones entre las secuencias polipeptídicas, un algoritmo BLASTP se usa normalmente en combinación con
30 una matriz de puntuación, tal como PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 o BLOSUM 50. Se usan también programas de comparación de secuencias FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) y SSEARCH Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132:185 (2000); y Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195 (1981)). Programs for quantitating protein structural similarity using Delaunaybased topological mapping have also been developed (Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003)).
35 Se puede determinar la afinidad mediante la constante de asociación (Ka) y disociación (Kd). La constante de afinidad del equilibrio, K, es la relación de Ka/Kd. Las constantes de asociación (Ka) y disociación (Kd) se pueden medir utilizando resonancia de plasmón superficial (SPR) (Rich y Myszka, Curr. Opin. Biotechnol. 11:54 (2000); Englebienne, Analyst. 123:1599 (1998)). La instrumentación y los métodos para la detección y vigilancia en tiempo
40 real de las constantes de unión se conocen y están comercialmente disponibles (BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala, Suecia; y Malmqvist, Biochem. Soc. Trans. 27:335 (1999)).
Se describen y se proporcionan también en el presente documento anticuerpos y fragmentos funcionales con la condición de que las formas modificadas retengan, al menos una parte de una actividad o función de un anticuerpo
45 no modificado o de referencia o de un fragmento funcional.
Como se usa en el presente documento, el término "modificar" y sus variaciones gramaticales, significa que la composición se aparta de una composición de referencia Dichas proteínas, ácidos nucleicos y otras composiciones modificadas pueden tener más o menos actividad que o una función distinta de una proteína, ácido nucleico, o
50 composición no modificada de referencia.
Las modificaciones que incluyen sustituciones, adiciones y deleciones, se pueden denominar "variantes." Los ejemplos no limitantes específicos de variantes de aminoácidos incluyen el anticuerpo LM1 que se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ N.º de registro DSM ACC 2623 o representado por las
55 secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 5, 7 o 9, y 11 o 13 o los fragmentos y las subsecuencias.
Como se usa en el presente documento, el término "fragmento" o "subsecuencia" significa una parte de la molécula de longitud completa. De esta manera, un fragmento o subsecuencia de un anticuerpo tiene uno o más aminoácidos 60 menos que un anticuerpo de referencia intacto de longitud completa (por ejemplo, una o más deleciones de aminoácidos internos o terminales procedentes tanto de los términos amino o carboxi como de las regiones variables
o constantes de la cadena pesada o ligera). Un fragmento de ácido nucleico tiene al menos un nucleótido menos que la secuencia de ácido nucleico comparativa de longitud completa. Los fragmentos, por tanto, pueden ser de cualquier longitud hasta la molécula nativa de longitud completa.
Los términos "fragmento funcional" y "subsecuencia funcional" cuando se refieren a un anticuerpo se refieren a una parte de un anticuerpo con una función o actividad. Por ejemplo, un fragmento funcional puede retener una o más funciones o actividades parciales como un anticuerpo de referencia intacto, por ejemplo, una función o actividad del anticuerpo LM1, que se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro
5 DSM ACC 2623, o representado por las secuencias de la cadena pesada y ligera que se muestran como SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13. Por ejemplo, una subsecuencia del anticuerpo LM1 que compite para la unión del anticuerpo LM1 intacto de longitud completa, que se representa por un anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representado por las secuencias de la cadena pesada y ligera que se muestra como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13 para una célula o para un antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55), o que se une a una célula o antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55) al cual se une el anticuerpo LM1 intacto de longitud completa que se considera una subsecuencia funcional.
Una "sustitución conservativa" es la sustitución de un aminoácido por un resto similar biológica, química o estructuralmente. biológicamente similar significa que la sustitución no destruye la actividad biológica, por ejemplo, la
15 unión a la célula o la proliferación celular que inhibe o induce la apoptosis o que estimula la actividad. Estructuralmente similares significa que los aminoácidos tienen cadenas secundarias con longitud similar, tales como alanina, glicina y serina, o un tamaño similar. Similitud química significa que los restos tienen la misma carga o son ambos hidrófilos o hidrófobos. Los ejemplos concretos incluyen la sustitución de un resto hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina para otro, o la sustitución de un resto polar por otros, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, serina por treonina, y similares.
En realizaciones concretas, una secuencia de la región hipervariable de la cadena pesada o ligera o de una región de la misma, tal como una CDR (CDR1, CDR2 o CDR3; los aminoácidos 2435, 5267 o 100118 de la SEQ ID NO:
25 1, 3, 5, 7 o 9, o los aminoácidos 2335, 5158 o 90101 de la SEQ ID NO: 11) o la FR tendrá 110, 15, 13 o menos (por ejemplo, 1 o 2) sustituciones de aminoácidos. En una realización adicional, una sustitución de aminoácido en una secuencia de la región hipervariable de la cadena pesada o ligera no está dentro de más de una CDR. En una realización adicional, una sustitución en una secuencia de la región hipervariable de la cadena pesada o ligera no está dentro de una CDR. En otra realización, una sustitución en una secuencia de la región hipervariable no está dentro de una FR.
El efecto de una modificación dada puede evaluarse fácilmente a fin de identificar los anticuerpos y los fragmentos funcionales que retienen al menos una parte de la actividad de unión de la célula o antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55), la afinidad o la función del anticuerpo o la actividad del anticuerpo no modificado, por ejemplo, el
35 anticuerpo LM1 producido por la línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representado por las secuencias pesada y ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13. Por ejemplo, una sustitución de aminoácido en una región variable (por ejemplo, dentro o fuera de CDR1, CDR2 o CDR3) del anticuerpo LM1, que se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623 o representado por las secuencias de la cadena pesada y ligera que se muestran como SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13 se pueden evaluar para la unión a la célula o al antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55), que inhibe la proliferación celular o reduce la actividad, induciendo o estimulando la muerte celular, la lisis o la apoptosis, etc.
Se puede usar el análisis de la mutabilidad regional para prever el efecto de sustituciones concretas en regiones
45 determinantes de la complementariedad (CDR) y en regiones marco (FR) (Shapiro et al., J Immunol. 163:259 (1999)). En resumen, la comparación de las secuencias indica una jerarquía o mutabilidad entre secuencias de dinucleótidos y trinucleótidos localizados en el ADN intrónico de Ig que prevé regiones que son más o menos mutables. Se pueden usar relaciones de estructuraactividad cuantitativa (QSAR) para identificar la naturaleza del dominio de reconocimiento del anticuerpo y, por tanto, los aminoácidos que participan en la unión del ligando. Los modelos predictivos basados en QSAR pueden a su vez utilizarse para prever el efecto de sustituciones (mutaciones). Por ejemplo, se ha utilizado el efecto de las mutaciones sobre la constante de asociación y disociación de un anticuerpo que interactúa con su antígeno para construir modelos predictivos cuantitativos para ambas constantes cinéticas (Ka and Kd) que a su vez se usan para prever el efecto de otras mutaciones sobre el anticuerpo (De Genst et al., J Biol Chem. 277:29897 (2002)). El técnico experto puede por tanto utilizar dichos análisis para
55 identificar las sustituciones de aminoácidos de los anticuerpos y los fragmentos funcionales que dan probablemente como resultado un anticuerpo o fragmento funcional que retiene al menos la actividad o la función parcial del anticuerpo o fragmento funcional no sustituido.
Las sustituciones de aminoácidos pueden ser con el mismo aminoácido, excepto que el aminoácido que se produce naturalmente se sustituye con un aminoácido de forma D Las modificaciones incluyen por tanto uno o más Daminoácidos, sustituidos por Laminoácidos, o mezclas de Daminoácidos sustituidos por Laminoácidos. Las modificaciones incluyen también análogos estructurales y funcionales, por ejemplo, peptidomiméticos que tienen aminoácidos sintéticos o no naturales o análogos de aminoácidos y las formas derivatizadas.
65 Las formas modificadas incluyen además secuencias derivatizadas, por ejemplo, aminoácidos en los que los grupos amino libres forman clorhidratos de aminas, grupos ptolueno sulfonilo, grupos carbobenzoxi; los grupos carboxi
libres procedentes de sales, ésteres metílicos y etílicos; los grupos hidroxilo libres que forman derivados de Oacilo u Oalquilo, así como los derivados de aminoácidos que se producen naturalmente, por ejemplo, 4hidroxiprolina, para prolina, 5hidroxilisina para lisina, homoserina para serina, ornitina para lisina, etc. Se pueden producir modificaciones utilizando los métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, modificaciones y mutagénesis dirigidas
5 al sitio basadas en la PCR, mutagénesis mediante deleción e inserción, modificación química y mutagénesis, reticulación, etc.).
Las formas modificadas incluyen adiciones e inserciones. Por ejemplo, una adición puede ser una unión covalente o una unión no covalente de cualquier tipo de molécula a una proteína (por ejemplo), ácido nucleico u otra composición. Normalmente, las adiciones e inserciones confieren una función o actividad distinta.
Las adiciones e inserciones incluyen un polipéptido de fusión (quimérico) o secuencias de ácido nucleico, que es una secuencia que tiene una o más moléculas no normalmente presentes en una secuencia nativa de referencia (natural) unida covalentemente a la secuencia. Un ejemplo concreto es una secuencia de aminoácidos de otra
15 proteína (por ejemplo, anticuerpo) para producir una proteína multifuncional (por ejemplo, anticuerpo multiespecífico).
De acuerdo con la invención, se proporcionan anticuerpos, ácidos nucleicos, y otras composiciones que incluyen un dominio heterólogo. De esta manera, un dominio heterólogo puede consistir en cualquiera de varios diferentes tipos de restos funcionales pequeños o grandes. Dichos restos incluyen ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, lípidos o compuestos orgánicos pequeños, tal como un fármaco (por ejemplo, un agente antiproliferativo celular), metales (oro, plata), etc. un dominio heterólogo puede ser una adición o inserción de un aminoácido.
Los ejemplos no limitantes concretos de dominios heterólogos incluyen, por ejemplo, etiquetas, marcas detectables y
25 agentes citotóxicos. Los ejemplos específicos de etiquetas y marcas detectables incluyen enzimas (peroxidasa de rábano picante, ureasa, catalasa, fosfatasa alcalina, betagalactosidasa, cloranfenicol transferasa); sustratos enzimáticos; ligandos (por ejemplo, biotina); receptores (avidina); radionucleidos (por ejemplo, C14,S35,P32,P33,H3 , 1125,1131, galio67 y 68, escandio47, indio 111, radio223); T7, His, myc, HA y etiquetas FLAG; reactivos densos en electrones; moléculas de transferencia de energía; marcas paramagnéticas; fluoróforos (fluoresceína, fluoroescamina, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina); cromóforos; agentes quimioluminiscentes (imidazol, luciferasa, acridinio, oxalato); y agentes bioluminiscentes. Los ejemplos específicos de agentes citotóxicos (citotoxinas) incluyen difteria, toxina, toxina del cólera y ricina.
Los ejemplos adicionales de dominios heterólogos incluyen, por ejemplo, agentes proliferativos anticelulares (por
35 ejemplo, agentes antineoplásicos, agentes antitumorales o anticancerosos o agentes antimetastásicos). Los ejemplos no limitantes específicos de agentes proliferativos anticelulares (por ejemplo, agentes antineoplásicos, agentes antitumorales o anticancerosos, o agentes antimetastásicos, citotoxinas, etc.) se divulgan en el presente documento y se conocen en la técnica.
Se pueden insertar secuencias enlazadoras entre la proteína (por ejemplo, anticuerpo), ácido nucleico, u otra composición y la adición o inserción (por ejemplo, dominio heterólogo) de tal manera que dos entidades mantienen, al menos en parte, una función o actividad distinta. Las secuencias enlazadoras pueden tener una o más propiedades que incluyen una estructura flexible, una incapacidad para formar una estructura secundaria ordenada o un carácter hidrófobo o cargado que podría promover o interactuar con cualquier dominio. Los aminoácidos que se
45 encuentran normalmente en regiones flexibles de la proteína incluyen Gly, Asn y Ser. Pueden utilizarse otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala en la secuencia enlazadora. La longitud de la secuencia enlazadora puede variar (véase, por ejemplo Patente de estados Unidos N.º 6.087.329). Los enlazadores incluyen agentes de reticulación química y agentes de conjugación, tales como derivados de sulfosuccinimidilos (sulfoSMCC, sulfoSMPB), disuccinimidil suberato (DSS), disuccinimidil glutarato (DSG) y disuccinimidil tartrato (DST).
Los ejemplos adicionales de adiciones incluyen glicosilación, ácidos grasos, lípidos, acetilación, fosforilación, amidación, formilación, ubiquitinación, y derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes y cualquiera de numerosas modificaciones químicas. Otras permutaciones y posibilidades serán fácilmente evidentes para las personas normalmente expertas en la materia, y se consideran que están comprendidas en el alcance de la
55 invención.
El término "aislado" utilizado como un modificador de una composición significa que la composición se prepara manualmente o se separa a partir de uno o más componentes diferentes en su entorno in vivo que se produce naturalmente. Generalmente, las composiciones separadas de esta manera están sustancialmente exentas de uno o más materiales con los que se asocian normalmente en la naturaleza, por ejemplo, una o más proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, hidratos de carbono, membrana celular. De esta manera, una composición aislada se separa sustancialmente de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el que la composición se produce naturalmente, o a partir del medio artificial en el que se produce (por ejemplo, sintéticamente o a través de cultivo celular). Por ejemplo, un polipéptido aislado se separa sustancialmente de otros polipéptidos y ácidos nucleicos y no 65 incluye una biblioteca de polipéptidos o polinucleótidos presentes entre millones de secuencias de polipéptidos o secuencias de ácidos nucleicos, tal como, por ejemplo, una biblioteca de polipéptidos, genómica o de ADNc Un
ácido nucleico aislado está sustancialmente separado de otros polipéptidos y ácidos nucleicos y no incluye una biblioteca de polipéptidos o polinucleótidos presente entre millones de secuencias de polipéptidos o ácidos nucleicos, tal como, por ejemplo, una biblioteca de polipéptidos, genómica o de ADNc El término "aislado" no excluye las formas físicas alternativas de la composición, por ejemplo, una proteína aislada podría incluir multímeros
5 de proteínas, modificaciones posteriores a la traducción (por ejemplo, glicosilación, fosforilación) o las formas derivatizadas.
El término "purificado" utilizado como un modificador de la composición se refiere a una composición exenta de la mayoría o todos los materiales con los que se asocia normalmente en la naturaleza. De esta manera, una proteína
10 separada de las células se considera que está sustancialmente purificada cuando se separa de los componentes celulares mediante métodos normalizados mientras que una secuencia de ácido nucleico químicamente sintetizada se considera que está sustancialmente purificada cuando se separa de sus precursores químicos. Purificado no requiere por tanto pureza absoluta. Además, una composición "purificada" se puede combinar con una o más moléculas diferentes. De esta manera, el término "purificado" no excluye combinaciones de composiciones.
15 Las proteínas y ácidos nucleicos "purificados" incluyen proteínas y ácidos nucleicos producidos mediante métodos de purificación normalizados. El término incluye también proteínas y ácidos nucleicos producidos mediante expresión recombinante en una célula hospedadora así como la síntesis química. "Purificado" puede referirse también a una composición en la que el nivel de contaminantes está por debajo de un nivel que es aceptable para
20 un organismo regulador para la administración a un animal humano o no humano, por ejemplo, la Food and Drug administration (FDA).
Pureza sustancial puede ser al menos de aproximadamente 60 % o más de la molécula en masa. Pureza puede ser también de aproximadamente 70 % u 80 % o más, y puede ser mayor, por ejemplo, 90 % o más. Pureza puede ser
25 menos, por ejemplo, en un transportador farmacéutico, la cantidad de una molécula en % en peso puede ser menor del 60 %, pero la proporción relativa de la molécula en comparación con otros componentes con los cuales se asocia normalmente será mayor. Se puede determinar la pureza mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, la espectroscopía de UV, la cromatografía (por ejemplo, HPLC en fase gas), electroforesis en gel (por ejemplo, tinción de plata o Coomassie) y el análisis de la secuencia (péptidos y ácidos nucleicos).
30 Se conocen en la técnica los métodos de producir anticuerpos policlonales y monoclonales. Por ejemplo, el antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55) o uno de sus fragmentos inmunógenos, conjugados opcionalmente a un transportador tal como hemocianina de lapa californiana (KLH) u ovoalbúmina (por ejemplo, BSA), o mezclados con un adyuvante, tal como el adyuvante completo o incompleto de Freund, y se usa para inmunizar un animal.
35 Utilizando la tecnología convencional del hibridoma, se pueden aislar esplenocitos de animales inmunizados que responden al antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55) y fusionarse con células de mieloma. Se pueden seleccionar los anticuerpos producidos por los hibridomas para la reactividad con el antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55), por ejemplo, mediante ELISA. Los métodos particulares no limitantes adicionales de cribado y selección de anticuerpos y fragmentos funcionales incluyen la expresión en fagos, unión proteínaARNm mediante
40 ribosomas y expresión en ARNm, expresión en células de levaduras, bacterias, de mamíferos o retrovirus, compartimentalización in vitro mediante microperlas, expresión de proteínaADN, selección en crecimiento mediante el híbrido 2 de levadura, complementación del fragmento de proteína (Hoogenboom, R., Nature Biotechnol. 23:1105 (2005)).
45 Los anticuerpos que compiten con el anticuerpo LM1 como se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13 para la unión a una célula o antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55) se puede seleccionar e identificar utilizando ensayos de unión de competición convencionales. Los anticuerpos cribados se seleccionan basándose en la capacidad de competir con el anticuerpo
50 LM1 que se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ N.º de registro DSM ACC 2623 o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 5, 7 o 9, y 11 o 13 para la unión a una célula o antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55). La capacidad de un anticuerpo de competir con el anticuerpo LM1 para la unión a una célula o un antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55), inhibe, evita o bloquea la unión del anticuerpo LM1 a una célula o un antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55), se puede
55 determinar mediante diversos ensayos conocidos en la técnica, incluyendo el enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA).
Las proteínas y anticuerpos, subsecuencias y sus fragmentos, así como otras secuencias modificadas pueden producirse mediante metodología genética. Dichas técnicas incluyen la expresión de todo o parte del gen que 60 codifica la proteína o anticuerpo en una célula hospedadora tal como células Cos o E. coli. Dichas células hospedadoras pueden expresar la longitud completa o un fragmento, por ejemplo, un scFv (véase, por ejemplo Whitlow et al., En: Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991), Bird et al., Science 242:423 (1988); y la patente de Estados Unidos Nº 4.946.778. Los anticuerpos y los fragmentos funcionales, y las secuencias de ácidos nucleicos pueden producirse también mediante síntesis química utilizando los métodos conocidos por el 65 técnico experto,por ejemplo, un equipo automatizado de síntesis de péptidos (véase, por ejemplo, Applied
Biosystems, Foster City, CA).
Las células o el antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55) adecuados para generar anticuerpos se pueden producir mediante cualquiera de varias técnicas de purificación o expresión recombinante normalizadas de la proteína 5 conocidas en la materia. Por ejemplo, el antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55) se puede transfectar en células, incluyendo bacterias o células eucariotas (por ejemplo, levaduras). LM1 está presente también en células, tales como células Colo699 (DSMZ con N.º de registro ACC 196), línea de células DV90 de adenocarcinoma de pulmón (DSMZ con N.º de registro ACC 307), línea de células EPLC272H de carcinoma de pulmón epidermoide (DSMZ con N.º de registro ACC 383), o línea de células LOUNH91 de carcinoma escamocelular de pulmón (DSMZ con número de registro ACC 393). De acuerdo con ello, células completas, o preparaciones completas, extractos celulares, o preparaciones de células con el antígeno de LM1 recombinante (por ejemplo, NONO/nmt55),se pueden usar para producir anticuerpos que compiten con el anticuerpo LM1, como se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con n.º de registro DSM ACC 2623 o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13, para la unión a
15 una célula o antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55), o que se une a una célula o antígeno, (por ejemplo, NONO/nmt55) al cual se une el anticuerpo LM1, que se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o13.
Los animales que se pueden inmunizar incluyen ratones, ratas, conejos, cabras, ovejas, vacas o cabestros, cobayas
o primates. La inmunización inicial, y cualquier inmunización posterior opcional puede ser mediante rutas intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, o subcutánea. Las posteriores inmunizaciones pueden ser a igual o a diferentes concentraciones de la preparación del antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55), y puede ser a intervalos regulares o irregulares.
25 Los animales incluyen aquellos modificados genéticamente para incluir loci de genes de la IgG humana que se pueden usar por tanto para producir anticuerpos humanos Los animales transgénicos con uno o más genes de la inmunoglobulina humana que no expresan las inmunoglobulinas endógenas se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados unidos N.º 5.939.598. Se describen métodos para producir anticuerpos policlonales humanos y anticuerpos monoclonales humanos (véase, por ejemplo, Kuroiwa et al., Nat. Biotechnol. 20:889 (2002); documento WO 98/24893, documento WO 92/01047, documento WO 96/34096, documento WO 96/33735, Patentes de Estados Unidos con números 5.413.923, 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; y 5.939.598). Se describe un panorama general para producir anticuerpos humanos en Lonberg y Huszar (Int. Rev. Immunol. 13:65 (1995)).
35 Se pueden generar también anticuerpos utilizando otras técnicas incluyendo tecnologías del hibridoma, recombinante y de expresión en fagos, o una de sus combinaciones (véanse las patentes de Estados unidos números 4.902.614, 4.543.439, y 4.411.993; véase también Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.), 1980, y Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. 1988).
Se pueden preparar subsecuencias y fragmentos mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo, por ejemplo, mediante digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos. Las subsecuencias y fragmentos de anticuerpos producidos mediante escisión enzimática con pepsina proporcionan un fragmento 5S denotado F(ab')2.
45 Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes 3.5S Fab' De forma alternativa, una escisión enzimática utilizando pepsina produce dos fragmentos Fab' monovalentes y el fragmento Fc directamente (véase, por ejemplo, patentes de Estados Unidos números.
4.036.945 y 4.331.647; y Edelman et al., Methods Enymol. 1:422 (1967)). Se pueden producir fragmentos Fv y anticuerpos monocatenarios como se describe en las Patentes de Estados Unidos 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., Methods Enzymol. 203:46 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038 (1988). Otros métodos de escindir los anticuerpos, tales como la separación de las cadenas pesadas para formar los fragmentos monovalentes de la cadena ligerapesada, además se pueden usar también la escisión de los fragmentos, u otros métodos enzimáticos o químicos.
55 Los anticuerpos modificados y los fragmentos funcionales que tienen características alteradas, tales como una afinidad de unión aumentada, se pueden producir utilizando los métodos conocidos por la técnica de los técnicos expertos. Por ejemplo, se pueden usar técnicas de maduración por afinidad para mejorar la afinidad de unión al anticuerpo (documento US 2004/0162413 A1; Patentes de Estados Unidos números 6.656.467, 6.531.580,
6.590.079 y 5.955.358; Fiedler et al., Protein Eng. 15:931 (2002); Pancook et al., Hybrid. Hybridomics 20:383 (2001); Daugherty et al., Protein Eng. 11:825 (1998); Wu et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6037 (1998); y Osbourn et al., Immunotechnology 2:181 (1996)).
Los anticuerpos se pueden humanizar usando varias técnicas conocidas en la materia, incluyendo, por ejemplo, el injerto de CDR (documentos EP 239.400; WO91/09967; Patentes de Estados Unidos con números 5.225.539,
65 5.530.101; y 5.585.089), chapado o pulido de la superficie (documento EP 592.106; documento EP 519.596; Padlan, Molecular Immunol. 28:489 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7:805 (1994); Roguska. et al., Proc. Nat'l.
Acad. Sci. USA 91:969 (1994)), e intercambio de cadenas (Patente de Estados Unidos N.º 5.565.332). Secuencias consenso humanas (Padlan, Mol. Immunol. 31:169 (1994); y Padlan, Mol. Immunol. 28:489 (1991)) se han usado previamente para producir anticuerpos humanizados (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); y Presta et al, J. Immunol. 151:2600 (1993)).
5 Se conocen en la técnica métodos para producir anticuerpos quiméricos (por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191 (1989); y Patentes de Estados Unidos números 5.807.715; 4.816.567; y 4.816.397). Los anticuerpos quiméricos en los que un dominio variable de un anticuerpo de una especie se sustituye por el dominio variable de otra especie se describen, por ejemplo, en Munro, Nature 312:597 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604 (1984); Sharon et al., Nature 309:364 (1984); Morrison et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643 (1984); Capon et al., Nature 337:525 (1989); y Traunecker et al., Nature 339:68 (1989).
Las técnicas adecuadas que se pueden emplear adicionalmente en los métodos de anticuerpos incluyen la
15 purificación por afinidad, la purificación del gel no desnaturalizante, HPLC o RPHPLC, exclusión por tamaño, purificación sobre columna de proteína A, o cualquier combinación de estas técnicas. Se puede determinar el isotipo del anticuerpo utilizando un ensayo ELISA, por ejemplo, se puede identificar la Ig humana utilizando la Ig de ratón absorbida dirigida contra la Ig humana.
