KR20100003366A - 암 세포의 세포독성을 매개하는 인간화 및 키메라 항-ｔｒｏｐ-２ 항체 - Google Patents

암 세포의 세포독성을 매개하는 인간화 및 키메라 항-ｔｒｏｐ-２ 항체 Download PDF

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헬렌 피 핀들레이
수잔 이 한
크루즈 루이스 에이 지 다
앨리슨 엘 페리
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

약 35 kDa 막통과 단백질 및 단백질 키나아제 C의 기질인 TROP-2의 발현은 여러 암과 연결된다. TROP-2는 또한 GA733-1, 상피 당단백질 1 (EGP-I) 및 종양-관련 칼슘 신호 변환기-2로서 공지된다. 캐나다 특허 미생물 국제공인 기탁기관 (IDAC)에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마 AR47A6.4.2로부터의 TROP-2에 대한 단클론 항체는, 세포독성에 의해 전립선, 췌장 및 유방암을 포함하는 여러 암 모델에서 종양 성장을 방지하고 종양 존재량을 감소시키는 암 질환 변형 항체 (CDMAB)일 것으로 이전에 나타났다. 상기 단클론 항체의 가변 부위는 또한 단리, 서열화되며 상보성 결정 부위 (CDR) 측정된다. 이제, 모체 141205-05 단클론 항체와 유사한 TROP-2 결합 활성을 갖는 키메라 항체 및 인간화 항체가 생성된다. 단클론, 키메라 및 인간화 항체는 암을 치료하게 위해 독소, 효소, 방사성 화합물, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분 및 혈행 세포에 접합된다. 이들 항체는 또한 세포 상 TROP-2 발현을 측정하기 위한 결합 검정에 사용된다.

Description

암 세포의 세포독성을 매개하는 인간화 및 키메라 항-ＴＲＯＰ-２ 항체 {HUMANIZED AND CHIMERIC ANTI-TROP-2 ANTIBODIES THAT MEDIATE CANCER CELL CYTOTOXICITY}
본 발명은 암성 질환의 진단 및 치료, 특히 종양 세포의 세포독성의 매개; 및 가장 특히 세포독성 반응을 개시하기 위한 수단으로서 하나 이상의 CDMAB/화학요법제와 임의 조합된, 암성 질환 변형 항체 (CDMAB)의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 CDMAB를 이용하는 결합 검정법에 관한 것이다.
TROP-2는 대부분의 암종 뿐 아니라 일부 정상 인간 조직에서 발현되는 세포 표면 당단백질이다. 이는 처음에 인간 영양막 세포 상 항원을 인지하는 인간 융모막암종 세포주 BeWo로 고양된 두 쥐과 단클론 항체에 의해 인지되는 분자로서 정의되었다 (Faulk 1978). 다른 조사자들에 의해 동일한 분자가 독립적으로 발견되어, 동일한 항원을 설명하는 다중 명칭이 야기되었다. 따라서, TROP-2는 또한 GA733-1 및 상피 당단백질-1 (EGP-1)로서 나타내어진다 (Basu 1995, Fornaro 1995).
TROP-2 유전자는 RNA 중간체를 통한 동종 유전자 GA733-2 (또한 상피 당단백질-2, EpCAM 및 Trop-1로서 공지됨)의 후위를 통해 형성된 것으로 생각되었던 인트 론 없는 유전자이다. TROP-2 유전자는 염색체 1p32로 지도화되었다 (Calabrese 2001). TROP-2의 단백질 성분은 약 35 킬로달톤의 분자 질량을 갖는다. 이의 질량은 세포외 영역의 이종 N-연결된 글리코실화로 11~13 킬로달톤 증가될 수 있다. 디설파이드 브릿지 위치를 형성할 수 있는 세포외 영역 중 많은 시스테인 잔기가 존재한다. TROP-2는 단백질 키나아제 C에 대한 기질이며, Ca2 + 의존성 단백질 키나아제 및 세포내 세린 303 잔기가 인산화되는 것으로 나타났다 (Basu 1995). 또한, TROP-2와 항-TROP-2 항체와의 교차 결합이 세포질 Ca2 +에서의 상승으로써 나타나는 바와 같이 칼슘 신호를 변환하였다는 것이 나타났다 (Ripani 1998). 현재까지 생리학적 리간드가 확인되어 있지 않지만, 이들 데이터는 TROP-2의 생리학적 기능으로서 신호 변환을 지지한다. TROP-2 발현 및 암 사이의 관련은, TROP-2가 cDNA 미세배열 기술을 사용한 대규모 유전자 발현 분석에서 정상 난소 상피와 비교하여 난소 장액 유두상 암종에서 매우 높게 과다발현되는 것으로 보고된 유전자 군의 구성원으로서 확인되었던 보고서에 나타났다 (Santin 2004). 최근 연구는 정량적 실시간 RT-PCR로 74개 결장 직장 인간 암 검체를, 및 면역조직화학으로 34개의 검체를 분석하여, 암 및 정상 환자 박편에서의 TROP-2 발현 수준을 검사하였다. TROP-2는 정상 환자 검체에 대해 암 환자 검체에서 보다 높게 발현되는 것으로 발견되었고, 연구는 또한 TROP-2 발현 수준 및 생물학적 공격성 사이의 상관관계를 나타내었다. 높은 수준의 TROP-2는 불량한 예후, 환자 생존율 감소 및 간 전이 횟수의 증가와 관련되는 것으로 발견되었고 (Ohmachi 2006), 이는 TROP-2가 예후 지표로서 유용할 수 있으며, 매력적인 치료 표적일 수 있다는 것을 제안한다.
TROP-2의 발현 프로필은 많은 상이한 TROP-2 항체를 사용하여 유세포 분석 연구 및 면역조직화학 (IHC)을 통해 설명된 바 있다. 항-TROP-2 항체 162-25.3 및 162-46.2는 인간 융모막암종 세포주 BeWo로의 마우스 면역화를 통해 생성되었으며, 종양 및 림프 세포주 및 말초 혈관 단핵 세포의 연속물에 대한 이의 반응성을 조사하였다. 이러한 연구에서 두 항체는, 간접 면역형광 FACS 검정법에서, 시험한 4개 융모막암종 세포주 중 3개가 염색되어 영양막 특이적인 것으로 나타난 반면, 다른 림프 또는 종양 세포주 (섬유육종, 자궁 육종, 결장 암종, 흑색종, 신경모세포종, 적백혈병을 나타냄) 중에는 아무것도 염색되지 않았다. 또한, 정상 말초 혈액 세포 중 아무것도 염색되지 않았다. 항체는 포르말린 고정된 파라핀 포매 태반 조직 박편, 및 간, 신장, 비장, 흉선 및 림프절 조직의 동결 정상 박편의 염색에 대해 시험되었다. 태반 조직 박편은 두 항체로 염색되었으나, 다른 정상 조직은 염색되지 않았다 (Lipinski 1981). 이들 두 항체는 시험관내 진단 연구에서의 사용을 위해 엄격히 보고된 바 있다.
항-TROP-2 항체 MOv16은 불량하게 분화된 난소 암종 OvCa4343/83의 미정제 막 제조물로 마우스를 면역화시켜 생성되었다. MOv16은 양성 및 악성 난소 종양의 동결 조직 박편의 연속물에 대한 반응성에 대해 시험되었다. MOv16은 54개 악성 난소 종양 중 31개, 및 16개 양성 난소 종양 중 2개와 반응되었다. 시험된 5개 점액 난소 종양 중, MOv16은 완전히 미반응성이었다. MOv16은 또한 189개 유방암종 박편 중 117개, 및 18개 폐 암종 박편 중 12개에 결합하는 것으로 발견된 비-난소 악성 종양의 동결 박편에 대한 반응성에 대해 시험되었다. MOv16은 시험한 16개 비-상피 종양 (지방육종, 연골육종, 내피종, 조직구종 및 미분화세포종 포함)에 대해 완전히 미반응성이었다. 동결된 정상 조직 박편에 대해 시험한 경우, MOv-16은 유방, 췌장, 신장 및 전립선 박편과 반응성이었다. 사용된 조직 박편의 수가 보고되지는 않았으나, MOv16 반응성은 폐, 비장, 피부, 난소, 갑상선, 귀밑샘, 위, 후두, 자궁 및 결장 박편에 대해 음성이었다. 저자는 MOv16이 파라핀 포매 조직에 대해 미반응성이었기 때문에 동결 조직 박편을 사용하였음을 주목하였다 (Miotti 1987). 이러한 항체는 또한 시험관내 진단 연구에서의 사용을 위해서만 보고되었던 바 있다.
항-TROP-2 항체 Rs7-3G11 (RS7)은, 수술적으로 제거된 인간 폐 1차 편평 세포 암종에서 유래한 미정제 막 제조물로 마우스를 면역화시켜 생성되었다. IHC는 인간 종양 및 정상 조직의 동결 박편 상 RS7의 염색을 검사하는데 사용되었다. RS7은 유방, 결장, 신장, 폐, 전립선의 종양 및 편평 세포 암을 나타내는 40개 박편 중 33개에 결합하였다. 정상 조직 중 RS7은 유방, 결장, 신장, 간, 폐 및 전립선 조직의 20개 박편 중 16개에 결합한 반면, 비장 조직의 5개 박편 중 아무것도 염색되지 않았다. 이러한 연구에서, 저자는 종양에서의 항원 밀도가 정상 상피 조직에서보다 더 높게 나타난다는 것을 주목하였다 (Stein 1990).
RS7의 조직 특이성의 추가적인 연구가 종양 및 정상 조직에 대해서 실행되었다. RS7은 동결 종양 박편의 패널에 대해 시험되었고, 폐, 위, 신장, 방광, 결 장, 유방, 난소, 자궁 및 전립선의 종양을 나타내는 77개 박편 중 65개에 결합하였다. 시험한 5개 림프종에 대한 결합은 없었다. RS7은 총 24개 조직 유형으로 이루어지는 85개의 동결 인간 정상 조직 박편의 패널에 대해 시험되었다. 13개 정상 조직 중 39개 박편 (폐, 기관지, 기도, 식도, 결장, 간, 췌장, 신장, 방광, 피부, 갑상선, 유방 및 전립선)을 RS7로 염색하였다. 이러한 연구의 저자는 양성 염색이 관찰된 조직에서, 반응성이 일반적으로 상피 세포, 주로 관 또는 샘에 제한되었다는 것을 주목하였다. 또한, RS7이 포르말린 고정 파라핀 동결 박편에 대해 반응성이 없음이 관찰되었기 때문에, 상기 연구가 동결 박편에 제한되었다는 것을 주목하였다 (Stein 1993).
인간 TROP-2의 세포질 영역의 169 내지 182 사이 아미노산 위치에 상응하는 합성 펩티드로 마우스를 면역화시켜 다클론 항-TROP-2 항체를 제조하였다. 포르말린 고정 인간 식도 과다형성 및 암종 조직을 포함하는 조직 배열 슬라이드에 대해 다클론 항체를 시험하였다. 55개 암종 표본 중 10개가 다클론 항체로 강하게 염색된 반면, 경도 과다형성 조직은 매우 약하게 염색되었는데, 이는 발현 수준이 악성 세포전환과 관련될 수 있다는 것을 나타낸다 (Nakashima 2004).
전체적으로, 상이한 항-TROP-2 항체로 수득한 IHC 반응성 패턴은 일관되었다. 암에서의 발현은 일차적으로 암종에서 나타났으며, 대부분의 암종이 반응성이었다. 정상 조직에서, 발현은 상피 기원의 세포에 제한되는 것으로 나타났으며, 암종의 염색이 상응하는 정상 상피 조직의 염색보다 강하다는 일부 증거가 있었다.
IHC 연구에서 사용되는 것에 추가로, 항체 RS7은 누드 마우스 이종이식 모델에서의 종양 표적 연구로 이루어지는 초기 실험으로 생체내 모델에서 시험되었다. 정맥내 주사된 방사선표지된 RS7은 Calu-3 (폐 선암) 또는 GW-39 (결장 암종) 종양을 갖는 마우스의 종양에서 특이적으로 축적되는 것으로 나타났다 (Stein 1990). 이종이식 시스템에서의 방사선표지된 RS7의 생분포를 조사하고, 면역접합체로서 RS7의 치료적 가능성을 연구하기 위해 추가적인 연구가 수행되었다. 이러한 연구에서, Calu-3 인간 폐 선암 이종이식을 갖는 누드 마우스에서 131I-표지된 RS7 F(ab')2의 치료적 효능을 조사하였다. 마우스에 Calu-3 세포를 접종한 후 3주에, 종양의 크기가 약 0.3~0.9 그램에 도달하였을 때, 6~7 마우스 군을 1.0 mCi 131I-RS7-F(ab')2 또는 1.5 mCi 131I-RS7-F(ab')2의 단일 용량으로 정맥내 주사하여 처리하고, 처리하지 않은 대조 마우스의 유사한 군과 비교하였다. 1.0 mCi 131I-RS7-F(ab')2의 단일 용량은 약 5주 동안 종양 성장 억제를 일으키는 반면, 1.5 mCi 131I-RS7-F(ab')2의 단일 용량은 종양 퇴행을 일으켰으며, 평균 종양 크기는 방사선항체 주사 후 8주까지 치료요법 전 크기를 초과하지 않았다. 1.5 mCi 131I-RS7-F(ab')2 용량을 받는 마우스는 18.7 퍼센트의 평균 체중 감소를 경험하였는데, 이는 치료와 관련된 독성이 있음을 나타낸다. 이러한 연구에서, 네이키드 RS7 또는 RS7의 F(ab')2 절편을 사용한 치료의 효과는 시험되지 않았다 (Stein 1994a). MDA-MB-468 유방암 이종이식 모델에서 131I-RS7의 효능을 시험하기 위해 또 다른 연구를 수행하였다. 약 0.1 cm3의 MDA-MB-468 종양을 갖는 10마리 마우스의 군을, 250 마이크로퀴리 131I-RS7 또는 250 마이크로퀴리 131I-Ag8 (대조군 항체와 매치되는 동형)의 단일 용량으로 정맥내 주사 처리하였다. 6마리 마우스 군을 30 마이크로그램의 비표지된 RS7 또는 Ag8의 단일 용량으로 정맥내 주사 처리하였다. 종양의 완전 퇴행 (종양이 일시적으로 재출현한 한 동물 제외)이 131I-RS7로 처리된 동물에서 나타냈는데, 이는 11주 관찰 기간 동안 지속되었다. 종양 퇴행은 또한 131I-Ag8 처리된 마우스에서도 나타났으나, 나머지 연구 동안 성장이 지속 또는 연속되는 종양이 단지 2주 내지 5주 사이에서만 관찰되었다. 비표지된 RS7 또는 Ag8을 받은 마우스의 종양 성장은 억제되지 않았으며, Ag8 처리된 마우스와 비교하여 RS7 처리된 마우스의 평균 종양 부피에서 어떠한 차이도 나타나지 않았다. 약 0.2~0.3 cm3의 더 큰 MDA-MB-468 종양을 갖는 10마리 마우스의 추가적인 두 군을, 275 마이크로퀴리 131I-Rs7 또는 275 마이크로퀴리 131Ag8의 약간 더 높은 단일 용량으로 처리하고 미처리 마우스의 유사한 군과 비교하였다. 종양 부피를 15주 동안 매주 측정하였다. 이러한 경우 비처리 마우스와 비교하여 131I- RS7 처리된 마우스에서 종양 성장에 있어서 유의한 차이가 있음에도 불구하고, 131I-Ag8 처리된 마우스와 비교하여 131I-RS7 처리된 마우스의 종양 성장에는 유의한 차이가 없는데, 이는 효능 부분이 방사선의 비-특이적 효과 때문일 수 있다는 것을 나타낸다. 비표지된 항체는 0.2~0.3 cm3 종양을 포함하는 마우스에서 시험되지 않았다 (Shih 1995).
방사선면역요법을 위한 최적의 방사선표지를 선택하려는 시도와 함께 면역접합체로서 RS7의 효능을 검사하는 많은 추가적인 연구가 있었다 (Stein 2001a, Stein 2001b, Stein 2003). RS7의 인간화 버전이 또한 생성되었으나; 이는 전임상적 이종이식 모델에서만 시험되었다 (Govindan 2004). 이들 연구는 이전에 기재된 RS7로의 연구에서와 동일한 긍정적 효과를 나타냈으나, 한 연구에서, 심지어 방사선표지된 RS7이 이전에 결정된 최대 내약 용량으로 전달되는 경우에도, 일부 마우스에서의 사망을 일으키는 독성이 발생하였다 (Stein 2001a). 이들 연구에서 마우스에서의 이종이식 종양이 방사선표지된 RS7로 효과적으로 치료되었음에도 불구하고, 네이키드 RS7은 평가되지 않았다.
뉴라미니다아제 예비-처리된 H3922 인간 유방암종 세포로 마우스를 면역화하여 항-TROP-2 단클론 항체 BR110이 생성되었다 (미국 특허 제 5,840,854 호에 개시된 바와 같음, 선행 특허 부분 참고). 면역조직학에 의해, 인간 동결 조직 표본을 사용하여, BR110은 폐, 결장, 유방, 난소, 신장, 식도, 췌장, 피부, 폐 및 편도선의 것을 포함하는 광범위한 인간 암종 표본과 반응하는 것으로 나타났다. 인간 정상 조직 박편은 시험되지 않았다. 시험관내 연구는 BR110이 인간 암종 세포주 H3396 또는 H3922에 대한 ADCC 또는 CDC 활성을 갖지 않는다는 것을 나타내었다. BR110-면역독소의 세포독성을 분석하는 시험관내 연구가 인간 암 세포주 H3619, H2987, MCF-7, H3396 및 H2981에 대해 수행되었다. 시험한 세포주에 대한 EC50은 각각 0.06, 0.001, 0.05, 0.09 및 >5 마이크로그램/mL 이었다. 네이키드 BR110 항체에 대한 세포독성은 개시되지 않았다. 네이키드 또는 면역접합된 BR110에 대한 생체내 데이터는 개시되지 않았다.