Se describen también en el presente documento los métodos para producir anticuerpos y fragmentos funcionales. En una realización, un método incluye administrar un antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55), o una célula que expresa un antígeno de LM1 (por ejemplo, NO NO/nmt55), en un animal, seleccionar al animal para la expresión de un anticuerpo que se une al antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55) o una célula que expresa un antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55), seleccionar un animal que produce un anticuerpo que se une al
25 antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55) o una célula que expresa un antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55), y aislar el anticuerpo procedente del animal seleccionado. En otra realización, el método incluye administrar el antígeno LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55) o la célula que expresa un antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55) a un animal capaz de expresar una inmunoglobulina humana, aislar los esplenocitos de un animal que produce un anticuerpo que se une al antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55) o una célula que expresa un antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55), fusionando los esplenocitos con una célula de mieloma para producir un hibridoma, y cribar el hibridoma para la expresión de un anticuerpos que se une al antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55) o una célula que expresa un antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55).
Como se usa en el presente documento, los términos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno hiperproliferativo
35 celular" y sus variaciones gramaticales, cuando se usan en referencia a una célula, tejido u órgano, se refiere a cualquier célula, tejido, u órgano en crecimiento, proliferación, diferenciación o supervivencia indeseable, excesiva o anómala. Una célula hiperproliferativa denota una célula cuyo crecimiento, proliferación, o supervivencia es mayor que la deseada, tal como una célula normal de referencia, por ejemplo, una célula que es del mismo tejido u órgano pero que no es una célula hiperproliferativa, o una célula que no puede diferenciarse normalmente. La proliferación celular indeseable y los trastornos hiperproliferativos incluyen enfermedades y dolencias fisiológicas, dolencias hiperplásicas benignas caracterizadas por cantidades de células, crecimiento celular, proliferación celular, supervivencia celular o diferenciación indeseable, excesiva o anómala en un sujeto. Los ejemplos de dichos trastornos incluyen neoplasias, tumores y cánceres (neoplasias malignas) metastásicos y no metastásicos.
45 Se describe en el presente documento un método que incluye administrar a un sujeto un anticuerpo LM1, como se representa por un anticuerpo producido por la línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representado por las secuencias de la cadena pesada y ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13, o un anticuerpo que se une a un antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55), en una cantidad eficaz para tratar el trastorno proliferativo celular o el trastorno hiperproliferativo celular en el sujeto. En aspectos concretos, el trastorno es una neoplasia, tumor o cáncer metastásico o no metastásico (neoplasia maligna). En aspectos adicionales, el trastorno afecta o está presente en parte al menos en mama, pulmón, tiroides, cabeza y cuello, nasofaringe, nariz o senos, cerebro, médula espinal, glándula adrenal, ganglios linfáticos, tracto gastrointestinal (boca, esófago, estómago, duodeno, íleon, yeyuno, (intestino delgado), colon, recto), tracto genitourinario, (útero, ovario, endometrio, cuello del útero, vejiga, testículo, pene, próstata), riñón, páncreas, glándula adrenal, hígado,
55 hueso, médula ósea, ganglios linfáticos, sangre, músculo, piel o el sistema hematopoyético.
Los términos "tumor," "cáncer" y "neoplasia" se usan de forma indistinta y se refieren a una célula o población cuyo crecimiento, proliferación o supervivencia es mayor que el crecimiento, proliferación o supervivencia de una célula homóloga normal, por ejemplo, un trastorno proliferativo celular o un trastorno diferenciativo. Normalmente, el crecimiento es incontrolado. El término "neoplasia maligna" se refiere a la invasión del tejido cercano. El término "metástasis" se refiere a la dispersión o diseminación de un tumor, un cáncer o una neoplasia a otros sitios, localizaciones o regiones en el sujeto, en el que los sitios, localizaciones o regiones son distintos del tumor o del cáncer primarios.
65 El anticuerpo se puede usar para reducir o inhibir la metástasis de un tumor o un cáncer primarios a otros sitios, o la formación o el establecimiento de tumores o cánceres metastásicos en otros sitios distales del tumor o del cáncer
primarios que inhiben o reducen por tanto la recidiva del tumor o el cáncer o la progresión del tumor o el cáncer. Esto incluye entre otros temas, 1) reducir o inhibir el crecimiento, la proliferación, la movilidad o la invasividad de las células tumorales o cancerosas que potencialmente o desarrollan las metástasis (por ejemplo, células tumorales diseminadas, DTC); 2) reducir o inhibir la formación o el establecimiento de las metástasis que surgen de un tumor o
5 un cáncer primarios en uno o más sitios, localizaciones o regiones diferentes distintas del tumor o del cáncer primarios; 3) reducir o inhibir el crecimiento o la proliferación de la metástasis en uno o más sitios, localizaciones o regiones distintas del tumor o del cáncer primarios después que se ha formado o se ha establecido la metástasis; y 4) reducir o inhibir la formación o el establecimiento de la metástasis adicional después que se ha formado o establecido la metástasis.
Las neoplasias, tumores y cánceres incluyen un sarcoma, carcinoma, adenocarcinoma, melanoma, mieloma, blastoma, glioma, linfoma o leucemia. Los cánceres ilustrativos incluyen, por ejemplo, carcinoma, sarcoma, adenocarcinoma, melanoma, neural (blastoma, glioma), mesotelioma y reticuloendotelial, trastornos neoplásicos linfáticos o hematopoyéticos (por ejemplo, mieloma, linfoma o leucemia). En aspectos concretos, una neoplasia,
15 tumor o cáncer incluye un adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón, carcinoma gástrico difuso o intersticial, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma de próstata, carcinoma de esófago, carcinoma de mama, adenocarcinoma de páncreas, adenocarcinoma de ovario, adenocarcinoma de las glándulas adrenales, adenocarcinoma del endometrio o adenocarcinoma de útero.
Las neoplasias, tumores y cánceres incluyen los tipos benignos, malignos, metastásicos y no metastásicos, e incluyen cualquier estadio (I, II, III, IV o V) o grado (GI, G2, G3, etc.) de neoplasia, tumor, o cáncer, o una neoplasia, tumor, cáncer o metástasis que está progresando, empeorando, estabilizada o en remisión.
Las neoplasias, tumores y cánceres pueden surgir de una multitud de tipos de tumores primarios, incluyendo, pero
25 no de forma limitativa, de mama, pulmón, tiroides, cabeza y cuello, nasofaringe, nariz o senos, cerebro, médula espinal, glándula adrenal, tiroides, ganglios linfáticos, tracto gastrointestinal (boca, esófago, estómago, duodeno, íleon, yeyuno (intestino delgado), colon, recto), tracto genitourinario (útero, ovario, endometrio, cuello del útero, vejiga, testículo, pene, próstata), riñón, páncreas, glándula adrenal, hígado, hueso, médula ósea, ganglios linfáticos, sangre, músculo, piel, y el sistema hematopoyético, y puede metastatizar en sitios secundarios.
Una "neoplasia, tumor o cáncer sólido" se refiere a una neoplasia, tumor o cáncer (por ejemplo, metástasis) que normalmente se agrega en su conjunto y forma una masa. Los ejemplos específicos incluyen tumores viscerales tales como melanomas, cánceres de mama, de páncreas, de útero y de ovario, cáncer de testículo, incluyendo seminomas, cáncer gástrico o cáncer de colon, hepatomas, carcinomas adrenal, renal y de vejiga, cánceres de
35 pulmón, de cabeza y cuello y tumores/cánceres cerebrales.
Los carcinomas se refieren a neoplasias malignas de tejido epitelial o endocrino en incluyen carcinomas del sistema respiratorio (de pulmón, microcítico de pulmón), carcinomas del sistema gastrointestinal, carcinomas del sistema genitourinario, carcinomas de testículos, carcinomas de mama, carcinomas de próstata, carcinomas del sistema endocrino, y melanomas. El término incluye también carcinosarcomas, por ejemplo, que incluyen tumores malignos compuestos de tejidos carcinomatosos y tejidos sarcomatosos. El adenocarcinoma incluye un carcinoma de un tejido glandular, o en el que el tumor forma una estructura de tipo glándula Melanoma se refiere a tumores malignos de melanocitos y otras células derivadas de pigmentos de origen celular que pueden surgir en la piel, el ojo (incluyendo la retina) u otras regiones del cuerpo. Pueden formarse carcinomas adicionales a partir del útero/cuello del útero,
45 endometrio, pulmón, cabeza/cuellos, colon, páncreas, testículos, glándulas adrenales, riñón, esófago, estómago, hígado y ovario.
Los sarcomas se refieren a tumores malignos de origen en las células del mesénquima Los sarcomas ilustrativos incluyen, por ejemplo, linfosarcoma, liposarcoma, osteosarcoma, condrosarcoma, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma y fibrosarcoma.
Las neoplasias neurales incluyen glioma, glioblastoma, meningioma, neuroblastoma, retinoblastoma, astrocitoma, oligodendrocitoma
55 Los ejemplos no limitantes específicos de neoplasias, tumores y cánceres adecuados para el tratamiento incluyen neoplasias malignas y no malignas, tumores y cánceres, y metástasis. En particular, una neoplasia, tumor, cáncer o metástasis de cualquier estadio (por ejemplo, los estadíos IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB o IV) o grado (por ejemplo, los grados G1. G2 o G3). Los ejemplos no limitantes adicionales incluyen el adenocarcinoma de estómago (por ejemplo, difuso o intestinal, adenocarcinoma colorrectal, adenocarcinoma de pulmón escamocelular, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma escamocelular del esófago, adenocarcinoma del páncreas, carcinoma urotelial de la vejiga urinaria, carcinoma renal del riñón, adenocarcinoma de la próstata, carcinoma ductal de la mama, carcinoma lobular de la mama, adenocarcinoma del ovario, adenocarcinoma de la glándula adrenal, adenocarcinoma del endometrio o un adenocarcinoma de útero.
65 Una "neoplasia, tumor o cáncer líquido " se refiere a una neoplasia, tumor o cáncer del sistema reticuloendotelial o del sistema hematopoyético, tal como un linfoma, mieloma, o leucemia, o una neoplasia que es difusa en la
naturaleza. Los ejemplos concretos de leucemias incluyen leucemias linfoblásticas agudas y crónicas, leucemias mieloblásticas y mieloma múltiple. Normalmente, dichas enfermedades surgen de leucemias agudas mal diferenciadas, por ejemplo, leucemia eritroblástica y leucemia megacarioblástica aguda. Los trastornos mieloides específicos incluyen, pero no de forma limitativa, leucemia promieloide aguda (APML) leucemia mielógena aguda
5 (AML) y leucemia mielógena crónica (CML); las neoplasias malignas linfoides incluyen, pero no de forma limitativa, leucemia linfoblástica aguda (ALL), que incluye ALL de linaje B y ALL de linaje T, leucemia linfocítica crónica (CLL),leucemia promielocítica (PLL), leucemia de células pilosas (HLL) y macroglobulinemia de Waldenstrom (WM) Los linfomas malignos específicos incluyen, linfoma no de Hodgkin y las variantes, linfomas de linfocitos T periféricos, leucemia/linfoma de linfocitos T adultos (ATL), linfoma de linfocitos T cutáneo (CTCL), leucemia linfocítica granular grande (LGF), enfermedad de Hodgkin y enfermedad de ReedSternberg.
Como se usa en el presente documento, los términos "tratar," "que trata," "tratamiento" y sus variaciones gramaticales significan someter a un paciente individual a un protocolo, régimen, proceso o remedio, en el que se desea obtener una respuesta fisiológica o resultado en este paciente Debido a que cada paciente tratado puede no
15 responder a un protocolo, régimen, proceso o remedio de tratamiento concreto, el tratamiento no requiere que se consiga la respuesta o el resultado fisiológico deseado en cada uno y en cada paciente o población de pacientes. De acuerdo con ellos, un paciente o una población de pacientes dada puede fracasar en responder o responder de manera inadecuada al tratamiento.
Se puede practicar la aplicación mediante cualquier modo de administración o mediante cualquier ruta de administración sistémica, regional y local. Las rutas de administración incluyen la intravenosa, intraarterial, intradérmica, intramuscular, subcutánea, intrapleural, transdérmica (tópica), transmucosal, intracraneal, intraespinal, intraocular, rectal, oral (alimentaria) y mucosal.
25 Se describe en el presente documento obtener una mejora detectable o medible en una dolencia de un sujeto dado, tal como aliviar o mejorar uno o más síntomas o consecuencias (físicas) adversos asociados con la presencia de un trastorno proliferativo celular o un trastorno hiperproliferativo celular, neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis, es decir, un beneficio terapéutico o un efecto beneficioso.
Un beneficio terapéutico o efecto beneficioso es cualquier mejora objetiva o subjetiva, transitoria, temporal, o a largo plazo en la dolencia o patología, o una reducción en el inicio, la gravedad, la duración o la frecuencia de un síntoma adverso asociado con o producido por la proliferación celular o un trastorno hiperproliferativo celular tal como una neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis. Un criterio de valoración clínica satisfactorio de un método de tratamiento de acuerdo con la invención se consigue, por ejemplo, cuando existe una reducción incremental o parcial en la 35 gravedad, duración o frecuencia de una o más patologías, síntomas adversos o complicaciones asociadas, o la inhibición o la reversión de una o más manifestaciones o características fisiológicas, bioquímicas o celulares de proliferación celular o de un trastorno hiperproliferativo celular tal como una neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis. Un beneficio o mejora terapéutica es por tanto una cura, tal como la destrucción de las células proliferantes diana (por ejemplo, neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis) o la eliminación de una o más, de la mayoría o de todas las patologías, síntomas adversos o complicaciones asociadas con o producidas por la proliferación celular o el trastorno hiperproliferativo celular tal como una neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis Sin embargo, un beneficio o mejora terapéutica necesario para ser una cura o destrucción completa de todas las células proliferantes diana (por ejemplo neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis) o la eliminación de todas las patologías, síntomas o complicaciones adversas asociados con o producidos por la proliferación celular o el trastorno hiperproliferativo
45 celular tal como una neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis. Por ejemplo, la destrucción parcial de una masa de células tumorales o cancerosas, o la estabilización de la masa tumoral o cancerosa, el tamaño o las cantidades de células inhibiendo la progresión o el empeoramiento del tumor o el cáncer, pueden reducir la mortalidad y prolongar el lapso de vida incluso si solo durante unos pocos días, semanas o meses, incluso aunque permanezca una parte del volumen de la masa tumoral o cancerosa, el tamaño o las células.
Los ejemplos específicos no limitantes del beneficio terapéutico incluyen una reducción en el volumen de la neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis (tamaño o masa de las células) o de las cantidades de células, inhibiendo o evitando un aumento en el volumen de la neoplasia, tumor o cáncer (por ejemplo, estabilizando), retrasando o inhibiendo la progresión, el empeoramiento o la metástasis de la neoplasia, tumor o cáncer, estimulando, induciendo
55 o aumentando la lisis o apoptosis de la neoplasia, tumor o cáncer o inhibiendo la proliferación, el crecimiento o la metástasis de la neoplasia, tumor o cáncer. Un método de la invención puede no tener efecto inmediatamente. Por ejemplo, el tratamiento puede continuarse por un aumento en la cantidad de células neoplásicas, tumorales o cancerosas o en la masa, pero puede producirse posteriormente en el tiempo la estabilización o reducción eventual en la masa, tamaño o cantidad de células de las células tumorales en un sujeto dado tras la lisis celular o la apoptosis de la neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis.
Los síntomas y complicaciones adversas adicionales asociados con la neoplasia, tumor, cáncer y metástasis que pueden estar inhibidos, reducidos, disminuidos, retrasados o evitados incluyen, por ejemplo, náuseas, ausencia de apetito, letargia, dolor, y malestar. De esta manera, una disminución o reducción parcial o completa en la gravedad, 65 duración o frecuencia de un síntoma o complicación adversa asociado con o producido por un trastorno hiperproliferativo celular, una mejora en el bienestar de los sujetos, tal como un aumento en la energía, el apetito, el
bienestar psicológico, son todos ejemplos no limitantes concretos del beneficio terapéutico. Un beneficio o mejora terapéutica puede por tanto incluir también una mejora subjetiva en la calidad de vida de un sujeto tratado.
En diversas realizaciones, el método reduce o disminuye el tamaño de la neoplasia, el tumor o el cáncer, o la
5 metástasis, inhibe o evita un aumento en el tamaño o el volumen de la metástasis de la neoplasia, tumor o cáncer, inhibe o retrasa la progresión o el empeoramiento de la neoplasia, el tumor o el cáncer, estimula la neoplasia, el tumor o el cáncer, o la metástasis de la lisis celular o la apoptosis, o inhibe, reduce, disminuye o retrasa la proliferación o la metástasis de la neoplasia, tumor o cáncer. En una realización adicional, el método prolonga o extiende el lapso de vida del sujeto. En una realización, el método mejora la calidad de vida del sujeto.
10 El examen de una muestra de biopsia que contiene una neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis (por ejemplo, una muestra de sangre o tejido), puede establecer volúmenes de células o cantidades de células neoplásicas, tumorales
o cancerosas, o metastásicas, y por tanto, si se ha producido una reducción o estabilización en la masa o en las cantidades o volúmenes de células neoplásicas, tumorales o cancerosas o metastásicas o en la inhibición del 15 establecimiento, formación, proliferación, crecimiento o supervivencia (apoptosis) de las células neoplásicas, tumorales, cancerosas o metastásicas. Para una neoplasia, tumor o cáncer sólido, los métodos de diagnóstico por imágenes invasivos y no invasivos pueden discernir el tamaño o volumen de la neoplasia, tumor o cáncer. El examen de la sangre o el suero, o la médula ósea, por ejemplo, para poblaciones, cantidades y tipos de células (por ejemplo, trastornos hiperproliferativos celulares hematopoyéticos, células tumorales diseminadas) puede establecer
20 si una reducción o estabilización en la masa o en las cantidades de células neoplásicas, tumorales, cancerosas o metastásicas, o que se ha producido en la inhibición del establecimiento, la formación, la proliferación, el crecimiento
o la supervivencia (apoptosis).
Las composiciones y los métodos de la invención pueden combinarse con cualquier tratamiento o terapia que
25 proporción a un efecto deseado. En particular, los tratamientos y terapias que se han caracterizado teniendo una actividad proliferativa anticelular que proporciona un efecto deseado. Los tratamientos y terapias ilustrativos incluyen agentes o fármacos proliferativos anticelulares o agentes inmunopotenciadores.
Los tratamientos y terapias pueden llevarse a cabo antes de, de forma sustancialmente contemporánea con
30 cualquier otro método de la invención, por ejemplo, un trastorno proliferativo anticelular o trastorno hiperproliferativo anticelular (por ejemplo, una neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis) 
Se describen métodos combinados en los que los métodos de la invención, en los que cualquiera de los anticuerpos, fragmentos funcionales y formas modificadas y variantes, se usan en una combinación con cualquier régimen 35 terapéutico, protocolo de tratamiento o composición, tal como un protocolo proliferativo anticelular agente o fármaco que se muestra en el presente documento o se conoce en la técnica. En una realización, el método incluye administrar el anticuerpo LM1, como se representa por un anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623 o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 5, 7 o 9, y 11 o 13 y un tratamiento proliferativo anticelular o un tratamiento 40 inmunopotenciador, agente o fármaco. En otra realización, el método incluye administrar un anticuerpo que se une a un antígeno LM1 (por ejemplo NONO/nmt55), y un tratamiento proliferativo anticelular o tratamiento inmunopotenciador, agente o fármaco. Se puede administrar el tratamiento proliferativo anticelular o el tratamiento inmunopotenciador, agente o fármaco antes de, de forma sustancialmente contemporánea con o tras la administración del anticuerpos LM1, como se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ
45 con N.º de registro DSM ACC 2623 o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 5, 7 o 9, y 11 o 13 o el anticuerpo que se une a un antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55 ).
Como se usa en el presente documento un tratamiento, terapia, actividad "proliferativo anticelular", "antineoplásico",
50 "antitumoral", o "anticanceroso" significa cualquier terapia, régimen de tratamiento, agente, fármaco, protocolo o proceso que es útil en el tratamiento de patologías, síntomas adversos, o complicaciones asociadas con o producidas por la proliferación celular anómala o indeseable (hiperproliferación celular),un trastorno hiperproliferativo celular, neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis. Las terapias particulares, regímenes de tratamiento, agentes, fármacos, protocolos o procesos pueden inhibir, disminuir, retrasar, retardar, reducir, retrasar, o evitar la proliferación
55 celular, el crecimiento celular, la hiperproliferación celular, neoplásica, tumoral, o el crecimiento canceroso (maligno), la proliferación, la supervivencia o la metástasis. Dichos tratamiento, terapias, regímenes, protocolos, agentes y fármacos, pueden funcionar perturbando, reduciendo, inhibiendo o retrasando la progresión del ciclo celular o la proliferación o el crecimiento celular; aumentar, estimular o potenciar la apoptosis celular, la lisis o la muerte;, inhibir la síntesis del ácido nucleico o la síntesis de proteínas o el metabolismo; reducir, disminuir, inhibir o retrasar la
60 división celular; o disminuir, reducir o inhibir la supervivencia, o producción o utilización celular de un factor de supervivencia celular, factor de crecimiento o ruta de señalización (extracelular o intracelular).
Los Ejemplos de tratamiento y terapias proliferativas anticelulares incluyen quimioterapia, inmunoterapia, radioterapia (ionizante o química), terapia local o regional térmica (hipertermia) y resección quirúrgica
Las clases no limitantes específicas de agentes proliferativos anticelulares y fármacos que incluyen agentes alquilantes, antimetabolitos, extractos vegetales, alcaloides vegetales, nitrosureas, hormonas (esteroides) análogos de nucleósidos y nucleótidos Los ejemplos no limitantes específicos de toxinas microbianas incluyen la toxina bacteriana del cólera, la toxina pertussis, la toxina del ántrax, la toxina de la difteria, y la toxina de la planta de ricina.
5 Los ejemplos específicos de fármacos incluyen la diclofosfamida, azatriopina, ciclosporina A, melfalán, clorambucilo, mecloretamina, busulfán, metotrexato, 6mercaptopurina, tioguanina, 5fluorouracilo, 5fluorouridina, citosina arabinósido, 6tioguanina, 6mercaptopurina, AZT, 5azacitidina (5AZC) y los compuestos relacionados con 5azacitidina, pentostatina, gemcitabina, citarabina, bleomicina, actinomicina D, dactinomicina, mitramicina,mitomicina C, carmustina, caliqueamicina,lomustinas, semustina, estreptozotocina,tenipósido, etopósido, hidroxiurea, nitrosurea, cisplatino, carboplatino, levamisol, ifosfamida, mitotano, mitoxantrona, procarbazina, dacarbazina, taxol, vinblastina, vincristina, vindesina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, daunomicina y dibromomanitol. Los ejemplos no limitantes específicos incluyen prednisona, prednisolona, dietilestilbesterol, fluoximesterona, flutamida, leuprólido, toremifeno, triamcinolona, zodalex, y antagonistas hormonales que liberan gonadotropina.
15 La radioterapia incluye la administración interna o externa a un sujeto. Por ejemplo, se pueden administrar rayos alfa, beta, gamma y X al sujeto externamente sin internalizar al sujeto o poner en contacto físicamente de otra forma el radioisótopo. Los ejemplos específicos de dosificaciones varían de las dosis diarias de 50 a 200 roentgens durante periodos prolongados de tiempo (3 a 5/semana), hasta dosis únicas de 2000 a 6000 roentgens. Las dosificaciones varían ampliamente, y dependen de la duración de la exposición, la vida media del isótopo, el tipo de radiación emitida, el tipo de células y la localización tratada y del estadio progresivo de la enfermedad. Los ejemplos específicos de radionucleidos incluyen,por ejemplo, 47Sc 67Cu, 72Se, 88Y, 90Sr, 90Y, 97Ru, 99Tc, 105Rh, 111In, 125I, 131I, 149Tb, 153Sm, 186Re, 188Re, 194Os, 203Pb, 211At, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 223Ra, 225Ac, 227Ac, y 228Th.
Los anticuerpos que se unen a las células tumorales son un ejemplo concreto del tratamiento o terapia proliferativo
25 anticelular. Los anticuerpos antitumorales incluyen, por ejemplo, el anticuerpo M195 que se une al antígeno celular CD33 de la leucemia (Patente de Estados Unidos N.º 6.599.505); el anticuerpo monoclonal DS6 que se une al antígeno asociado al tumor CA6 de carcinoma de ovario (Patente de Estados Unidos N.º 6.596.503); el anticuerpo monoclonal IBD12 humano que se une al antígeno H superficial celular epitelial (Patente de Estados Unidos N.º
4.814. 275); y el anticuerpo BR96 que se une al epítopo del hidrato de carbono Lex expresado por los carcinomas de colon, mama, ovario, y carcinomas de pulmón. Los anticuerpos antitumorales adicionales que se pueden emplear incluyen, por ejemplo, Herceptina (anticuerpo neu dirigido contraHer2), Rituxan®, Zevalin, Bevacizumab (Avastin), Bexxar, Campath®, Oncolym, 171A (Edrecolomab), 3F8 (anticuerpo dirigido contra neuroblastoma), MDXCTLA4, IMCC225 (Cetuximab) y Mylotarg.
35 Como se usa aquí, el término "inmunopotenciador," cuando se usa en referencia a un tratamiento, terapia, agente o fármaco significa que el tratamiento, terapia, agente o fármaco proporciona un aumento, estimulación inducción o promoción de una respuesta inmunitaria, humoral o mediada por célula. Dichas terapias pueden potenciar las respuestas inmunitarias generalmente o potenciar la respuesta inmunitaria en una diana específica, por ejemplo, un trastorno proliferativo celular o un trastorno hiperproliferativo celular, tal como una neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis.