TROP-2을 표적으로 하는 추가적인 항체, 예컨대 난소 암 세포주 Colo 316으로 마우스를 면역화시켜 생성된 MR54, MR6 및 MR23 (Stein 1994b), 및 T24 방광 암 세포주로 마우스를 면역화시켜 생성된 항체 T16 (Fradet 1984)이 생성되었다. 이들 항체의 사용은 TROP-2 항원의 생화학적 분석 및 세포주 및 조직 발현 연구에 제한되었다. 이들 항체의 시험관내 또는 생체내 항암 효능에 대한 보고서는 존재하지 않았다. RS7은, 이의 사용이 방사성 동위원소의 담체에 대해서 제한된, 전임상적 암 모델에서의 치료적 효능에 대해 시험된 유일한 항체였다. 임상 연구에서 또는 전임상적 암 모델에서 시험관내 또는 생체내 치료적 효능을 나타내는 어떠한 네이키드 TROP-2 항체에 대한 보고서도 존재하지 않는다.
암 치료요법으로서 단클론 항체: 암을 나타내는 각각의 개인은 고유하며 사람의 고유성만큼 다른 암과 상이한 암을 갖는다. 이것에도 불구하고, 현재 치료요법은 동일한 단계에서의 동일한 유형의 암을 갖는 모든 환자를 동일한 방법으 로 치료한다. 이들 환자 중 30 퍼센트 이상이 제 1선 치료요법에 실패하여, 추가적인 치료 단계를 야기하며, 치료 실패, 전이 및 최후에는 사망의 가능성이 증가하게 된다. 치료에 대한 우위적인 접근은 특정 개인을 위한 치료요법의 개별화이다. 개별화를 위해 자체 적합화된 현재 유일한 치료요법은 수술이다. 화학요법 및 방사선 치료는 환자에게 맞추어질 수 없으며, 수술 자체는 대부분의 경우 치료에 불충분하다.
단클론 항체의 등장으로, 개별화된 치료요법을 위한 개발 방법의 가능성이 보다 현실적으로 되었는데, 이는 각각의 항체가 단일 에피토프로 유도될 수 있기 때문이다. 더욱이, 특정 개인의 종양을 고유하게 정의하는 에피토프의 집합체에 유도되는 항체의 조합을 생성할 수 있다.
암성 세포와 정상 세포 사이의 유의한 차이가, 암성 세포가 형질전환된 세포에 특이적인 항원을 포함한다는 것임을 인지하여, 과학계는 오랫동안 단클론 항체를 암 항원에 대해 특이적으로 결합하게 함으로써 형질전환된 세포를 특이적으로 표적하도록 설계할 수 있다고 여겨왔는데; 따라서 단클론 항체가 암 세포를 제거하기 위한 "마법의 탄환"으로서 역할할 수 있다는 믿음이 생겼다. 그러나, 단일 단클론 항체가 모든 경우의 암에서 역할할 수 없고, 단클론 항체가 표적된 암 치료로서의 부류로서 활용될 수 있다는 것이 현재 널리 인지된다. 개시된 본 발명의 교시에 따라 단리된 단클론 항체는 환자에게 유익한 방법으로 (예를 들어 종양 존재량을 감소시킴으로써) 암성 질환 과정을 변형시키는 것으로 나타났으며, 이는 암성 질환 변형 항체 (CDMAB) 또는 "항암" 항체로서 본원에서 다양하게 나타날 것 이다.
현재, 암 환자는 통상 소수 옵션의 치료를 받는다. 암 치료요법에 대한 조직화된 접근은 세계적 생존율 및 이환율을 개선시켰다. 그러나, 특정 개인에 대해, 이러한 개선된 통계 자료가 이들의 개인적 상황에서의 개선과 반드시 상관 관계가 있는 것은 아니다.
따라서, 전문가가 동 세대에서의 다른 환자의 각각의 암을 독립적으로 치료할 수 있도록 방법론이 발휘된다면, 이는 단 한 사람에 대한 맞춤 치료요법의 고유한 접근을 허용한다. 치료요법의 이러한 과정은, 이상적으로는 치료율을 증가시키고, 보다 양호한 성과를 내어, 이로 인해 오랜 필요성을 만족시킨다.
역사적으로, 다클론 항체의 사용은 인간 암 치료에서의 제한된 성공으로 사용되어왔다. 림프종 및 백혈병은 인간 혈장으로 치료되었으나, 장기간 관해 또는 반응이 거의 없었다. 더욱이, 화학요법과 비교하여 추가적인 이득이 없고, 재현 가능성이 부족하였다. 고체 종양 예컨대 유방암, 흑색종 및 콩팥 세포 암종은 또한, 인간 혈액, 침팬지 혈청, 인간 혈장 및 말 혈청으로 치료되었으나, 이에 상응하는 결과는 예측불가능하고 비효과적이었다.
고체 종양을 위한 단클론 항체의 많은 임상 실험이 있었다. 1980년대에, 특정 항원에 대한 항체를 사용하여 또는 조직 선택성을 기준으로 한, 인간 유방암에 대한 4번 이상의 임상 실험이 있었는데, 47명의 환자로부터 단 한 명의 반응자가 생겼다. 인간화 항-Her2/neu 항체 (Herceptin
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)를 CISPLATIN과 병용하여 사용한 성공적인 임상 실험은 1998년까지는 없었다. 상기 실험에서 37명의 환 자를 반응에 대해 평가하였는데, 약 1/4이 부분적인 반응률을 가졌고 추가적인 1/4이 경미한 또는 안정적인 질환 진전을 가졌다. 반응자 중에서 진전에 대한 시간 중간값은 8.4개월이었고, 반응 지속 중간값은 5.3개월이었다.
Herceptin
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은 1998년에 Taxol
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과 병용한 제 1선 용도에 대해 승인되었다. 임상 연구 결과는, Taxol
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단독만을 받은 군과 비교하여, Taxol
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과 함께 항체 치료요법을 받은 환자에 대해, 질환 진전에 대한 시간 중간값 (6.9개월)이 증가된 것을 나타내었다. 또한, 생존 기간 중간값에서 약간의 증가가 있었다; Herceptin
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과 Taxol
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치료 부분 대 Taxol
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단독 치료 부분에 대해, 22개월 대 18개월. 또한, 항체와 Taxol
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병용군에서, Taxol
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단독과 비교하여 완전 (8퍼센트 대 2퍼센트) 및 부분적 반응자 (34퍼센트 대 15퍼센트)의 수가 모두 증가하였다. 그러나, Herceptin
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및 Taxol
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로의 치료는 Taxol
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단독 치료와 비교하여 더 높은 심독성 발생을 일으킨다 (각각 13퍼센트 대 1퍼센트). 또한, Herceptin
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치료요법은, 현재 공지된 기능 또는 생물학적으로 중요한 리간드가 없는 수용체인 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (Her2/neu) (면역조직화학 (IHC) 분석을 통해 측정된 바와 같음)를 과다발현하는 환자 (; 전이성 유방암을 갖는 환자의 약 25퍼센트)에 대해서만 효과적이었다. 그러므로, 유방암 환자에 대한 큰 미충족된 필요성이 아직 존재한다. Herceptin
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치료로부터 이익을 얻을 수 있는 환자라도 아직 화학요법을 필요로 하며, 그 결과로 적어도 일부 정도, 이러한 종류의 치료의 부작용을 아직 처리해야만 한다.
결장 직장암을 조사하는 임상 실험에는 당단백질 및 당지질 표적 모두에 대한 항체가 포함된다. 선암에 대한 일부 특이성을 갖는 항체 예컨대 17-1A는, 60명이 넘는 환자에서 임상 제 2상 실험을 거쳐 오직 1명의 환자만이 부분적인 반응을 가졌다. 다른 실험에서, 17-1A의 사용은 추가적인 시클로포스파미드를 사용하는 프로토콜에서, 52명의 환자 중 오직 1명의 완전한 반응, 및 2명의 경미한 반응을 생성시켰다. 현재까지, 17-1A의 임상 제 3상 실험은 3기 결장암에 대한 항원보강제 치료요법으로서의 개선된 효능을 보여주지 못했다. 영상화에 대해 처음에 승인된 인간화 쥐과 단클론 항체의 사용도 또한 종양 퇴행을 생성하지 않았다.
최근에, 단클론 항체를 사용하는 결장 직장암 임상 연구로부터 어떤 긍정적인 결과가 존재하였다. 2004년에, ERBITUX
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는 이리노테칸 기초 화학요법에 대해 불응인 EGFR-발현 전이 결장 직장암 환자의 제 2선 치료에 대해 승인되었다. 2-군 (two-arm) 임상 제 2상 연구 및 단일군 (single arm) 연구 모두로부터의 결과는, 이리노테칸과 병용된 ERBITUX
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가 각각 23퍼센트 및 15퍼센트의 반응률과 함께 각각 4.1개월 및 6.5개월의 질환 진전에 대한 시간 중간값을 갖는다는 것을 나타내었다. 동일한 2-군 임상 제 2상 연구 및 다른 단일군 연구로부터의 결과는, ERBITUX
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단독 치료가 각각 11퍼센트 및 9퍼센트 반응률과 함께 각각 1.5개월 및 4.2개월의 질환 진전에 대한 시간 중간값을 야기하였다는 것을 나타내었다.
결과적으로 스위스 및 미국에서 이리노테칸과 병용된 ERBITUX
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치료, 및 미 국에서 ERBITUX
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단독 치료가 또한 제 1선 이리노테칸 치료요법에서 실패한 결장암 환자의 제 2선 치료로서 승인되었다. 그러므로, Herceptin
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과 같은 스위스에서의 치료는 단클론 항체 및 화학요법의 조합으로서만 승인된다. 또한, 스위스 및 미국에서의 치료는 환자에 대한 제 2선 치료요법으로서만 승인된다. 또한, 2004년에, AVASTIN
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이 전이성 결장 직장암의 제 1선 치료로서 정맥내 5-플루오로우라실계 화학요법과의 병행 사용에 대해 승인되었다. 임상 제 3상 연구 결과는, 5-플루오로우라실 단독으로 치료한 환자와 비교하여 AVASTIN
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과 5-플루오로우라실로 치료된 환자의 생존 기간 중간값에서의 연장을 나타내었다 (각각 16개월 대 20개월). 그러나, Herceptin
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및 ERBITUX
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에서와 같이 치료는 단클론 항체 및 화학요법과의 조합으로서만 승인되었다.
또한 폐, 뇌, 난소, 췌장, 전립선 및 위암에 대한 취약한 결과가 지속된다. 비-소세포 폐암에 대한 가장 기대되는 최근의 결과는, 치료가 화학요법제 TAXOTERE
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와 조합된 세포-살해 약물 독소루비신에 접합된 단클론 항체 (SGN-15; dox-BR96, 항-시알릴-LeX)를 포함하는, 임상 제 2상 실험으로부터 나왔다. TAXOTERE
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는 폐암의 제 2선 치료에 대해 유일하게 FDA 승인된 화학요법이다. 초기 데이터는 TAXOTERE
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단독과 비교하여 개선된 전체 생존을 나타낸다. 연구를 위해 모집된 62명의 환자 중에, 2/3는 TAXOTERE
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와 조합된 SGN-15를 받은 반면, 나머지 1/3은 TAXOTERE
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을 단독으로 받았다. TAXOTERE
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와 조합된 SGN-15를 받은 환자에 대해, 전반적인 생존 기간 중간값은, TAXOTERE
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을 단독으로 받은 환자에 대해서는 5.9개월인 것에 비교하여, 7.3개월이었다. 1년 및 18개월에서의 전반적인 생존은, SNG-15와 TAXOTERE
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를 받은 환자에 대해 각각 29퍼센트 및 18퍼센트였고, TAXOTERE
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을 단독으로 받은 환자에 대해 각각 24퍼센트 및 8퍼센트였다. 추가적인 임상 실험이 계획되고 있다.
전임상적으로, 흑색종에 대한 단클론 항체의 사용에서의 일부 제한적인 성공이 있었다. 이들 항체의 극소수가 임상 실험에 도달하였고, 현재까지 임상 제 3상 실험에서 유망한 결과를 나타내거나 승인된 것은 아무것도 없다.
질환을 치료하기 위한 신규 약물의 발견은, 질환 발병기전에 기여할 수 있는 30,000개의 공지된 유전자 생성물 중 관련된 표적을 확인하지 못하는 것에 의해 방해된다. 종양학 연구에서, 잠재적인 약물 표적은 종종 단순히 이들이 종양 세포에서 과다발현된다는 사실로 인해 선택된다. 따라서 확인된 표적은 이후 다수의 화합물과의 반응에 대해 스크리닝된다. 잠재적인 항체 치료요법의 경우에서, 이들 후보 화합물은 통상 Kohler 및 Milstein에 의해 규정된 기초 원리에 따른 전통적인 단클론 항체 생성 방법 (1975, Nature, 256, 495-497, Kohler 및 Milstein)으로부터 유래된다. 비장 세포는 항원 (예를 들어 전체 세포, 세포 분획, 정제된 항원)으로 면역화된 마우스로부터 수집되고, 무한증식 하이브리도마 파트너와 융합된다. 생성된 하이브리도마를 스크리닝하고 표적에 가장 열렬히 결합하는 항체를 분비하는 것을 선택한다. 암 세포에 대해 유도된 많은 치료적 및 진단 항체 (Herceptin
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및 RITUXIMAB 포함)는, 이러한 방법을 사용하여 생성되 고 이의 친화성을 기초로 선택된다. 이러한 전략의 흠은 이중적이다. 첫 번째로, 치료적 또는 진단 항체 결합에 대한 적정한 표적의 선택은 조직 특이적 발암 과정을 둘러싼 지식의 부족, 및 그 결과로서 생긴, 이들 표적을 확인하는, 과발현에 의한 선택과 같은 극단적으로 단순화된 방법에 의해 제한된다. 두 번째로, 최대 친화성으로 수용체에 결합하는 약물 분자가 통상 신호를 개시 또는 억제하기 위한 최고 확률을 갖는다는 가정이, 항상 그런 것이 아닐 수 있다.
유방 및 결장암의 치료로의 일부 진전에도 불구하고, 단일 제제 또는 공동 투여로서 유효한 항체 치료요법의 확인 및 개발은 모든 유형의 암에 대해 불충분하였다.
선행 특허:
미국 특허 제 5,750,102 호는 환자의 종양으로부터의 세포가 환자로부터의 세포 또는 조직으로부터 클로닝될 수 있는 MHC 유전자로 트랜스펙션되는 방법을 개시한다. 이들 트랜스펙션된 세포는 이후 환자에게 백신을 접종하는데 사용된다.
미국 특허 제 4,861,581 호는 포유류의 신생물 및 정상 세포의 내부 세포 성분에 특이적이나 외부 성분에는 특이적이지 않은 단클론 항체를 수득하고, 단클론 항체를 표지하고, 신생물 세포를 사멸시키기 위한 치료요법을 받는 포유류의 조직과 표지된 항체를 접촉시키고, 퇴행하는 신생물 세포의 내부 세포 성분에 대한 표지된 항체의 결합을 측정함으로써 치료요법의 유효성을 측정하는 단계를 포함하는 방법을 개시한다. 인간 세포내 항원에 대해 유도된 항체를 제조하는 데 있어 서, 당해 특허권자는 이러한 항원의 편리한 공급원을 나타내는 악성 세포를 인지한다.
미국 특허 제 5,171,665 호는 신규한 항체 및 이의 생성 방법을 제공한다. 특별하게는, 특허는 인간 종양 (예를 들어 결장 및 폐의 종양)이 결합된 단백질 항원에 강하게 결합하는 반면, 정상 세포에는 훨씬 덜한 정도로 결합하는 특성을 갖는 단클론 항체의 형성을 교시한다.
미국 특허 제 5,484,596 호는 인간 암 환자로부터 종양 조직을 수술적으로 제거하고, 종양 조직을 처리하여 종양 세포를 수득하고, 종양 세포를 조사 (irradiating)하여 생육가능하나 종양을 형성하지는 않게 하고, 이들 세포를 사용하여 제 1차 종양의 재발을 억제하면서 동시에 전이를 억제할 수 있는, 환자를 위한 백신을 제조하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 특허는 종양 세포의 표면 항원과 반응성인 단클론 항체의 개발을 교시한다. 4번째 컬럼, 45번째 줄 이하에서 설명된 바와 같이, 당해 특허권자는 인간 신생물에서 활성 특이적 면역요법을 나타내는 단클론 항체의 개발에서 자발생 종양 세포를 이용한다.
미국 특허 제 5,693,763 호는 인간 암종에 특유한 것으로서 기원의 상피 조직에 비의존적인 당단백질 항원을 교시한다.
미국 특허 제 5,783,186 호는 Her2 발현 세포에서의 세포자멸사를 유도하는 항-Her2 항체, 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주, 상기 항체를 이용하는 암 치료 방법 및 상기 항체를 포함하는 약학 조성물을 명시한다.
미국 특허 제 5,849,876 호는 종양 및 비종양 조직 공급원으로부터 정제된 점액소 항원에 대한 단클론 항체의 생성을 위한 신규한 하이브리도마 세포주를 기재한다.
미국 특허 제 5,869,268 호는 원하는 항원에 대해 특이적인 항체를 생성하는 인간 림프구를 생성하는 방법, 단클론 항체를 생성하는 방법 뿐 아니라 상기 방법에 의해 생성된 단클론 항체를 명시한다. 특허는 특히 암의 진단 및 치료에 유용한 항-HD 인간 단클론 항체의 생성을 명시한다.
미국 특허 제 5,869,045 호는 인간 암종 세포와 반응성인 항체, 항체 절편, 항체 접합체 및 단일 사슬 면역독소에 관한 것이다. 이들 항체가 기능하는 메카니즘은 이중적이어서, 분자가 인간 암종의 표면에 제시된 세포막 항원과 반응성이고, 또한 항체가 결합 후에 암종 세포 내에서 내재화되는 능력을 가져, 이들이 항체-약물 및 항체-독소 접합체를 형성하는데 특히 유용하게 된다. 이들의 비변형된 형태에서 항체는 또한 특정 농도에서 세포독성 특성을 명백히 보여준다.
미국 특허 제 5,780,033 호는 종양 치료요법 및 예방을 위한 자동항체의 사용을 개시한다. 그러나, 상기 항체는 노화된 포유류로부터의 항핵 자동항체이다. 이러한 경우에서, 자동항체는 면역계에서 발견된 자연 항체 중 한 유형으로 언급된다. 자동항체가 "노화된 포유류"로부터 나오기 때문에, 자동항체가 실제로 치료될 환자로부터 나온 것일 필요는 없다. 또한 특허는 노화된 포유류로부터의 자연 및 단클론 항핵 자동항체, 및 단클론 항핵 자동항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 개시한다.
미국 특허 제 5,840,854 호는 특이적 항체, GA733-1에 대해 유도된 BR110을 개시한다. 상기 특허는 면역독소 접합체로서 BR110에 대한 시험관내 기능을 개시한다. 상기 항원에 대해 개시된 네이키드 항체로서 시험관내 기능은 존재하지 않았다. 상기 항원에 대해 개시된 생체내 기능 또한 존재하지 않았다.