Los ejemplos específicos no limitantes de agentes inmunopotenciadores incluyen anticuerpos, factores de crecimiento celular, factores de supervivencia celular, factores diferenciativos celulares, citoquinas, interferones y quimioquinas. Los ejemplos adicionales de agentes inmunopotenciadores y los tratamientos incluyen células
45 inmunitarias tales como linfocitos, células plasmáticas, macrófagos, células dendríticas, linfocitos NK y linfocitos B que expresan tanto el anticuerpo contra el trastorno proliferativo celular, o de otra manera, activan probablemente una respuesta inmunitaria contra el trastorno proliferativo celular. Las citoquinas que potencian o estimulan la inmunogenicidad incluyen IL2, IL1a, IL1p, IL3, IL6, IL7, factor estimulador de colonias de granulocitos macrófagos (GMCSF), IFNy, IL12, TNFα, y TNFβ, que son también ejemplos no limitantes de agentes inmunopotenciadores. Las quimioquinas incluyen MIP1a, MIP1p, RANTES, SDF1, MCP1, MCP2, MCP3, MCP4, eotaxin, eotaxin2, I309/TCA3, ATAC, HCC1, HCC2, HCC3, PARC, TARC, LARC/MIP3a, CKp, CKp6, CKp7, CKp8, CKp9, CKp11, CKp12, C10, IL8, ENA78, GROa, GROp, GCP2, PBP/CTAPIIIpTG/NAP2, Mig, PBSF/SDF1, y linfotactina son ejemplos no limitantes adicionales de agentes inmunopotenciadores.
55 Se describen, entre otras cosas, métodos que dan como resultado una necesidad o uso reducido de otro protocolo de tratamiento o régimen terapéutico, proceso o remedio. Por ejemplo, para una neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis, el uso de la invención tiene un beneficio terapéuticosi en un sujeto dado da como resultado una dosis menos frecuente o reducida o la eliminación de un tratamiento proliferativo anticelular (por ejemplo, antineoplásico, antitumoral, anticanceroso, o antimetastásico) o un tratamiento o terapia inmunopotenciador, tal como un fármaco quimioterapéutico, o tratamiento de radioterapia, inmunoterapia, o cirugía para la neoplasia, tumor o cáncer o metástasis.
De acuerdo con la invención, se proporcionan una necesidad o uso reductor de un tratamiento o terapia proliferativo anticelular (por ejemplo, antineoplásico, antitumoral, anticanceroso o antimetastásico).
Las dosis o la "la cantidad eficaz" o "cantidad suficiente" en un método de tratamiento o terapia en el que se desea conseguir un beneficio o mejora terapéutica incluye, por ejemplo, cualquier alivio objetivo o subjetivo o mejora de una, varias o todas las patologías, síntomas adversos o complicaciones asociadas con o producidas por la diana (por ejemplo, trastorno hiperproliferativo celular), en una extensión medible o detectable, aunque evitando,
5 inhibiendo o retrasando la progresión o el empeoramiento de la patología de la diana (por ejemplo, trastorno hiperproliferativo celular), síntoma adverso o complicación, es un resultado satisfactorio. De esta manera, en el caso de un trastorno hiperproliferativo celular, la cantidad será suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico a un sujeto dado o para aliviar o mejorar una patología, síntoma adverso o complicación del trastorno en un sujeto dado. Se pueden administrar dosis únicas o múltiples o la dosis puede aumentarse o reducirse proporcionalmente como se indica por el estado o tratamiento o la diana terapéutica (por ejemplo, trastorno hiperproliferativo celular) o cualquier(cualesquiera) efecto(s) secundarios del tratamiento o la terapia.
Las cantidades no limitantes ilustrativas (dosis) están en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, y cualquier valor o intervalo numérico en dichos intervalos. Se pueden administrar
15 cantidades mayores o menores (o dosis), por ejemplo 0,01500 mg/kg, y cualquier valor numérico o intervalo o valor comprendido en dichos intervalos. Las cantidades no limitantes ilustrativas adicionales (o dosis) varían de aproximadamente 0,150 mg/kg, 0,550 mg/kg, 1,025 mg/kg, 1,010 mg/kg, y cualquier valor numérico o intervalo o valor comprendido en dichos intervalos.
El anticuerpo para uso en la invención puede administrarse una o más veces (por ejemplo, 110, 15 o 13 veces) por día, semana, mes, o año. El técnico experto conocerá cuando es adecuado retrasar o interrumpir la administración. Un calendario de dosificación no limitante ilustrativo es de 17 veces por semana, durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más semanas, y cualquier valor o intervalo numérico o valor comprendido en dichos intervalos.
25 Por supuesto, como es típico para cualquier tratamiento o terapia, diferentes sujetos presentarán diferentes respuestas al tratamiento y algunos puede no responder o responder de forma inadecuada a un protocolo, régimen o proceso de tratamiento concreto. Cantidades eficaces dependerán por tanto al menos en parte del trastorno tratado (por ejemplo, proliferación celular, hiperplasia benigna o una neoplasia, tumor o cáncer y el tipo de almacenamiento, por ejemplo, el grado de tumor o cáncer y si está en un estadio avanzado, tardío o temprano) el efecto terapéutico deseado, así como el sujeto individual (por ejemplo, la biodisponibilidad comprendida por el sujeto, género, edad, etc.) y la respuesta del sujeto al tratamiento basándose en la variabilidad genética y epigenética (por ejemplo, farmacogenómica).
35 La toxicidad y viabilidad celular (apoptosis celular lisis, proliferación del crecimiento, etc.) se puede medir por varios medios sobre la base de ensayos colorimétricos, luminiscentes, radiométricos, o fluorométricas conocidas en la materia. Las técnicas colorimétricas para determinar la viabilidad celular incluyen, por ejemplo, exclusión por azul tripán. En resumen, se tiñeron las células con azul tripán y se hizo el recuento utilizando un hemocitómetro. Las células viables excluyen el colorante mientras que las células muertas y las células coloreadas captan el colorante azul y se distinguen fácilmente al microscopio óptico. El rojo neutro es adsorbido por las células viables y se concentra en los lisosomas de las células; Se pueden determinar las células viables con un microscopio óptico para cuantificar las cantidades de células teñidas con rojo neutro.
Las técnicas fluorométricas para determinar la viabilidad celular incluyen, por ejemplo, yoduro de propidio, un agente
45 intercalante de ADN fluorescente. Se excluye yoduro de propidio de las células viables, pero tiñe el núcleo de las células muertas. La citometría de flujo de las células marcadas con yoduro de propidio puede utilizarse a continuación para cuantificar las células viables y muertas. La liberación de la lactato deshidrogenasa (LDH) indica daño estructural y la muerte de las células, y se puede medir mediante un ensayo de enzima espectrofotométrico. Se incorpora bromodesoxiuridina (BrdU) en el ADN sintetizado recientemente y se puede detectar con un anticuerpo marcado con fluorocromo. El colorante fluorescente Hoechst 33258 marca el ADN y se puede utilizar para cuantificar la proliferación de células (por ejemplo, mediante citometría de flujo) La incorporación cuantitativa del colorante fluorescente diacetato de succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE o CFDASE) puede proporcionar el análisis de la división celular (por ejemplo, citometría de flujo) Esta técnica se puede usar tanto in vitro como in vivo. 7aminoactinomicina D (7AAD) es un intercalador fluorescente que experimenta un desplazamiento espectral en
55 asociación con ADN y puede proporcionar un análisis de la división celular (por ejemplo, citometría de flujo).
Las técnicas radiométricas para determinar la proliferación celular incluyen, por ejemplo, [3H]Timidina, que se incorpora en ADN sintetizado recientemente de células vivas y se utiliza frecuentemente para determinar la proliferación de células. Puede cuantificarse la liberación de cromo (51Cr) procedente de células muertas mediante recuento por centelleo a fin de cuantificar la viabilidad celular
Las técnicas luminiscentes para determinar la viabilidad celular incluyen, por ejemplo, el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiterGlo (Promega Madison WI). Esta técnica cuantifica la cantidad de ATP presente para determinar el número de células viables.
Los kits comercialmente disponibles para determinar la viabilidad celular y la proliferación celular incluyen, por ejemplo, Cell Proliferation Biotrak ELISA (Amersham Biosciences Piscataway, NJ); el ensayo Guava ViaCount™, que proporciona recuentos celulares rápidos y la determinación de la viabilidad basándose en la captación diferencial de reactivos fluorescentes (Guava Technologies, Hayward, CA); el kit de ensayo de proliferación celular 5 CyQUANT® (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR); y el kit de ensayo CytoLux (PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA). Los kits de ensayo DELFIA® (PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) pueden determinar la proliferación y la viabilidad celular usando un método fluorométrico resuelto en tiempo El ensayo de proliferación celular Quantos™ es un ensayo basado en la fluorescencia que mide la fluorescencia de un complejo de colorante del ADN procedente de células lisadas (Stratagene, La Jolla, CA). El ensayo de viabilidad celular CellTiterGlo es un
10 ensayo luminiscente para medir la viabilidad celular (Promega, Madison WI).
Los términos "sujeto" y "paciente" se usan de manera indistinta en el presente documento y se refieren a animales, normalmente mamíferos, tales como seres humanos, primates no humanos (gorila, chimpancé, orangután, macaco, gibón), animales domésticos (perro y gato), animales de animales de granja y de explotaciones (caballo, vaca, 15 cabra, oveja, cerdo) animales de laboratorio y experimentales (ratón, rata, conejo, cobaya). Los sujetos incluyen animales de modelos de enfermedad (por ejemplo, tales como ratones, ratas y primates no humanos) para estudiar la eficacia la eficacia in vivo (por ejemplo, un modelo animal de neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis). Los sujetos humanos incluyen niños, por ejemplo, recién nacidos, bebés, niños pequeños y adolescentes, entre las edades de 1 y 5, 5 y 10 y 10 y 18 años, adultos entre las edades de 19 y 60 años, y personas mayores, por ejemplo, entre las
20 edadesde60y 65,65y 70y 70y 100años.
Los sujetos incluyen mamíferos (por ejemplo, seres humanos) que necesitan tratamiento es decir, que tienen una proliferación celular indeseable o anómala (hiperproliferación celular) o un trastorno hiperproliferativo celular. Los sujetos también incluyen aquellos que están en riesgo de tener una proliferación celular indeseable o un trastorno 25 hiperproliferativo celular. Los sujetos incluyen además un sujeto que necesita un tratamiento proliferativo anticelular
o un tratamiento o terapia inmunopotenciador debido a un diagnóstico de laboratorio o clínico que corrobora dicho tratamiento, los sujetos experimentan un tratamiento proliferativo anticelular o un tratamiento inmunopotenciador, y los sujetos que han experimentado un tratamiento proliferativo anticelular o un tratamiento inmunopotenciador y están en riesgo de recidiva o recurrencia.
30 Los sujetos en riesgo incluyen aquellos con antecedentes históricos familiares, predisposición genética, o que han padecido una dolencia previa con un trastorno proliferativo celular o hiperproliferativo celular (por ejemplo, una hiperplasia benigna, neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis) y están es riesgo de experimentar recidiva o reincidencia. Los sujetos en riesgo incluyen además la exposición ambiental a carcinógeno o mutágenos, tales como
35 fumadores, o aquellos en un escenario laboral (industrial, químico, agrícola). Dichos sujetos en riesgo de desarrollar un trastorno proliferativo celular o un trastorno hiperproliferativo celular tal como una neoplasia, tumor o cáncer, se puede identificar con tamices genéticos para los genes asociados a tumor, las deleciones de genes o las mutaciones de genes. Los sujetos que carecen de Brea1 están en riesgo, por ejemplo, de desarrollar cáncer de mama. Los sujetos en riesgo de desarrollar cáncer de colon han perdido o mutado los genes supresores del tumor, tales como
40 la poliposis cólica adenomatosa. Se sabe de sujetos en riesgo que tienen una predisposición genética hacia los trastornos proliferativos celulares (véase, por ejemplo, The Genetic Basis of Human Cancer 2ª ed. por Bert Vogelstein (Editor), Kenneth W. Kinzler (Editor) (2002) McGrawHill Professional; The Molecular Basis of Human Cancer. Editado por WB Coleman y GJ Tsongalis (2001) Humana Press; y The Molecular Basis of Cancer. Mendelsohn et al., WB Saunders (1995)).
45 Los sujetos en riesgo pueden por tanto tratarse a fin de inhibir o reducir la probabilidad de desarrollar un trastorno proliferativo celular o un trastorno hiperproliferativo celular, o después de haberse curado de un trastorno proliferativo celular, padecer una recidiva o reincidencia del mismo o un trastorno proliferativo celular o un trastorno hiperproliferativo celular diferente. El resultado de dicho tratamiento puede ser reducir el riesgo de desarrollar un
50 trastorno proliferativo celular o trastorno hiperproliferativo celular, o para evitar un trastorno proliferativo celular o un trastorno hiperproliferativo celular, o una patología, síntoma adverso o sus complicaciones en el sujeto en riesgo tratado.
La invención proporciona además kits, incluyendo anticuerpos, fragmentos funcionales, formas y variantes
55 modificadas, ácidos nucleicos, agentes, fármacos y formulaciones farmacéuticas, envasadas en un material de envase adecuado, opcionalmente en combinación con instrucciones para utilizar los componentes del kit, por ejemplo, instrucciones para llevar a cabo un método de la invención. En una realización, el kit incluye un anticuerpo LM1, como se representa por un anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623 o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID
60 NO:1, 5, 7 o 9, y 11 o 13 y un tratamiento proliferativo anticelular o un tratamiento inmunopotenciador, agente o fármaco. En un aspecto, las instrucciones son para tratar la proliferación o hiperproliferación celular indeseable o un trastorno hiperproliferativo celular En otro aspecto, las instrucciones son para tratare una neoplasia, tumor o cáncer,
o metástasis. En una realización adicional, un kit incluye un anticuerpo LM1, como se representa por el anticuerpo producido por la línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623,o representado por las secuencias de la
65 cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13, o un anticuerpos que se une a un antígeno LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55), y las instrucciones para tratar la proliferación o la
hiperproliferación células indeseable, o un trastorno hiperproliferativo celular, y un tratamiento proliferativo anticelular
o un tratamiento, agente o fármaco. En diversos aspectos, un kit incluye un agente antineoplásico, un agente anticanceroso o un agente antitumoral. En otros aspectos más, el kit incluye un artículo de fabricación, por ejemplo, un artículo de fabricación para administrar el anticuerpo o el ácido nucleico, un tratamiento proliferativo anticelular o
5 un tratamiento inmunopotenciador, agente o fármaco en un sujeto local, regional o sistémicamente.
El término "material de envasado" se refiere a una estructura física que aloja los componentes del kit. El material de envasado puede mantener los componentes de forma estéril, y pueden prepararse de materiales comúnmente utilizados para dichos fines (por ejemplo, fibra corrugada, vidrio, plástico, hoja de aluminio, ampollas, etc.). La marca 10 o inserción de envasado puede incluir instrucciones escritas adecuadas, por ejemplo, la práctica de un método de la invención, por ejemplo, tratar un trastorno proliferativo celular o un trastorno hiperproliferativo celular, un ensayo para cribar para, detectar o identificar un antígeno LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55), o una célula a la cual se une el anticuerpo LM1, como se representa por el anticuerpo producido por la línea celular DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como SEQ
15 ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13, etc. de esta manera, en realizaciones adicionales, el kit incluye una marca o inserción de envasado que incluye las instrucciones para practicar un método de la invención en solución, in vitro, in vivo, o ex vivo.
Las instrucciones pueden por tanto incluir instrucciones para practicar cualquiera de los métodos de la invención
20 descritos en el presente documento. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden estar incluidas en un recipiente, envase, o dispensador junto con las instrucciones para la administración a un sujeto para tratar el trastorno proliferativo celular o el trastorno hiperproliferativo celular, tal como una neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis Las instrucciones pueden incluir indicaciones desde un criterio de valoración clínico satisfactorio, o cualesquiera síntomas o complicaciones adversas que se pueden producir, información del almacenamiento, fecha
25 de caducidad, o cualquier información requerida por los organismos reguladores tales como la Food and Drug Administration para uso en un sujeto humano.
Las instrucciones pueden estar en "material impreso" por ejemplo, en papel o cartoncillo en el kit, sobre una marca prefijada al kit o material de envasado unidas a un vial o tubo que contiene un componente del kit Las instrucciones
30 pueden comprender cintas de voz o vídeo y adicionalmente pueden estar incluidas en un medio legible informáticamente, tal como un disco (un disco flexible o un disco duro), CD óptico, tal como CD o DVDROM/RAM, cinta magnética, medios de almacenamiento eléctrico tales como RAM y ROM e híbridos de estos tales como medios de almacenamiento magnético/óptico.
35 Los kits de la invención pueden incluir adicionalmente un agente tamponante, un conservante, o un agente estabilizante de proteína/ácido nucleico. El kit puede incluir también componentes del control para evaluar la actividad, por ejemplo, una muestra del control o una normalizada. Cada componente del kit puede estar encerrado en un recipiente individual o en una mezcla y todos los diversos recipientes pueden estar en envases individuales o múltiples.
40 Los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpo LM1, como se representa por el anticuerpo producido por una línea de células DSMZ con N.º de registro DSM ACC 2623, o representado por las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera que se muestran como las SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13 o un anticuerpo que se une a un antígeno de LM1 (por ejemplo NONO/nmt55)), ácidos nucleicos, y otras composiciones (por ejemplo, un antígeno
45 de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55)) y los métodos de la invención pueden estar incluidos en o emplean formulaciones farmacéuticas. Dichas formulaciones farmacéuticas son útiles para el tratamiento de, o la administración o liberación a, un sujeto in vivo o ex vivo.
Las formulaciones farmacéuticas incluyen transportadores, diluyentes o excipientes "farmacéuticamente aceptables"
50 y "fisiológicamente aceptables". Como se usa en el presente documento los términos "farmacéuticamente aceptable" y "fisiológicamente aceptable" incluyen disolventes (acuosos o no acuosos), soluciones, emulsiones, medios de dispersión, revestimientos, agentes promotores o retardantes isotónicos y de absorción, compatibles con la administración farmacéutica. Dichas formulaciones pueden estar contenidas en un líquido; emulsión, suspensión, jarabe o elixir, o en forma sólida comprimidos (revestidos o no revestidos), cápsulas (dura o blanda), polvo, gránulo,
55 cristal o microperla. Se pueden incorporar también compuestos suplementarios (por ejemplo, conservantes, agentes antibacterianos, antivírico y antifúngicos)
Puede prepararse formulaciones farmacéuticas para ser compatibles con una administración o ruta de liberación local, regional o sistémica. De esta manera, las formulaciones incluyen transportadores, diluyentes, o excipientes
60 adecuados para la administración mediante rutas concretas. Los ejemplos no limitantes específicos de rutas de administración de la invención son parenteral, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, intradérmica, intramuscular, subcutánea, intrapleural, transdérmica (tópica), transmucosal, intracraneal, intraespinal, intraocular, rectal, oral (alimentaria), administración mucosal, y cualquier otra formulación adecuada para el método de tratamiento o el protocolo de administración.
Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral pueden incluir; una diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos,
5 citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tal como cloruro de sodio o dextrosa. Se puede ajustar el pH con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio.
Las formulaciones farmacéuticas para la inyección incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables 10 estériles. Para la administración intravenosa, los transportadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany. N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). El transportador puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y sus mezclas adecuadas. Se puede mantener la fluidez, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento como lecitina, por el mantenimiento del
15 tamaño de partícula necesario en caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos. Los agentes antibacterianos y antifúngicos incluyen, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico y timerosal. Se pueden incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio Incluyendo un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina pueden prolongar la absorción de las composiciones inyectables.
20 Se pueden preparar formulaciones inyectables estériles incorporando la composición activa en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes anteriores. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando la composición activa en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico cualquier otro ingrediente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los
25 métodos de preparación incluyen, por ejemplo, secado al vacío y criodesecación que da como resultado un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseada procedente de una de sus soluciones preparadas anteriormente.
Para la administración transmucosal o transdérmica, se utilizan en la formulación penetrantes adecuados para la
30 barrera a permear. Dichos penetrantes son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosal, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosal se puede realizar mediante el uso de pulverizadores nasales, dispositivos de inhalación (por ejemplo, aspiradores) o supositorios. Para la administración transdérmica, los principios activos se formulan en pomadas, ungüentos, geles, cremas o parches.
35 Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar con portadores que protegen contra la rápida eliminación del organismo, tales como una formulación de liberación controlada o un material de retraso temporal tale como monoestearato de glicerilo o estearato de glicerilo. Las formulaciones también se pueden suministrar usando artículos de fabricación tales como implantes y sistemas de administración microencapsulados para conseguir una
40 liberación local, regional o sistémica, o la liberación controlada o liberación sostenida.
Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, Poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos de preparación de dichas formulaciones son conocidos de los expertos en la materia. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza
45 Corporation (Palo Alto, CA). Las suspensiones liposómicas (que incluyen liposomas dirigidos a células o tejidos usando anticuerpos o proteínas del revestimiento vírico) también se pueden utilizar como transportadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según métodos conocidos, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos n.º 4.522.811.
50 Otras composiciones farmacéuticas adecuadas para administración son conocidas en la materia (véase, (por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7ª ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999); Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3ª ed., (2000); y Remington's Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc.,
55 Lancaster, Pa., (1993)).
Las composiciones utilizadas de acuerdo con la invención, incluyendo proteínas (anticuerpos), ácidos nucleicos (inhibidores), tratamientos, terapias, agentes, fármacos y formulaciones farmacéuticas se pueden envasar en formas farmacéuticas unitarias para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma farmacéutica 60 unitaria que se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el tratamiento; cada unidad contiene una cantidad de la composición junto con el transportador, excipiente, diluyente, o vehículo calculada para producir el efecto terapéutico o tratamiento deseado (por ejemplo, beneficioso. La forma farmacéutica unitaria dependerá de varios factores entre los que se incluyen, aunque no de forma limitativa necesariamente, la composición específica empleada, el efecto a conseguir, y la
65 farmacodinámica y farmacogenómica del sujeto que se va a tratar.
Se describen métodos sin células (por ejemplo, en fase solución, en fase sólida) y con células (in vitro ) para cribar, detectar e identificar una célula o antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55) a quien se une un anticuerpo LM1, representado mediante un anticuerpo producido mediante una línea celular depositada con el número de referencia DSMZ DSM ACC 2623, o representada por secuencias de la región de la cadena pesada y ligera definidas como
5 SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13. Los métodos se pueden realizar en solución, in vitro usando un material o muestra de origen biológico, e in vivo, por ejemplo, usando células neoplásicas, tumorales o cancerosas, o células metastásicas, tejido u órgano (por ejemplo, una biopsia) de un animal.
Se describen métodos para identificar, detectar o cribar una célula o un antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55) a quien se une un anticuerpo LM1, representado mediante un anticuerpo producido mediante una línea celular depositada con el número de referencia DSMZ DSM ACC 2623, o representada por secuencias de la región de la cadena pesada y ligera definidas como SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13. En una realización, un método incluye poner en contacto un material o muestra de origen biológico con un anticuerpo LM1, representado mediante un anticuerpo producido mediante una línea celular depositada con el número de referencia DSMZ DSM ACC 2623, o
15 representada por secuencias de la región de la cadena pesada y ligera definidas como SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13, o un anticuerpo que se une a un antígeno LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55) en condiciones que permiten la unión del anticuerpo a una célula o antígeno; y analizar la unión del anticuerpo a la célula o el antígeno. La unión del anticuerpo a una célula o antígeno detecta su presencia. En un aspecto, el material o muestra de origen biológico se obtiene de un sujeto mamífero. En un aspecto adicional, el anticuerpo que se une a la célula o antígeno (por ejemplo, NONO/nmt55) es distinto del anticuerpo LM1, producido mediante una línea celular depositada con el número de referencia DSMZ DSM ACC 2623, o representada por secuencias de la región de la cadena pesada y ligera definidas como SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 o 9, y 11 o 13.
También se describen métodos sin células (por ejemplo, en fase solución, en fase sólida) y con células (por ejemplo
25 (in vitro o in vivo) para diagnosticar y vigilar la progresión de un sujeto que tiene o está en alto riesgo de tener una proliferación celular indeseada o anómala, o un trastorno hiperproliferativo celular (por ejemplo, neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis), la presencia o extensión de una proliferación celular indeseada o anómala, o un trastorno hiperproliferativo celular (por ejemplo, neoplasia, tumor o cáncer, o metástasis), así como identificar un sujeto adecuado para el tratamiento con un anticuerpo LM1, o un anticuerpo que se une a un antígeno LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55), debido a la mayor probabilidad de responder al tratamiento. Los métodos se pueden realizar en solución, in vitro usando un material o muestra de origen biológico, por ejemplo, una biopsia de células sospechosas que pueden comprender o ser indicativas de células neoplásicas, tumorales o cancerosas, o metastásicas, tejido u órgano. Los métodos también se pueden realizar in vivo, por ejemplo, en un animal.
35 Los ensayos de identificación, detección, cribado y diagnósticos se pueden llevar a la práctica mediante el análisis de células hiperproliferantes potenciales o sospechosas, por ejemplo, una célula o un trastorno hiperproliferativo o una muestra adecuada. Las células incluyen líneas celulares hiperproliferativas, inmortalizadas, neoplásicas, tumorales y cancerosas y aislados primarios derivados de mama, pulmón, tiroides, cabeza y cuello, nasofaringe, nariz o senos frontales, cerebro, espina dorsal, glándulas adrenales, tiroides, linfa, gastrointestinal (boca, esófago, estómago, duodeno, íleon, yeyuno (intestino delgado), colon, recto), tracto genitourinario (útero, ovario, endometrio, cuello de útero, vejiga, testículos, pene, próstata), riñón, páncreas, glándulas adrenales, hígado, hueso, médula ósea, linfa, sangre, músculo, piel, y el sistema hematopoyético, y sitios metastásicos o secundarios.