미국 특허 제 6,653,104 호는 EGP-1을 포함하나 이에 제한되지 않는 항원의 숙주에 대해 유도된, RS7을 포함하나 이에 제한되지는 않는 면역독소-접합된 항체를 청구한다. 면역독소는 리보핵산분해 활성을 갖는 것에 제한된다. 그러나, 예는 오직 특이적 면역독소-접합된 항체, CD22에 대해 유도된 LL2만을 개시한다. 본 출원에 개시된 RS7에 대한 시험관내 또는 생체내 기능은 존재하지 않았다.
미국 출원 제 20040001825A1 호는 특이적 항체, EGP-1에 대해 유도된 RS7을 개시한다. 본 출원은 방사선표지된 접합체로서 RS7에 대한 시험관내 기능을 개시한다. 상기 항체에 대해 개시된 네이키드 항체로서 시험관내 기능은 존재하지 않았다. 본 출원은 또한 순차적으로 투여된 방사선표지 또는 비표지된 접합체로부터 야기된 RS7에 대한 생체내 기능을 개시한다. 그러나, 본 연구는 한 환자에만 제한되며, 관찰된 기능 중 어떤 것이 비표지된 항체로 인한 것인지는 공지되지 않는다. 네이키드 항체의 투여로 야기된 RS7에 대한 생체내 기능은 존재하지 않았다.
발명의 개요
본 출원은 암성 질환 변형 단클론 항체를 인코딩하는 하이브리도마 세포주를 단리시키기 위한 특허 U.S. 6,180,357에서 교시된 환자 특이적 항암 항체 제조를 위한 방법론을 이용한다. 이들 항체는 항 종양에 대해 특이적으로 만들어질 수 있고, 따라서 암 치료요법의 개별화를 가능하게 한다. 본 출원의 문맥 내에서, 세포-살해 (세포독성) 또는 세포-성장 억제 (세포 증식 억제) 특성을 갖는 항암 항체를 이후 세포 독성으로서 나타낼 것이다. 이들 항체는 암의 단계화 및 진단을 지원하는데 사용될 수 있으며, 종양 전이를 치료하는데 사용될 수 있다. 이들 항체는 또한 예방적 치료로서 암의 방지에 사용될 수 있다. 전통적인 약물 개발 패러다임에 따라 생성된 항체와 달리, 이러한 방법으로 생성된 항체는 악성 조직의 성장 및/또는 생존에 필수인 것으로 이전에는 나타나지 않았던 통로 및 물질을 표적할 수 있다. 더욱이, 이들 항체의 결합 친화성은 더 강한 친화성 반응에 따르지 않을 수 있는 세포독성 사건의 개시를 위한 필요조건에 알맞다. 또한, 이는 표준 화학요법적 양식 (예를 들어 방사선핵종)을 본 발명의 CDMAB과 접합하여, 이로써 상기 화학요법의 용도에 초점을 맞추는 것도 본 발명의 범위 내에 있다. CDMAB은 또한 독소, 세포독성 부분, 효소 예를 들어 바이오틴 접합된 효소, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분 또는 혈행 세포와 접합되어, 이로써 항체 접합체를 형성할 수 있다. CDMAB는 단독으로 또는 하나 이상의 CDMAB/화학요법제와 조합하여 사용될 수 있다.
개별화된 항암 치료의 전망은 환자가 관리되는 방식에서의 변화를 초래할 것이다. 있을 법한 임상 시나리오는 종양 검체가 제시되는 시기에 수득하고 보관하는 것이다. 이러한 검체로부터, 예비-존재하는 암성 질환 변형 항체의 패널로부터 종양을 유형화시킬 수 있다. 환자는 관례적으로 단계화되지만, 활용가 능한 항체가 환자의 추가적인 단계화에 사용될 수 있다. 환자는 존재하는 항체로 즉시 치료될 수 있고, 이는 종양에 특이적인 항체의 패널이 본원에 개요로 나타낸 방법, 또는 본원에 개시된 스크리닝 방법과 함께 파지 디스플레이 라이브러리의 사용을 통해 생성될 수 있다. 생성된 모든 항체는 항암 항체의 라이브러리에 추가되는데, 이는 다른 종양이 치료되는 종양과 동일한 에피토프 중 일부를 가질 수 있기 때문이다. 본 방법에 따라 생성된 항체는 이들 항체에 결합하는 암을 갖는 많은 환자의 암성 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.
항암 항체에 추가로, 환자는 치료의 다중양식 요법의 부분으로서 현재 권장된 치료요법을 받을지를 택할 수 있다. 본 방법론을 통해 단리된 항체가 비-암성 세포에 대해 상대적으로 비독성이라는 사실은, 항체의 조합을 높은 용량에서, 단독 또는 통상적인 치료요법과 함께 사용될 수 있게 한다. 높은 치료 지수는 또한 단기간에 재치료를 가능하게 하는데, 치료 저항성 세포의 출현의 가능성이 감소되어야 한다.
환자가 치료요법의 처음 과정에 대해 불응이거나 전이가 발전된다면, 종양에 대해 특이적인 항체를 생성하는 방법은 재치료를 위해 반복될 수 있다. 더욱이, 항암 항체는 환자로부터 수득한 적혈구에 접합되고 전이 치료를 위해 재융합될 수 있다. 전이성 암에 대한 효과적인 치료는 거의 없는데, 전이는 통상 사망을 일으키는 불량한 결과를 예고한다. 그러나, 전이성 암은 통상 혈관화가 잘 되어 있어, 적혈구에 의한 항암 항체의 전달은 종양 위치에 항체를 집중시키는 효과를 가질 수 있다. 전이되기 전에도, 대부분의 암 세포는 이의 생존을 위해 숙 주의 혈액 공급에 의존하며, 적혈구에 접합된 항암 항체가 원위치 (in situ) 종양에 대해 또한 효과적일 수 있다. 대안적으로는, 항체는 다른 혈행 세포, 예를 들어 림프구, 대식세포, 단핵구, 자연 살해 세포 등에 접합될 수 있다.
5개 부류의 항체가 존재하며, 각각은 이의 중쇄에 의해 주어지는 기능과 관련된다. 일반적으로, 네이키드 항체에 의한 암 세포 살해는 항체 의존성 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 통해 매개된다. 예를 들어 쥐과 IgM 및 IgG2a 항체는 보체 시스템의 C-1 성분에 결합하여 인간 보체를 활성화시킬 수 있는데, 이로써 종양 분해를 일으킬 수 있는 보체 활성의 고전적 통로를 활성화시킬 수 있다. 인간 항체에 대해 가장 효과적인 보체 활성 항체는 일반적으로 IgM 및 IgG1이다. IgG2a 및 IgG3 동형의 쥐과 항체는 단핵구, 대식세포, 과립구 및 특정 림프구에 의한 세포사를 일으키는 Fc 수용체를 갖는 세포독성 세포를 보강하는데 효과적이다. IgG1 및 IgG3 동형의 인간 항체는 ADCC를 매개한다.
Fc 부위를 통해 매개된 세포독성은 효과기 세포, 또는 단백질 예를 들어 NK 세포, T-세포 및 보체의 존재를 필요로 한다. 이들 효과기 메카니즘의 부재 하에, 항체의 Fc 부위는 불활성이다. 항체의 Fc 부위는 생체내에서 항체의 약동학에 영향을 주는 특성을 줄 수 있으나, 시험관내에서는 작용하지 않는다.
항체 매개된 암 살해의 또 다른 가능한 메카니즘은 세포막 및 이에 결합된 당단백질 또는 당지질에서의 다양한 화학적 결합의 가수분해를 촉매하도록 기능하 는 항체, 이른바 촉매적 항체의 사용을 통한 것일 수 있다.
항체-매개 암 세포 살해의 세 가지 추가적인 메카니즘이 존재한다. 첫 번째는 암 세포 상 잔류물인 추정의 항원에 대한 면역 반응이 생성되도록 신체를 유도하기 위한 백신으로서 항체를 사용하는 것이다. 두 번째는 성장 수용체를 표적하고, 이의 기능으로 방해하거나 수용체를 강하 조절하여 이의 기능이 효과적으로 손실되도록 항체를 사용하는 것이다. 세 번째는 직접적인 세포사를 일으킬 수 있는 세포 표면 부분의 직접 연결 (예컨대 TRAIL R1 또는 TRAIL R2와 같은 사멸 수용체, 또는 인테그린 분자 예컨대 알파 V 베타 3 등의 연결)에 대한 이러한 항체의 효과이다.
암 약물의 임상적 이용은 환자에 대한 허용가능한 위험 특성 하 약물의 이득을 기준으로 한다. 암 치료요법에서 생존은 일반적으로 가장 많이 구하는 이득이었지만, 삶을 연장시키는 것에 추가로 다른 잘 인식된 이득이 많이 존재한다. 치료가 생존에 불리한 영향을 갖지 않는, 이들 다른 이득에는, 증상 완화, 유해 사례에 대한 보호, 재발까지의 시간 또는 무질환 생존 기간의 연장, 및 질병 진행까지의 시간 연장이 포함된다. 이들 기준은 일반적으로 허용되며, 미국 식품 의약품국 (FDA)과 같은 규제 기관은 이러한 이득을 생성하는 약물을 승인한다 (Hirschfeld 등 Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42:137-143 2002). 이들 기준에 추가로, 이러한 유형의 이득을 예지할 수 있는 다른 결과변수 (endpoint)가 있다는 것이 잘 인식된다. 미국 F.D.A.에 의해 수여된 가속화된 승인 절차는, 환자 이득을 예측할 법한 대리지표가 있다는 것을 일부분 인정한다. 2003년 말 현재, 이러한 절차 하에 16개의 승인된 약물이 있었으며, 이들 중, 네 개는 최종 승인으로 넘어갔는데, 즉 잇따른 연구가 대리 결과변수 (surrogate endpoint)에 의해 예측되는 바와 같은 직접적인 환자 이득을 나타내었다. 고체 종양에서의 약물 효과를 측정하기 위한 한 가지 중요한 결과변수는 치료에 대한 반응을 측정함으로써 종양 존재량을 평가하는 것이다 (Therasse 등 Journal of the National Cancer Institute 92(3):205-216 2000). 이러한 평가를 위한 임상적 기준 (RECIST 기준)은 국제 암 전문가 집단인 Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group 에 의해 공표되었다. RECIST 기준에 따른 객관적인 반응에 의해 나타내는 바와 같이, 종양 존재량에 대한 효과가 설명된 약물은, 적정한 대조군과 비교하여 궁극적으로 직접적인 환자 이득을 생성하는 경향이 있다. 전임상 환경에서 종양 존재량은 일반적으로 평가 및 기록하기에 보다 간단하다. 전임상 연구가 임상 환경으로 변형될 수 있는 것에서, 전임상 모델에서 연장된 생존을 만들어내는 약물은 최대 예견된 임상 효용을 갖는다. 임상 치료에 대한 긍정적인 반응을 만들어내는 것과 유사하게, 전임상 환경에서 종양 존재량을 감소시키는 약물은 또한 질환에 대해 유의한 직접적 영향을 갖는다. 생존의 연장이, 가장 많이 구하는 암 약물 치료로부터의 임상 결과이지만, 임상 효용을 갖는 다른 이득이 있으며, 질환 진전에서의 지연과 상관관계가 있을 수 있는 종양 존재량 감소, 연장된 생존 또는 둘 다가 또한 직접적인 이득을 야기하고 임상 영향을 가질 수 있다는 것이 명백하다 (Eckhardt 등 Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds; ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003, 페이지 209-219).
참고문헌으로 본원에 각각 그 내용이 첨부된 U.S. 6,180,357의 방법, 및 미국 특허 출원 S.N. 11/709,676에 개시된 바와 같은 방법을 실질적으로 사용하여, 인간 난소 종양 조직으로부터의 세포로 마우스를 면역화시켜 마우스 단클론 항체, AR47A6.4.2를 수득하였다. AR47A6.4.2 항원은 상이한 조직 기원으로부터의 광범위한 인간 세포주의 세포 표면에서 발현되었다. 난소 암 세포주 OVCAR-3은 AR47A6.4.2의 시험관내 세포독성 효과에 대해 민감하였다.
인간 암에 대한 AR47A6.4.2 세포독성의 시험관내 결과는 이의 생체내 항종양 활성을 나타냄으로써 보다 연장되었다 (S.N. 11/709,676에 개시된 바와 같음). AR47A6.4.2는 인간 췌장암의 생체내 예방 BxPC-3 모델에서 종양 성장을 방지하고 종양 존재량을 감소시켰다. 이식 후 49일, 치료의 마지막 날에, AR47A6.4.2 처리군에서의 평균 종양 부피는 완충액 대조 처리군의 것보다 53퍼센트 미만이었다 (p<0.05). 연구 전체에 걸쳐 독성의 임상적 징후는 없었다. 요약하여, AR47A6.4.2는 상기 인간 췌장암 이종이식 모델에서 잘 용인되었으며 종양 존재량을 감소시켰다.
인간 췌장암의 BxPC-3에 대한 AR47A6.4.2의 효능을 더 측정하기 위해, 확립된 BxPC-3 이종이식 모델에서 항체를 시험하였다 (S.N. 11/709,676에 기재된 바와 같음). AR47A6.4.2는 인간 췌장암의 확립된 모델에서 종양 존재량을 유의하게 감소시켰다. 54일에, 항체의 마지막 용량의 투여 1일 후에, AR47A6.4.2-처리된 동물은 대조군-처리된 동물에서의 평균 종양 부피의 40퍼센트인 평균 종양 부피를 가졌다 (p<0.0001). 이들 결과는 AR47A6.4.2에 대한 30퍼센트의 평균 T/C에 상응한다. 연구 전체에 걸쳐 독성의 임상적 징후는 없었다. 요약하여, AR47A6.4.2는 상기 확립된 인간 췌장암 이종이식 모델에서 잘 용인되었으며 종양 존재량을 감소시켰다. AR47A6.4.2는 인간 췌장암의 예방 및 확립된 모델에서 모두 효과를 나타내었다.
AR47A6.4.2는 인간 췌장암 모델에 대해서 항암 효과를 나타내었다. 상기 발견을 연장하기 위해 AR47A6.4.2를 PL45 인간 췌장 암의 이종이식 모델에서 시험하였다 (제 11/79,676 호에 개시된 바와 같음). AR47A6.4.2는 인간 췌장암의 PL45 생체내 예방 모델에서 종양 성장을 완전히 억제하였다. 대조군 및 항체 처리군에서의 거의 모든 마우스가 생존한 경우 77일, 항체의 마지막 용량 20일 후에 측정된 것으로서, ARIUS 항체 AR47A6.4.2로의 처리는 완충액 처리군과 비교하여 거의 100퍼센트로 PL45의 성장을 감소시켰다 (p=0.0005, t-시험). 종양 부피로 인해, 대조군에서의 모든 마우스를 102일, 마지막 용량 45일 후에, 연구에서 제거하였다. 그러나 AR47A6.4.2는 여전히 종양 성장의 거의 완전한 억제를 나타내었으며 그 군에서 4마리 마우스 (일부 마우스는 암과 관련없는 사고로 인해 손실되었음)가 아직 살아있었다. 연구 전체에 걸쳐 독성의 명백한 임상적 징후는 없었다. 요약하여, AR47A6.4.2는 상기 인간 췌장암 이종이식 모델에서 잘 용인되었으며 종양 성장을 거의 완전히 억제하였다. AR47A6.4.2 처리는 또한 완충액 처리와 비교하여 증가된 생존을 나타내었다. 그러므로 AR47A6.4.2는 인간 췌장 암의 두 상이한 모델에서 효능을 나타내었다.
AR47A6.4.2는 두 상이한 인간 췌장암 이종이식 모델에 대한 항암 특성을 나타내었다. 상이한 인간 암 이종이식 모델에 대한 AR47A6.4.2의 효능을 측정하기 위해, PC-3 전립선암 이종이식 모델에서 항체를 시험하였다 (S.N. 11/709,676에 개시된 바와 같음). AR47A6.4.2는 인간 전립선 선암 세포의 PC-3 생체내 예방 모델에서 종양 성장을 억제하였다. 대조군 및 항체 처리군에서의 거의 모든 마우스가 아직 살아있는 경우 항체의 5회 용량 처리 후 32일에 측정된 것으로서, ARIUS 항체 AR47A6.4.2로의 처리는 완충액 처리군과 비교하여 60.9퍼센트로 PC-3 종양의 성장을 감소시켰다 (p=0.00037, t-시험). 종양 부피/병변으로 인해, 대조군에서의 모든 마우스를 47일, 항체의 마지막 용량 3일 전, 연구에서 제거하였다. 77일에, 항체의 마지막 용량 27일 후에, AR47A6.4.2-처리군에서의 마우스의 40퍼센트가 아직 살아있었다. 독성 연구 전체에 걸쳐 독성의 명백한 임상적 징후는 없었다. 요약하여, AR47A6.4.2는 상기 인간 전립선암 이종이식 모델에서 잘 용인되었으며 종양 성장을 유의하게 억제하였다. 항체로의 처리는 또한 대조군과 비교하여 생존 이득을 나타내었다. AR47A6.4.2는 두 상이한 인간 암 표현 (: 췌장 및 전립선암)에 대해 효능을 나타내었다.
AR47A6.4.2는 두 상이한 인간 췌장 및 전립선암 이종이식 모델에 대해 항암 특성을 나타내었다. 또 다른 인간 암 이종이식 모델에 대한 AR47A6.4.2의 효능을 측정하기 위해, MCF-7 암 이종이식 모델에서 항체를 시험하였다 (S.N. 11/709,676에 개시된 바와 같음). AR47A6.4.2는 인간 유방암의 MCF-7 생체내 예방 모델에서 종양 성장을 감소시켰다. ARIUS 항체 AR47A6.4.2로의 처리로, 종양 성장이 두드러지게 지연되었다. AR47A6.4.2는, 처리 18일에서 35일까지는 42퍼센트 미만이고 49일까지는 42퍼센트에 가까운 T/C 퍼센트 값 (18일에 10.9퍼센트의 최적 T/C 퍼센트 값)을 유도하였다. 53일에, 처리가 종결된 후, AR47A6.4.2 처리의 효능은 여전히 57퍼센트의 T/C로 관찰되었다. 연구의 끝 (91일)에서, AR47A6.4.2 처리군으로부터의 2마리 마우스는 종양이 없는 채로 남아있었다. 처리 후 생존 이득은 AR47A6.4.2 투여와 연관되었다. 완충액 대조군은 처리 후 85일에 100퍼센트 사망률에 도달한 반면, AR47A6.4.2 마우스의 33.3퍼센트는 처리 후 91일에도 여전히 살아있었다. 독성 연구 전체에 걸쳐 임상적인 징후는 없었다. 요약하여, AR47A6.4.2는 상기 인간 유방암 이종이식 모델에서 잘 용인되었고, 종양 성장을 감소시켰으며 생존 이득을 제공하였다. AR47A6.4.2는 세 상이한 인간 암 표현 (: 췌장, 전립선 및 유방암)에 대해 효능을 나타내었다.
AR47A6.4.2는 두 상이한 인간 췌장, 전립선 및 유방암 이종이식 모델에 대해 항암 특성을 나타내었다. 또 다른 인간 암 이종이식 모델에 대한 AR47A6.4.2의 효능을 측정하기 위해, Colo 205 결장 암 이종이식 모델에서 항체를 시험하였다 (S.N. 11/709,676에 개시된 바와 같음). A6.4.2는 인간 결장 직장 선암 세포의 Colo 205 생체내 예방 모델에서 종양 성장을 억제하였다. 27일, 항체의 마지막 용량 4일 전에 측정된 것으로서, ARIUS 항체 AR47A6.4.2로의 처리는 완충액 처리군과 비교하여 60.2퍼센트로 Colo 205 종양의 성장을 감소시켰다 (p=0.0003851, t-시 험). 연구 전체에 걸쳐 독성의 명백한 임상적 징후는 없었다. 요약하여, AR47A6.4.2는 상기 인간 결장암 이종이식 모델에서 잘 용인되었으며 종양 성장을 유의하게 억제하였다. AR47A6.4.2는 네 상이한 인간 암 표현 (: 췌장, 전립선, 유방 및 결장암)에 대해 효능을 나타내었다. 인간 암 질환의 여러 잘 인정된 모델에서, 다른 포유류 (인간을 포함)에서의 치료요법을 위한 상기 항체의 약리학 및 약학적 이득을 제안하는 치료 이득이 관찰되었다. 전부, 상기 데이터는 AR47A6.4.2 항원이 암 관련된 항원이고 인간 암 세포에서 발현되며, 병리학적으로 관련된 암 표적이라는 것을 나타낸다.
이전에 개시된 바와 같이 (S.N. 11/709,676), 생화학 데이터는 AR47A6.4.2에 의해 인지된 항원이 TROP-2임을 나타내었다. 이는 TROP-2에 대해 반응성인 단클론 항체 (클론 77220.11, R&D Systems, Minneapolis, MN)가 면역침전에 의해 AR47A6.4.2에 결합하는 단백질을 확인하는 것을 보여준 연구에 의해 지지되었다. 또한, AR47A6.4.2는 웨스턴 면역블럿에 의해 인간 TROP-2의 재조합 형태를 특이적으로 인지한다. AR47A6.4.2 에피토프는 탄수화물 의존성으로는 나타나지 않으나, 형태 의존성으로 나타난다. AR47A6.4.2는 또한 또 다른 항-TROP-2 항체 (: AR52A301.5)로부터의 별개의 에피토프에 결합하는 것으로 나타났다.
AR47A6.4.2 에피토프의 효용을 측정하기 위해, 동결 정상 인간 조직 박편에서 AR47A6.4.2 항원의 발현 (실험은 포르말린 고정 조직과 상기 항체와의 반응성을 나타내지 않았음)을 이전에 측정하였다 (S.N. 11/709,676에 개시된 바와 같음). 인간 정상 조직 스크리닝 배열 (Biochain, CA, USA)을 사용하여 12개의 인간 정상 기관, 난소, 췌장, 갑상선, 뇌 (대뇌, 소뇌), 폐, 비장, 자궁, 경부, 심장, 피부 및 골격근에 대한 결합을 수행하였다. 배열에는 20개의 정상 인간 기관이 포함되었으나; 기관 중 오직 12개만이 염색 후 해석가능하였다. AR47A6.4.2 항체는 상피 조직 (혈관의 내피 세포, 갑상선의 소포 상피, 췌장의 샘꽈리 및 도관 상피, 폐의 폐포 상피, 및 피부의 표피 각질세포)에 대한 우세한 결합을 나타내었다. 항체는 또한 비장의 림프 조직에 대한 불확실한 결합 및 뇌의 신경 조직에 대한 결합을 나타내었다. 세포 국소화는 확산 염색 패턴을 갖는 막성 및 세포질이었다. AR47A6.4.2는 연구 항-TROP-2 항체 (클론 77220.11)와 비교하여 유사한 결합 패턴을 나타내었다.
AR47A6.4.2의 치료적 이득을 보다 연장하기 위해, 다양한 인간 암 조직 및 이의 상응하는 정상 조직 박편 (10개 결장암 및 1개 정상 결장, 7개 난소암 및 1개 정상 난소, 11개 유방암 및 3개 정상 유방, 14개 폐암 및 3개 정상 폐, 13개 전립선암 및 3개 정상 전립선, 및 13개 췌장암 및 4개 정상 췌장) 내에서의 항원의 빈도 및 국소화를 또한 이전에 측정하였다 (S.N. 11/709,676에 개시된 바와 같음). AR47A6.4.2는 5/10 (50퍼센트), 6/7 (86퍼센트), 10/11 (91퍼센트), 11/14 (79퍼센트), 13/13 (100퍼센트) 및 2/13 (15퍼센트)의 각각 결장, 난소, 유방, 폐, 전립선 및 췌장암에 대해 온건 내지 강한 결합을 나타내었다. 또한, 2/10 (20퍼센트), 1/11 (9퍼센트), 3/14 (21퍼센트), 및 2/13 (15퍼센트)의 각각 결장, 유방, 폐 및 췌장암 박편에서 불확실 내지 약한 결합이 관찰되었다. 시험한 종양 모두에서, 결합은 종양 세포에 대해 특이적이었다. 상응하는 정상 조직에 대해 항체는 0/1, 0/1, 3/3, 3/3, 3/3 및 4/4의 정상 결장, 난소, 유방, 폐, 전립선, 및 췌장 조직에 대한 결합을 나타내었다. 그러나, 결합은 정상 기관의 상피 조직에 대해 우세하였다.
다양한 종의 동결 정상 조직에서의 AR47A6.4.2 항원 교차 반응성을 분석하기 위해 IHC 연구를 이전에 수행하였다 (S.N. 11/709,676에 개시된 바와 같음). AR47A6.4.2는 시험한 마우스, 랫트, 기니아 피그, 염소, 양, 햄스터, 닭, 소, 말 또는 돼지 정상 조직에 대해 검출가능한 결합을 나타내지 않았다. 정상 토끼 및 개 조직에 대해, 상응하는 인간 조직에서 관찰되었던 유사하지 않은 결합이 있었다. 필리핀 원숭이 (cynomolgus monkey) 정상 조직에 대해, AR47A6.4.2는 난소 및 고환을 제외 (필리핀 원숭이 박편에 대해 검출가능한 결합이 관찰되지 않았음)한 모든 시험 기관에 대해 상응하는 인간 정상 조직에서 관찰된 것과 유사한 조직 특이성을 나타내었다. 붉은털 원숭이 (rhesus monkey) 정상 조직에 대해, AR47A6.4.2는 상응하는 인간 정상 조직에서 관찰된 것과 유사한 조직 특이성을 나타내었다. 붉은털 원숭이 정상 조직 패널이 필리핀 원숭이에 대해 시험된 것보다 작았다는 것이 주목되어야 한다. 염색 프로필을 기준으로, 필리핀 원숭이 및 붉은털 원숭이 모두 인간 조직에 대해 유사한 AR47A6.4.2 항원 분포를 갖는다.
항체 키메라의 생성을 촉진하기 위해, 중쇄 및 경쇄의 가변 부위를 인코딩하는 유전자는 개별적으로 클로닝되고 서열화되었다 (S.N. 11/709,676에 개시된 바와 같음).
본 발명은 AR47A6.4.2, 키메라 AR47A6.4.2 ((ch)AR47A6.4.2) 및 인간화 변 이, (hu)AR47A6.4.2의 개발 및 용도를 개시한다. AR47A6.4.2는 세포독성 검정법, 종양 성장 모델, 및 암성 질환을 겪는 포유류의 생존 시간 연장에서의 이의 효과에 의해 확인되었다. 본 발명은 암 치료 분야에서의 진보를 나타내는데, 이는 처음으로, 표적 분자, TROP-2에 존재하는 에피토프(들)에 특이적으로 결합하는 시약을 기재하는데, 이는 또한 네이키드 항체로서 악성 종양 세포에 대한 (정상 세포에 대해서는 아님) 시험관내 세포독성 특성을 가지며, 이는 또한 네이키드 항체로서 인간 암의 생체내 모델에서의 종양 성장의 억제 및 생존의 연장을 직접적으로 매개한다. 유사한 특성을 갖는 것이 나타나지 않았기 때문에, 이는 이전에 기재된 어떤 다른 항-TROP-2 항체와 비교하여서도 진보된 것이다. 이는 또한 분야에서의 진보를 제공하는데, 특정 유형의 종양의 성장 및 발달과 관련된 사건에서의 TROP-2의 직접적 관여를 처음으로 명백히 나타내었기 때문이다. 이는 또한 암 치료요법에서의 진보를 나타내는데, 인간 환자에서 유사한 항암 특성을 나타낼 가능성을 갖기 때문이다. 추가적인 진보는, 항암 항체의 라이브러리에 이들 항체가 포함되는 것이, 종양의 성장 및 발달을 표적하고 억제하는데 있어서 가장 효과적인 것을 발견하기 위해 상이한 항암 항체의 적정한 조합을 결정함으로써 상이한 항원 표지자를 발현하는 종양을 표적하는 가능성을 강화시킬 것이라는 점이다.
모두에서, 본 발명은 치료제용 표적으로서 AR47A6.4.2 항원의 용도를 교시하는데, 이는 투여되는 경우 포유류에서 항원을 발현하는 암의 종양 존재량을 감소시킬 수 있고, 또한 치료된 포유류의 연장된 생존을 야기할 수 있다. 본 발명은 또한, 포유류에서 항원을 발현하는 암의 종양 존재량이 감소되고 치료된 포유류의 연장된 생존이 야기되도록 항원을 표적하기 위한 CDMAB (AR47A6.4.2, 키메라 AR47A6.4.2 ((ch)AR47A6.4.2) 및 인간화 변이, (hu)AR47A6.4.2) 및 이의 유도체, 및 이의 항원 결합 절편, 및 이의 리간드를 유도하는 세포 독성의 용도를 교시한다. 더욱이, 본 발명은 또한 진단, 치료요법의 예측, 및 상기 항원을 발현하는 종양을 갖는 포유류의 예후를 위해 유용할 수 있는, 암성 세포에서 AR47A6.4.2 항원을 검출하는 용도를 교시한다.
따라서, 본 발명의 목적은 하이브리도마 세포주 및 상기 하이브리도마 세포주를 인코딩하는 상응하는 단리된 단클론 항체 및 이의 항원 결합 절편을 단리하기 위해, 특정한 개인, 또는 하나 이상의 특정한 암 세포주로부터 유래한 암성 세포에 대해 야기된 암성 질환 변형 항체 (CDMAB)를 생성하는 방법을 이용하는 것이며, 여기서 CDMAB는 암 세포에 대해 세포독성이면서 동시에 비-암성 세포에 대해서는 상대적으로 비독성이다.
본 발명의 추가적인 목적은 암성 질환 변형 항체, 이의 리간드 및 항체 결합 절편을 교시하는 것이다.
본 발명의 또 다른 추가적인 목적은 세포독성이 항체 의존성 세포독성을 통해 매개되는 암성 질환 변형 항체를 생성하는 것이다.
본 발명의 또 다른 추가적인 목적은 세포독성이 보체 의존성 세포독성을 통해 매개되는 암성 질환 변형 항체를 생성하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포독성이 세포 화학 결합의 가수분해를 촉매시 키기 위한 이들의 능력의 기능으로서인, 암성 질환 변형 항체를 생성하는 것이다.
본 발명의 더 추가적인 목적은 암의 진단, 예후 및 모니터링을 위한 결합 검정법에 유용한 암성 질환 변형 항체를 생성하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 본 발명의 도해 및 실시예, 특정 구현예로서 설명되는 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
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도 1은 예방적 인간 MDA-MB-231 유방암 모델에서의 종양 성장에 대한 AR47A6.4.2의 효과를 나타낸다. 수직의 점선은 항체가 복강 내 투여되었던 동안의 기간을 나타낸다. 데이터 점은 평균 +/- SEM을 나타낸다.
도 2는 예방적 MDA-MB-231 유방암 모델에서의 마우스 생존에 대한 AR47A6.4.2의 효과를 나타낸다. 데이터 점은 생존 퍼센티지를 나타낸다.
도 3은 예방적 MDA-MB-231 유방 선암 모델에서의 마우스 체중에 대한 AR47A6.4.2의 효과를 나타낸다. 데이터 점은 평균 +/- SEM을 나타낸다.
도 4는 용량-반응 방법에서의 확립된 인간 PL45 췌장암 모델에서의 종양 성장에 대한 AR47A6.4.2의 효과를 나타낸다. 수직의 점선은 항체가 복강 내 투여되었던 동안의 기간을 나타낸다. 데이터 점은 평균 +/- SEM을 나타낸다.
도 5는 확립된 PL45 췌장암 모델에서의 마우스 생존에 대한 AR47A6.4.2의 효 과를 나타낸다. 데이터 점은 생존 퍼센티지를 나타낸다.
도 6은 확립된 PL45 췌장암 모델에서의 마우스 체중에 대한 AR47A6.4.2의 효과를 나타낸다. 데이터 점은 평균 +/- SEM을 나타낸다.
도 7은 상이한 조직 미세배열로부터의 다양한 인간 종양 및 정상 조직 박편에 대한 AR47A6.4.2의 IHC 비교를 표화하였다.
도 8. 다양한 인간 종양 조직 미세배열로부터의, AR47A6.4.2 (A) 또는 동형 대조 항체 (B)로 수득된 유방 종양 조직, 및 AR47A6.4.2 (C) 또는 동형 대조 항체 (D)로 수득된 전립선 종양 조직, 및 AR47A6.4.2 (E) 또는 동형 대조 항체 (F)로 수득된 췌장 종양 조직에 대한 결합 패턴을 나타내는 대표 현미경 사진. 배율은 유방 및 췌장 종양 조직에 대해 400X이고 전립선 종양 조직에 대해 200X이다.
도 9. 난소 종양 조직 (A) 또는 난소 정상 조직 (B)에 대한, AR47A6.4.2로 수득된 결합 패턴을 대표 현미경 사진. AR47A6.4.2는 종양에 대해 강한 결합을 나타내었으나 상응하는 정상 조직에 대해서는 그렇지 않았다. 배율은 200X이다.
도 10. AR47A6.4.2 후 혈청 및 보충물 자극으로 처리된 BxPC-3의 처리에 의해 인산화가 영향을 받는 키나아제의 목록.
도 11. AR47A6.4.2로 처리된 BxPC-3 세포의 처리에 의해 영향받는 혈관형성 인자의 목록.
도 12는 두 상이한 인간 췌장암 세포주; PL45 및 BxPC-3에 대한 AR47A6.4.2의 시험관내 CDC 활성을 나타낸다.
도 13. TROP-2 아미노산 서열을 기준으로 합성된 CLIPS 펩티드에 대한 AR47A6.4.2의 결합 (등장 순서대로 각각, SEQ ID NOS 13-32).
도 14. TROP-2의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:33). AR47A6.4.2에 의해 인지된 불연속 에피토프는 밑줄 그은 서열 내에 포함된다. 아미노산 위치 1~274는 TROP-2의 세포외 부분을 나타내고; 아미노산 위치 275~290은 TROP-2의 막통화 부분을 나타내고, 아미노산 위치 291~232는 TROP-2의 세포내 부분을 나타낸다.
도 15. 경쇄의 PCR 증폭에 사용된 프라이머 (등장 순서대로 각각, SEQ ID NOS: 34-52).
도 16. 중쇄의 PCR 증폭에 사용된 프라이머 (등장 순서대로 각각, SEQ ID NOS: 53-68).
도 17. 마우스 AR47A6.4.2 VH 서열 (각각 SEQ ID NOS: 69-70에 개시된 바와 같은 뉴클레오티드 및 아미노산 서열).
도 18. 마우스 AR47A6.4.2 VL 서열 (각각 SEQ ID NOS: 71-72에 개시된 바와 같은 뉴클레오티드 및 아미노산 서열).
도 19. 키메라 및 변이 인간화 AR47A6.4.2 VH 서열의 생성에 사용된 올리고뉴클레오티드 (등장 순서대로 각각, SEQ ID NOS: 73-92).
도 20. 키메라 및 변이 인간화 AR47A6.4.2 VL 서열의 생성에 사용된 올리고뉴클레오티드 (등장 순서대로 각각, SEQ ID NOS: 93-110).
도 21. 경쇄 및 중쇄 발현 벡터.
도 22A, 22B 및 22C. 인간화 AR47A6.4.2 VH 변이. CDR은 밑줄 그어진다 (등장 순서대로 각각, SEQ ID NOS: 111-113, 10, 7 및 114).
도 23A, 23B 및 23C. 인간화 AR47A6.4.2 VL 변이. CDR은 밑줄 그어진다 (등장 순서대로 각각, SEQ ID NOS: 115, 9, 8 및 116-117).
도 24. 인간화 AR47A6.4.2 VH 및 VL 변이의 활성.
도 25. 쥐과 AR47A6.4.2 및 (hu)AR47A.6.4.2의 다양한 변이의, rhTROP-2에 대한 결합 친화성 회합 속도 상수 (Ka) 및 해리 속도 상수 (Kd).
일반적으로, 하기의 단어 또는 구절들은 본 개요, 상세한 설명, 실시예 및 청구항에 사용될 때 하기 나타낸 정의를 갖는다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는, 예를 들어 단독 단클론 항체 (작용제, 길항제, 및 중화 항체, 탈-면역화, 쥐과, 키메라 또는 인간화 항체 포함), 다에피토프 특이성 (polyepitopic specificity)을 갖는 항체 조성물, 단쇄 항체, 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 면역접합체 및 항체 절편을 포함한다 (하기 참조).