El término "poner en contacto" cuando se usa en referencia a una composición tal como una proteína (por ejemplo,
45 anticuerpo), material, muestra, o tratamiento, significa una interacción directa o indirecta entre la composición (por ejemplo, proteínas tal como un anticuerpo) y la otra entidad citada. Un ejemplo particular de interacción directa es la unión. Un ejemplo particular de una interacción indirecta es donde la composición actúa a través de una molécula intermedia, que a su vez actúa sobre la entidad citada. Por lo tanto, por ejemplo, poner en contacto una célula (por ejemplo, que comprende un trastorno hiperproliferativo celular) con un anticuerpo incluye permitir que el anticuerpo se una a la célula, o permitir que el anticuerpo actúa a través de un intermedio (por ejemplo, antígeno) que a su vez actúa sobre la célula.
Los términos "ensayar" y medir" y las variaciones gramaticales de los mismos se utilizan de forma indistinta en el presente documento y se refieren a determinaciones tanto cualitativas como cuantitativas, o tanto cualitativas como
55 cuantitativas. Cuando los términos se utilizan en referencia a la unión, cualquier medio para evaluar la cantidad relativa, afinidad o especificidad de unión se tiene en cuenta, incluyendo los diferentes métodos definidos en el presente documento y conocidos en la materia. Por ejemplo, la unión de un anticuerpo se puede ensayar o medir en un ensayo ELISA, transferencia Western o ensayo de inmunoprecipitación.
El término "correlacionar" y las variaciones gramaticales del mismo se refieren a relaciones o vínculos entre dos o más entidades. Por ejemplo, antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55), o células que expresan el antígeno de LM1 (por ejemplo, sobre la superficie celular) están asociados con diferentes tumores, neoplasias, cánceres y metástasis. Por lo tanto, debido a esta relación entre el antígeno de LM1 expresado en la superficie celular (por ejemplo, NONO/nmt55) y el cáncer, están correlacionados entre sí. Por lo tanto, la correlación de la cantidad del 65 antígeno de LM1 (por ejemplo, NONO/nmt55) o células que expresan el antígeno de LM1 (por ejemplo, sobre la superficie celular) puede indicar la presencia y/o la extensión de un tumor, neoplasia, cáncer o metástasis en un
sujeto.
Salvo que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente una persona normalmente experta en la materia a la
5 que se refiere la presente invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento para llevar a la práctica o en el ensayo de la invención, los métodos y materiales adecuados se describen en el presente documento.
Todas las publicaciones, patentes, números de registro de Genbank y resto de referencias citadas en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones, tendrá la preferencia.
Como se usa en el presente documento, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen las referencias plurales a no ser que el contexto dicte claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a un "anticuerpo" incluye
15 una pluralidad de anticuerpos y la referencia a un "tratamiento o terapia" puede incluir múltiples dosis, simultáneas, consecutivas o secuenciales, tratamientos o terapias, y así sucesivamente.
Como se usa en el presente documento, todos los valores numéricos o intervalos numéricos incluyen números enteros completos incluidos o que abarcan dichos intervalos y fracciones de los valores, o los números enteros incluidos o abarcados en los intervalos salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a un intervalo de 90100 %, incluye cualquier valor numérico o intervalo que comprenda o abarque dichos valores, tal como un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 95 %, 97 %, etc., así como un 91,1 %, 91,2 %, 91,3 %, 91,4 %, 91,5 %, etc., 92,1 %, 92,2 %, 92,3 %, 92,4 %, 92,5 %, etc., y cualquier intervalo numérico comprendido en dicho intervalo, tal como 9092 %, 9095 %, 9598 %, 9698 %, 99100 %, etc. En un ejemplo adicional, la referencia
25 a un intervalo de 15000 veces incluye, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, veces, etc., así como 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, veces, etc., 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, veces, etc., y cualquier intervalo numérico comprendido en dicho intervalo, tal como 12, 510, 1050, 50100, 100500, 1001000, 5001000, 10002000, 10005000, etc. En un ejemplo adicional, la referencia a un intervalo de KD 105 M a aproximadamente KD 1013 M incluye cualquier valor numérico o intervalo que comprende o abarca dichos valores.
La invención se divulga de forma general en el presente documento usando un lenguaje afirmativo para describir las numerosas realizaciones. La invención también incluye especialmente realizaciones en los que una materia sujeto concreta está excluida, en todo o en parte, tales como sustancias o materiales, etapas y condiciones metodológicas, protocolos, procedimientos, ensayos o análisis. Por lo tanto, incluso aunque la invención no se exprese
35 generalmente en el presente documento en términos de que la invención no incluye, los aspectos que no están expresamente incluidos en la invención sin embargo se han divulgado.
Se han descrito numerosas realizaciones de la invención. Sin embargo, se debe entender que se pueden realizar diversas modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. De acuerdo con ello, los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar pero no limitar el alcance de la invención descrito en las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1
45 Este ejemplo incluye una descripción de materiales y métodos.
Cultivo celular: La línea celular de carcinoma escamocelular de pulmón humano LOUNH91 se cultivó en medio RPMI1640 (PAA, Viena, Austria) suplementado con de suero de feto de ternera al 20 % (FCS), glutamina 2 mM y penicilina/estreptomicina (ambos al 1 %) e incubado en una atmósfera unificada al 5 % de CO2 a 37° C. Para los ensayos descritos, las células se hicieron crecer hasta subconfluencia, se separaron con tripsina/EDTA y se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes del uso.
Producción de hibridomas: Los inventores inmortalizaron los linfocitos fusionándolos con el heteromieloma HAB1.
55 En resumen, las células del heteromieloma HAB1 se lavaron dos veces con RPMI 1640 (PAA, Viena, Austria) sin aditivos y las células se centrifugaron dos veces durante 5 minutos a 1500 rpm. Los inventores descongelaron linfocitos congelados obtenidos bien del bazo o bien de los ganglios linfáticos, y lavaron dichas células dos veces con RPMI 1640 sin aditivos y centrifugaron dichas células a 1500 rpm durante 5 minutos. Tanto el HAB1 como el aglomerado de linfocitos se resuspendieron en 10 ml de RPMI 1640 sin aditivos, y se contaron en una cámara de recuento celular Nebauer. Las células se lavaron de nuevo, se añadieron las células HAB1 y los linfocitos juntos en una relación de 1:2 a 1:3, se mezclaron, y la mezcla se centrifugó durante 8 minutos a 1500 rpm. Se precalentó polietilenglicol 1500 (PEG) a 37º C. y se dejó escurrir el PEG cuidadosamente gota a gota sobre el aglomerado con una pequeña rotación del tubo de 50 ml. A continuación, el aglomerado se resuspendió suavemente y se hizo girar el tubo durante exactamente 90 segundos a 37º C en un baño de agua. Las células se lavaron dos veces con una
65 pipeta completa de 10 ml de RPMI sin aditivos y las células se centrifugaron durante 5 minutos a 1500 rpm. Se añadió 1 ml de RPMI 1640 con suplemento HAT (PAA, Viena, Austria) y FCS al 10 %, glutamina al 1 %, y 
penicilina/estreptomicina al 1 % ("RPMI 1640 HAT") en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. El aglomerado celular se disolvió en RPMI 1640 HAT y 0,5 ml de las células se añadieron a cada pocillo de la placa de 24 pocillos. A continuación, las placas de 24 pocillos se introdujeron en una incubadora a 37 ºC y el medio RPMI 1640 HAT se cambió cada semana. Tras de cuatro a seis semanas, los sobrenadantes de cultivo celular se cribaron para
5 determinar la producción de anticuerpos en un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA).
Con este protocolo, aproximadamente 80 % a 90 % de los triomas generados fueron viables y aproximadamente un 50 % secretan inmunoglobulinas. Los clones positivos se analizaron inmunohistoquímicamente en secciones de tejido de tumor autólogo, y los clones que mostraron una reacción positiva se volvieron a clonar posteriormente.
Síntesis de ADNc y RT·PCR: Para obtener la secuencia del anticuerpo, los autores aislaron el ARN completo del trioma usando el kit RNASE de Qiagen. El ARN total también se puede preparar usando métodos convencionales en la técnica, por ejemplo, los descritos en Krenn et al. (Clip. Exp. Immunol. 115:168175, 1999). La síntesis de ADNc a partir del ARN total obtenido a partir de la línea celular de hibridoma LM1 (n.º de registro DSMZ DSM ACC2623) se
15 realizó con 5 mg de ARN total usando MMLV Reverse Transcriptase de Gibco BRL (Eggenstein, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La amplificación de los genes VH y VL se llevó a cabo en un volumen de 25 µl con MgCl2 1,75 mM, 0.4 pM de cebador, 200 µM de cada dNTP, y IU Taq polimerasa (MBI Fermentas, St. LeonRot, Alemania). Los productos de la PCR se amplificaron con los siguientes perfiles de ciclo: 95 ºC, durante 2 min, seguido por 35 ciclos de desnaturalización (94 ºC, durante 30 s; 65 ºC, durante 30 s (para los cebadores VH3 y VH4), 60 ºC, para VH1, VH2, VH5, VH6 y 52 ºC, para los cebadores VL, respectivamente; un extensión final a 72 ºC, durante 4 min.
Secuenciación del anticuerpo: Los productos de la PCR se purificaron mediante electroforesis en gel con agarosa al 2 % (Roth, Karlsruhe, Alemania) seguido por extracción en gel del producto de la PCR usando un kit de extracción
25 en gel Jetsorb (Genomed, Bad Oeynhausen, Alemania). Los productos de la PCR se clonaron a continuación usando el kit de clonación pCRScript Amp SK+ (Stratagene, Heidelberg, Alemania). Se secuenciaron diez clones positivos usando el kit de secuenciación de finalización del ciclo DyeDeoxy (Applied BioSystems Inc., Weiterstadt, Alemania) y se analizaron en un secuenciador automático de ADN ABIPrism373 (ambas cepas se secuenciaron usando los cebadores T3 y T7). Las secuencias se analizaron con el programa informático de comparación de secuencias DNASIS para Windows y las bases de datos GenBank y IMGT/VQUEST. La base de datos de inmunogenética internacional ("IMGT") está coordinada por MariePaule Lefranc de la Universidad de Montpellier, Montpellier, Francia.
Tinción inmunohistoquímica de secciones de parafina: Se seccionaron tejidos humanos incluidos en parafina (2
35 mm). La parafina se eliminó mediante dos lavados con xileno de 5 minutos cada uno, dos lavados con etanol de 5 minutos cada uno, un lavado con metanol (70 µl) y un lavado con H2O2 (500 µl) durante 5 minutos, dos lavados con etanol al 90 % de 3 minutos cada uno, dos lavados con etanol al 80 % de 3 minutos cada uno, dos lavados con etanol al 70 % de 3 minutos cada uno, y lavado con Tris/NaCl (3 gramos de Tris, 40,5 gramos de NaCl en 5 litros de agua destilada y el pH se ajustó a 7,4 con HCI).
Los portas que contenían las secciones de tejidos se incubación en 300 ml de agua destilada y ácido cítrico (pH 5,5) en una olla a presión a 100 ºC, durante 5 minutos. Los portas se bloquearon durante 15 minutos con 150 µl de fracción V de albúmina de suero bovino ("BSA"; Roth, Karlsruhe, Alemania) en solución salina tamponada con fosfato ("PBS") por porta, y se lavó una vez con Tris/NaCl.
45 Las secciones se incubaron con el anticuerpo primario (por ejemplo, LM1, anticuerpos de IgM monoclonales humanos no relacionados (ChromPure IgM, Dianova, Hamburgo, Alemania, 10 mg/ml), anticuerpo de CK8, o anticuerpo de ratón CAM 5.2) diluído 1:50 (CAM 5.2 diluido 1:10) con BSA/PBS (Dako, Hamburgo, Alemania) durante 2,5 horas en una incubadora humidificada a 37 ºC. Las secciones se lavaron a continuación tres veces con Tris/NaCl (3 gramos de Tris, 40,5 gramos de NaCl en 5 litros de agua destilada y el pH se ajustó a 7,4 con HCI), seguido por incubación con el anticuerpo secundario (por ejemplo, complejo de anticuerpo de conejo dirigido contra Ig humana o anticuerpo de conejo dirigido contra Ig de ratón marcado con peroxidasa (Dako)) diluido 1:50 en PBS que contenía suero de conejo al 30 % a temperatura ambiente ("TA") durante 1 hora. Tras lavar tres veces con Tris/NaCl, las secciones de tejido se incubaron en PBS durante 10 minutos antes de la tinción con 150 µl de
55 diaminobencidina (0,05 %)peróxido de hidrógeno (0,02 %) durante 10 minutos a TA. La reacción se detuvo usando agua corriente (1015 minutos) y las secciones se contratiñeron con hematoxilina. Tras montaje con glicerolgelatina, las secciones se analizaron al microscopio óptico.
Tinción inmunohistoquímica de criosecciones procedentes de tumores autólogos: Los tejidos humanos se cortaron (4 mm) y se secaron al aire durante dos horas, se fijaron en acetona, se secaron al aire durante 30 minutos, y se lavaron con Tris/NaCl (3 gramos de Tris, 40,5 gramos de NaCl en 5 litros de agua destilada y el pH se ajustó a 7,4 con HCI). Las criosecciones se bloquearon a continuación con PBS que contenía leche en polvo al 3 % durante 1530 minutos a TA. Tras lavar tres veces con Tris/NaCl, las secciones se incubaron con anticuerpos IgM humanos contra LM1, anticuerpos de IgM monoclonales humanos no relacionados (ChromPure IgM, Dianova, 10 mg/ml), 65 CK8 (diluido 1:50 con BSA/PBS; Dako) o anticuerpo CAM 5.2 de ratón (diluido 1:10 con BSA/PBS) durante 30 minutos a TA. Las secciones se lavaron tres veces con Tris/NaCl, seguido por incubación con anticuerpos
secundarios (conjugado de anticuerpo de conejo dirigido contra Ig humana o anticuerpo de conejo dirigido contra Ig de ratón marcado con peroxidasa 1:50 en PBS al 70 % y suero humano al 30 %) durante 30 minutos a TA. Tras lavar tres veces con Tris/NaCl e incubación en PBS durante 10 minutos, las secciones se tiñeron con diaminobencidina (0,05 %)peróxido de hidrógeno (0,02 %) durante 10 minutos a TA. La reacción se detuvo bajo
5 agua corriente y las secciones se contratiñeron con hematoxilina. Tras montaje con glicerolgelatina, las secciones se analizaron al microscopio óptico.
Preparación de extractos de membrana de célula tumoral: El aislamiento de las proteínas de membrana de las células tumorales se realizó como se ha descrito usando métodos convencionales en la técnica, como se describen, por ejemplo, en Hensel et al. (Int. 7. Cancer 81:229235, 1999). En particular, células tumorales confluentes (por ejemplo, células LOUNH91) se lavaron dos veces con PBS, se recogieron con un raspador celular, se centrifugaron, y se resuspendieron en tampón hipotónico (HEPES 20 nM, KCl 3 mM, MgCl2 3 mM) y se incubaron durante 15 minutos sobre hielo. A continuación, las células se sonicaron durante 5 minutos, y los núcleos se aglomeraron por centrifugación a 10.000xg durante 10 min. El sobrenadante se centrifugó durante 40 minutos a 100.000xg en un
15 rotor basculante para aglomerar las membranas. Tras lavar el aglomerado con el tampón hipotónico, el aglomerado se volvió a suspender en tampón de lisis de membrana (HEPES 50 mM pH 7,4, EDTA 0,1 mM, glicerol al 10 %, y 1 % de Triton X100). El inhibidor completo de proteasa (Boehringer, Mannheim, Alemania) también se añadió a todas las soluciones.
Transferencia Western: Las transferencias Western se realizaron utilizando técnicas estándar como se describe, por ejemplo, en Hensel et al. (Int. 7. Cancer 81:229235, 1999). En resumen, las membranas de nitrocelulosa con las transferencias se bloquearon con PBS que contenía un 3 % de leche en polvo baja en grasa, seguido por incubación durante 1 hora con 2040 µg de anticuerpos IgM humanos contra LM1 o una IgM de controla humana no relacionada (ChromPure IgM, Dianova). El anticuerpo secundario (anticuerpo de conejo dirigido contra IgM humana
25 acoplado con peroxidasa 1:1.000, Dianova) se detectó mediante el kit de quimioluminiscencia SUPERSIGNAL de Pierce (KMF, St. Augustin, Alemania).
Preparación citoespín: Las células en crecimiento adherente se desprendieron mediante adición de tripsina/EDTA (PAA, Viena, Austria) seguido por una incubación durante 5 minutos en una incubadora humidificada (37° C, 5 % CO2) y centrifugación durante 5 minutos a 1.500 rpm. A continuación, las células se lavaron dos veces con 10 ml de medio de cultivo celular RPMI1640 (PAA, Viena, Austria). El número de células se ajustó a una densidad de 1x105 células/ml. A partir de esta solución, 100 µl se centrifugaron sobre portas de microscopio con una centrífuga citoespín (CYTOSPIN 2, Shandon, RU) durante 2 minutos a 50 rpm. Los citoespines resultantes se secaron durante al menos dos horas y se tiño como se especifica a continuación.
35 Tinción con inmunoperoxidasa de citoespines y criosecciones: Los citoespines se secaron durante al menos dos horas a temperatura ambiente o las criosecciones se secaron durante al menos dos horas después de su corte. Las secciones o citoespines se fijaron a continuación durante 10 minutos en acetona. Las criosecciones/citoespines fijados se secaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron tres veces con Tris/NaCl (3 gramos de Tris, 40,5 gramos de NaCl en 5 litros de agua destilada y el pH se ajustó a 7,4 con HCI), y se introdujeron en Tris/NaCl durante 5 minutos. Las criosecciones/citoespines se bloquearon durante 1530 minutos con leche en polvo al 3 % en PBS (100 µl por criosección/citoespín) y se lavaron tres veces con TrisNaCl. Las criosecciones/citoespines se incubaron en 100 µl de anticuerpo primario por criosección/citoespín (por ejemplo, a 20 µg/ml en BSA al 0,5 %/PBS; CK 8 a 1:50 en BSA/PBS; CAM 5.2 a 1:10 en BSA/PBS; o medio RPMI 1640 (PAA,
45 Viena, Austria) como control negativo) durante 30 minutos en una cámara húmeda a temperatura ambiente. Tras la incubación, las criosecciones/citoespines se lavaron tres veces con TrisNaCl.
Las criosecciones/citoespines se incubaron a continuación en 100 µl de una solución que contiene el anticuerpo secundario (PBS al 70 % + suero de conejo o de ser humano al 30 % + por ejemplo, anticuerpo de conejo dirigido contra ratón 1:50, anticuerpo de conejo dirigido contra IgM humana acoplado con peroxidasa o 1:50, acoplado con peroxidasa; Dako, Hamburgo, Alemania) por criosección/citoespín durante 30 minutos en una cámara húmeda a temperatura ambiente y se lavaron tres veces con TrisNaCl y se introdujeron en PBS durante 10 minutos. Las criosecciones/citoespines se incubaron a continuación durante 10 minutos en 100 µl de una solución que contenía diaminobenzidina al 0,05 % y peróxido de hidrógeno al 0,02 % (Sigma, Taufkirchen (Múnich), Alemania). Tras la
55 incubación, las criosecciones/citoespines se lavaron con agua destilada y se introdujeron en una solución de tinción de hematoxilina (Roth, Karlsruhe, Alemania) durante 5 minutos. Las criosecciones/citoespines se enjuagaron a continuación durante 15 minutos bajo agua corriente, se lavaron con agua destilada, se taparon con glicerolgelatina precalentada.
Ensayo de la glicosidasa: Los extractos de membrana de células BXPC3, preparados mediante centrifugación diferencial, se usaron en los estudios de glicosilación. Para escindir todos los tipos de cadenas de carbohidratos unidas a N y a O, el extracto de membrana se desnaturalizó en tampón que contenía 1 % de dodecilsulfato de sodio y 1 % de βmercaptoetanol durante 3 min a 95 ºC. El extracto desnaturalizado se diluyó en tampón de reacción (PBS pH 7,4, 1 % de nonidet NP40, 1 % de βmercaptoetanol) hasta una concentración final de proteína de 0,5 mg/µl. 65 Para la deglicosilación de los carbohidratos unidos a N y a O, se incubaron alícuotas de 100 µl bien con 10 U de Nglicosidasa F (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) o 5 mU de Oglicosidasa (Roche Applied Science,
Mannheim, Alemania) a 37 ºC durante la noche. El extracto no tratado en tampón de reacción sirvió como control. La extensión de la desglicosilación se analizó mediante SDSPage y procedimiento de transferencia Western.
Ejemplo 2
5 Este ejemplo incluye una descripción de los materiales y métodos usados en los estudios descritos en los Ejemplos 15 y 16.
Materiales: RPMI 1640 y FCS (PAA), Fect silente (BioRAD), solución de disolución celular (Sigma C5789), Si GENOME siRNA (Dharmacon), uMACS, uColumns, y microperlas de proteína G y microperlas dirigidas contra IgM humana (Miltenyi Biotec).
PBS: 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, y 0,24 g de KH2PO4 en 800 ml de agua destilada.
15 PBS·Tween: 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4 en 800 ml de agua destilada, añadir 400 ul de Tween 20.
Tampón de lisis1: 1 % de Triton, NaCl 150 mM, Tris 50 mM, pH 8.
Tampón hipoton.: HEPES 20 mM pH 7,4, KCl 3 mM, MgCl2 3 mM.
Tampón de análisis: Tris 25 mM, glicina 250 mM, SDS al 0,1 %
Tampón de transferencia: Tris 48 mM, glicina 39 mM, MeOH al 20 % pH 9.2, añadir un minicomprimido de inhibidor 25 de proteasa por 10 ml 10 µl (Roche).
Tinte de carga: Tris 250 mM, SDS al 10 % 0,5 % de azul de bromofenol, glicerol al 50 %, DTT 210 mM.
Tampón de lisis para preparación de membrana (2): NaCl 150 mM, Tris 50 mM, 1,5 % de Triton, 0,5 % de NaDOC, glicerina al 10 %, EDTA 1 mM, pH 8,0, añadir un minicomprimido de inhibidor de proteasa por 10 ml 10 µl (Roche).
Transfección: Las células BxPc3 se sembraron en placas de 6 pocillos a 2x105 células/pocillo en día anterior. En el día de la transfección se prepararon dos soluciones (por pocillo): 125 ul de medio exento de suero (SFM) con 5 ul de
35 Fect silente, y 125 ul de SFM y 22,5 ul de solución de ARN 5 uM (concentración final 50 nM). Ambas soluciones se mezclaron y se incubaron durante 30 min a TA, y la mezcla se añadió gota a gota a las células. El medio se cambió después de 56 h. Después de 48 horas, las células se lavaron una vez con 1xPBS. Las células se recogieron en 200 ul de tampón de lisis 1.
Preparación de lisado de células completas: 9 x 106 células (MKN, BxPC, A549) se lavaron tres veces con PBS previamente enfriado. El aglomerado celular se volvió a suspender en 1 ml de tampón de lisis (NaCl 150 mM, 1 % de Triton X100, TrisHCl 50 mM, pH 8,0). Después de 30 minutos de incubación en hielo con mezclado ocasional, las células se centrifugaron a 10.000xg a 4 ºC para sedimentar los residuos celulares. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo de 1,5 ml.
45 Preparación de extractos de membrana celular: Tras eliminar el medio de la placa de cultivo, las células se lavaron tres veces con PBS previamente enfriado. 5 ml de PBS previamente enfriado se añadieron a una placa de cultivo de 15 cm y las células se rasparon con un raspador celular. La suspensión celular se transfirió a un tubo de centrífuga de 50 ml y se centrifugó a 1.300 rpm durante 5 minutos. Los aglomerados celulares de diferentes placas de cultivo se recogieron y se volvieron a lavar con PBS. Tras la centrifugación con 1.300 rpm durante 5 minutos, las células se volvieron a suspender en tampón hipotón. (10 ml / 1 g de aglomerado celular). La suspensión celular se cultivó durante 30 minutos sobre hielo con vortización cada 5 minutos y a continuación se congelaron y se descongelaron en nitrógeno líquido 5 veces. Para sedimentar los residuos celulares, la suspensión se centrifugó durante 10 minutos a 13.000 rpm a 4 ºC. El sobrenadante resultante se centrifugó a continuación en una
55 ultracentrífuga durante 45 minutos a 125.000xg a 4º C. El aglomerado resultante de 4 g de suspensión se volvió a suspender en 1 ml de tampón de lisis y se disolvió con un pulso de sonicación corto (2 s). La suspensión se centrifugó durante 10 minutos a 13.000 rpm a 4 ºC y el sobrenadante que contenía la fracción de membrana se transfirió a un tubo nuevo de 1,5 ml.
Inmunoprecipitación: La inmunopurificación se realizó con microcolumnas y un separador µMACS (Miltenyi Biotec). A 150300 µl de preparación de membrana se añadieron 300400 µl de lisado completo, 1,5 µl de anticuerpo monoclonal de ratón (antinmt55) y se añadieron 50 µl de microperlas de proteína G (marcadas magnéticamente) y se rellenó con tampón de lisis hasta un volumen total de 800 µl.
65 La suspensión se incubó durante 30 minutos rotando a 16 rpm a 4 ºC. Las µColumns Mintenyi se introdujeron en el campo magnético del separador µMACS. Las columnas se prepararon por enjuagado con 200 µl de tampón de lisis.
El lisado celular se aplicó sobre la columna. Cuando el lisado hubo pasado por la columna, esta se lavó con 5x200 µl de tampón de lisis. Para elución, 20 µl de tampón de carga de gel precalentado (95º C) 1x SDS (Tris HCl 50 mM, pH 6,8; DTT 50 mM, SDS al 1 % azul de bromofenol al 0,005 %; glicerol al 10 %) se aplicó sobre la columna y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Un tubo de recogida nuevo se colocó bajo la columna y la columna se
5 eluyó con otros 50 µl de tampón de carga de gel precalentado (95º C) 1x SDS.
SDS·PAGE: Las muestras se aplicaron a un SDSPAGE al 10 % tras adición de 15 µl de tampón de carga a 35 µl de células lisadas. Se cargaron 14 µl por hilera, se analizó el gel durante 45 min a 40 mA.
Transferencia Western: El gel se transfirió en una cámara de transferencia húmeda (BioRad) sobre una membrana de PVDF (Millipore) durante 1 hora a 350 mA. Las transferencias se bloquearon en leche seca al 5 % en PBSTween durante una hora. Los primeros anticuerpos antigrp78 (1:2000), antinmt55 (1:2500) y antivimentina (1:1250) se aplicaron durante 1 hora en leche seca al 5 % en PBSTween. LM1 C7 (40 µg/ml) se aplicó durante 2 horas. Las transferencias se lavaron con PBSTween durante 5 minutos tres veces, y el anticuerpo secundario acoplado con
15 peroxidasa se aplicó durante una hora. Las transferencias se lavaron 3 veces durante 15 minutos y se revelaron con soluciones Pierce ECl Super Signal West Pico.
FACS: Las células siempre se mantuvieron sobre hielo, y se utilizó PBS filtrado con membrana y enfriado sobre hielo. Las células procedentes de la transfección se disolvieron en solución de disociación celular durante 140 minutos, después se volvieron a suspender en medio de cultivo completo, se centrifugaron a 800 g durante 5 minutos, las células se volvieron a suspender en medio de cultivo completo nuevo y se contaron, las células se ajustaron a 2x105 /ml en medio completo y se incubaron sobre hielo durante 30 min. Se dispensó 1 µl de células a cada tupo Eppendorf, se lavó con PBS, se centrifugaron a 800 g a 4º C, se volvió a suspender en 500 µl de PBS, se centrifugó y después se añadió el primer anticuerpo; LM1 a 25 resp. 100 µg/ml, o antinmt55 a 1:50 resp 1:251:100.
25 Los controles negativos fueron anticuerpos control de isotipo y, sin el 10 anticuerpo. Tras la incubación con el anticuerpo, las células se lavaron una vez con PBS y el anticuerpo secundario (anticuerpo dirigido contra IgMFITC humana, (DAKO, F0317) o anticuerpo dirigido contra IgG FITC de ratón (Dianova, 115095008)diluido 1:50 en 200 µl, se añadió a lo anterior, y se incubó durante 30 min (en la oscuridad). Posteriormente, las células se lavaron tres veces con PBS, se transfirieron a un tubo FACS en 250 µl de PBS. FACS se llevó a cabo en un FACS Scan (BeckmannCoulter), y los datos se analizaron con el programa informático libre WinMDI 2.8.
Cultivo celular: A549 (células epiteliales basales de alvéolo humano carcinómico) y HEK293 (células de riñón de embriónico humano) se obtuvieron de la ECACC (colección europea de cultivo celular). El medio de cultivo de las células A549 y HEK293 fue RPMI 1640 sin glutamina (PAA) suplementado con suero de feto de ternera al 10 %, 1 %
35 de 1glutamina y antibióticos. Las células se cultivaron a 37 ºC, 95 % de aire y 5 % de CO2, y se pasaron cada 2 a 3 días.
Generación de construcciones Nono de sentido directo y sentido contrario: El ADNc Nono humano se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando la línea celular de cáncer pancreático humano BxPC. ADNc como molde usando el siguiente conjunto de cebadores: cebador 5' ATG CAG AGT AAT AAA ACT TTT AAC3', y cebador 3', 5'GTA TCG GCG ACG TTT GTT TGG GGC3'. Este fragmento se ligó mediante clonaci en el vector pcDNA3.1V5His TOPO TA (Invitrogen) que produjo los plásmidos Nono de sentido directo y contrario en una proporción de 50:50. Algunas construcciones Nono de sentido directo y sentido contrario se identificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se denominaron "pcDNA3.1V5HisNono
45 6xHisAnti" y "pcDNA3.1V5HisNono6xHis". La dirección de la secuencia del producto de la PCR en la construcción de expresión se confirmó mediante secuenciación de ADN (Qiagen).
Construcción de una línea celular estable: Para generar una línea celular estable, se transfectaron 5 µg de plásmido pcDNA3.1V5HisNono6xHisAnti o pcDNA3.1V5HisNono6xHis, que transmite resistencia a neomicina, en células A549 usando el reactivo TransPass Transfection (BioLabs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dos días después de la transfección, las células se seleccionaron en 1 mg/ml de G418 (PAA) durante 2 semanas. A continuación, los clones resistentes a G418 se seleccionaron y se analizaron para determinar la expresión de la proteína Nono reducida o aumentada mediante transferencia Western usando el anticuerpo mnt 55 (Dianova) o el anticuerpo pentaHis (Qiagen). Se identificaron y expandieron varios clones positivos.
55 Producción de proteínas en bacterias (E. Coli): E. Coli BL21 Star™(DE2) se transformaron con un plásmido que codificaba en transcrito de longitud completa del gen Nono humano denominado "pEXP5CTNono6xHis." Se seleccionaron los transformantes en placas LB que contenían ampicilina y a continuación las colonias se hicieron crecer durante la noche a 37 ºC en medio LB suplementado con 100 mg/ml de ampicilina con agitación a 250 rpm. El cultivo nocturno se diluyó 25 veces con medio LB nuevo complementado con ampicilina y cultivado a 37 ºC hasta alcanzar una DO600 de 0,9. A continuación, la expresión de la proteína se indujo mediante la adición de IPTG 1 mM (isopropil1tioβDgalactopiranósido, Invitrogen) e incubación a 37 ºC durante 3 h. Las bacterias se recogieron mediante centrifugación y se lisaron por sonicación en un tampón que contenía NaCl 20 mM, TrisHCl 0,1 M pH 7,8, MgCl2 10 mM, 1/1000 (NP40, EDTA 0.5 mM, 1/10 glicerol, PMSF 50 µl y 0,2 mg/ml de agentes lisozima y
65 antiproteasa (Complete, Roche). Tras la eliminación de los residuos celulares mediante centrifugación (10 min, 5000 g), la proteína se comprobó mediante análisis por transferencia Western.
Ejemplo 3
Este ejemplo incluye una descripción de la generación de una línea celular que expresa el anticuerpo monoclonal 5 LM1. Los siguientes estudios se realizaron usando los materiales y métodos del Ejemplo 1. También se incluye una descripción de las secuencias de la región variable de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo monoclonal LM1.
Tal como se ha descrito anteriormente, el hibridoma que expresa el anticuerpo monoclonal LM1 se obtuvo fusionando linfocitos obtenidos de los ganglios linfáticos de un paciente de cáncer con una línea celular de
10 heteromieloma HAB1 (Taller, et al., Br. J. Cancer 62:595598, 1990). Las fuentes linfoides no estaban preseleccionadas en los que respecta a la edad o sexo del paciente. La célula resultante es un tipo de hibridoma conocido como trioma, ya que es la fusión de tres células. Análogamente a los linfocitos B normales, este trioma tiene la capacidad para producir anticuerpos. La especificidad del anticuerpo se determina por la especificidad del linfocito original procedente del paciente que se usó para generar el trioma.
15 Los sobrenadantes del hibridoma se cribaron para la producción de anticuerpos con un ensayo ELISA. Después del ELISA, los anticuerpos se analizaron inmunohistoquímicamente, en primer lugar, contra su tumor autólogo para determinar la reactividad específica de tumor. El anticuerpo LM1 se generó a partir de los linfocitos de un paciente con adenocarcinoma de pulmón.
20 Las CDR previstas, de las que hay tres en cada cadena ligera y pesada, se denomina convenientemente en el presente documento como LCCDR1, LCCDR2 y LCCDR3; y HCCDR1, HCCDR2 y HCCDR3.
Las secuencias previstas de la CDR de la región variable de cadena pesada de LM1 son CDR1, VSGGSISSGGYY,
25 CDR2, YIYYSGSTYYNPSLKS, y CDR3, VDARYDYVWGSYRYDAFDI. La CDR1 de la cadena pesada de LM1 expande los nucleótidos 72105 que codifican los aminoácidos 2435, La CDR2 expande los nucleótidos 153201 que codifican los aminoácidos 5267, y la CDR3 expande los nucleótidos 300354 que codifican los aminoácidos 100118.
30 Las secuencias previstas de la CDR de la región variable de cadena ligera son CDR1; SGSSSNIGNNYVS, CDR2; DNNKRPSG, y CDR3; GTWDSSLSAGWV
La CDR1 o la cadena ligera lambda expande los nucleótidos 69105 que codifican los aminoácidos situados en las posiciones 2335. CDR2 expande los nucleótidos 153174 que codifican los aminoácidos 5158 y CDR3 expande los 35 nucleótidos 270303 y codifica los aminoácidos 90101.
Ejemplo 4
Este ejemplo incluye una descripción de la caracterización inmunohistoquímica del anticuerpo LM1. Los siguientes 40 estudios se realizaron usando los materiales y métodos del Ejemplo 1.
Para caracterizar el anticuerpo monoclonal secretado por un hibridoma, los autores sometieron a ensayo el anticuerpo contra un panel de tejidos normales y tumorales usando un ensayo con inmunoperoxidasa como se describe en la sección de materiales y métodos. Este ensayo proporciona una visión general de qué tejidos se tiñen
45 con el anticuerpo y la distribución del antígeno.
Los anticuerpos que son específicos de células tumorales y de tejido normal se caracterizaron adicionalmente. En primer lugar, los inventores sometieron a ensayo los anticuerpos con los mismos tipos de tumores de diferentes pacientes. A continuación, los inventores sometieron a ensayo a los anticuerpos contra tumores de otros órganos y,
50 finalmente, contra tejidos normales. Con estos ensayos, los inventores identificaron el anticuerpo monoclonal humano LM1. Este anticuerpo reactivo a tumor es uno del isotipo IgM/λ (Tabla 1).
TABLA 1
Origen del anticuerpo monoclonal LM1 contra IgM y datos clínicos de pacientes de cáncer
Anticuerpo Órgano Tipo de tumor Estadio Grado Edad Sexo Fuente de Clase tumoral tumoral linfocitos Ig
LM1 Pulmón Adenocarcinoma T2N1 G3 45 M Ganglio IgM/λ linfático
55 Para investigar el origen genético de estos anticuerpos monoclonales humanos contra IgM, se amplificó el gen VH, se clonó y se secuenció. La secuencia se comparó con las secuencias de la línea germinal en la base de datos IMGT/VQUEST para identificar los genes de línea germinal con mayor homología y para detectar mutaciones somáticas. Los resultados se presentan en la Tabla 2. El grado de identidad de las secuencias de nucleótidos del segmento VH con las de los genes VH de la línea germinal más cercana fue aproximadamente del 99,6 % como se
60 resumen en la Tabla 2.
TABLA 2
Caracterización de la región pesada variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal LM1 contra IgM
Anticuerpo Gen de la línea germinal Homología (%) Marco R/S CDR de R/S
LM1 IGHV 430.01/431 *01 99,6 1/0 0/0
Genes de la familia del gen VH4 expresan el anticuerpo LM1. La elevada homología entres las regiones VH y los genes de la línea germinal y la baja relación R/S, que es un indicador de la maduración por afinidad de los
5 anticuerpos, indica que ninguno de los anticuerpos experimentó maduración por afinidad debido al contacto con el antígeno. Los datos indican que el anticuerpo LM1 pertenece a la familia de anticuerpos naturales no madurados por afinidad.
Tras el ensayo inicial en tumores autólogos, los modelos de reacción de los anticuerpos se investigaron con mayor
10 detalle usando tinción inmunohistoquímica sobre varios carcinomas y tejidos normales incluidos en parafina y crioincluidos. El anticuerpo LM1 no mostró actividad de unión detectable con tejidos normales (Tabla 3).
TABLA 3
Modelo de reacción del anticuerpo monoclonal LM1 dirigido contra IgM sobre tejidos normales CAM M6 (IgMTejido LM1 5.2 Control)
Estómag +
oColon + Pulmón Esófago Vejiga urinaria Próstata Mama Páncreas Tejido LM1 5.2 Control) Intestino delgado +
15 Por el contrario, el anticuerpo LM1 tiñe diferentes tejidos tumorales (Tabla 4). TABLA 4
Modelo de reacción del anticuerpo monoclonal LM1 dirigido contra IgM sobre tejidos tumorales
Tejido Tipo de carcinoma LM1 CAM 5.2 M6 (IgMControl) +/ 
Estómago Adeno/difuso 5/0 +
Adeno/intestinal 2/1 +
Colon Adeno 3/0 +
Pulmón Adeno 5/1 +
Célula escamosa 6/0 +(CK5/6)
Esófago Célula escamosa 3/0 +(CK5/6)
Adeno (Barrett) 4/0 +
Páncreas Adeno 6/0 +
Vejiga urinaria Urotel 1/0 +
Riñón Células renales 1/0
Próstata Adeno 7/0 +
Mama Invasivo (ductal) 4/0 +
Invasivo (lobular) 4/0 +
Ovario Adeno 3/0 +
Útero Adeno 3/0 +
El anticuerpo LM1 proporcionó una amplia gama de modelos de tinción en varios tejidos tumorales que se
20 analizaron. Los anticuerpos del control positivo usados en estos estudios fueron un anticuerpo monoclonal humano dirigido contra citoqueratina humana 5/6 ("CK 5/6;" Dako A/S, Dinamarca) para el carcinoma escamocelular del pulmón y esófago y un anticuerpo monoclonal de ratón contra citoqueratina humana ("CAM 5.2;" Becton Dickinson,
Nueva Jersey). Se usaron en los estudios anticuerpos del control positivo adicionales (AEI/AE3 para el adenocarcinoma de colon y el anticuerpo CK8 para el carcinoma ductal invasivo de mama).
Para examinar el antígeno reconocido por el anticuerpo LM1. Se realizaron transferencias Western con extractos de
5 membrana de la línea celular de carcinoma de pulmón establecida LOUNH91. El anticuerpo LM1 reacciona con el antígeno con un peso molecular aproximado de 70 kDa. Para descartar la unión no específica de los anticuerpos IgM a los extractos de membrana, una IgM de control humana no relacionada se usó como el control.
Además, el anticuerpo monoclonal LM1 también tiñe específicamente numerosas líneas celulares de carcinoma. En particular, el anticuerpo LM1 se une específicamente a la línea celular de adenocarcinoma de pulmón Colo699 (número de registro a DSMZ ACC 196), línea celular de adenocarcinoma de pulmón DV90 (número de registro DSMZ ACC 307), línea celular de carcinoma epidermoide de pulmón EPLC272H (número de registro DSMZ ACC 383), y línea celular de carcinoma escamocelular de pulmón LOUNH91 (número de registro DSMZ ACC 393). Portas de estas células se tiñeron de acuerdo con el protocolo de citoespín descrito en la sección de materiales y
15 métodos.
Ejemplo 5
Este ejemplo incluye una descripción los estudios de inhibición de la proliferación celular de un anticuerpo LM1. Los siguientes estudios se realizaron usando los materiales y métodos del Ejemplo 1.
La proliferación celular se puede analizar mediante numerosos métodos que son convencionales en la técnica, por ejemplo, por la reducción de sales de tetrazolio. La sal de tetrazolio de color amarillo bromuro de 3(4,5dimetiltiazol2il)2,5difeniltertrazolio ("MTT") (Sigma, St. Louis, MO.), se reduce por las células metabólicamente activas, en
25 parte por la acción de las enzimas deshidrogenasas mitocondriales para generar equivalentes reductores como NADH y NADPH. El formazano intracelular resultante de color púrpura se puede solubilizar y cuantificar por métodos espectrofotométricos. El ensayo de proliferación celular MTT mide la tasa de proliferación celular y, cuando los eventos metabólicos conducen a la apoptosis, la reducción en la viabilidad celular.
Para el ensayo MTT, los inventores tripsinizaron las células y resuspendieron las células en 10 ml de medio RPMI1460 que cotenía suero de feto de ternera al 10 % ("FCS") (20 % de FCS para LOUNH91), glutamina al 1 %, y penicilina/estreptomicina al 1 % (medio completo). Las células se contaron a continuación y se diluyeron a 1x106 células/ml. 50 µl de esta suspensión se pipetearon en los pocillos de una placa de 96 pocillos, dando como resultado aproximadamente 5x104 células/pocillo. La primera fila de pocillos se dejó vacía. A continuación se añadieron 50 µl 35 de anticuerpo diluido en medio completo a cada pocillo. La placa de 96 pocillos se incubó a continuación durante 24
o 48 horas en una incubadora a 37 ºC.
Tras el periodo de incubación, 50 µl de solución de MTT (5 mg/ml en PBS) se añadieron a cada pocillo. La placa de 96 pocillos se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, y se centrifugó durante 5 minutos a 800xg. El sobrenadante se aspiró, 150 µl de dimetilsulfóxido (DMSO) se añadieron a cada pocillo, y el aglomerado celular se volvió a suspender. La absorción se determinó a una longitud de onda de 540 nm y a una longitud de onda de referencia de 690 nm en un lector ELISA.
Tal como se muestra en la Figura 1, después de 24 horas, el anticuerpo monoclonal LM1 inhibió la proliferación
45 celular de la línea celular de carcinoma de pulmón LOUNH91. En dichos estudios, las células LOUNH91 se incubaron con el anticuerpo monoclonal LM1, con sobrenadante agotado, o sin anticuerpo durante 24 horas. El eje y muestra la diferencia de absorbancia a 540 nm y 690 nm (A540A690). Como se evidencia en dichas gráficas, la incubación con el anticuerpo monoclonal LM1 dio como resultado una disminución en la proliferación celular y en la viabilidad celular tanto después de 24 horas como después de 48 h de período de incubación.
Resultados ilustrativos adicionales de estos estudios se representan en las Figuras 2A y 2B. Después de 24 o 48 horas, el anticuerpo monoclonal LM1 inhibió la proliferación celular de la línea celular de carcinoma de células epidermoides humano EPLC272H de una forma dependiente de la concentración, mientras que los controles con el sobrenadante de cultivo celular agotado permanecieron inalterados (Figura 2A y 2B).
Ejemplo 6
Este ejemplo incluye una descripción los estudios de apoptosis celular de un anticuerpo LM1. Los siguientes estudios se realizaron usando los materiales y métodos del Ejemplo 1.
Se pueden utilizar numerosos ensayos convencionales en la técnica para determinar si un anticuerpo induce la apoptosis en una célula. Por ejemplo, los inventores utilizan el CELL DEATH DETECTION ELISA PLUS (Roche, Mannheim, Alemania) para analizar la extensión con la que el anticuerpo LM1 induce la apoptosis. La detección de la muerte celular por ELISA se basa en un principio de sándwichenzimainmunoensayo cuantitativo que utiliza 65 anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos contra ADN e histonas, respectivamente. Este ensayo permite la determinación específica de mono y oligonucleosomas que se liberan en el citoplasma de las células que mueren
por apoptosis.
En particular, 1x104 células tumorales (LOUNH91) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron en presencia de diferentes concentraciones del anticuerpo LM1 contra IgM durante 24 horas a 37 ºC y un 7 % CO2 en 5 una incubadora de CO2. El sobrenadante del cultivo celular agotado con anticuerpos contra IgM no relacionados sirvió como control negativo.
Tras el periodo de incubación, las células se centrifugaron durante 10 minutos a 200xg y se eliminaron los sobrenadantes. Los aglomerados celulares resultantes se incubaron después con 200 µl de tampón de lisis durante 10 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, 20 µl de los sobrenadantes se transfirieron a una placa de microvaloración (MTP) revestida con estreptavidina y 80 µl de inmunorreactivo (una mezcla de AntiHistonaBiotina al 10 %, AntiADN peroxidasa al 10 % (AntiADN POD) y 80 % de tampón de incubación) se añadió antes de la incubación durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador MTP a 250 rpm. Tras el periodo de incubación, los componentes no unidos se eliminaron en una etapa de lavado con tampón de incubación. POD se determinó 15 fotométricamente con ABTS™ como sustrato (1 comprimido de ABTS™ (2,2'Azinodi[3etilenzotiazolinsufonato]) en 5 µl de tampón sustrato). La apoptosis inducida por el anticuerpo se midió determinando la intensidad de color del precipitado de color verde que se forma como resultado de su reacción usando un lector ELISA a una longitud de onda de 415 nm en comparación con solución de ABTS™ como blanco (longitud de onda de referencia de aproximadamente 490 nm). Basándose en esta intensidad de color, los inventores calcularon el nivel de apoptosis
20 inducida por anticuerpos.
Estos estudios mostraron claramente que el anticuerpo LM1 induce apoptosis en células de carcinoma LOUNH91 después de 24 horas de incubación (Figuras 3 y 4A) y después de 48 horas de incubación (Figura 4B). El eje Y en estas figuras es la diferencia entre la absorbancia 415 nm y la longitud de onda de referencia a 490 nm (A415A490) y
25 el medio del control es medio RPMI 1460. La concentración del anticuerpo LM1 fue bien 25 µl o 50 µl/ml en el sobrenadante.
Ejemplo 7
30 Este ejemplo incluye una descripción de la obtención de imágenes in vivo de neoplasias usando un anticuerpo LM1.
Un paciente con sospecha de tener una neoplasia, como un carcinoma de pulmón, puede recibir una dosis de anticuerpo LM1 radio yodado, u otro polipéptido específico de tumor, y anticuerpo inespecífico radiomarcado usando los métodos descritos en el presente documento. La localización del tumor mediante obtención de imágenes 35 se puede realizar según el procedimiento de Goldenberg et al. (N. Engl. 7. Med., 298:1384, 1978). Por I.V. se puede administrar a un paciente una infusión de volúmenes iguales de soluciones de anticuerpo 131ILM1 y anticuerpo inespecífico marcado con Tc99m. Antes de la administración i.v. de los reactivos, el paciente se suele ensayar previamente para determinar la hipersensibilidad a la preparación de anticuerpo (no marcado) o a un anticuerpo del mismo tipo que la preparación de anticuerpos. Para bloquear la captación de 131I por el tiroides, se administró por vía 40 oral una solución de Lugol, comenzando uno o más días antes de la inyección del anticuerpo radio yodado, a una dosis de 5 gotas dos o tres veces al día. Se pueden tomar imágenes de varias regiones corporales y vistas a 4, 8, y 24 horas después de la inyección de las preparaciones marcadas. Si está presente, la neoplasia, por ejemplo, un carcinoma colorrectal, se detecta por imágenes de la cámara gamma por resta del recuento de Tc99m del de los 131I, como se describe para el anticuerpo dirigido contra CEA marcado con 131I y albúmina sérica humana marcada
45 con Tc99m en DeLand et al. (Cancer Res. 40:3046, 1980). A las 8 horas de la inyección, la imagen suele ser clara y mejora con el tiempo hasta el barrido de las 24 horas.
Ejemplo 8
50 Este ejemplo incluye una descripción del tratamiento de neoplasias mediante el uso del anticuerpo LM1, tales como mezclas de anticuerpos marcados.
Un paciente con diagnóstico de neoplasia, por ejemplo, un carcinoma de pulmón, se puede tratar con los polipéptidos de la invención de la siguiente forma. Se puede administrar solución de Lugol, por ejemplo, 7 gotas 3 55 veces al día, al paciente. Posteriormente, se puede administrar una dosis terapéutica de anticuerpo 131ILM1 al paciente. Por ejemplo, se puede administrar una dosis de 131I de 50 mCi semanalmente durante 3 semanas, y a continuación repetidamente en intervalos ajustados individualmente, por ejemplo, cada tres meses, hasta que la toxicidad hematológica interrumpa el tratamiento. La pauta terapéutica exacta se determina de forma general por el médico a cargo del paciente o la persona que supervisa el tratamiento. Los anticuerpos radioyodados se pueden
60 administrar en forma de infusiones i.v. lentas en 50 ml de solución salina fisiológica estéril. Después de la tercera dosis inyectada, se puede observar una reducción en el tamaño del tumor primario y la metástasis, especialmente después del segundo ciclo de terapia, o 10 semanas después de iniciar la terapia.
Ejemplo 9
Este ejemplo incluye una descripción del tratamiento de neoplasias mediante el uso de anticuerpos conjugados.