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동질인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내는데, 즉 상기 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체들은 매우 특이적이어서, 단일 항원 위치에 대해 유도된다. 더욱이, 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제조물과 반대로, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 유도된다. 이의 특이성에 추가로, 상기 단클론 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론"이라는 수식어구는, 실질적으로 동질인 항체의 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특징을 나타내는 것이며, 임의의 특정 방법에 의해 상기 항체를 제조하여야 한다는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 문헌 [Kohler 등, Nature, 256:495 (1975)]에 최초 기재된 하이브리도마 (쥐과 또는 인간) 방법에 의해 생성될 수 있고, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 생성될 수도 있다 (예를 들어 미국 특허 제 4,816,567 호 참조). "단클론 항체"는 또한, 예를 들어 문헌 [Clackson 등, Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks 등, J. Mol . Biol ., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
"항체 절편"은 완전한 (intact) 항체의 일부분, 바람직하게는 이의 항원-결합 또는 가변 부위를 포함하는 부분을 포함한다. 항체 절편의 예에는 전장 (full length) 보다 짧은 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 절편들; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 단쇄 항체, 단일 영역 항체 분자, 융합 단백질, 재조합 단백질 및 항체 절편(들)으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
"완전한" 항체는 항원-결합 가변 부위 뿐 아니라 경쇄 불변 영역 (CL) 및 중쇄 불변 영역인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 상기 불변 영역은 본래적 서열 불변 영역 (예를 들어 인간 본래적 서열 불변 영역) 또는 이의 아미노산 서열 변이일 수 있다. 바람직하게는, 완전한 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 갖는다.
중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 완전한 항체는 상이한 "부류"로 할당될 수 있다. 완전한 항체에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 부류가 있으며, 이들 중 몇몇은 "하위부류"(동형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가적으로 나뉠 수 있다. 상이한 항체 부류들에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 면역글로불린 부류의 아단위 (subunit) 구조 및 3차원 형상은 잘 공지되어 있다.
항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 부위 (본래적 서열의 Fc 부위 또는 아미노산 서열 변이의 Fc 부위)에 기인한 것일 수 있는 생물학적 활성을 나타낸다. 항체 효과기 기능의 예에는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이 포함된다.
"항체-의존성 세포-매개성 세포독성" 및 "ADCC"는, Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예컨대 자연 살해 (NK) 세포, 중성구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인지하고 이후 상기 표적 세포의 용해를 일으키는, 세포-매개성 반응을 나타낸다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch 및 Kinet, Annu . Rev . Immunol 9:457-92 (1991)]의 464페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 미국 특허 제 5,500,362 호 또는 제 5,821,337 호에 기재된 것과 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수도 있다. 이러한 검정에 유용한 효과기 세포에는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포가 포함된다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes 등 PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하여 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 상기 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예에는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 중성구가 포함되며; PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 효과기 세포는 그의 본래적 공급원으로부터, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 혈액 또는 PBMC로부터 단리될 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"이라는 용어들은 항체의 Fc 부위에 결합하는 수용체를 기술하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 본래적 서열의 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이며, 이에는 대립유전자 변이 및 이들 수용체의 선택적 스플라이싱 (alternatively spliced) 형태를 포함하여, FcγRI, FcγRII 및 Fcγ RIII 하위부류의 수용체가 포함된다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")가 포함되며, 이는 이의 세포질 영역이 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체인 FcγRIIA는 그의 세포질 영역에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 저해 수용체인 FcγRIIB는 그의 세포질 영역에 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다 (하기 총설 참조: M. in Daeron, Annu . Rev . Immunol . 15:203-234 (1997)). FcR은 하기에 개관되어 있다: 문헌 [Ravetch 및 Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel 등, Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas 등, J. Lab . Clin . Med . 126:330-41 (1995)]. 미래에 확인될 것들을 포함하여, 다른 FcR도 본원에서 "FcR"이라는 용어에 포함된다. 상기 용어에는 또한, 모체 IgG의 태아로의 전달을 담당하는 신생아 수용체인 FcRn이 포함된다 (Guyer 등, J. Immunol . 117:587 (1976) 및 Kim 등, Eur . J. Immunol . 24:2429 (1994)).
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적을 용해할 수 있는 분자의 능력을 나타낸다. 보체 활성화 통로는 보체계의 제 1 성분 (C1q)이 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예를 들어 항체)에 결합함에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro 등, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 것과 같은, CDC 검정을 수행할 수 있다.
"가변"이라는 용어는, 가변 영역의 특정 부분의 서열이 항체들 간에 광범위하게 상이하여 이들이 각 특정 항체의 대응 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에 사용되는 사실을 나타낸다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 영역 전체에 걸쳐 고르게 분포하지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 영역 모두에 존재하는 과가변 (hypervariable) 영역으로 불리는 3개의 단편에 집중되어 있다. 가변 영역에서 더욱 고도로 보존된 부분은 구조형성 부위 (framework region, FR)로 불린다. 본래적 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 4개의 FR을 포함하는데, 이들은 주로 3개의 과가변 부위로 연결된 β-시트 배열을 취하며, 상기 과가변 영역들은 상기 β-시트 구조를 연결하는, 일부 경우에는 상기 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 사슬 내의 과가변 부위는 상기 FR에 의해 서로 아주 근접하게 결합되어 있고, 다른 쇄로부터의 과가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (하기 참조: Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. pp 15-17; 48-53 (1991)). 상기 불변 영역은 항체가 항원에 결합하는데 있어서 직접적으로 관여하는 것은 아니나, 항체 의존성 세포독성 (ADCC)에서 항체의 관여와 같은 다양한 효과기 기능을 나타낸다.
본원에서 사용되는 경우 용어 "과가변 부위"는 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 과가변 부위는 일반적으로 하기를 포함한다: "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어 경쇄 가변 영역에서 잔기 24~34 (L1), 50~56 (L2) 및 89~97 (L3) 및 중쇄 가변 영역에서 31~35 (H1), 50~65 (H2) 및 95~102 (H3); Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. pp 15-17; 48-53 (1991)) 및/또는 "과가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어 경쇄 가변 영역에서 잔기 26~32 (L1), 50~52 (L2) 및 91~96 (L3) 및 중쇄 가변 영역에서 26~32 (H1), 53~55 (H2) 및 96~101 (H3); Chothia 및 Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)). "구조형성 부위" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의되는 바와 같은 과가변 부위 잔기가 아닌 가변 영역 잔기이다. 항체를 파파인으로 절단하면, "Fab" 절편으로 불리는 각각 단일 항원-결합 위치를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 절편과, 쉽게 결정화하는 그의 능력이 명칭에 반영된 나머지의 "Fc" 절편이 생성된다. 펩신 처리에 의해서는, 2개의 항원-결합 위치를 가지며 여전히 항원과 가교결합할 수 있는 F(ab')2 절편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 위치를 포함하는 최소 항체 절편이다. 상기 부위는 강한 비공유 결합 상태로 있는 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 영역의 이량체로 이루어진다. 이러한 배열로, 각 가변 영역의 3개의 과가변 부위는 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원-결합 위치를 정의한다. 집합적으로, 6개의 과가변 부위는 해당 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일의 가변 영역 (또는 항원에 특이적인 3개의 과가변 부위만 포함하는 Fv의 절반)이라도, 전체 결합 위치보다 친화력이 덜하긴 하지만, 항원을 인지하여 그에 결합하는 능력을 갖는다. Fab 절편은 또한 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 제 1 불변 영역 (CH1)을 포함한다. Fab' 절편은 중쇄 CH1 영역의 카르복시 말단에서 항체 힌지 (hinge) 부위로부터의 하나 이상의 시스테인을 비롯한 수 개의 잔기가 추가된 점이 Fab 절편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 영역의 시스테인 잔기(들)가 하나 이상의 유리 티올기를 갖는 Fab'를 나타낸다. F(ab')2 항체 절편은 원래는 그들 사이에 힌지 시스테인이 존재하는 Fab' 절편의 쌍으로 생성되었다. 항체 절편의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물종의 항체의 "경쇄"는 그의 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는, 2개의 분명히 구별되는 유형 중 하나로 할당될 수 있다.
"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 절편은 항체의 VH 및 VL 영역을 포함하는데, 여기서 이들 영역은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 VH 및 VL 영역 사이에, scFv 가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성할 수 있게 하는 폴리펩티드 연결자를 추가로 포함한다. scFv에 대한 개관을 위해서는, 하기를 참조한다: 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Mon℃lonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)].
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 가진 소형 항체 절편으로서, 동일 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내에서 가변 중쇄 영역 (VH)이 가변 경쇄 영역 (VL)에 연결되어 있는 절편을 나타낸다. 상기 동일 사슬 상의 상기 두 영역 간의 쌍 형성 (pairing)을 허용하기에는 너무 짧은 연결자를 사용함으로써, 상기 영역은 또 다른 사슬의 상보성 영역과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 위치를 생성하도록 촉진된다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger 등, Pr℃. Natl . Acad . ScL USA, 90:6444-6448 (1993)]에 더욱 상세히 기술되어 있다.
용어 "트리아바디" 또는 "3가 삼량체"는 세 개의 단일 사슬 항체의 조합을 나타낸다. 트리아바디는 임의의 연결자 서열이 없는 VL 또는 VH 영역의 아미노산 말단으로 구성된다. 트리아바디는 환형, 헤드-투-테일 (head-to-tail) 방식으로 배열된 폴리펩티드를 갖는 세 개의 Fv 헤드를 갖는다. 트리아바디의 가능한 형태는 서로 120°의 각도로 한 면에 위치한 3개의 결합 위치를 갖는 평면이다. 트리아바디은 일특이성, 이특이성 또는 삼특이성일 수 있다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염물 성분은 상기 항체의 진단적 또는 치료적 사용을 방해하는 물질로서, 이에는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질이 포함될 수 있다. 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 원 위치에 존재하는 항체가 포함되는데, 그 이유는 상기 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로는, 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
관심 항원 (예를 들어 TROP-2 항원)에 "결합하는" 항체는, 항체가 상기 항원을 발현하는 세포를 표적하는 것에 있어서 치료제 또는 진단제로서 유용하도록 충분한 친화성을 갖고 상기 항원에 결합할 수 있는 것이다. 상기 항체가 TROP-2에 결합하는 것인 경우, 이는 통상 다른 수용체들에 반대되는 것으로서 TROP-2에 우선적으로 결합할 것인데, 이에는 비-특이적 Fc 접촉과 같은 우연적인 결합, 또는 다른 항원에 공통인 번역후 변형 부분에의 결합이 포함되지 않으며, 이는 다른 단백질과 유의하게 교차반응하지 않는 것일 수도 있다. 관심 항원에 결합하는 항체의 검출 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 이는 FACS, 세포 ELISA 및 웨스턴 블럿과 같은 검정법을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 바와 같은 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양"은 상호교환가능하게 사용되며, 이러한 모든 표기에는 자손이 포함된다. 또한, 인위적인 또는 인위적인 것이 아닌 돌연변이로 인해서, 모든 자손의 DNA 내용이 정확히 동일하지는 않을 수 있음이 또한 이해된다. 최초 형질변환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가진 돌연변이 자손이 포함된다. 다른 의미가 의도된 경우는 문맥으로부터 명백할 것이다.
"치료 또는 치료하는"이란 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치를 모두 나타내는 것으로서, 이 때 목적은 표적 병리학적 상태 또는 장애를 방지하거나 또는 진행을 늦추는 (약화시키는) 것이다. 치료를 요하는 자들에는, 이미 상기 장애를 가진 자들 뿐 아니라, 상기 장애를 가지기 쉬운 자들 또는 상기 장애가 예방되어야 할 자들이 포함된다. 따라서, 본원에서 치료 대상인 포유류은 상기 장애를 가진 것으로 진단된 것일 수도 있고 또는 상기 장애에 걸리기 쉬운 또는 그에 취약한 것일 수도 있다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장 또는 사멸을 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 상태를 나타내거나 또는 기재한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프계 종양 (lymphoid malignancies)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 암의 더 구체적인 예에는 편평 세포 암 (예를 들어 편평 상피 세포 암), 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암 및 폐의 편평 암종을 포함하는 폐암, 복막의 암, 간세포 암, 위장관 암을 포함하는 위(gastric 또는 stomach)암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포 선종 (hepatoma), 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장 또는 콩팥암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종 뿐 아니라 두경부암이 포함된다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예에는 하기가 포함된다: 알킬화제, 예컨대 티오테파 (thiotepa) 및 시클로포스파미드 (CYTOXANTM); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판 (busulfan), 임프로설판 (improsulfan) 및 피포설판 (piposulfan); 아지리딘, 예컨대 벤조도파 (benzodopa), 카르보쿠온 (carboquone), 메투레도파 (meturedopa), 및 우레도파 (uredopa); 알트레타민 (altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올멜라민 (trimethylolmelamine) 을 포함하는 메틸올멜라민 (methylolmelamine) 및 에틸렌이민; 질소 머스터드, 예컨대 클로람부실 (chlorambucil), 클로르나파진 (chlornaphazine), 콜로포스파미드 (cholophosphamide), 에스트라무스틴 (estramustine), 이포스파미드 (ifosfamide), 메클로레타민 (mechlorethamine), 메클로레타민 옥시드 하이드로클로라이드, 멜팔란 (melphalan), 노벰비킨 (novembichin), 페네스테린 (phenesterine), 프레드니무스틴 (prednimustine), 트로포스파미드 (trofosfamide), 우라실 머스타드 (uracil mustard); 니트로스우레아 (nitrosurea), 예컨대 카르무스틴 (carmustine), 클로로조토신 (chlorozotocin), 포테무스틴 (fotemustine), 로무스틴 (lomustine), 니무스틴 (nimustine), 라니무스틴 (ranimustine); 항생제, 예컨대 아클라시노마이신 (aclacinomycin), 악티노마이신 (actinomycin), 안트라마이신 (anthramycin), 아자세린 (azaserine), 블레오마이신 (bleomycin), 칵티노마이신 (cactinomycin), 칼리케아미신 (calicheamicin), 카라비신 (carabicin), 카르노마이신 (carnomycin), 카르지노필린 (carzinophilin), 크로모마이신 (chromomycin), 닥티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 데토루비신 (detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신 (epirubicin), 에소루비신 (esorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 마르셀로마이신 (marcellomycin), 미토마이신 (mitomycin), 마이코페놀산 (mycophenolic acid), 노갈라마이신 (nogalamycin), 올리보마이신 (olivomycin), 페플로마이신 (peplomycin), 포트피로마이신 (potfiromycin), 푸로마이신 (puromycin), 쿠엘라마이신 (quelamycin), 로도루비신 (rodorubicin), 스트렙토니그린 (streptonigrin), 스트렙토조신 (streptozocin), 투베르시딘 (tubercidin), 우베니멕스 (ubenimex), 지노스타틴 (zinostatin), 조루비신 (zorubicin); 항-대사물, 예컨대 메토트랙세이트 (methotrexate) 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린 (denopterin), 메토트랙세이트, 프테로프테린 (pteropterin), 트리메트렉세이트 (trimetrexate); 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈 (fludarabine), 6-메르캅토퓨린, 티아미프린 (thiamiprine), 티오구아닌 (thioguanine); 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈 (ancitabine), 아자시티딘 (azacitidine), 6-아자우리딘 (6-azauridine), 카르모푸르 (carmofur), 시타라빈 (cytarabine), 디데옥시우리딘 (dideoxyuridine), 독시플루리딘 (doxifluridine), 에노시타빈 (enocitabine), 플록서리딘 (floxuridine), 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론 (calusterone), 드로모스타놀론 프로피오네이트 (dromostanolone propionate), 에피티오스타놀 (epitiostanol), 메피티오스탄 (mepitiostane), 테스토락톤 (testolactone); 항-부신제 (anti-adrenal), 예컨대 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide), 미토탄 (mitotane), 트리로스탄 (trilostane); 엽산 보충물, 예컨대 폴린산 (folinic acid); 아세글라톤 (aceglatone); 알도포스파미드 글리코시드 (aldophosphamide glycoside); 아미노레불린산 (aminolevulinic acid); 암사크린 (amsacrine); 베스트라부실 (bestrabucil); 비산트렌 (bisantrene); 에다트락세이트 (edatraxate); 데포파민 (defofamine); 데메콜신 (demecolcine); 디아지쿠온 (diaziquone); 엘포르미틴 (elformithine); 엘리프티늄 아세테이트 (elliptinium acetate); 에토글루시드 (etoglucid); 갈륨 니트레이트 (gallium nitrate); 하이드록시우레아; 렌티난 (lentinan); 로니다민 (lonidamine); 미토구아존 (mitoguazone); 미토잔트론 (mitoxantrone); 모피다몰 (mopidamol); 니트라크린 (nitracrine); 펜토스타틴 (pentostatin); 페나메트 (phenamet); 피라루비신 (pirarubicin); 포도필린산 (podophyllinic acid); 2-에틸히드라지드 (2-ethylhydrazide); 프로카르바진 (procarbazine); PSK®; 라족산 (razoxane); 시조피란 (sizofiran); 스피로게르마늄 (spirogermanium); 테누아존산 (tenuazonic acid); 트리아지쿠온 (triaziquone); 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄 (urethan); 빈데신 (vindesine); 다카르바진 (dacarbazine); 만노무스틴 (mannomustine); 미토브로니톨 (mitobronitol); 미토락톨 (mitolactol); 피포브로만 (pipobroman); 가시토신 (gacytosine); 아라비노시드 (arabinoside) ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁산 (taxane), 예를 들어 파클리탁셀 (paclitaxel) (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀 (docetaxel) (TAXOTERE®, Aventis, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈 (gemcitabine); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트랙세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 (cisplatin) 및 카르보플라틴 (carboplatin); 빈블라스틴 (vinblastine); 백금; 에토포시드 (etoposide) (VP-16); 이포스파미드 (ifosfamide); 미토마이신 C (mitomycin C); 미토잔트론; 빈크리스틴 (vincristine); 비노렐빈 (vinorelbine); 나벨빈 (navelbine); 노반트론 (novantrone); 테니포시드 (teniposide); 다우노마이신 (daunomycin); 아미노프테린 (aminopterin); 젤로다 (xeloda); 이반드로네이트 (ibandronate); CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신 (esperamicin); 카페시타빈 (capecitabine); 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체. 상기 정의에는 또한 하기가 포함된다: 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예컨대 항-에스트로겐, 예를 들어 타목시펜 (tamoxifen), 랄록시펜 (raloxifene), 아로마타제 (aromatase) 저해 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜 (trioxifene), 케옥시펜 (keoxifene), LY117018, 오나프리스톤 (onapristone), 및 토레미펜 (toremifene) (Fareston); 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드 (flutamide), 닐루타미드 (nilutamide), 비카루타미드 (bicalutamide), 류프롤리드 (leuprolide), 및 고세렐린 (goserelin); 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체.