5 Un paciente con diagnóstico de neoplasia, por ejemplo, un paciente con carcinoma de pulmón que ha experimentado metástasis al tórax, se puede tratar con soluciones de 131ILM1, 10BLM1, y anticuerpo inespecífico marcado con Tc99m. Se puede administrar al paciente Una cantidad de anticuerpo LM1 marcado con 131I (en 50 ml de solución salina fisiológica) suficiente para proporcionar 100 MCi de actividad 131I basado en un paciente de 70 kg de peso. Esta dosis es igual a 3,3 mg de un anticuerpo que tiene 4080 átomos de boro y 816 átomos de boro 10 por molécula de anticuerpo. La neoplasia se ubica precisamente en primer lugar usando el procedimiento del Ejemplo 6. Además, se debe administrar una solución de Lugol de forma continua al paciente, como en el ejemplo anterior. Un haz de neutrones térmicos bien colimados se puede enfocar a continuación sobre las ubicaciones definidas de los tumores. La irradiación con un haz de neutrones externos a una dosis de 400800 rads, suministrada en un periodo de 820 min, se realiza en cada sitio tumoral, y opcionalmente se repite con la
15 administración del anticuerpo para localizar el tumor, con o sin la radiomarca, en intervalos ajustados individualmente, pero que normalmente no superan una dosis total de 3200 rads salvo que esté indicada un tratamiento de irradiación externa simultánea. Si se desea, además de este tratamiento, también se puede administrar al paciente un agente antitumoral, tal como un agente quimioterapéutico.
Ejemplo 10
Este ejemplo incluye una descripción de la caracterización inmunohistoquímica adicional del anticuerpo LM1.
El análisis inmunohistoquímico reveló que el anticuerpo LM1 se une a las diferentes formas del cáncer. Por ejemplo,
25 LM1 se une a todos los grados y estadíos del adenocarcinoma de pulmón analizado, y no se detectaron diferencias entre hombres y mujeres. En particular, el anticuerpo LM1 se une al adenocarcinoma de pulmón en los estadíos UICC de IA, IB, IIB, IIIA y IIIB (por ejemplo, pT1pNoG1, pT1G2, pT1pNxG2, pT1pNoG2, pT1pNoG3, pT2pNo, pT2pNoG1, pT2G2, pT2pNoG2, pT2pN1G2, pT2pNoG3, pT2pN1G1, pT2pN1G3, pT3pNxG3, pT3pN1G3, pT1pN2G2, pT2pN2G2, pT2pN2G3, pT1pN3G1 y pT4pNoG2) con un porcentaje elevado de células de cada etapa con tinción positiva para LM1 (mayor del 40 %, 50 % o 60 %, normalmente de 90 % o superior).
LM1 también se une a todos los grados y estadios del carcinoma escamoso de pulmón analizado, y no se detectaron diferencias entre hombres y mujeres. En particular, el anticuerpo LM1 se une al carcinoma de pulmón de células escamosas a UICC estadios de IA, IIA, IB, IIB, IIIA, IIIB and IV (por ejemplo, pT1G2, pT1pNoG1, pT1pNoG2,
35 pT1pNoMoG3, pT1pNoG3, pT1pN1G3, pT1pN2G3, pT2pNoG2, pT2pNxG2, pT2pN1G2, pT2G3, pT2pNoG3, pT2pN1G3, pT2pN2G2, pT2pN2G3, pT3pNoG2, pT3pN1G2, pT3pN2G3, pT4pN1G3, pT2pN0pM1G2 y pT3pN0pM1G2) con un porcentaje elevado de células de cada etapa con tinción positiva para LM1 (mayor del 30 %, normalmente de 90 % o superior).
LM1 se une además a todos los grados y estadios del adenocarcinoma de colon analizado, y no se detectaron diferencias entre hombres y mujeres. En particular, el anticuerpo LM1 se une al adenocarcinoma de pulmón en los estadios UICC de IA, IIA, IIB, IIIA, IIIB y IIIC (por ejemplo, pT1pNoG1, pT1pNoG2, pT2pNo, pT2pNoG2, pT2pNoG3, pT3pNoG2, pT3pNoG3, pT4pNoG3, pT2pN1G2, pT4pN1G2, pT3pN1G2, pT3pN2G2, pT3pN1G3, pT3pN1G2, pT2pN2G2 and pT3pN2G2) con un elevado porcentaje de células de cada etapa de tinción dio un valor positivo para
45 LM1 (mayor del 30 %, normalmente de 90 % o superior).
LM1 se une adicionalmente a todas las pendientes y etapas del adenocarcinoma de páncreas analizado, y no se detectaron diferencias entre hombres y mujeres. En particular, el anticuerpo LM1 se une al adenocarcinoma de páncreas en los estadios UICC de IA, de en las etapas I, II, III, IVA y IVB (por ejemplo, pT1pNo, pT3pNoG2, pT3pNoG3, pT2pN1G3, pT3pN1G2, pT3pN1G3, pT3pN1aG2, pT3pN1aG23, pT3pN1bG1, pT3pN1bG2, pT3pN1bG23, pT3pN1bG3, pT4pN1b, pT3pNopM1G2, pT4pN1bpM1G2 y pT4pN1bpM1G3), y sobre en tumores endocrinos, con un porcentaje elevado de células de cada etapa con tinción positiva para LM1 (mayor del 30 %, normalmente de 90 % o superior).
55 Por lo tanto, el antígeno LM1 se expresa por tanto de forma ubicua en todos los grados y etapas del adenocarcinoma de pulmón, carcinomas de células escamosas de pulmón, adenocarcinoma de colon y adenocarcinoma de páncreas, tanto en hombres como en mujeres. Por lo tanto, el antígeno LM1 es una diana, y los anticuerpos LM1 y los fragmentos funcionales de los mismos y una terapia para tratar todos los estadios del adenocarcinoma de pulmón, carcinomas de células escamosas de pulmón, adenocarcinoma de colon y adenocarcinoma de páncreas, tanto en hombres como en mujeres.
El análisis inmunohistoquímico también reveló que el anticuerpo LM1 se une a las diferentes formas metastásicas del cáncer. En particular, LM1 se une a los ganglios linfáticos y a la metástasis cerebral que surge del adenocarcinoma de pulmón y del carcinoma de células escamosas de pulmón. LM1 también se une a la metástasis 65 de ganglios linfáticos que surge del cáncer de mama invasivo ductal e invasivo lobular. LM1 se une adicionalmente a la metástasis de hígado, metástasis de pulmón y metástasis de ganglios linfáticos que surgen del adenocarcinoma
de colon. LM1 se une adicionalmente a la metástasis de ganglios linfáticos que surgen del adenocarcinoma de estómago (intestinal y difuso), que surge del adenocarcinoma de páncreas y que surge del carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. Por lo tanto, el antígeno LM1 es una diana, y los anticuerpos LM1 y los fragmentos funcionales de los mismos y una terapia para reducir o inhibir el establecimiento o la formación de tumores 5 metastásicos, o el crecimiento de tumores metastásicos ya establecidos, que surgen de estos y otros cánceres, y que reducen el riesgo de recidiva o progresión a la formación o establecimiento de tumor metastásico, o crecimiento
o la proliferación de metástasis establecidas o formadas.
El análisis inmunohistoquímico también reveló que el anticuerpo LM1 no se une de forma detectable a diferentes
10 tejidos sanos no cancerosos. En particular, LM1 no se une de forma detectable al estómago (glandular), colon (epitelial), pulmón (glandular o alveolar), esófago (epitelial), páncreas (glandular), hígado (glandular), riñón (epitelial), próstata (glandular), testículos (germinal), mama (glandular), útero (epitelial), ovario (glandular), intestino delgado (epitelial), vejiga (epitelial), o glándulas suprarrenales (endocrino). LM1 tampoco se une de forma detectable al cerebelo, corteza cerebral, endotelio, retina, trompa de Falopio, corazón, riñón, ganglios linfáticos, páncreas,
15 tiroides), paratiroidea, pituitaria, placenta, piel, bazo, músculo o timo.
Ejemplo 11
Este ejemplo incluye una descripción de los estudios de perfilación de carbohidratos (Nglicano) presente en el LM
20 1, representado mediante un anticuerpo producido mediante un hibridoma depositado con el número de referencia DSMZ DSM ACC2623, depositado el 6 de noviembre de 2003, o como se representa mediante un anticuerpo que tiene las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera definidas como SEQ ID NO:1, 3, 5 o 7, y 11.
En resumen, LM1 obtenido de hibridomas de ser humano/ratón se evaluaron para determinar la presencia de
25 estructuras de glicano normalmente no humanas. Las estructuras de glicano de mamíferos humanos y no humanos se pueden distinguir según los glicanos sialilados: Los glicanos sialilados de origen humano contienen solamente Neu5Ac como ácido siálico, mientras que los roedores y la mayoría del resto de mamíferos también integran Neu5Gc en el interior de estructuras sialiladas.
30 El análisis por EM MALDITOF de los Nglicanos permetilados liberados se utilizó para determinar las estructuras que están presentes en los anticuerpos. La sustitución de un resto Neu5Ac por uno Neu5Gc en un glicano permetilado introduce un desplazamiento másico de 30 Da. Para el análisis por MALDITOF de los glicanos permetilados, 1,4 mg de LM1 se digirieron con PNGasa F y liberaron glicanos purificados. Tras la permetilación, los glicanos se analizaron mediante EM MALDITOF.
35 El espectro MALDITOF de LM1 se muestra en la Figura 5A. Man5GlcNAc2 to Man8GlcNAc2 representa el tipo de glicanos con alto contenido de manosa. Las otras estructuras corresponden a:
NeuAc1G1: NeuAc1Gal1GlcNAc1Man5GlcNAc2
40 NeuGc1G1: NeuGc1Gal1GlcNAc1Man5GlcNAc2 NeuAc1G2: NeuAc1Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 NeuGc1G2: NeuGc1Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 NeuAc1G3: NeuAc1Gal3GlcNAc2Man3GlcNAc2 NeuGc1G3: NeuGc1Gal3GlcNAc2Man3GlcNAc2
45 NeuAc2G3: NeuAc2Gal3GlcNAc2Man3GlcNAc2 NeuAc1NeuGc1G3: NeuAc1NeuGc1Gal3GlcNAc2Man3GlcNAc2 NeuGc2G3: NeuGe2Gal3GlcNAc2Man3GlcNAc2 NeuAc2G4: NeuAc2Gal4GlcNAc3Man3GlcNAc2 NeuAc1NeuGc1G4: NeuAc1NeuGc1Gal4GlcNAc3Man3GlcNAc2
50 NeuGc2G4: NeuGc2Gal4GlcNAc3Man3GlcNAc2
Solo las estructuras de glicano más predominantes se indican en la Figura 5A. Todas las estructuras de glicano identificadas se relacionan en la TABLA 5:
El análisis detallado de los Nglicanos de LM1 se comparó con los datos publicados en Arnold et al. (J.Biol.Chem. 280:29080 (2005)). El glicoperfilado del anticuerpo LM1 muestra un motivo de glicanos complejo. Existe un
5 contenido significativo de las estructuras con alto contenido de manosa (Man5 a Man9) y también una cantidad significativa de glicanos sialilados. Los glicanos galactosilados y fucosilados (por ejemplo, G1, G2, G0F, G1F y G2F) constituyen solamente una fracción minoritaria de los glicanos. La composición de glicanos del LM1 es comparable a los datos publicados por Arnold et al. sobre la glicosilación de la IgM del suero humano. Sin embargo, existen diferencias en las glicoformas.
10 El análisis por EM MALDITOF MS (Figura 5A) demuestra la presencia tanto de NeuAc como de NeuGc sobre los diferentes Nglicanos sialilados. Para cada uno de los glicanos sialilados, las isoformas con NeuAc, NeuGc o ambos ácidos siálicos están presentes.
15 Ejemplo 12
Este ejemplo incluye datos que aparentemente muestras la unión de LM1 a un antígeno de carbohidrato diana. Este ejemplo también incluye una descripción de los estudios de unión con el anticuerpo LM1 contra una biblioteca de carbohidratos, y antígenos del grupo sanguíneo.
20 El anticuerpo LM1 se une a numerosas células tumorales diferentes, tales como una o más de un línea celular de adenocarcinoma de pulmón Colo699 (número de registro DSMZ ACC 196), línea celular de adenocarcinoma de pulmón DV90 (número de registro DSMZ ACC 307), línea celular de carcinoma epidermoide de pulmón EPLC272H (número de registro DSMZ ACC 383), y una línea celular de carcinoma escamocelular de pulmón LOUNH91
25 (número de registro DSMZ ACC 393). Las células tumorales se trataron con Nglicosidasa y después se analizó la unión de LM1 a las células, tal como se describe en el Ejemplo 1.
Aunque los datos indican que la unión de LM1 a las células tratadas con Nglicosidasa fue significativamente reducida, lo que sugiere una implicación de un resto carbohidrato en el epitopo al que se une LM1, los datos
posteriores descritos en el Ejemplo 16 indican que LM1 se une a un antígeno expresado bacterianamente, lo que significa que los carbohidratos no son necesarios para la unión de LM1 al antígeno.
Un panel de carbohidratos se cribó para determinar su unión al anticuerpo LM1. En particular, el panel incluía mono, di, tri, tetra y oligosacáridos conjugadops a un separador de poliacrilamida. Los carbohidratos, número de sacáridos en los carbohidratos y tipo de espaciador se relacionan en la TABLA 6.
Tabla 6: Conjugados de carbohidratos
Separadores: 1 = carbohidratoHOCH2CH2CH2NH2; 2 = carbohidratoHOCH2CH2NH; 3 = carbohidratoNHCOCH2NH; y 4 = carbohidrato O(CH2)3NHCO(CH2)5NH
número
estructura del carbohidrato nombre abreviado número de sacáridos separador
0
HOCH2(HOCH)4CH2NH aminoglucitol
1
GalNacβ14GlcNAcβ LacdiNac di
1
2
GlcNAcβ13Galβ  GlcNacp3Gal di
2
3
GlcNAcβ16(GlcNAcβ13)Galβ1  Tk tetra 2
4
GalNacβ14Galβ14Glcβ, GA1 tri 1
5
GalNacαl3(Fucal2)Galβ14GlcNAcβ A tipo 2 tetra 1
6
Galα13(Fucα12)Galβ14GlcNAcβ  B tipo 2 tetra 1
7
Galα13Galβ14Glcβ, Galα13'Lac tri 2
8
GlcNAcβ12Galβ13GalNacα, GlcNAcβ12'TF tri 1
9
Galα14GlcNAcβ. Galα4GlcNAcβ di 1
10
Neu5Acβ (ácido βNacetilneuramínico mono 3
11
Glca14Glcβ maltosa di 1
12
Glcα  αDglucosa mono 1
13
Glcβ  βDglucosa mono 1
14
Galα  αDglalactosa mono 1
15
Galβ  βDgalactosa mono 1
16
Manα αDmanosa mono 1
17
6H2PO3Manα αDmanosa6 mono 1
18
Fucα αLfucosa mono 1
19
βDGLcNAc  βNacetilDglucamina mono 1
20
αDGaLNAc  αNacetilD mono 1
21
βDGalNAc  (βNacetilD mono 1
22
Manα13(Manα16)Manα Man3 tri 1
23
3OsuGalβ βDgalactosa3sulfato mono 1
24
Neu5Acα ácido αNacetilneuramínico mono 3
25
Neu5Acα2/3Galα1/4GlcNAcβ, 3'SLN tri 1
26
Galα14Galβ14Glcβ, Pk,Gb3 tri 2
27
Galα13GalNacβ Tαβ di 1
28
Galβ13Galβ Galβ3Gal di 1
29
Galβ13(Fucα14)GlcNAcβ Lea tri 1
30
Fucα12Galβ13(Fucα14)GlcNAcβ  Leb tetra 1
31
Fucα12Galβ13GlcNAcβ Led, H tipo 1 tri 1
32
Galβ13GlcNAcβ  Lec di 1
33
Galβ14(Fucα13)GlcNAcβ Lex tri 1
34
Fucα12Galβ14(Fucα1 3)GlcNAcβ  Ley tetra 1
35
Galp14Glcβ Lac di 1
36
Galβ14GlcNAcβ  LacNAc di 1
37
Galβ13GalNacα. TF di 1
38
Fucα13GlcNAcβ. Fuca3GlcNAc di 1
39
Fucα14GlcNAcβ Fuca4GlcNAc, Le di 1
40
GalNacα13GalNacβ Fs2 di 1
41
GalNacα13GalNacα núcleo 5 di 1
42
Galα13GalNacα. Taa di 1
43
Neu5Acα23Galβ13GlcNAcβ, 3'SiaLec tri 1
44
Galα12Galβ. Galα2Gal di 1
45
Gaiβ13GalNacβ Tpp di 1
46
GlcNAcβ14GlcNAcp (GlcNAc)2 di 1
47
Neu5Acα126GalNacα. sTn di 1
48
Fucα12Galβ13GalNacα, H tipo 3 tri 1
49
Neu5Acα23Galβ14Glcβ, 3'SL tri 3
50
Neu5Acα23Galβ13(Fucα14)GlcNAcβ sLea tetra 1
51
Neu5Acα23Galβ14(Fucα13)GlcNAcβ sLex tetra 1
52
Neu5Acα26Galβ14Glcβ, 6'SL tri 3
53
6OsuGlcNAcβ  βNacetilDglucosamina mono 1
54
Osu3Galβ13(Fucα14)GlcNAcβ  3'OsuLea tri 1
55
Osu3Galβ14(Fucα13)GlcNAcβ  3'OsuLex tri 1
56
3'OsuLacNAcp 3'suLacNAc di 1
57
3'OsuGalβ13GLcNAcp 3'suLec di 4
58
Galα16Glcβ melobiosa di 1
59
Galα13Galβ14GlcNAcβ Galα13'LacNAc tri 1
60
GlcNacα13Galβ13GalNacα, GlcNacα13'TF tri 1
61
Neu5Acα28Neu5Acα2 (Sia)2 di 1
62
Neu5Acα28Neu5Acα28Neu5Acα2 (Sia)3 tri 1
63
GlcNAcβ13Galβ13GalNacα GlcNAcβ13'TF tri 1
64
Galβ12Galβ. Gal2pGal di 1
65
Galβ14(60su)GlcNAcβ 60suLacNAc di 1
66
Galβ13(GlcNAcβ16)GalNacα  núcleo 2 tri 1
67
Fucα12Galβ13GalNacβ H tipo 4 tri 1
68
Galβ13GlcNAcβ1+3Galβ1+4GlcNAcβ LNT tetra 2
69
Galβ14GlcNAcβ13Galβ1+4GlcNAcβ LNnT tetra 2
70
Neu5Acα23Galβ GM4 di 1
71
Neu5Acα26Galβ Neu5Ac6Gal di 1
72
GalNacα13(Fucα12)Galβ Atri tri 4
73
Galα13(Fucα12)Galβ Btri tri 1
74
GalNacα13Galβ Adi di 1
75
Galα13Galβ Bdi di 1
76
Fucα12Galβ14GlcNAcβ H tipo 2 tri 1
77
6'suLacNAcp 6'0suLacNAc di 1
78
Fucα12Galβ Hdi di 1
79
3'0suGalβ13GalNacα  3'0suTF di 1
80
GlcNAcβ13Galβ14GlcNAcβ, GlcNAcβ13'LacNAc tri 2
81
GalNacβ13GalNacβ. diGalNacβ di 1
82
Neu5Acα23Galβ13GalNacα, 3'SiaTF tri 1
83
GlcNAcβ13GalNacα núcleo 3 di 1
84
GlcNAcβ16GalNacα núcleo 6 di 1
85
GlcNAcβ13(GlcNAcβ16) GalNacα  núcleo 4 tri 1
86
Neu5Acα26Neu5Acα23Galβ1  Sia2TF tetra 1
88
Neu5Acα26Galβ14GlcNAcβ12Manα16(Neu5 Acα26Galβ14GlcNAcβ12Manα13)Manp14G lcNAcp14GlcNAcβ YDS oligo 3
89
Galβ14GlcNAcβ12Manα16(Galβ14GlcNAcβ1 2Manα16)Manp14GlcNAcβ14GlcNAcβ 90S oligo 3
90
GlcNAcβ12Manα16(GlcNAcβ12Manα13)Man β14GlcNAcβ14GlcNAcβ 70S oligo 3
91
Neu5Acα23(Neu5Acα26)GalNacα  3,6SiaTn tri 1
93
Neu5Acα23 Galβ14GlcNAcβ  6'SLN tri 1
El cribado se realizó mediante ELISA. En resumen, los conjugados de carbohidratos se inmovilizaron en una placa de microvaloración de 96 pocillos, bloqueada con albúmina de suero bovino al 2 % e incubada en una primera etapa con el anticuerpo primario. La detección se realizó incubando el anticuerpo secundario de conejo dirigido contra IgM
5 humana marcado con POD (Dianova, código 309035095), revelado con sustrato de peroxidasa para micropocillos TMB (tebubio, código TMB500) durante 15 minutos, y medición de la DO a 450 nm y de nuevo 630 nm como longitud de onda de referencia. Cada sonda se investigó por duplicado.
Los primeros estudios se realizaron contra un panel de 6 conjugados para encontrar las diluciones del anticuerpo
10 individual para el ensayo, porque las señales positivas deberán estar en el intervalo de OD de 0,5 a 1,0. Además, se realizaron dos tipos de estudios de control para demostrar la especificidad para el carbohidrato de la señales obtenidas y excluir artefactos inespecíficos: (i) el uso del conjugado de aminoglucitol (número 0) como antígeno químicamente comparable, pero que no es un carbohidrato, y (ii) una preincubación del conjugado de carbohidrato con peryodato de acuerdo con Woodward (Woodward et al., J.lmmunol.Meth 78:143 (1985)), que altera la estructura
15 del carbohidrato. Una disminución en la intensidad de la señal detecta, por tanto, una especificidad de la unión entre el anticuerpo y el carbohidrato.
Adicionalmente, un anticuerpo dirigido contra lgM humana que no se une a carbohidratos se investigó contra un panel de 6 conjugados como control negativo. Los estudios incluyeron controles en blanco para cada conjugado en 20 cada placa de microvaloración individual. Los blancos representan pocillos sin incubación con el anticuerpo primario.
El cribado se realizó para una sola concentración, 0,5 µg/ml de LM1, 2 µg/ml de control negativo hlgM, y una dilución 1:20 del anticuerpo del control NemodTF2 que representa una concentración inferior a 0,1 µg/ml. El anticuerpo NMTF2 se sometió a ensayo contra el conjugado Galβ13GalNacα (Tabla 6, número 37) que este
25 anticuerpo reconoce positivamente. La intensidad de la señal se midió siempre a una OD mayor de 4.
La intensidad de la señal de las sondas en blanco siempre se midió a OD<0,020. Las Figuras 5B5F muestran los resultados del cribado del anticuerpo LM1 y se ilustran con respecto a la unión a conjugados de mono (Figura 5B), di (Figura 5C), tri (Figura 50), tetra (Figura 5E) y oligosacárido (Figura 5F), como se indica en la Tabla 6. Las barras
30 de control están ordenadas, el blanco, el conjugado con el no carbohidrato (Tabla 6, número "0"), y el control positivo NemodTF2.
El cribado reveló una baja intensidad de la señal a pesar de las elevadas concentraciones de anticuerpo en comparación con el anticuerpo de control positivo NemodTF2. Además, se midió una unión relativamente elevada
35 para el control sin carbohidrato (0), lo que no fue el caso para el NemodTF2. Sin embargo, la unión a los conjugados de carbohidratos cargados pareció potenciarse, en comparación con los conjugados de carbohidrato sin cambiar. Sin embargo, de nuevo, los datos del Ejemplo 16 indican que los carbohidratos no son necesarios para la unión de LM1 al antígeno.
40 Para comprobar la especificidad de la señales, así como para discriminar de un fondo elevado, se realizaron tres estudios adicionales. El conjugado 60suLacNAc (Tabla 6, número 77) se seleccionó para estos estudios porque la intensidad de la señal contra este conjugado quedó potenciada. El anticuerpo de control positivo NemodTF2 se investigó adicionalmente contra el conjugado Galβ13GalNacα (Tabla 6, número 37):
45 (i) Unión del anticuerpo en una serie de diferentes concentraciones contra el conjugado 60suLacNAc (Tabla 6, número 77), partiendo de una concentración donde todo el antígeno recubierto está unido (concentración de
saturación). La medición de la unión dependiente de la concentración se inició con concentraciones de anticuerpo que dan como resultado una unión máxima en las condiciones de ELISA usadas. LM1 1 (20 µg/ml) se usó para la unión con el conjugado 60suLacNAc. La concentración de partida de NemodTF2 fue <0,1 µg/ml (unión al conjugado número 37, Tabla 6). Una relación lineal entre la DO y la concentración indica una adsorción
5 no específica que significa que no hay una unión específica a dicho carbohidrato.
(ii) Comparación de la unión del anticuerpo a 60suLacNAc (Tabla 6, número 77) y al conjugado sin carbohidrato (Tabla 6, número 0) a cuatro concentraciones (etapas de dilución 1:2). La unión dependiente de la concentración se investigó en un intervalo de concentraciones más pequeño contra el conjugado 60suLacNAc (Tabla 6, número 77) y de nuevo con el conjugado sin carbohidrato (Tabla 6, número 0). La medición no se llevó a cabo con el anticuerpo del control NemodTF2, porque el anticuerpo no se une al conjugado sin carbohidrato. Una comparación de la unión entre el conjugado con carbohidrato y sin carbohidrato, puede indicar en cierta medida un reconocimiento de carbohidrato específico.
15 (iii) Unión a 60suLacNAc (Tabla 6, número 77) y al conjugado sin carbohidrato (Tabla 6, número 0) con o sin incubación con peryodato. Una oxidación con peryodato suave a pH ácido escinde los grupos hidroxilo vecinos del carbohidrato (Woodward et al., J.lmmunol.Meth 78:143 (1985), y es por tanto una herramienta para comprobar la especificidad de la unión del anticuerpo mediada por carbohidrato. La preincubación del antígeno del carbohidrato con peryodato disminuiría la intensidad de la señal de la unión al anticuerpo. La unión del anticuerpo LM1 no fue sensible al peryodato, en comparación con el anticuerpo del control NemodTF2, para el que se midió una disminución de la señal. Además, se midió no solamente una mayor unión a los pocillos recubiertos de carbohidrato, sino también a los pocillos no recubiertos de carbohidrato, lo que respalda la interpretación de una elevada unión de fondo, posiblemente mediada por contaminante(s) dentro de las muestras.