치료를 목적으로 하는 "포유류"는, 인간, 마우스, SCID 또는 누드 마우스 또는 마우스 변종, 가축 및 사육 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 양, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는, 포유류로 분류되는 임의의 동물을 나타낸다. 바람직하게는, 본원에서 포유류는 인간이다.
"올리고뉴클레오티드"는 공지된 방법으로 화학적으로 합성된 짧은 길이의, 단일- 또는 이중-가닥 폴리데옥시뉴클레오티드이다(예컨대, 1988년 5월 4일 공개된 EP 266,032 에 기재된 것과 같은 고체상 기법들을 사용하거나 또는 문헌 [Froehler 등, Nucl . Acids Res ., 14:5399-5407, 1986]에 기재된 바와 같은 데옥시뉴클레오시드 H-포스포네이트 중간체를 통한, 포스포트리에스테르, 포스파이트, 또는 포스포라미다이트 화학). 이들을 그 후 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정제된다.
본 발명에 따르면, 비-인간 (예를 들어 쥐과) 면역글로불린의 "인간화" 및/또는 "키메라" 형태는 원래의 항체와 비교하여, 인간 항-마우스 항체 (HAMA), 인간 항-키메라 항체 (HACA) 또는 인간 항-인간 항체 (HAHA) 반응의 감소를 야기하는 특정 키메라 면역글로불린, 이들의 면역글로불린 사슬 또는 절편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체들의 기타 항원-결합 하위서열)을 포함하고, 목적하는 효과를 재현하는데 필요한, 상기 비-인간 면역글로불린에서 유래한 필수 부분 (예를 들어 CDR(들), 항원 결합 부위(들), 가변 영역(들) 등)을 포함하는 한편, 동시에 상기 비-인간 면역글로불린에 필적하는 결합 특징을 보유하는 항체를 나타낸다. 대부분, 인간화 항체는, 수용자 항체의 상보성 결정 부위 (CDR)의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 가진 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 랫트 또는 토끼의 CDR의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 Fv 구조형성 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 FR 잔기로 대체된다. 더욱이, 상기 인간화 항체는 수용자 항체나 이입되는 CDR 또는 FR 서열에는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하고 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상의, 전형적으로는 2개의, 가변 영역을 실질적으로 모두 포함할 것인데, 이 때 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 부위는 비-인간 면역글로불린의 것에 해당하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기는 인간 면역글로불린 공통 서열의 잔기이다. 상기 인간화 항체는 최적으로는 또한 면역글로불린 불변 부위 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 것이다.
"탈-면역화" 항체는 주어진 종에 대해 비-면역원성이거나, 또는 면역원성이 보다 덜한 면역글로불린이다. 탈-면역화는 상기 항체에 구조적 변경을 가하여 달성할 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 탈-면역화 기술이 사용될 수 있다. 항체를 탈-면역화하는 한 가지 적절한 기술은, 예를 들어 2000년 6월 15일 공개된 WO 00/34317에 기재되어 있다.
"세포자멸사"를 유도하는 항체는 임의 수단에 의해, 이에 제한되는 것은 아니나 아넥신 V (annexin V)의 결합, 카스파제 (caspase) 활성, DNA 파편화, 세포 수축, 소포체 팽창, 세포 파편화, 및/또는 막 소포 (아포토시스 소체로 불림) 형성으로 예증되는, 예정된 세포사를 유도하는 항체이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "항체 유도성 세포독성"은 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 하이브리도마 상청액 또는 항체, IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 인간화 항체, IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 키메라 항체, 항원 결합 절편 또는 그의 항체 리간드로부터 유래된 세포독성 효과를 의미하는 것으로 이해되며, 상기 효과는 반드시 결합 정도에 관련되지는 않는다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 하이브리도마 세포주 뿐 아니라 이로부터 생성된 단리된 단클론 항체는 대안적으로는 이들의 내부적 호칭인, AR47A6.4.2 (쥐과), (ch)AR47A6.4.2 (키메라), (hu)AR47A6.4.2 (인간화) 또는 기탁 명칭인, IDAC 141205-05로 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같은 "항체-리간드"에는 표적 항원이 하나 이상의 에피토프에 대해 결합 특이성을 나타내는 부분이 포함되고, 이는 IDAC 141205-05 (IDAC 141205-05 항원)로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 단리된 단클론 항체, IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 인간화 항체, IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 키메라 항체 및 항원 결합 절편에 의해 결합된 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인지 및 결합하는, 완전한 항체 분자, 항체 절편 및 적어도 항원-결합 부위 또는 그의 일부분 (즉, 항체 분자의 가변 부분) 를 갖는 임의의 분자, 예를 들어 Fv 분자, Fab 분자, Fab' 분자, F(ab')2 분자, 이특이성 항체, 융합 단백질 또는 임의의 유전적으로 조작된 분자일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "암성 질환 변형 항체" (CDMAB)는 환자에 유익한 방식으로, 예를 들어 종양 존재량을 감소시키거나 또는 종양을 가진 개인의 생존을 연장시키는 것으로 암성 질환 과정을 변형하는 단클론 항체 및 이의 항체-리간드를 나타낸다.
넓은 의미로 "CDMAB 관련 결합제"는 하나 이상의 CDMAB 표적 에피토프에 경쟁적으로 결합하는, 임의 형태의 인간 또는 비-인간 항체, 항체 절편, 항체 리간드 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 것으로 이해된다.
"경쟁적 결합제" 는 하나 이상의 CDMAB 표적 에피토프에 대한 결합 친화성을 갖는 임의 형태의 인간 또는 비-인간 항체, 항체 절편, 항체 리간드 등을 포함하는 것으로 이해된다.
치료될 종양에는 1차 종양 및 전이 종양뿐만 아니라 불응 종양이 포함된다. 불응 종양에는 화학요법제 단독으로, 항체 단독으로, 방사 단독으로 또는 그의 조합으로의 치료에 대해 반응하지 않거나 내성을 갖는 종양이 포함된다. 불응 종양에는 또한, 상기 제제에 의한 치료에 의해 억제되나 치료의 중단 후 5년, 때로는 10년 이상의 기간 내에 재발하는 것으로 나타나는 종양이 포함된다.
치료될 수 있는 종양에는 혈관이 분포되지 않거나 아직 실질적으로 혈관이 분포되지 않은 종양뿐만 아니라 혈관이 분포된 종양이 포함된다. 따라서 치료될 수 있는 고체 종양의 예에는 유방암종, 폐암종, 결장 직장 암종, 췌장 암종, 신경 교종 및 림프종이 포함된다. 상기 종양의 일부 예에는 표피양 종양, 편평 종양 예컨대 두경부 종양, 결장 직장 종양, 전립선 종양, 유방 종양, 폐 종양, 소세포 및 비-소세포 폐 종양을 포함하는 폐 종양, 췌장 종양, 갑상선 종양, 난소 종양 및 간 종양이 포함된다. 다른 예에는 카포시 육종, CNS 신생물, 신경모세포종, 모세 혈관모세포종, 수막종 및 뇌전이, 흑색종, 위장 및 콩팥 암종 및 육종, 횡문근육종, 아교모세포종, 바람직하게는 다형성 아교모세포종 및 평활근육종이 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "항원-결합 부위"는 표적 항원을 인식하는 분자의 일부분을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "경쟁적으로 억제하다"는 통상의 상호 (reciprocal) 항체 경쟁 검정을 사용하여 IDAC 141205-05 (IDAC 141205-05 항체)로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 단클론 항체, IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 인간화 항체, IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 키메라 항체, 항원 결합 절편 또는 그의 항체 리간드가 유도되는 결정인자 위치를 인지하여 결합할 수 있는 것을 의미한다 (Belanger L., Sylvestre C. and Dufour D. (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta 48, 15).
본원에서 사용된 바와 같은 "표적 항원"은 IDAC 141205-05 항원 또는 이의 일부분이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "면역접합체"는 세포독소, 방사능제 (radioactive agent), 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분, 효소, 독소, 항-종양 약물 또는 치료제에 화학적으로 또는 생물학적으로 연결된 항체와 같은 임의의 분자 또는 CDMAB를 의미한다. 상기 항체 또는 CDMAB는, 해당 표적에 결합할 수 있는 한, 상기 분자 상의 임의의 위치에서 세포독소, 방사능제, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분, 효소, 독소, 항-종양 약물 또는 치료제에 연결될 수 있다. 면역접합체의 예에는, 항체 독소 화학 접합체 및 항체-독소 융합 단백질이 포함된다.
항-종양제로 사용하기에 적절한 방사성 제제가 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 131I 또는 211At가 사용된다. 이러한 동위원소는 통상의 기술을 사용하여 항체에 부착된다 (예를 들어 Pedley 등, Br. J. Cancer 68, 69-73 (1993)). 대안적으로, 항체에 부착된 항-종양제는 전구약물을 활성화시키는 효소다. 일단 항체 복합체가 투여되면, 그의 세포독소 형태로 전환되는 종양 위치에 도달할 때까지 그의 비활성 형태로 남아있을 전구약물이 투여될 수 있다. 실제로, 항체-효소 접합체는 환자에게 투여되어, 치료될 조직의 부위에 위치하게 된다. 그 다음, 세포독성 약물로의 전환이 치료될 조직의 부위에서 발생하도록 상기 전구 약물을 환자에게 투여한다. 대안적으로, 항체에 접합된 항-종양제는 사이토카인 예컨대 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-4 (IL-4) 또는 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)이다. 항체는 사이토카인이 다른 조직에 영향을 미치지 않고 종양에 대한 손상 또는 그의 파괴를 매개하도록, 종양에 대한 사이토카인을 표적으로 한다. 상기 사이토카인은 통상의 재조합 DNA 기술을 사용하는 DNA 수준에서 항체에 융합된다. 인터페론이 또한 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "융합 단백질"은 항원 결합 부위가 생물학적으로 활성인 분자, 예를 들어 독소, 효소, 형광 단백질, 발광 표지자, 폴리펩티드 표지, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분에 연결된 임의의 키메라 단백질 또는 단백질 약물을 의미한다.
본 발명은 본 발명의 CDMAB에 결합된 표적 또는 리포터 부분을 추가로 고려한다. 표적 부분은 결합 쌍의 일차 구성원이다. 항-종양제는 예를 들어, 상기 쌍의 제 2 구성원에 접합하고, 그에 따라 항원-결합 단백질이 결합된 부위로 유도된다. 상기 결합쌍의 통상 예는 아비딘 및 바이오틴이다. 바람직한 구현예에서, 바이오틴은 본 발명의 CDMAB의 표적 항원에 접합하고, 그에 따라 항-종양제에 대한 표적 또는 아비딘 또는 스트렙타비딘에 접합하는 다른 부분을 제공한다. 대안적으로, 바이오틴 또는 다른 상기 부분은 본 발명의 CDMAB의 표적 항원에 연결되고, 예를 들어, 검출가능한 신호-생성제가 아비딘 또는 스트렙타비딘에 접합하는 진단 시스템에서 리포터로 사용된다.
검출가능한 신호-생성제는 생체내 및 시험관내에서 진단용으로 유용하다. 신호 생성제는 외부 수단, 통상적으로는 전자기 방사의 측정에 의해 검출가능한 측정가능 신호를 생성한다. 대부분의 신호 생성제는 효소 또는 발색단이거나, 형광, 인광 또는 화학발광에 의해 빛을 방출한다. 발색단에는 자외선 또는 가시광선 영역에서 빛을 흡수하는 염료가 포함되고, 효소 촉매 반응 기질 또는 분해 생성물일 수 있다.
또한, 당업계에 잘 공지된 조사 또는 진단 방법을 위한 생체내 및 시험관내에서의 상기 CDMAB의 용도가 본 발명의 범주에 포함된다. 본원에서 고려되는 진단법을 실행하기 위해, 본 발명은 본 발명의 CDMAB를 포함하는 키트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기 개인의 세포상에서의 CDMAB의 표적 항원의 과다-발현을 검출하여, 개인의 특정 유형의 암에 대한 위험을 확인하는데 유용할 것이다.
진단 검정 키트
종양의 존재를 측정하기 위한 진단 검정 키트의 형태로 본 발명의 CDMAB를 사용하는 것이 고려된다. 상기 종양은 환자로부터 수득될 생물학적 검체, 예컨대 혈액, 혈청, 소변 및/또는 종양 생검에서 상기 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 종양-특이적 항원, 예를 들어 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드의 존재를 기준으로 환자에게서 통상적으로 검출될 수 있다.
단백질은 특정 종양, 예를 들어 결장, 유방, 폐 또는 전립선 종양의 존재 또는 부재를 나타내는 표지자로서 기능한다. 항원이 다른 암성 종양의 검출에 대해 유용성을 가질 것으로 추가 고려된다. 본 발명의 CDMAB로 구성된 결합제, 또는 CDMAB 관련 결합제의 진단 검정 키트 중 포함물은, 생물학적 검체에서 제제에 결합하는 항원의 수준을 검출할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 프라이머 및 프로브는 종양 단백질을 인코딩하는 mRNA의 수준을 검출하는데 사용될 수 있고, 이는 또한 암의 존재 및 부재를 나타낸다. 진단될 결합 검정을 위해, 결합을 인지하여 암성 종양의 존재가 명확히 진단되도록 정상 조직에 존재하는 항원에 관해 통계적으로 유의한 수준의 항원을 서로 비교하여 데이터를 생성시킬 것이다. 검체에서 폴리펩티드 표지자를 검출하기 위해 결합제를 사용하는, 당업자들에게 공지된 바와 같은 다수의 포맷은 본 발명의 진단 검정에 유용할 것으로 고려된다. 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 예시되어 있다. 상기 기술된 진단 검정 포맷의 임의의 및 모든 조합, 변경 또는 변형이 추가로 고려된다.
환자에서의 암의 존재 및 부재는 통상적으로 (a) 환자로부터 수득된 생물학적 검체를 결합제와 접촉시키고; (b) 검체에서 결합제에 결합하는 폴리펩티드의 수준을 검출하고; (c) 폴리펩티드의 수준을 예비측정된 절삭값과 비교하여 결정될 것이다.
예시적인 구현예에서, 검정법이 검체의 잔류물로부터 폴리펩티드를 제거하고, 결합된 고체 지지체 상에 고정된 CDMAB 기재 결합제를 사용하는 것을 포함할 것으로 고려된다. 이후, 결합된 폴리펩티드는 리포터 기를 포함하고 결합제/폴리펩티드 복합체에 특이적으로 결합하는 검출 시약을 사용하여 검출될 수 있다. 검출 시약의 예에는 폴리펩티드 또는 항체에 특이적으로 결합하는 CDMAB 기재 결합제 또는 결합제에 특이적으로 결합하는 다른 제제, 예컨대 항-면역글로불린, 단백질 G, 단백질 A 또는 렉틴이 포함될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 폴리펩티드를 리포터 기로 표지하고, 결합제를 검체와 인큐베이션한 후 고정된 결합제에 결합하도록 하는, 경쟁적 검정법이 이용될 수 있는 것으로 고려된다. 고정된 결합제와 검체와의 반응성을 나타내는 것은, 결합제에 대한 표지된 폴리펩티드의 결합을 억제하는 검체 성분으로 확장된다. 상기 검정법에서 사용하기에 적절한 폴리펩티드에는 전체 길이의 종양-특이적 단백질 및/또는 그의 일부분이 포함되고, 결합제는 이에 대해 결합 친화성을 갖는다.
진단 키트는 단백질이 부착될 수 있는 당업자에게 공지된 임의 물질의 형태일 수 있는 고체 지지체로 제공될 것이다. 적절한 예에는 마이크로타이터 플레이트에서의 시험 웰 또는 니트로셀룰로스 또는 다른 적절한 막이 포함될 수 있다. 대안적으로, 상기 지지체는 비드 또는 디스크, 예컨대 유리, 유리섬유, 라텍스 또는 플라스틱 물질, 예컨대 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드일 수 있다. 상기 지지체는 또한 예를 들어, 미국 특허 제 5,359,681 호에 개시된 것과 같은 자성 입자 또는 광섬유 센서일 수 있다.
결합제는 당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 고체 지지체 상에 고정될 것으로 고려되고, 이는 본 특허 및 과학 문헌에 충분히 기재되어 있다. 용어 "고정화"는 비공유 회합, 예컨대 흡착, 및 본 발명의 문맥에서 지지체 상에서 제제와 작용기 사이에 직접적인 연결 또는 가교 결합제에 의한 연결일 수 있는 공유 결합을 모두 나타낸다. 바람직한 비-제한적 구현예에서, 마이크로타이터 플레이트에서의 웰 또는 막에 대한 흡착에 의한 고정화가 바람직하다. 흡착은 결합제를 적절한 완충액에서 고체 지지체와 적절한 기간 동안 접촉시켜 달성될 수 있다. 접촉 기간은 온도에 따라 변할 수 있고, 통상적으로 약 1시간 내지 약 1일의 범위일 수 있다.
고체 지지체에 대한 결합제의 공유 결합은 통상적으로 우선 결합제 상에서 지지체를 지지체 및 작용기, 예컨대 하이드록실기 또는 아미노기와 반응할 수 있는 이작용성 시약과 반응시켜 달성될 수 있다. 예를 들어, 결합제는 벤조퀴논을 사용하거나 지지체 상의 알데히드기를 결합 파트너 상에서 아민 및 활성 수소와 축합시켜, 적정한 폴리머 코팅을 갖는 지지체에 공유적으로 결합될 수 있다 (예를 들어 Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, A12 A13 참조).
진단용 측정 키트는 두 개의 항체 샌드위치 검정법의 형태를 취하는 것으로 추가 고려된다. 상기 검정은 우선, 검체 내에 있는 폴리펩티드가 고정된 항체에 결합되도록, 항체 예를 들어 고체 지지체, 통상적으로는 마이크로타이터 플레이트의 웰 상에 고정된 바로 앞에 개시된 CDMAB를 검체와 접촉시켜 수행될 수 있다. 이후, 비결합된 검체를 고정된 폴리펩티드-항체 복합체로부터 제거하고, 리포터 기를 포함하는 검출 시약 (바람직하게는 폴리펩티드 상에서 상이한 위치에 결합할 수 있는 제 2 항체)을 첨가한다. 그 다음, 고체 지지체에 결합되어 잔류하는 검출 시약의 양을 특이적 리포터 기에 대해 적정한 방법을 사용하여 측정한다.