25 Los datos indican ausencia de unión específica a ninguno de los azúcares. Por lo tanto, parece improbable que los carbohidratos analizados reflejen la diana, y que una parte proteica pueda ser parte del epítopo.
Para el análisis de los antígenos del grupo sanguíneo, el anticuerpo LM1 se ensayó para su unión a los grupos sanguíneos A1, A2, B y O mediante un ensayo de hemaglutinación convencional. La hemaglutinación implica glóbulos rojos (RBC) y se puede utilizar para identificar los antígenos de la superficie del RBC (con anticuerpos conocidos) o para cribar anticuerpos (con RBC con antígenos de la superficie conocidos). Los resultados indican que el LM1 no se unió de forma detectable a los antígenos de los grupos sanguíneos A1, A2, B y O.
35 Para el análisis de la unión del anticuerpo LM1 a los linfocitos y granulocitos. En resumen, se recogió sangre venosa de un voluntario y se preparó un gradiente de Ficoll para separar los componentes de la sangre. Ficoll forma parte del FicollPaque que se utiliza para separar la sangre en sus componentes (por ejemplo, eritrocitos, leucocitos etc.). FicollPaque se coloca en la parte inferior de una columna, y la sangre se extiende lentamente por encima de FicollPaque. Tras la centrifugación, las siguientes capas se observan en la columna, de arriba abajo: plasma y otros constituyentes, células mononucleares (PBMC/MNC, por ejemplo, linfocitos), FicollPaque, y eritrocitos y granulocitos que deberán estar presentes en forma aglomerada. Tras la separación en gradiente de Ficoll, las diferentes poblaciones celulares (linfocitos, granulocitos) se lavaron y se utilizaron para análisis FACS. Las células (2 x 105) se incubaron posteriormente sobre hielo con el anticuerpo LM1 en una concentración final de 100 µg/ml o con el anticuerpo de control del isotipo correspondiente (IgM humana Chrompure, Dianova, Hamburgo, Alemania) a la
45 misma concentración durante 15 minutos sobre hielo, se lavó con PBS que contiene azida sódica al 0,01 %, y a continuación se incubó con un anticuerpo de conejo dirigido contra IgM humana marcada con FITC (1:50, Dianova) durante 15 minutos sobre hielo. Los anticuerpos se diluyeron óptimamente en PBS que contenía azida sódica al 0,01 % y las células se analizaron mediante citometría de flujo (FACScan; Becton Dickinson, EE.UU.). Los resultados indican que el LM1 no se une de forma detectable a los linfocitos o granulocitos.
Ejemplo 13
Este ejemplo incluye una descripción de los estudios que demuestran que los fragmentos del anticuerpo LM1 retienen la actividad inhibidora de la proliferación celular.
55 anticuerpo de LM1, representado mediante un anticuerpo producido mediante un hibridoma depositado con el número de referencia DSMZ DSM ACC2623, depositado el 6 de noviembre de 2003, o como se representa mediante un anticuerpo que tiene las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera definidas como SEQ ID NO:1, 3, 5, o 7 y 11 se sometió a intercambio con tampón con citrato sódico 100 mM (pH 3,5) usando columnas NAPtm 10 (Amersham Pharmacia Biotech) antes de la digestión con pepsina. Para cada miligramo de anticuerpo, se añadieron 5 µg de pepsina (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania), seguido de incubación durante 1015 min en un baño de agua a 37º C. La reacción finalizó por adición de 1/10 volumen de Tris 3,0 M (pH 8,8) seguido por centrifugación a 10.000 g durante 30 min. La digestión con pepsina también se realizó con un anticuerpo de control de IgM humana no relacionada (Chrompure IgM, Dianova, Hamburgo, Alemania). Antes de los estudios de
65 apoptosis, el fragmento Fv y el fragmento del control humano IgM se dializaron contra PBS. La electroforesis en gel SDS y la transferencia Western confirmaron la escisión de ambos anticuerpos mediante pepsina. El ensayo de
proliferación de células MTT descrito en el Ejemplo 4 se usó para estudiar el efecto sobre la proliferación de células BXPC3 y MKN45.
Los datos indican que el fragmento Fv de LM1 inhibe la proliferación celular de las células BXPC3 y MKN45. Los 5 anteriores resultados indican que los fragmentos del anticuerpo LM1 retienen la capacidad de inhibir o reducir la proliferación celular.
Ejemplo 14
10 Este ejemplo incluye una descripción de los estudios in vivo del anticuerpo LM1. Los datos indican que el anticuerpo LM1 es eficaz y puede reducir el tamaño de varios tumores, incluyendo carcinoma de colon, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, un tumor resistente a quimioterapia, así como metástasis tumoral.
Las células del carcinoma de colon humano HT29 se consideran un modelo de la metástasis en seres humanos. 15 Este carcinoma de colon metastatiza al hígado en ratones.
En resumen, células HT29 (1 x 106) se inyectaron intraportalmente en tres grupos de ratones atímicos (ratones Balb/c nu/nu de 10 semanas de edad, Charles River GmbH, Sulzfeld, Alemania). En los días 7, 9, 11, 13 y 15 tras la inoculación, los ratones recibieron 260 µg de PATLM1 (∼10,4 mg/kg, Grupo 1) y 260 µg de IgM no específica
20 (Grupo 2) en días alternos. Los animales de control adicionales (Grupo 3) no recibieron ningún tratamiento (sin inyección). Se determinó para cada grupo el número de animales con lesiones tumorales macroscópicas o microscópicas en el hígado en el día 60.
El peso corporal de los ratones que recibieron LM1 se mantuvo durante las 8 semanas después de la inyección de
25 células LM1. Por el contrario, el peso corporal de los ratones del control sin inyección y los ratones del control que recibieron IgM disminuyó en al menos un 20 % durante los 60 días del periodo de observación, por mala salud derivada de la metástasis hepática (Figura 6).
Se produjeron múltiples lesiones macroscópicas o microscópicas en el hígado de aproximadamente un 80 % de los
30 ratones del control sin inyección, y en aproximadamente un 70 % de los ratones del control que recibieron el IgM no específico. Por el contrario, solamente aproximadamente un 20 % de los ratones que recibieron LM1 tuvieron lesiones tumorales macroscópicas o microscópicas en el hígado (Figura 7). Los resultados anteriores indican, por tanto, que el anticuerpo LM1 puede reducir el establecimiento, formación o proliferación (crecimiento) de células metastásicas en una metástasis tumoral.
35 Los resultados anteriores indican que el anticuerpo LM1 reduce el número de metástasis hepáticas. El tratamiento con el anticuerpo LM1 conserva el peso corporal inicial de los animales tras la inyección de células tumorales, lo que puede indicar una actividad antitumoral sistémica del LM1.
40 A549 es una línea celular que forma carcinoma de pulmón en animales, y por tanto se puede utilizar como modelo animal del carcinoma de pulmón humano (por ejemplo, carcinoma de pulmón no microcítico, NSCLC). Células de carcinoma de pulmón A549 (2,0x106) se inyectaron s.c. en el día 0 a ratones (C.B17/IcrHanHsdscid, de una edad de 68 semanas, n=10 por grupo). El anticuerpo LM1 (200 µg) o el mAb de control (IgM humana Chrompure), o control de vehículo (NaCl) se administraron i.p. en los días 1, 3, 5, 7 y 9 a los ratones. Los ratones se sacrificaron en
45 el día 17 y se determinaron los pesos y volúmenes tumorales.
El tamaño del tumor promedio en los ratones que recibieron el anticuerpo LM1 fue significativamente inferior al de los ratones que recibieron el mAb de control. La reducción en el tamaño del tumor de los ratones que recibieron el anticuerpo LM1 fue del 71 %, en comparación con los ratones que recibieron el mAb de control.
50 El análisis histológico revelo que en los ratones tratados con LM1, las lesiones tumorales mostraban evidencia de apoptosis de células tumorales e inhibición y regresión del crecimiento tumoral. En los ratones tratados con LM1, las lesiones tumorales también mostraron evidencia de necrosis.
55 BXPC3 es una línea celular que forma cáncer pancreático en animales, y por tanto se puede utilizar como modelo animal del cáncer de páncreas humano. Células BXPC3 (2,0x106) se administraron s.c. en el día 0 a ratones (C.B17/IcrHanHsdscid, de una edad de 68 semanas, n=10 por grupo). El anticuerpo LM1 (200 µg) o el mAb de control (IgM humana Chrompure) se administró i.p. en días alternos una vez que el tumor quedó establecido (palpable) en el día 8 (5 dosis) y en la semana 4 (4 dosis). Los ratones se sacrificaron en el día 24 y se determinaron los volúmenes
60 tumorales.
El tamaño del tumor pancreático establecido en los ratones que recibieron el anticuerpo LM1 fue significativamente inferior al de los ratones que recibieron el mAb de control. La reducción en el tamaño del tumor de los ratones que recibieron el anticuerpo LM1 fue del 44 %, en comparación con los ratones que recibieron el mAb de control.
Para determinar la actividad de LM1 en un modelo tumoral establecido, el carcinoma mucoso de células A549 en ratones se sometió a tratamiento con el anticuerpo LM1. Células de carcinoma de pulmón A549 (2,0x106) se administraron s.c. en el día 0 a ratones (ratones lampiños NMRI, de una edad de 68 semanas, n=10 por grupo). Anticuerpo LM1 (1 mg/kg, 3 mg/kg, 9 mg/kg, o 27 mg/kg) o suero salino de control o mAb IgM (IgM humana 5 Chrompure), 675 µg) se administró i.p. en días alternos seis veces a ratones con tumores establecidos (14 días
después de la administración de células de carcinoma de pulmón) cada segundo días después de que el tumor se estableciera (palpable, ∼7mm2). En el día 14, el volumen tumoral promedio fue aproximadamente de 200 mm3. Los ratones se sacrificaron en el día 27 y se determinaron los volúmenes tumorales.
La reducción en el volumen de los tumores establecidos fue dependiente de la dosis, con una mayor reducción en el volumen tumoral observado a una dosis de 27 mg/kg. El volumen tumoral parece estabilizarse a las dosis de 1 y 3 mg/kg. A la dosis de 9 mg/kg, no se produjo una reducción aparente en el volumen tumoral.
Los resultados anteriores indican que el anticuerpo LM1 puede reducir el tamaño de diferentes tipos de tumor,
15 incluyendo carcinoma de colon, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, un tumor resistente a quimioterapia, así como el establecimiento, formación y proliferación (crecimiento) de metástasis de células tumorales. Los resultados anteriores también indican que el anticuerpo LM1 puede reducir el número, y tamaño de tumores o metástasis, o estabilizar el número o el tamaño de diferentes tumores establecidos. .
Ejemplo 15
Este ejemplo incluye una descripción de la identificación y verificación de la diana LM1. Los datos indican que el anticuerpo LM1 puede unirse aparentemente a una proteína que se une a un octámero que contiene un dominio no pou (NONO), también conocido como una proteína de unión de 54 kDa al ARN y ADN nuclear (p54nrb) y a la
25 proteínas nuclear de 55 kDa (nmt55).
En resumen, una preparación de membrana de células BxPC3 se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida 2D (PAGE) (Proteome Factory, Berlín, DE). Las proteínas fraccionadas (Figura 8A) se transfirieron a una membrana de PVDF y posteriormente se tiñeron con anticuerpo LM1. Las manchas indicadas en la membrana de PVDF (que se une a LM1; Figura 8B) se superpusieron en un PAGE teñido con plata, y las 8 manchas correspondientes se recortaron del gel y se sometieron a análisis MALDITOF (Proteome Factory, Berlín, DE).
Los resultados del MALDITOF, que relaciona las proteínas de cada mancha en orden de probabilidad, tras la comparación de los fragmentos identificados con la base de datos de secuencias, fueron Mancha 1a, vimentina,
35 desmina, tubulina, alfa, queratina, y neurofilamento; Mancha 1b, vimentina, desmina, periferina, queratina, y neurofilamento; Mancha 1c, vimentina, desmina, periferina, queratina, neurofilamento, y alfainternexina; Mancha 2, citoqueratina 8; Mancha 3, No identificada, Polipéptido inhibidor gástrico, péptido insulinotrópico dependiente de glucosa, fosfolipasa Calfa, y proteína disulfuro isomerasa; Mancha 4, citoqueratina 18; y casete de proteína de unión al ATP; Mancha 5, beta actina; Mancha 6, proteína de 54 kDa, que contiene un dominio no POU (NONO), y factor de corte y empalme humano; Mancha 7, No identificada, fucosil transferasa, miembro 5 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral, regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística, dominio HECT que contiene 1, y SB 1 de a subfamilia Alu; Mancha 7, No identificada, fucosil transferasa, miembro 5 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral, regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística, dominio HECT que contiene 1, y SB 1 de a subfamilia Alu; Mancha 8, No identificada, matriz repetitiva 2 de serina/arginina, proteína
45 de liberación de ras guanilo, producto de proteína sin nombre, y proteína mKIAA0232.
La diana LM1 también se identificó mediante cromatografía en gel de extractos de BXPC3 (Figura 9A) y las fracciones 9 y 10 se seleccionaron y sometieron a cromatografía de intercambio aniónico y posterior transferencia con el anticuerpo LM1 (Figuras 9B9D). Proteínas diana teñidas con LM1 adecuadamente dimensionadas del gel correspondiente (58 y 65 kDa) se recortaron y secuenciaron.
En resumen, las bandas de proteína se redujeron, y se alquilaron, y posteriormente se digirieron con la proteasa tripsina. Los péptidos resultantes se midieron con EM MALDI en un intervalo de 800 Da4500 Da para obtener una huella dactilar de masa de péptido. Una búsqueda en base de datos con el programa ProFound se realizó contra la
55 base de datos NCBI.
Banda 1: La proteína se identificó como calnexina [67,9 kDa / pI 4,6 / gil179832 / Homo sapiens]. Banda 2: Glutamato deshidrogenasa 1 [56,3 kDa / pI 6.7 / gil4885281 / Homo sapiens] se identificó en la banda
2. Banda 3: La proteína se identificó como calnexina [67,9 kDa / pI 4,6 / gil179832 / Homo sapiens]. Banda 4: La proteína de la banda 4 se identificó como que contiene el dominio no POU de unión a octámero, [54,3 kDa / pI 9.1 / gil34932414 / Homo sapiens]. Banda 5: La identificación de esta banda no fue clara, debido quizás a la baja concentración de proteína en la banda del gel. Pero existe evidencia de que la banda de proteína consiste en una que contiene el dominio no
65 POU, de unión a octámero, [54,3 kDa / pI 9.1 / gil34932414 / Homo sapiens]. Banda 6: En la banda de proteína se pudo encontrar una mezcla de queratina 9 [62,3 kDa / pI 5.1 / gil55956899
/ Homo sapiens] y chaperonina [61,2 kDa / pI 5.7 / gil3l542947 / Homo sapiens]. La queratina 9 debe ser un contaminante.
La secuencia de aminoácidos del NONO natural (SEQ ID NO:16) con las secuencias identificadas en la diana LM1 que son idénticas a la de tipo natural están marcadas en negrita (primera identificación).
La secuencia de aminoácidos del NONO natural con las secuencias identificadas en la diana LM1 que son idénticas 10 a la de tipo natural están marcadas en negrita (segunda identificación).
Los datos anteriores indican que LM1 se une a una nueva diana del cáncer, concretamente a una isoforma de la proteína que contiene el dominio no POU de unión a octámero (NONO) unida a membrana, también conocido como
15 una proteína de unión de 54 kDa al ARN y ADN nuclear (p54nrb) y a la proteínas nuclear de 55 kDa (nmt55). Esta proteína se expresa en células cancerosas, tumorales y malignas, y la unión a LM1 induce apoptosis de las células a las que se une.
Se ha notificado que el gen nmt55 cartografía el cromosoma Xq13.1 (70.420.15870.437.743). El análisis de la
20 expresión de los 33 genes unidos a X en 8 híbridos de células somáticas de ratón/ser humano que contenían cromosoma X humano activo (3 híbridos) o inactivo (5 híbridos) notificó que revelaba que el gen nmt55 se expresaba solamente en aquellos híbridos con el X humano activo. El gen se expande aproximadamente 18 kb y consiste en 12 exones con un tamaño comprendido entre 40 y 1.227 pb, se ha notificado que el codón de inicio está en el exón 3 y el codón de detención en el exón 12.
25 Para verificar la identidad de la diana LM1, se realizó la transfección con ARNip para regular por defecto la expresión de NONO/nmt55. La unión de LM1 debería desaparecer si NONO/nmt55 es la diana.
En resumen, Células BxPc3 se transfectaron transitoriamente con ARNip específico (dharmacon siGENOME Smart
30 Pool) y se recogieron 48 h después de la transfección. Las células se lisaron, y las muestras se analizaron en un PAGE al 10 % y se transfirieron sobre una membrana de PVDF. La transferencia de la membrana se tiño bien con αnmt55 o IgM de LM1.
El ARNip reguló por defecto la expresión de NONO/nmt55 (Figura 10A). La unión de LM1 a las células
35 transfectadas con el ARNip se redujo (Figura 10B, flecha). Estos estudios corroboran que LM1 se une a NONO/nmt55.
Para verificar adicionalmente la identidad de la diana LM1, se realizaron estudios de inmunopreparación de membranas celulares MKN, BxPC3 y A549 se realizaron con un anticuerpo comercial que se une a NONO/nmt55
40 (Dianova, MA32024). Los resultados se muestran en las Figuras 1113.
Las Figuras 11A11D ilustran los resultados con células MKN. En resumen, los extractos de membrana celular se inmunoprecipitaron con antinmt55, y posteriormente se tiñeron con antiNONO/nmt55 mAb de ratón/antiIgG de ratón HRP (Figura 11A), antiIgG de ratón HRP (Figura 11B), LM1 / antiIgM humana HRP (Figura 11C), antiIgM humana HRP (Figura 11D). La flecha superior (peso molecular mayor) es NONO, y la flecha de abajo (peso
5 molecular inferior) es una cadena pesada de ratón.
Las Figuras 12A12B ilustran los resultados con células BxPC3. En resumen, los extractos de membrana celular se inmunoprecipitaron con antinmt55, y posteriormente se tiñeron con LM1 (Figura 12A), o se tiñeron con antiNONO/nmt55 (Figura 12B), Las flechas indican nmt55 y la cadena pesada de IgG de ratón. Los resultados indican
10 que el anticuerpo dirigido contra nmt55 puede precipitar la proteína del extracto de membrana celular BxPC3.
Las Figuras 13A13B ilustran los resultados con células A549. En resumen, los extractos de membrana celular se inmunoprecipitaron con antinmt55, y posteriormente se tiñeron con antiNONO/nmt55 (Figura 13A), o se tiñeron con LM1 (Figura 13B), Las flechas indican nmt55 y la cadena pesada de IgG de ratón. Los resultados indican que el
15 anticuerpo dirigido contra nmt55 puede precipitar la proteína del extracto de membrana celular A549.
Para verificar adicionalmente la identidad de la diana LM1, se llevó a cabo un análisis FACS de las células A549, BxPC3 y MKN con un anticuerpo que se une a NONO/nmt55 (Dianova, MA32024) o LM1. Estos estudios revelaron que NONO/nmt55 se expresa sobre la superficie celular de las células A549, BxPC3 y MKN.
20 Se transfectaron establemente células A549 con NONO de sentido contrario, y se analizaron por FACS con un anticuerpo que se une a NONO/nmt55 y LM1. Para producir vectores, el ADNc Nono humano (1422 pb) se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando la línea celular de cáncer pancreático humano BxPC. Tras la amplificación por la PCR, el transcrito de Nono de longitud completa se introdujo en pcDNA3.1V5His
25 mediante una reacción de clonación TA (Invitrogen). Este método es una estrategia de clonación no dirigida y, por tanto, la relación entre los plásmidos Nono de sentido directo (pcDNA3.1V5HisNono6xHis) y de sentido contrario (pcDNA3.1V5HisNono6xHisAnti) es de aproximadamente 50:50. Tras el cribado mediante PCR, se identificaron varios clones con Nono de sentido directo (NONOdirecto) y de sentido contrario (NONOanti) bajo el control del promotor del citomegalovirus (CMV).
30 Las células A549 se transfectaron con NONOanti usando el reactivo de transfección TransPass y las células se seleccionaron en 1 mg/µl de G418 durante 23 semanas. Se establecieron siete líneas celulares estables con este plásmido de sentido contrario. El análisis mediante transferencia Western de la expresión de proteína endógena Nono en estas células reveló una reducción significativa en los niveles de proteína en comparación con los niveles
35 en las células del control.
Los estudios con FACS de células A549 transfectadas con NONOanti reveló una unión más débil de NONO/nmt55 y LM1 a las células. Los estudios indican que la regulación por defecto de la expresión de NONO/nmt55 sobre la superficie de las células A549 reduce la unión del anticuerpo dirigido contra NONO/nmt55 a las células.
40 El NONOdirecto se transfectó en HEK293 usando el reactivo de transfección TransPass y las células se seleccionaron en 1 mg/ml de G418 durante 23 semanas. Se establecieron diez clones celulares estables que expresan NONO en exceso. El análisis mediante transferencia Western de estas células mostro una expresión en exceso estable de la proteína de fusión recombinante Nono6xHis. Estas líneas celulares estables se pueden utilizar
45 en estudios FACS o, tras la purificación de la proteína Nono6xHis, generación de ELISA específicos de la diana.
Para confirmar que LM1 se une a las células HEK293 transfectadas con NONO, 40 µg de HEK293Nono6xHisA9 y lisado celular HEK293wt se usaron en la transferencia Western. Tras la transferencia, las proteínas inmunorreactivas se detectaron con LM1 (IgM) y un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (antiIgM
50 humanaHRP) (Figura 14A). Para demostrar que la interacción LM1Nono es específica de la diana, las mismas sondas de proteína se analizaron con un IgM de control (Figura 14B). El análisis reveló una interacción específica de la proteína de fusión LM1 y Nono6xHis. El tamaño diferente entre la proteína de fusión y la endógena es un artefacto de la expresión de la proteína recombinante en pcDNA3.1V5His.
55 Ejemplo 16
Este ejemplo incluye una descripción de los estudios para determinar si la glicosilación de la proteína NONO es necesaria para la unión a LM1.
60 Para determinar si la glicosilación de NONO es necesaria para la unión a LM1, el gen NONO humano (pEXP5CT) se transformó en bacterias BL21 (DE3). Tras la transformación, algunos clones bacterianos positivos se expresaron en medio LB inducido con IPTG 1 mM. El análisis mediante transferencia Western demostró que LM1 (IgM) se une a las bacterias que expresan la proteína de fusión Nono6xHis (Figura 15). El hecho de que la bacteria no glicosile proteínas excluye la tesis de que la interacción antígenoanticuerpo LM1 (diana) requiera la glicosilación del
65 antígeno (diana).
Ejemplo 17
Este ejemplo incluye una descripción de algunas variantes de anticuerpo LM1, y los estudios de unión. Los estudios de unión indican que las variantes de secuencia del anticuerpo LM1 retienen la capacidad de unión al antígeno 5 diana nmt55.
Se expresaron varios anticuerpos LM1 en forma de un anticuerpo recombinante scFv (monocatenario) y se analizaron para determinar su unión a las células diana (A549, BxPC3, HT29, HeLa, CRL1424 y HDFa). Los cambios de un solo aminoácido en la secuencia de proteína de los dominios variables V de la cadena ligera y pesada (variable) pueden afectar al nivel de expresión de la célula y, posiblemente, a la afinidad del anticuerpo por el antígeno diana. Sin embargo, todas las variantes que se unen de forma detectable a células que expresan bacterianamente NONO/nmt55 tal como se determina en un ensayo ELISA.
Los diferentes estudios con anticuerpos scFv de LM1 para la unión son LM1 scFv (nuevo) representado por las
15 SEQ ID Nos:3 y 11, (1BTA1.16VH y 1BTA1.16VL), LM1 scFv (representado por las SEQ ID NO:1 y 11), LM1 scFv opt (representado por las SEQ ID NO:9 y 13), un IgM de LM1 derivado de hibridoma, e IgM de LM1 (SEQ ID NO:3 y 11) producidos en una línea celular perC.6™ (Percivia).
El análisis de unión se realizó con poblaciones de células vivas de líneas celulares de cáncer humano (A549, BxPC3, HT29, HeLa, CRL1424 y HDFa) cultivadas hasta una densidad celular consistente. Se añadieron anticuerpos humanos a las células y, si presentan un antígeno diana reconocido por los anticuerpos, se produce la unión. Se añadió un anticuerpo secundario con una etiqueta fluorescente (FITC) que se detectó mediante FACS (clasificación celular activada por fluorescencia). Los inventores utilizaron anticuerpo dirigido contra FLAG FITC de ratón para las proteínas scFv de LM1 y FITC de ratón dirigido contra IgM humano para la proteína IgM.
25 La unión se refleja por un desplazamiento de la población hacia la derecha, lo que se considera positivo, si este desplazamiento es superior al de los controles negativos. Varios eventos pueden producir un desplazamiento "falso positivo". Las células solas autofluorescen, por lo que necesitan medirse, y algunas líneas celulares hacen esto más que otras. La adición solamente del anticuerpo primario provoca en las células un desplazamiento, tal como lo hace también la adición de solo el anticuerpo secundario. Todos estos eventos se consideran como controles negativos. La unión del anticuerpo a una línea celular (HDFa línea celular dérmica) negativa para el antígeno diana también se lleva a cabo.