특정 구현예에서, 일단 항체가 상기 기재된 바와 같이 지지체 상에 고정되면, 지지체 상에 잔류하는 단백질 결합 위치는 당업자에게 공지된 임의 적절한 차단제, 예컨대 소과 혈청 알부민 또는 Tween 20TM (Sigma Chemical Co., St.Louis,Mo.)을 사용하여 차단될 수 있다. 그 다음, 고정된 항체를 검체와 인큐베이션하고, 폴리펩티드가 항체에 결합하도록 할 수 있다. 검체는 인큐베이션하기 전에, 적절한 희석액, 예컨대 포스페이트-완충 식염수 (PBS)로 희석될 수 있다. 일반적으로, 적정한 접촉 시간 (즉 인큐베이션 시간)은 특이적으로 선택된 종양을 갖는 개인으로부터 수득된 검체 내에서 폴리펩티드의 존재를 검출하기에 충분한 시간에 상응하도록 선택될 수 있다. 바람직하게는, 접촉 시간은 결합 및 비결합 폴리펩티드 간의 평형이 약 95% 이상 달성된 결합 수준을 달성하기에 충분하다. 평형을 달성하는데 필요한 시간은, 상기 기간에 걸쳐 발생한 결합 수준을 검정하여 쉽게 측정될 수 있는 것으로 당업자들에게 인식될 수 있다.
따라서, 비결합된 검체는 고체 지지체를 적정한 완충액으로 세척하여 제거될 수 있는 것으로 추가 고려된다. 이후 리포터 기를 포함하는 제 2 항체를 고체 지지체에 첨가할 수 있다. 이후, 결합된 폴리펩티드를 검출하기에 충분한 시간량 동안 검출 시약과 고정된 항체-폴리펩티드 복합체의 인큐베이션을 실행할 수 있다. 이어서, 비결합된 검출 시약을 제거한 후, 리포터 기를 사용하여 결합된 검출 시약을 검출할 수 있다. 리포터 기를 검출하는데 사용된 방법은 예를 들어, 방사성 기로 선택된 상기 유형의 리포터 기에 반드시 특이적이며, 섬광 계수법 또는 자가방사그래픽법이 일반적으로 적정하다. 분광법은 염료, 발광기 및 형광기를 검출하는데 사용될 수 있다. 바이오틴은 상이한 리포터 기 (통상적으로 방사성 또는 형광기 또는 효소)에 결합된 아비딘을 사용하여 검출될 수 있다. 효소 리포터 기는 일반적으로 기질의 첨가 후 (일반적으로 특정 기간 동안), 반응 생성물을 분광 또는 다르게 분석하여 검출될 수 있다.
암, 예컨대 전립선 암의 존재 또는 부재가 측정되도록 본 발명의 진단 검정 키트를 사용하기 위해, 고체 지지체에 결합된 잔류하는 리포터 기로부터 검출된 신호를 일반적으로 예비측정된 절삭값에 상응하는 신호와 비교할 수 있다. 예를 들어, 암을 검출하기 위한 예시적인 절삭값은 고정된 항체가 암이 없는 환자로부터 수득된 검체와 인큐베이션되는 경우, 수득되는 평균값 신호일 수 있다. 일반적으로, 예비측정된 절삭값의 약 3배의 표준 편차를 갖는 신호를 발생시키는 검체는 암에 대해 양성인 것으로 고려될 수 있다. 대안적 구현예에서, 절삭값은 [Sackett 등, Clinical Epidemiology. A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p. 106-7]의 방법에 따라, 수신자 작동 곡선 (Receiver Operator Curve)을 사용하여 측정될 수 있다. 상기 구현예에서, 절삭값은 진단 시험 결과에 대한 각각의 가능한 절삭값에 상응하는 진양성률 (즉, 민감도) 및 위양성률 (100%-특이성)의 쌍의 도표로부터 결정될 수 있다. 상부 좌측 모퉁이에 가장 근접한 도표 상 절삭값 (즉, 가장 큰 면적을 포함하는 값)이 가장 정확한 절삭값이고, 상기 방법에 의해 측정된 절삭값보다 큰 신호를 생성시키는 검체는 양성인 것으로 고려될 수 있다. 대안적으로, 절삭값은 위양성률을 최소화하기 위해 도표를 따라 왼쪽으로, 또는 위양성률을 최소화하기 위해 오른쪽으로 이동될 수 있다. 일반적으로, 상기 방법에 의해 결정된 절삭값보다 큰 신호를 생성시키는 검체가 암에 대해 양성인 것으로 고려된다.
키트에 의해 가능한 진단 검정은 유동-통과 또는 스트립 시험 포맷으로 수행될 수 있으며, 상기 결합체는 막, 예컨대 니트로셀룰로스 상에 고정되는 것으로 고려된다. 유동-통과 시험에서, 검체 내에 있는 폴리펩티드는 막을 통과하는 검체로서 고정된 결합제에 결합한다. 두 번째로, 표지된 결합제는 이후 막을 통해 흐르는 제 2 결합제를 포함하는 용액으로서 결합제-폴리펩티드 복합체에 결합한다. 그 다음, 결합된 제 2 결합제의 검출을 상기 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 스트립 시험 포맷에서, 결합제가 결합된 막의 한쪽 끝은 검체를 포함하는 용액에 침지될 것이다. 검체는 제 2 결합제를 포함하는 부위를 통해, 및 고정된 결합제의 구역으로 막을 따라 이동한다. 고정된 항체의 구역에서의 제 2 결합제의 농도는 암의 존재를 나타낸다. 시각적으로 판독될 수 있는, 결합 위치에서의 선과 같은 패턴의 생성은 양성 시험을 나타낼 수 있다. 상기 패턴의 부재는 음성 결과를 나타낸다. 일반적으로, 막에 고정된 결합제의 양은 상기 거론된 포맷에서 생물학적 검체가 두 개의 항체 샌드위치 검정법으로 양성 신호를 생성하기에 충분한 수준의 폴리펩티드를 포함하는 경우, 시각적으로 인식될 수 있는 패턴을 생성하도록 선택된다. 본 진단 검정에 사용되는 바람직한 결합제는 바로 앞서 개시된 항체, 이의 항원-결합 절편 및 본원에 기재된 임의의 CDMAB 관련 결합제이다. 막에 고정된 항체의 양은 진단 검정을 수행하기에 효과적인 임의의 양일 수 있고, 약 25 나노그램 내지 약 1 마이크로그램의 범위일 수 있다. 전형적으로 상기 시험은 매우 소량의 생물학적 검체로 수행될 수 있다.
추가로, 본 발명의 CDMAB는 이의 표적 항원을 확인하는 이의 능력으로 인해 연구실에서 사용될 수 있다.
본원에 기재된 발명을 더욱 완전히 이해할 수 있도록, 하기에 상세히 설명한다.
본 발명은 IDAC 141205-05 항원을 특이적으로 인지 및 이와 결합하는 CDMAB (즉, IDAC 141205-05 CDMAB, IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 인간화 항체, IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 키메라 항체, 항원 결합 절편 또는 이의 항체 리간드)를 제공한다.
IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 CDMAB는, 이것이 이의 표적 항원에 대한 하이브리도마 IDAC 141205-05에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 면역특이적 결합을 경쟁적으로 억제하는 항원-결합 부위를 갖는 한, 임의의 형태일 수 있다. 따라서, IDAC 141205-05 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는 임의의 재조합 단백질 (예를 들어, 항체가 제 2 단백질, 예컨대 림포카인 또는 종양 억제 성장 인자와 조합된 융합 단백질)이 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명의 한 구현예에서, CDMAB는 IDAC 141205-05 항체이다.
다른 구현예에서, CDMAB는 IDAC 141205-05 항체의 항원-결합 부위를 갖는 Fv 분자 (예컨대 단쇄 Fv 분자), Fab 분자, Fab' 분자, F(ab')2 분자, 융합 단백질, 이특이성 항체, 이종항체 또는 임의의 재조합 분자일 수 있는 항원 결합 절편이다. 본 발명의 CDMAB는 IDAC 141205-05 단클론 항체가 유도되는 에피토프로 유도된다.
본 발명의 CDMAB를 분자 내의 아미노산 변형으로 변형시켜, 유도체 분자를 생성할 수 있다. 화학적 변형이 또한 가능할 수 있다. 직접적인 돌연변이에 의한 변형, 친화성 돌연변이 방법, 파지 디스플레이 또는 사슬 셔플링에 의한 변형이 또한 가능할 수 있다.
친화성 및 특이성은 CDR 및/또는 페닐알라닌 트립토판 (FW) 잔기를 돌연변이시키고, 원하는 특징을 갖는 항원 결합 위치를 스크리닝하여 변형 또는 개선될 수 있다 (예를 들어 Yang 등, J. Mol.Biol., (1995) 254: 392-403). 한가지 방법은 그 밖에 동일한 항원 결합 위치의 집단에서, 2개 내지 20개의 아미노산으로부터의 아집단이 특정 위치에서 발견되도록 개별 잔기 또는 잔기의 조합을 무작위화하는 것이다. 대안적으로, 돌연변이는 잔기의 범위에 걸쳐 오류 유발 PCR 방법에 의해 유도될 수 있다 (예를 들어 Hawkins 등, J. Mol.Biol., (1992)226:889-96). 다른 예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 부위 유전자를 포함하는 파지 디스플레이 벡터는 대장균 (E. coli)의 돌연변이유발 균주로 전파될 수 있다 (예를 들어 Low 등, J. Mol.Biol., (1996)250:359-68). 이러한 돌연변이유발 방법은 당업자에게 공지된 많은 방법에 의해 예시된다.
본 발명의 항체의 친화성을 증가시키는 또 다른 방법은 사슬 셔플링을 실행하는 것이며, 여기서 중쇄 또는 경쇄는 다른 중쇄 또는 경쇄와 무작위하게 쌍을 이루어 높은 친화성을 갖는 항체를 생성시킨다. 항체의 다양한 CDR은 또한 다른 항체에서 상응하는 CDR과 셔플링될 수 있다.
유도체 분자는 상기 폴리펩티드의 기능적 특성을 보유할 것인데, 즉, 상기와 같은 치환을 가진 분자는 여전히 IDAC 141205-05 항원 또는 이의 일부분에 대한 상기 폴리펩티드의 결합을 가능하게 할 것이다.
이러한 아미노산 치환에는, 반드시 이에 제한되는 것은 아니나 당업계에 "보존적인 것"으로 공지된 아미노산 치환이 포함된다.
예를 들어, 해당 단백질의 형태나 기능을 변경시키지 않는, "보존적 아미노산 치환"으로 일컬어지는 특정 아미노산 치환이 종종 단백질 내에서 이루어질 수 있다는 것은 단백질 화학에 있어서 잘 확립된 원리이다.
이러한 변경에는, 이소류신 (I), 발린 (V), 및 류신 (L) 중 임의의 것을 이들 소수성 아미노산 중 임의의 다른 것으로; 아스파르트산 (D)을 글루탐산 (E)으로 및 그 반대로; 글루타민 (Q)을 아스파라긴 (N)으로 및 그 반대로; 및 세린 (S)을 트레오닌 (T)으로 및 그 반대로 치환하는 것이 포함된다. 다른 치환들도 또한, 특정 아미노산의 환경 및 해당 단백질의 3차원 구조 내에서의 그의 역할에 따라 보존적인 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 글리신 (G) 및 알라닌 (A)은 빈번히 상호교환가능하며, 알라닌 및 발린 (V)도 마찬가지이다. 메티오닌 (M)은 비교적 소수성인 것으로서, 류신 및 이소류신과 빈번히, 및 발린과 간혹 상호교환될 수 있다. 리신 (K) 및 아르기닌 (R)은, 해당 아미노산 잔기의 유의한 특징이 그의 전하이며 이들 두 아미노산 잔기의 상이한 pK가 유의하지 않은 위치에서 빈번히 상호교환가능하다. 또 다른 변경들도 특정 환경에서 "보존적"인 것으로 간주될 수 있다.
실시예 1
인간 MDA-MB-231 유방암 세포를 사용한 생체내 종양 실험
AR47A6.4.2는 인간 MCF-7 인간 유방암 이종이식 모델에서 이미 증명된 (S.N. 11/709,676에 개시된 바와 같음) 효능을 가졌다. 상기 발견을 확장하기 위해, AR47A6.4.2를 MCF-7 모델과 상이하며 Her2/neu 음성, 에스트로겐 및 프로게스테론 수용체 음성인 MDA-MB-231 인간 유방암 이종이식 모델에서 시험하였다. 도 1, 2 및 3과 관련하여, 8 내지 10주령 암컷 SCID 마우스에 100 ㎕ PBS 용액 중 500 만 개의 인간 유방암 세포 (MDA-MB-231)를 각각의 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하여 이식하였다. 상기 마우스를 10마리씩 2개의 처리군으로 무작위하게 나누었다. 이식 후 1일에, 저장 농축액 (stock concentration)을 2.7 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 20 mM Na2HPO4 를 포함하는 희석액으로 희석한 후, 20 mg/kg의 AR47A6.4.2 시험 항체 또는 완충액 대조군을 300 마이크로리터의 부피로 각각의 코호트에 대해 복강 내 투여하였다. 이후 상기 항체 및 대조군 검체를, 처음 2주 동안 주 1회, 및 추가 3주 동안 주 2회 투여하였다. 종양 성장을 주 1회 캘리퍼스 (calipers)로 측정하였다. 상기 처리를 항체 8회 용량 후 완료하였다. 종양 측정과 동시에 동물의 체중을 기록하였다. 모든 동물을 상기 연구의 말미에서 그들이 종말점에 도달하였을 때, CCAC 지침에 따라 안락사시켰다.
AR47A6.4.2는 인간 유방암의 MDA-MB-231 생체내 예방 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제하였다. ARIUS 항체 AR47A6.4.2로의 처리는, 55일에, 항체의 마지막 용량 5일 후에 측정된 바와 같이 완충액-처리군과 비교하여 91.9퍼센트 (p<0.00001, t-시험)로 MDA-MB-231 종양의 성장을 감소시켰다 (도 1). 108일에, 항체의 마지막 용량 58일 후에, 종말점에 도달한 것으로 인해, 대조군에서의 모든 마우스를 연구에서 제거하였다. 그러나, AR47A6.4.2-처리군에서의 마우스 중 90퍼센트는 이 때 아직 살아있었다 (도 2).
연구 전체에 걸쳐 독성의 명백한 임상적 징후는 없었다. 주 간격으로 측정된 체중은 웰-빙 및 번식 실패에 대한 대리지표였다. 평균 체중은 연구의 지속 기간에 걸쳐 모든 군에서 증가하였다 (도 3). 0일 내지 55일 사이에 증가된 평균 중량은 대조군에서는 1.3 g (6.9%)였고 AR47A6.4.2-처리군에서는 1.8 g (9.3%)였다. 상기 처리 기간 동안 군 사이의 유의한 차이는 없었다. 요약하여, AR47A6.4.2는 인간 유방암 이종이식 모델에서 잘 용인되었고, 종양 성장을 유의하게 억제하였다.
실시예 2
인간 PL45 췌장암 세포를 사용한 생체내 종양 실험
AR47A6.4.2는 예방적 PL45 인간 췌장암 이종이식 모델에서 이미 증명된 (S.N. 11/709,676에 개시된 바와 같음) 효능을 가졌다. 효과적인 용량 수준을 측정하기 위해, AR47A6.4.2를 다양한 용량으로 확립된 PL45 모델에서 시험하였다. 도 4, 5 및 6과 관련하여, 8 내지 10주령 암컷 SCID 마우스에 100 마이크로리터 PBS 용액 중 400 만 개의 인간 췌장암 세포 (PL45)를 마우스의 목 뒷덜미에 피하 주사하여 이식하였다. 평균 마우스 종양 부피가 약 100 mm3 에 도달하였을 때 마우스를 10마리씩 5개의 처리군으로 무작위하게 나누었다. 이식 후 32일에, 저장 농축액을 2.7 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 20 mM Na2HPO4를 포함하는 희석액으로 희석한 후, 20, 10, 2 또는 0.2 mg/kg의 AR47A6.4.2 시험 항체 및 완충액 대조군을 300 마이크로리터의 부피로 각각의 코호트에 대해 복강 내 투여하였다. 이후, 항체 및 대조군 검체를 연구가 지속되는 동안 주 3회 투여하였다. 종양 성장을 약 4~7일마다 캘리퍼스로 측정하였다. 항체의 10회 용량 후 연구를 완료하였다. 동물의 체중을 연구가 지속되는 동안 주 1회 기록하였다. 모든 동물을 상기 연구의 말미에서 그들이 종말점에 도달하였을 때, CCAC 지침에 따라 안락사시켰다.
AR47A6.4.2는 인간 췌장암의 PL45 생체내 확립된 모델에서 용량-의존성 종양 성장 억제를 나타내었다. ARIUS 항체 AR47A6.4.2로의 처리는, 67일, 처리 마지막 용량 14일 후에 측정된 것으로서, 완충액 처리군과 비교하여, 20, 10, 2 및 0.2 mg/kg의 용량에서 각각, 48.9 퍼센트 (p=0.0001, t-시험), 34.6퍼센트 (p=0.0011, t-시험), 17.4퍼센트 (p=0.1938, t-test) 및 4.7퍼센트 (p=0.7065, t-시험)로 PL45 종양의 성장을 감소시켰다 (도 4). 이는 대조군 및 항체-처리군에서의 거의 모든 마우스가 아직 살아있을 때였다. 모든 군에 대한 생존은 88일, 처리 마지막 용량 35일 후까지 모니터링되었다. 이 시점에서, 대조군에서의 오직 20퍼센트 (2/10)의 마우스가 아직 살아있었던 반면, AR47A6.4.2-처리군에서는 20, 10 및 2 mg/kg의 용량에서 각각, 60퍼센트 (6/10), 40퍼센트 (4/10) 및 90퍼센트 (9/10)의 마우스가 아직 살아있었다 (도 5).
연구 전체에 걸쳐 독성의 명백한 임상적 징후는 없었다. 주 간격으로 측정된 체중은 웰-빙 및 번식 실패에 대한 대리지표였다. 체중은 연구의 지속 기간에 걸쳐 모든 군에서 증가하였다 (도 6). 32일과 67일 사이에 증가된 평균 중량은 대조군에서 0.8 g(4.1퍼센트)이었고, AR47A6.4.2-처리군에서는 20, 10, 2 및 0.2 mg/kg의 용량에서 각각, 1.5 g (7.6퍼센트), 1.5 g (7.6퍼센트), 1.2 g (6.3퍼센트) 또는 1.9 g (9.5퍼센트)였다. 처리 기간 동안 군 사이에 유의한 차이는 없었다.