Las líneas celulares A549, BxPC3, HT29, HeLa, CRL1424 y HDFa se compararon con la unión a LM1. Se usó una
35 concentración de 10.000 células para cada línea celular. El anticuerpo se añadió a 100 µg/µl pero la cantidad total de proteína utilizada por reacción es de 20 µg. Los datos determinan que todas las formas del anticuerpo LM1 estudiados se unen a las 5 líneas celulares que expresan el antígeno diana.
A continuación, el antígeno diana de LM1, nmt55, se expresó en bacterias y se purificó con una resina antiHIS. El gel SDS teñido con Coomassie mostró algunas bandas en la región de 5060 KDa, que tiene el tamaño esperado. La banda de 55 Kda fue la más intensa, pero no era la única banda. Estas otras bandas contribuirán a la concentración de proteína total. Se realizaron ensayos ELISA. En resumen, nmt55 se revistió sobre la placa, se bloqueó, y después se sondeó con los anticuerpos; a continuación, el anticuerpo secundarioHRP relevante se añadió y se detectó. Los datos indican que todas las formas del anticuerpo LM1 estudiado se unen al antígeno diana nmt55 expresado
45 bacterianamente.
Ejemplo 18
Este ejemplo incluye una descripción de un anticuerpo LM1 contra IgG de isotipo cambiado, y los estudios de unión.
En resumen, la región VH del LM1 se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el hibridoma IgM de LM1. ADNc como molde usando el siguiente conjunto de cebadores: cebador 5'AGA TCT GCC ACC ATG GCA TGC CCT GGC TTC3', y cebador 3', 5'TGA AGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC. La región CH del LM1 se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el vector de expresión pFUSE
55 CHIghG1 como molde. Se indica a continuación el conjunto de cebadores usado: cebador 5'AGC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC3', y cebador 3', 5'CTC GAG TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG.
Para producir la cadena pesada de LM1, la región VH y CH se ligó mediante la T4 ADN ligasa (New England Biolabs) y se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se indica a continuación el conjunto de cebadores usado: cebador 5'AGA TCT GCC ACC ATG GCA TGC CCT GGC TTC 3', y cebador 3', 5' CTC GAG TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG. Este fragmento se ligó mediante clonación TA en el vector pEXP5CT/TOPO TA (Invitrogen). Después de la clonación TA, la cadena pesada de LM1 se recortó del vector pEXP5CT/TOPO TA con BglII/XhoI y se transfirió al primer casete de expresión de pVitro2neomcs (InvivoGen).
65 La cadena ligera del LM1 se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el hibridoma IgM de LM1. ADNc como molde usando el siguiente conjunto de cebadores: cebador 5'GAT ATC TCC GCC ACC
ATG GCA TGC CCT GGC TTC3', y cebador 3', 5'GTC GAC CTA TGA ACA TTC TGT AGG GGC CAC. Este fragmento de PCR se ligó mediante clonación TA en el vector pEXP5CT/TOPO TA (Invitrogen). Después de la clonación TA, la cadena ligera de LM1 se recortó del vector pEXP5CT/TOPO TA con EcoRV/Sal I y se transfirió al segundo casete de expresión de pVitro2neomcs (InvivoGen). La secuencia de todos los productos de la PCR se
5 confirmó mediante secuenciación de ADN (Qiagen).
Para confirmar que la IgG retiene la actividad de unión, se produjo un anticuerpo mediante la expresión en células HEK293, y se evaluó un anticuerpo que se une a células A549 y BxPc3. Los materiales utilizados en estos estudios incluyeron RPMI 1640 (PAA, E15039), suero de feto bovino al 10 % (PAA, A15151), glutamina al 1 % (PAA, M11004), solución de disolución celular (Sigma C5789), Anticuerpo dirigido contra IgG humanoFITC, dianova, 109095003, y 1xPBS.
Se utilizó plásmido de expresión "pVitro2LM1HCLC" con una concentración madre de 2,5 µg/ml y una relación A260/A280 entre 1,75 y 1,78. El procedimiento de transfección se realizó en medio que contiene suero (DMEM con
15 FBS al 1 %) sobre una superficie de aproximadamente 2500 cm2 (16x 154 cm2 de placas de pocillos recubiertos de poliDlisina). En resumen, las células HEK293 cultivadas en condiciones que contienen suero y recogidas en mitad de su fase de crecimiento exponencial, se contaron 24 h antes de realizar el procedimiento de transfección. Se diluyeron hasta una concentración de aproximadamente 2,5x107 células/pocillo y se incubaron hasta el día siguiente. Las células se volvieron a contar y cuando casi doblaron su concentración (entre 5,0 x 107 células/placa (densidad celular de aproximadamente un 80 %), se transfectaron como se describe a continuación.
Para la preparación del complejo de transfección, 1,5 mg de ADN endrofree se diluyó en 40 ml de medio nuevo sin suero (suficiente para dieciséis placas de 150 cm2). Tras pipetear arriba y abajo para mezclar la solución, se añadieron 10 ml de PEI, se homogeneizaron por vortización inmediatamente y se incubaron durante 8 min a TA.
25 Tras añadir 324 ml de medio que contiene suero (10 %), el complejo ADN:PEI se añadió a las células y se incubó a 37 ºC durante una hora. Para eliminar el PEi de las células, las placas se lavaron tres veces con PBS. Después, las placas se llenaron con 70 ml de medio que contiene suero (1 % FBS) y se incubaron durante una noche. Para eliminar las células muertas, el medio se cambió y, a continuación, todas las placas se incubaron normalmente durante 6 días a 37 ºC. Los sobrenadantes se almacenaron a 4 ºC para la purificación posterior de las proteínas.
Para los estudios de unión, las células A549 y BxPc3 se tripsinizaron con solución de disociación celular, se resuspendieron en medio completo y se configuraron a 2x105/ml. Después de 30 minutos sobre hielo, las células se dispersaron en 1 ml por tubo FACS y se lavaron una vez con PBS enfriado en hielo por centrifugación a 500 g y 4 ºC. La tinción se realizó con las concentraciones indicadas de anticuerpo IgG o sin anticuerpo en 200 µl de PBS.
35 Los anticuerpos se incubaron durante 30 minutos sobre hielo, a continuación se lavaron con PBS enfriado en huelo y se aplicó el anticuerpo secundario a una dilución de 1:50 en 200 µl por tubo. Después de otros 30 minutos de incubación en la oscuridad, las células se lavaron dos veces con PBS y se aplicaron a FACS.
El análisis por FACS reveló que el anticuerpo LM1 contra IgG se une a las células A549 y BxPc3, lo que indica que el anticuerpo retiene la especificidad de antígeno/epítopo.
Ejemplo 19
Este ejemplo incluye una descripción de estudios de unión adicionales que indican que LM1 se une al antígeno diana, NONO/nmt55, una parte del cual incluye la secuencia de 300 aminoácidos del extremo N de NONO/nmt55.
45 En resumen, nmt55 se clonó en el vector pPOW para su secreción en el periplasma de E coli. Se diseñaron cebadores para amplificar el gen NONO procedente del gen NONO humano clonado en pExP5CT (descrito en el Ejemplo 16) y se introdujo en el vector de expresión bacteriana pPOW que permite la secreción en el periplasma de E coli mediante la señal de secreción pelB.
Para expresar nmt55 pPOW, un cultivo inicial de 50 ml se inoculó con E. coli BL21 (DE3) recientemente transformada que contiene el plásmido pPOW, que codifica el nmt55 de longitud completa, se cultivó en medio triptona de levadura (YT) con ampicilina a 33 ºC con agitación, aproximadamente 250 rpm. Tras la incubación nocturna, 25 µl de este cultivo se añadieron a 175 µl de caldo terrífico (TB) que contiene ampicilina en un matraz
55 Erlenmeyer de 2 l. el cultivo se hizo crecer a 33 ºC, con agitación, aproximadamente 250 rpm, hasta que alcanzó una densidad óptica (DO600) de ∼4.000 (∼ 3 h), una alícuota de 1 ml y se almacenó a 4 ºC para comparación posterior (T0). A continuación el cultivo se pasó a incubadoras a 42 ºC y el crecimiento continuó durante 3 horas más. El progreso se comprobó periódicamente después de 3 horas, una vez que la OD600 se hubo estabilizado se detuvo la inducción. Se tomó una alícuota de 1 ml tras la inducción TFINAL y se almacenó a 4 ºC para comparación posterior.
Los cultivos se transfirieron a frascos de policarbonato de 2540 ml (Nalgene) y se centrifugaron a 4000 x g, 4 ºC durante 20 minutos para aglomerar las células de E. coli. A continuación, el medio se decantó y los aglomerados se almacenaron a 20 ºC para la extracción y purificación de proteínas usando Profinia™ antiHis.
65 Para extraer nmt55 pPOW, los aglomerados descongelados se volvieron a suspender completamente, por pipeteo y
vortización, en 15 µl de tampón de lisis Profinia denaturing IMAC (BioRad Laboratories) para lisar las células. El lisado se sonicó a continuación sobre hielo, usando un sonicador de sonda (10 µm de amplitud), en intervalos de 30 s durante 4 minutos. El lisado se clarificó mediante centrifugación (20.230 x g; minifuga Eppendorf 542) en tubos de microfuga (Eppendorf) y se filtraron a través de un filtro de 0,45 µm al vacío. El lisado se transfirió a continuación a
5 un tubo de muestra de 50 ml (Falcon; BD) para su purificación.
La purificación se realizó mediante Histag usando cromatografía de afinidad con desnaturalización por metal inmovilizado (IMAC). En resumen, el nmt55 extraído se purificó mediante purificación de proteínas IMAC automatizado con Pofinia™. Los tampones utilizados en la purificación se suministraron por BioRad como
10 concentrados 1,4x. Se añadió urea a estos concentrados para obtener una concentración final de urea 6 M. Se instaló un IMAC (NiNTA) en el sistema y el instrumento se configuró según las recomendaciones del fabricante. Protocolo Profinia IMAC:
Etapa
Función Tampón ml/min Volúmenes de columna Tiempo (min)
1
Lavado con agua Agua des 20 0.2
2
Equilibrar columna Agua des 2 2 1
3
Equilibrar columna Tampón 1† 2 5 2.5
4
Cargar muestra N/A 2 x x
5
Lavado columna 1 Tampón 1† 2 6 3
6
Lavado columna 2 Tampón 2† 2 6 3
7
Eluir 1* Tampón 3† 2 3.1
8
Eluir 2* Tampón 3† 2 4 2
9
Limpiar columna Tampón 5† 2 5 2.5
10
Limpiar columna Tampón 6† 2 5 2.5
11
Lavado con agua Agua des 2 5 2.5
12
Almacenar columna Tampón 7† 2 7 3.5
13
Lavado con agua Agua des 20 0.2
14
Limpiar juntas bomba Agua des 20 0.2
15
Pausa limpieza
16
Limpiar puerto muestra Agua des 20 0.2
† Número de tampón según su posición en Profinia
15 El intercambio de tampón se realizó mediante dispositivos Amicon Ultra15. En resumen, 15 ml de 1 x PBS (NaCl 300 mM, pH 6,5) se añadieron un concentrador de centrífuga Amicon Ultra15 y se centrifugaron a 4000 rpm (4 ºC) durante 15 minutos para eliminar cualquier conservante de las membranas. Se añadió un volumen de muestra completamente eluido (4 ml) al depósito de la membrana, y se llevó hasta 15 ml con 1 x PBS (NaCl 300 mM, pH 6,5) y se centrifugaron a 4000 rpm (4 ºC) durante 30 minutos. Una muestra de 1,0 ml del flujo pistón se descartó y una
20 cantidad adicional de 14 ml de 1 x PBS (NaCl 300 mM, pH 6,5) se añadió al depósito y se repitió el proceso. Se repitió 2 veces más para garantizar que la concentración de urea es suficientemente baja. Recuperación de la muestra de proteína y medición de la concentración a DO280.
La electroforesis en gel de acrilamida (PAGE) se llevó a cabo en To, TFlNAL usando el sistema Invitrogen Novex 25 NuPAGE según las instrucciones del fabricante.
La transferencia Western se realizó usando un sistema de transferencia de gel Invitrogen iBlot™ según las recomendaciones del fabricante. La membrana después de la transferencia se bloqueó usando leche desnatada al 5 % en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. El reactivo de bloqueo se descartó, y el anticuerpo primario 30 (LM1opt scFv, una variante de Fv monocatenaria de LM1 con etiquetas FLAG y His en el extremo C) se añadió a una relación de 1:500 en leche desnatada al 5 % TBST (5 ml de volumen total) y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente (basculante). A continuación se descartó el anticuerpo primario, la membrana se lavó con 3 x cambios de 5 ml de TBST en intervalos de 5 minutos. El anticuerpo secundario (conjugado antiFLAG HRP) se añadió a una relación de 1:1000 en leche desnatada al 5 % TBST y se incubó durante una hora más (balanceo). La 35 membrana se volvió a lavar con 3 x cambios de 5 ml de TBST en intervalos de 5 minutos y durante 5 minutos más con TBS. La detección se realizó mediante detección colorimétrica de sustrato DAB potenciada con metal (Thermo
Scientific).
Se realizó a continuación el análisis por espectrometría de masas con digestión en gel de las proteínas teñidas con plata. En resumen, la banda de gel de interés del gel nmt55 purificado (Figura 16B) se recortó y se introdujo en un
5 tubo de micrófuga de 1,5 ml (Eppendorf) y se lavó dos veces con 300 µΙ de agua de calidad Milli Q durante aproximadamente 15 minutos. El tapón de gel se lavó a continuación 2 veces con 50 µΙ de acetonitrilo al 50 % en bicarbonato de amonio 50 mM (pH 8,0) para eliminar toda la mancha del tapón de gel. Cada lavado duró aproximadamente 30 minutos.
El tapón de gel se deshidrató a continuación con 100 µΙ de acetonitrilo hasta que se volvió opaco, y a continuación el líquido se decantó y el tapón se secó en una centrífuga al vacío. A continuación, el tapón se rehidrató y se incubó en ditiotreitol 10 mM (DTT) en bicarbonato de amonio 25 mM a 56 ºC durante 1 hora, después, se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se añadió después a la muestra un volumen igual de yodoacetamina 55 m en bicarbonato de amonio 25 mM y se incubó en la oscuridad durante 45 minutos. Después de esto, la solución de DTT/yodoacetamida
15 se decantó, y la muestra se lavó con bicarbonato de amonio 25 mM durante 10 minutos seguido por una deshidratación de 10 minutos con acetonitrilo al 100 %. De nuevo, la muestra se rehidrató con bicarbonato de amonio 25 mM durante 15 minutos. Este líquido se decantó a continuación y se sustituyó con acetonitrilo al 100 % durante 10 minutos. El líquido se decantó a continuación y el tapón se secó en una centrífuga al vacío.
Se preparó una solución de secuencia de porcino modificada y graduada en tripsina (Promega) por disolución reciente de 20 a 25 µg en 200 µΙ de HCl 1 mM o ácido acético al 1 % de forma que la concentración final esté comprendida entre 100 ng/µΙ y 125 ng/µΙ. La tripsina de trabajo se preparó diluyendo la solución madre 1:10 con bicarbonato de amonio 25 mM de tal forma que la concentración final sea de 10 a 12,5 ng/µΙ.
25 Tras centrifugar al vacío, el tapón seco se rehidrató con 20 µΙ de solución de tripsina de trabajo durante 20 minutos. El exceso de solución de tripsina se eliminó con una pipeta y la muestra se digirió a 37 ºC durante 4 h. La digestión se detuvo mediante 25 µΙ más de ácidos al 10 % y se dejó reposar durante 15 minutos. El sobrenadante se recuperó, y el tapón de gel se extrajo adicionalmente con 15 µΙ de acetonitrilo al 50 % en bicarbonato de amonio 50 mM durante 15 minutos para recuperar más péptidos que se combinaron con el sobrenadante inicial, en este momento el tapón se descartó. A continuación, la muestra se concentró a 5 µΙ en una centrífuga de vacío y se cargó directamente en una espectrometría de masas LCMSDToF para su análisis.
La Figura 16A muestra el análisis PAGE de la expresión de nmt55. El gel se tiñó usando Invitrogen SimplyBlue SafeStain. Hilera 1) marcador de peso molecular de proteína preteñido Novex Sharp. Hilera 2) para la muestra, que
35 indica el nivel inicial de expresión de proteína. Hilera 3) TFINAL que indica el nivel de expresión de nmt55 tras la inducción térmica a 42 ºC.
La Figura 16B muestra el análisis PAGE de nmt55 tras purificación con Profinia™. El gel se tiñó usando Invitrogen SimplyBlue SafeStain. Hilera 1) marcador de peso molecular de proteína preteñido Novex Sharp. Hilera 2) nmt55 purificado y concentrado procedente de la expresión periplásmica en E coli. Aunque el PM previsto de NMT55 es 55 KDa, se observó una banda de proteína de aproximadamente 30 KDa, lo que sugiere un producto de escisión.
Figura 16C muestra la transferencia Western de nmt55 tras purificación con Profinia™. Hilera 1) marcador de peso molecular de proteína preteñido Novex Sharp. Hilera 2) el nmt55 purificado y concentrado se detectó usando LMlopt
45 scFv como anticuerpo primario con anticuerpo monoclonal dirigido contra FLAG conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) como anticuerpo secundario. Se detectó una banda de proteína de aproximadamente 30 KDa se detectó mediante LMlopt scFv.
La banda de 30 KDa débil del gel teñido con Coomassie (Figura 16B) se recortó y se trató para el análisis por espectro de masas, como se ha descrito. Del espectro de masas y la búsqueda informática en bases de datos, se identificaron algunos hallazgos. SLYD_ECOLI peptidilprolil cistrans isomerasa de tipo FKBP slyD OS=Escherichia coli NONO_HUMANO proteína de unión al octámero que contiene el dominio no POU =Homo sapiens DEOD_ECOHS Purina nucleósido fosforilasa tipo deoD OS=Escherichia coli DEOD2_VI8CH Purina nucleósido fosforilasa tipo deoD 2 OS=Vibrio cholerae DEOD_SALCH Purina nucleósido fosforilasa tipo deoD deoDtype
55 OS=Salmonella choleraesuis
Se calculó la probabilidad de Mowse basada en la probabilidad respecto a los hallazgos de proteínas. La puntuación de los iones es 10*Log(P), donde P es la probabilidad de la correspondencia observada en un evento aleatorio. Las puntuaciones de iones individuales > 51 indican la identidad o una extensa homología (p< 0,05). Las puntuaciones de las proteínas se derivan de las puntuaciones de los iones de forma no probabilística para ordenar los hallazgos de proteínas.
La cobertura de la secuencia de nmt55 fue el 11 %. Los péptidos correspondientes (negrita, subrayado) de NONO identificado a partir de espectrómetro de masas y búsqueda en bases de datos corresponden a las secuencias de
65 péptido en la región del extremo N del NMT55 recombinante. De esta forma el epítopo al que se une LM1 está presente en al menos el dominio de 30 KDa del extremo N, o de los aminoácidos 1300 de NONO/nmt55.
LISTADO DE SECUENCIAS 5
<110> PATRYS LIMITED VOLLMERS, HEINZ PETER BRANDLEIN, STEPHANIE THALHEIMER, ANDREAS
10 ILAG, LEODEVICO L. POWER, BARBARA UDABAGE, LISHANTHI HENSEL, FRANK SCHOENEN, FRANK
15 KELTER, ARNDTRENE HOSKING, CHRISTOPHER G.
<120> ANTICUERPOS LM, FRAGMENTOS FUNCIONALES, ANTÍGENO DIANA LM1, Y MÉTODOS PARA
PREPARARLOS Y USARLOS 20
<130> 090946WO
<140> PCT/US2009/47401
<141> 15062009 25
<150> 61/143.351
<151> 08012009
<150> 61/061.881 30 <151> 16062008
<160> 30
<170> PatentIn versión 3.3 35
<210> 1
<211> 129
<212> PRT
<213> Homo sapiens 40
<400> 1
<210> 2
<211> 342
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 129
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 387
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 129
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 387
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 6
<210> 7
<211> 129
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
<210> 8
<211> 387
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 130
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
<210> 10
<211> 390
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 10
<210> 11
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
<210> 12
<211> 339
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 12
<210> 13
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13 <210> 14
<211> 345
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 14
<210> 15
<211> 241
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15 <210> 16
<211> 471
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 33 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador 10
<400> 17 agatctgccg ccaccatggc atgccctggc ttc 33
<210> 18 15 <211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador
<400> 18 tgaagagacg gtgaccattg tccc 24
<210> 19
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador
<400> 19 agcaccaagg gcccatcggt cttc 24
<210> 20
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador
<400> 20 ctcgagtcat ttacccggag acagggagag 30
<210> 21
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador
<400> 21 gatatctccg ccaccatggc atgccctggc ttc 33
<210> 22
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador
<400> 22 gtcgacctat gaacattctg taggggccac 30
<210> 23
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador
<400> 23 atgcagagta ataaaacttt taac 24
<210> 24
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador
<400> 24 gtatcggcga cgtttgtttg gggc 24
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
25 <210> 27
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
<210> 28 35 <211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29 <210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que comprende una región variable de cadena pesada y una
    región variable de cadena ligera, en el que: 5
    (a) la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera comprenden una secuencia que es al menos un 90 % idéntica a la región variable de la cadena pesada y una secuencia que es al menos un 90 % idéntica a la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo LM1 producido mediante una línea celular depositada como depósito DSMZ n.º DSM ACC 2623; y 
    10 (b) la región variable de cadena pesada comprende las tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 1, y la región variable de la cadena ligera comprende las tres CDR de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11
    para su uso en el tratamiento de metástasis de una neoplasia, un tumor o un cáncer en un sujeto que necesita
    15 tratamiento, o para reducir o inhibir la metástasis de una neoplasia un tumor o un cáncer primarios en uno o más sitios, ubicaciones o regiones diferentes de una neoplasia, un tumor o un cáncer primarios en un sujeto que necesita tratamiento, o para reducir o inhibir el crecimiento, la proliferación, la movilidad o la capacidad de invasión de células neoplásicas, células tumorales o células cancerosas que se pueden desarrollar u ocasionar una metástasis en un sujeto que necesita tratamiento.
  2. 2. El anticuerpo o el fragmento funcional para el uso de la reivindicación 1, en donde las tres CDR de la región variable de cadena pesada comprenden o consisten en CDR1, VSGGSISSGGYY, CDR2, YIYYSGSTYYNPSLKS y CDR3, VDARYDYVWGSYRYDAFDI; y/o las tres CDR de la región variable de cadena ligera comprenden o consisten en CDR1, SGSSSNIGNNYVS, CDR2, DNNKRPSG y CDR3, GTWDSSLSAGWV.
  3. 3.
    El anticuerpo o el fragmento funcional para el uso de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo se unen a la proteína NONO/nmt55.
  4. 4.
    El anticuerpo o el fragmento funcional para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que compite con
    30 el anticuerpo LM1 producido mediante una línea celular que tiene el número de depósito DSMZ DSM ACC 2623 para su unión a NONOnmt55.
  5. 5. El anticuerpo o el fragmento funcional para el uso de las reivindicaciones 3 o 4, en donde NONOnmt55
    comprende una secuencia de aminoácidos NONOnmt55 en su extremo N. 35
  6. 6.
    El anticuerpo o el fragmento funcional para el uso de las reivindicaciones 3 o 4, en donde NONOnmt55 comprende una secuencia definida como:
  7. 7.
    El anticuerpo o el fragmento funcional para el uso de las reivindicaciones 3 o 4 que se une a los aminoácidos 1300 de la secuencia NONOnmt55 definida como:
  8. 8.
    El anticuerpo o el fragmento funcional para el uso de las reivindicaciones 3 o 4, en donde la proteína
    NONO/nmt55 comprende la SEQ ID NO:16. 5
  9. 9. El anticuerpo o el fragmento funcional para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo o el fragmento funcional se unen a células Colo699 (número de registro DSMZ ACC 196), línea celular de adenocarcinoma de pulmón DV90 (número de registro DSMZ ACC 307), línea celular de carcinoma epidermoide de pulmón EPLC272H (número de registro DSMZ ACC 383) o línea celular de carcinoma escamocelular de pulmón
    10 LOUNH91 (número de registro DSMZ ACC 393).
  10. 10. El anticuerpo o el fragmento funcional para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la neoplasia, el tumor, el cáncer o la metástasis afectan o están presentes al menos en parte en cerebro, espina dorsal, cabeza o cuello, mama, esófago, boca, nasofaringe, nariz o senos frontales, tiroides, cabeza o cuello, tracto
    15 gastrointestinal, estómago, intestino delgado, duodeno, íleon, yeyuno, pulmón, hígado, páncreas, riñón, glándulas adrenales, vejiga, colon, recto, tracto genitourinario, próstata, útero, endometrio, cuello de útero, ovario, médula ósea, linfa, sangre, hueso, testículos, pene, piel o músculo, o sistema hematopoyético.
  11. 11. El anticuerpo o el fragmento funcional para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la
    20 neoplasia, el tumor, el cáncer o la metástasis comprenden sarcoma, carcinoma, adenocarcinoma, osteosarcoma, fibrosarcoma, melanoma, mieloma, blastoma, glioma, linfoma o leucemia.
    Porcentaje de cambio de peso corporal
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