요약하여, AR47A6.4.2는 20 및 10 mg/kg에서의 상기 확립된 인간 췌장암 이종이식모델에서 잘 용인되었으며 용량 의존성 방법으로 종양 성장을 유의하게 억제하였다. 2 mg/kg 초과의 용량에서의 AR47A6.4.2-처리군 중 마우스는 또한 유의한 생존 이득을 나타내었다. 전부, 상기 데이터는 AR47A6.4.2가 용량 의존성 방법으로 인간암을 치료하는데 있어서 효과적이라는 것을 나타낸다.
실시예 3
인간 정상 및 다-종양 조직 염색
인간암에서의 AR47A6.4.2 항원 이환율을 더 분석하게 위해 추가적인 IHC 연구 (이전의 연구는 S.N. 11/709,676에 개시되었음)를 수행하였다. 슬라이드를 -80℃에서 -20℃로 옮겼다. 1시간 후, 슬라이드를 냉각된 (-20℃) 아세톤에서 10분 동안 후고정한 후 실온이 되게 하였다. 슬라이드를 4℃ 냉각된 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에서 2분 동안 3회 헹군 후, 각각 10분 동안 3퍼센트 과산화수소에서 세척하여 내인성 과산화효소 활성을 차단하였다. 이후 슬라이드를 PBS에서 5분 동안 3회 헹군 후, 범용 차단 용액 (Dako, Toronto, Ontario)에서 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. AR47A6.4.2, 항-인간 근육 액틴 (Clone HHF35, Dako, Toronto, Ontario), 항-사이토케라틴 7 클론 OV-TL 12/30 (Dako, Toronto, Ontario), 항-TROP-2 클론 77220.11 (R&D System Inc., MN, USA) 또는 동형 대조군 항체 (포유류 조직에서 존재하지도 유도가능하지도 않은 효소인 아스퍼질러스 니게르 (Aspergillus niger) 글루코오스 옥시다아제에 대해 유도됨; Dako, Toronto, Ontario)를, 항체 희석 완충액 (Dako, Toronto, Ontario)에서, 0.5 마이크로그램/mL인 항-액틴을 제외하고는 각각의 항체에 대해 5 마이크로그램/mL의 이의 작용 농도로 희석 (항-사이토케라틴 7은 사용 준비가 되었고 시판되는 항-TROP-2는 1 마이크로그램/mL이었음)하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 각각 PBS로 2분 동안 3회 세척하였다. 제 1 항체의 면역반응성을 30분 동안 실온에서 공급된 HRP 접합된 제 2 항체 (Dako Envision System, Toronto, Ontario)로 검출/시각화시켰다. 상기 단계 후 슬라이드를 각각 PBS로 5분 동안 3회 세척하고, 면역과산화효소 염색을 위해 DAB (3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드라클로라이드, Dako, Toronto, Ontario) 크로모겐 기질 용액을 10분 동안 실온에서 첨가하여 색 반응을 발전시켰다. 수돗물로 슬라이드를 세척하여 발색 반응을 완결시켰다. 메이어 헤마톡실린 (Sigma Diagnostics, Oakville, ON)으로 대조염색한 후, 슬라이드를 등급화된 에탄올 (75~100퍼센트)로 탈수하고, 자일렌으로 소제하였다. 표본화 배지 (Dako Faramount, Toronto, Ontario)를 사용하여 슬라이드를 덮었다. 췌장 배열 (Tri Star, Rockville, MD)에 대해, 하기의 수정을 제외하고는 동일한 프로토콜을 따랐다. 조직 박편을 처음에 2시간 동안 실온에서 공기 건조시키고, 아세톤으로 고정 후 30분 동안 다시 공기 건조시켰다. 내인성 과산화수소를 메탄올 중 3퍼센트 과산화수소를 사용하여 15분 동안 차단하고; 상기 단계를 제 1 항체 인큐베이션 후 수행하였다.
Axiovert 200 (Ziess Canada, Toronto, ON)를 사용하여 슬라이드를 현미경 검사하고, 디지털 영상을 수득하고 Northern Eclipse 영상화 소프트웨어 (Mississauga, ON)를 사용하여 저장하였다. 조직병리학자에 의해 결과를 읽고, 점수 매기고 해석하였다.
도 7은 인간 종양의 패널 및 상응하는 정상 조직 (11개 결장암 및 2개 정상 결장, 8개 난소암 및 2개 정상 난소, 12개 유방암 및 4개 정상 유방, 15개 폐암 및 4개 정상 폐, 14개 전립선암 및 4개 정상 전립선, 및 14개 췌장암 및 5개 정상 췌장)의 AR47A6.4.2 염색 결과의 요약을 나타낸다. 이들 조직은 네 조직 미세배열 상에 분포하였다 (Tri Star, Rockville, MD). 항체는 6/11 (55퍼센트), 6/8 (75퍼센트), 11/12 (92퍼센트), 12/15 (80퍼센트), 14/14 (100퍼센트) 및 3/14 (21퍼센트)의 각각 결장, 난소, 유방, 폐, 전립선 및 췌장암에 대해 중등도 내지 강한 결합을 나타내었다 (도 8 및 9). 추가로, 불확실한 내지 약한 결합이 결합, 유방, 폐 및 췌장암에 대해 각각 2/11 (18퍼센트), 1/12 (8퍼센트), 3/15 (20퍼센트) 및 2/14 (14퍼센트)에서 관찰되었다. 결합은, 일부 조직에서 종양 대 정상에서의 과다발현을 갖는 모든 시험된 종양에서의 종양 세포에 대해 특이적이었다. 상응하는 정상 조직에 대해, 항체는 0/2, 0/2, 4/4, 4/4, 4/4 및 5/5의 정상 결장, 난소, 유방, 폐, 전립선 및 췌장 조직에 대한 결합을 나타내었다 (도 9). 결합은 주로 이들 기관의 상피 조직에 대해 주로 나타났다. 양성 항체 대조군으로서 사용된 항-사이토케라틴-7 또는 항-액틴은 각각 상피 조직 및 근육 조직에 대해 예측된 양성 결합을 나타내었다. IgG 동형 음성 대조군은 시험된 조직에 대해 음성 결합을 나타내었다.
실시예 4
포스포-MAPK (미토겐-활성화된 단백질 키나아제) 프로테옴 프로파일러 블럿
AR47A6.4.2 처리에 의해 영향받은 세포내 신호 분자를 확인하기 위해, 프로테옴 프로파일러 인간 포스포-MAPK 항체 배열 (ARY002, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)을 사용하여, AR47A6.4.2로 처리된 세포로부터의 용해물을 스크리닝하였다.
세포의 처리 및 제조
이전의 작업 (S.N. 11/709,676에 기재된 바와 같음)은 중증 복합형 면역결핍 (SCID) 마우스에서 성장한 BxPC-3 세포를 사용하여 췌장암 이종이식 모델에서의 AR47A6.4.2의 생체내 효능을 나타내었다. 따라서, 세포내 신호 분자의 활성에 대한 스크리닝을 BxPC-3 세포주를 사용하여 수행하였다. BxPC-3 세포를 근합류 (near confluence)로 성장시켜, 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 세척한 후 혈청 및 보충물-결핍 배지에서 37℃에서 4시간 동안 절식시켰다. 이 후, AR47A6.4.2 (20 마이크로그램/mL) 또는 8A3B.6 (동형 대조군; IgG2a) (20 마이크로그램/mL)을 세포에 첨가하고 4℃에서 20분 동안 결합시켰다. 그후 태아 소과 혈청 (FBS), L-글루타민 및 나트륨 피루베이트를 세포에 10퍼센트 FBS, 1퍼센트 L-글루타민 및 1퍼센트 나트륨 피루베이트의 최종 농도로 첨가하여, 세포를 자극하였다. 세포를 인큐베이터에서 37℃에 두고, 자극 1시간 후 세포 용해물을 수집하였다. PBS로 세포를 2회 세척하고 용해 완충액 6 (Part no. 895561: R&D Systems antibody array ARY002)에서 채취함으로써 용해물을 수집하였다. 피펫팅으로 세포를 재현탁시키고, 1.5 mL 마이크로퓨즈 튜브에 옮기고, 4℃에서 30분 동안 회전시켜 혼합하였다. 이후 용해물을 14000xg에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 깨끗한 튜브에 옮겼다. 단밸질 농도를 비신콘산 (BCA) 단백질 검정법 (Pierce, Rockford, IL)으로 측정하였다.
인간 포스포-MAPK 항체 배열
생산자 (Fourth Revision, May 2006, R&D Systems antibody array ARY002)에 의해 기재된 프로토콜에 따라 인간 포스포-MAPK 항체 배열을 BxPC-3 세포 용해물에 대해 스크리닝하였다. 간략하게, 1.5 mL의 배열 완충액 1 (Part no. 895477: R&D Systems antibody array ARY002)에서 1시간 동안 진동 플랫폼 쉐이커에서 인큐베이션하여 각각의 인간 포스포-MAPK 프로파일러 막을 제조하였다. 각각의 처리에 대해, 150 마이크로그램의 총 단백질을 250 마이크로리터의 최종 부피가 수득되도록 용해 완충액으로 희석하고, 1.25 mL의 배열 완충액 1로 혼합하였다. 상기 혼합물을 제조된 프로파일러 막에 혼합하고, 진동 플랫폼 쉐이커에서 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이후 각각의 막을 1X 세척 완충액에서 3회 세척 (25X 저장액으로부터 정제 증류수에서 희석됨, (Part no. 895003: R&D Systems antibody array ARY002))하고, 1X 배열 완충액 2/3 (5X 배열 완충액 2, Part no. 895478: R&D Systems antibody array ARY002; 배열 완충액 3, Part no. 895008: R&D Systems antibody array ARY002)에서 제조된 1.5 mL의 항-포스포-MAPK 검출 항체 칵테일 (바이오티닐화 포스포-특이적 항체를 포함함) (Part no. 893051: R&D Systems antibody array ARY002)로 2시간 동안 인큐베이션하였다. 막을 1X 세척 완충액으로 3회 세척하고, 1X 배열 완충액 2/3에서 1:2000로 희석된 1.5 mL의 스트렙타비딘-HRP (Part no. 890803: R&D Systems antibody array ARY002)로 30분 동안 인큐베이션하였다. 막을 1X 세척 완충액으로 3회 세척하고, 현상을 위해 ECL 플러스 웨스턴 검출 시약 (GE Healthcare, Life Sciences, Piscataway, NJ)에 노출시켰다. 막을 화학발광 필름 (Kodak, Rochester, NY)에 노출시키고, X-선 의학 처리장치를 사용하여 현상하였다. 투과-방식 스캐너 상에서 필름을 스캔하고, Image J 분석 소프트웨어 (Image J 1.37v, NIH)를 사용하여 배열 영상 파일을 분석하여, 현상된 X-선 필름 상의 포스포-MAPK 배열 데이터를 정량하였다. 각각의 키나아제에 대해, 상응하는 이중의 반점에 대한 평균 픽셀 밀도를 계산하고 막 상의 깨끗한 영역의 픽셀 밀도를 사용하여 배경 신호에서 뺐다. 각각의 상응하는 포스포-단백질 표적에 대해, AR47A6.4.2-처리된 검체의 평균 정상화된 픽셀 밀도를 8A3B.6-처리된 검체의 평균 정상화된 픽셀 밀도로 나누어 상대적 변화의 비율을 수득하였다. 상대적 변화의 비율을 1에서 빼고 100을 곱하여 포스포-단백질 신호의 퍼센트 감소를 측정하였다.
AR47A6.4.2 또는 8A3B.6으로 인큐베이션한 포스포-MAPK 배열 막으로부터의 결과를 도 10에 나타내었다. 8A3B.6과 비교하여, AR47A6.4.2는 혈청 및 보충물로 자극된 BxPC-3 세포에서의 p42/p44 MAPK/세포외 신호-조절 키나아제 (ERK) (ERK1 (32퍼센트) 및 ERK2 (20퍼센트), Akt/ 단백질 키나아제 B (PKB) (Akt1/PKB알파 (15퍼센트), Akt2/PKB베타 (18퍼센트) 및 Akt3/PKB감마 (27퍼센트))의 인산화를 억제하였다. 이들 키나아제는 세포 증식, 성장 및 생존에 영향을 줄 수 있는 세포내 신호 통로에 포함된다. AR47A6.4.2가 혈청 및 보충물에 의한 자극 시 이들 키나아제의 인산화를 감소시킬 수 있다는 것은, AR47A6.4.2가 이들 키나아네 및 이의 관련된 세포내 신호 통로를 통해 암 세포의 세포 성장 및 생존을 막을 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 5
조건 배지의 TranSignalTM 혈관형성 항체 배열
AR47A6.4.2 처리가 혈관형성 인자의 분비에 영향을 줄 수 있는지 측정하기 위해, 혈관형성 배열 (MA6310, Panomics Inc., Redwood City, CA)을 사용하여 AR47A6.4.2로 처리된 세포로부터의 조건 배지를 스크리닝하였다.
세포의 처리 및 제조
S.N. 11/709,676에 개시된 바와 같이, 중증 복합형 면역결핍 (SCID) 마우스에서 성장한 BxPC-3 세포를 사용하여 췌장암 이종이식 모델에서 AR47A6.4.2의 생체내 효능을 나타내었다. 따라서, BxPC-3 세포주를 사용하여 혈관형성 인자의 분비에 대한 스크리닝을 수행하였다. BxPC-3 세포를 근합류로 성장시켜, 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 세척한 후 2 mL의 혈청-결핍 배지를 다시 공급하였다. AR47A6.4.2 (20 마이크로그램/mL) 또는 8A3B.6 (동형 대조군; IgG2a) (20 마이크로그램/mL)을 세포에 첨가하고, 4℃에서 20분 동안 결합시켰다. 세포를 24시간 동안 37℃에서 인큐베이터에 두었다. 24시간 후, 각각의 배양물로부터의 조건 배지를 수집하고, 분 당 1200 회전 (rpm)에서 5분 동안 원심분리하여 세포 또는 세포 잔해를 제거하였다.
TranSignalTM 혈관형성 항체 배열
생산자 (발표 10/07/03, 개정 08/03/05; MA6310, Panomics Inc., Redwood City, CA)에 의해 기재된 프로토콜에 따라 BxPC-3 세포 조건 배지로 TranSignalTM 혈관형성 항체 배열을 스크리닝하였다. 간락하게, 진동 플랫폼 쉐이커에서 실온에서 1시간 동안 3 mL의 1X 블러킹 완충액 (MA6310, Panomics Inc., Redwood City, CA)에서 인큐베이션하여 각각의 TranSignalTM 혈관형성 항체 배열 막을 제조 하였다. 이후 막을 4 mL의 1X 세척 완충액 II (20X 세척 완충액 II를, 증류수 (dH20)로 1X로 희석, MA6310, Panomics Inc., Redwood City, CA)로 2회 세척하였다. 세척 후, 수집된 전체 조건 배지 (2 mL)를 막에 첨가하고, 진동 플랫폼 쉐이커에서 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이후 막을 4 mL의 1X 세척 완충액 I (20X 세척 완충액을 dH20 중 1X로 희석, MA6310, Panomics Inc., Redwood City, CA)을 사용하여 3회 세척하였다. 이후 4 mL의 1X 세척 완충액 II (MA6310, Panomics Inc., Redwood City, CA)로 3회 세척하였다. 이후 막을 1.5 mL의 바이오틴-접합된 항-혈관형성 혼합물 (MA6310, Panomics Inc., Redwood City, CA)에서, 진동 플랫폼 쉐이커에서 1시간 동안 인큐베이션하여, 4 mL의 1X 세척 완충액 I (MA6310, Panomics Inc., Redwood City, CA )을 사용하여 3회 세척한 후, 4 mL의 1X 세척 완충액 II (MA6310, Panomics Inc., Redwood City, CA)로 3회 세척하였다. 스트렙파비딘-HRP (1X 세척 완충액 II 중에서 1:1000로 희석)를 막에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여, 4 mL의 1X 세척 완충액 I (MA6310, Panomics Inc., Redwood City, CA)을 사용하여 3회 다시 세척한 후 4 mL의 1X 세척 완충액 II (MA6310, Panomics Inc., Redwood City, CA)로 3회 세척하고, HyperfilmTM ECL 시약 (RPN3114K, GE Healthcare, Life Sciences, Piscataway, NJ)을 사용하여 현상하였다. 막을 화학 발광 필름 (Kodak, Rochester, NY)에 노출시키고, X-선 의학 처리장치를 사용하여 현상하였다. 투과 방식 스캐너 상에서 필름을 스캐닝하고 Image J 분석 소프트웨어 (Image J 1.37v, NIH)을 사용하여 배 열 영상 파일을 분석하여, 현상된 X-선 필름 상의 혈관형성 배열 데이터를 정량하였다. 각각의 분비된 인자에 대해, 상응하는 이중의 반점에 대한 평균 픽셀 밀도를 계산하고 막 상의 깨끗한 영역의 픽셀 밀도를 사용하여 배경 신호에서 뺐다. 각각의 상응하는 표적에 대해, AR47A6.4.2-처리된 검체의 평균 정상화된 픽셀 밀도를 8A3B.6-처리된 검체의 평균 정상화된 픽셀 밀도로 나누어 상대적 변화의 비율을 수득하였다. 상대적 변화의 비율을 1에서 빼고 100을 곱하여 신호의 퍼센트 감소를 측정하였다.
AR47A6.4.2 또는 8A3B.6으로 인큐베이션된 TranSignalTM 혈관형성 항체 배열 막으로부터의 결과를 도 11에 나타내었다. 8A3B.6과 비교하여, AR47A6.4.2는 강력한 혈관형성 인자 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 태반 성장 인자 (PLGF)의 분비를 억제하였다. 상기 관찰은, AR47A6.4.2로의 BxPC-3 췌장암 세포주의 처리가, 고체 종양에서 혈관 성장을 촉진하는 세포에 의한 인자의 분비를 감소시켜 암 세포의 생존 및 종양 성장의 억제를 야기할 수 있다는 것을 제안한다. 상기 발견은 AR47A6.4.2에 대한 활성의 가능한 메카니즘을 나타내었다.
실시예 6
항-TROP-2 항체 AR47A6.4.2의 시험관내 보체-의존성 세포독성 (CDC) 활성의 증명
쥐과 AR47A6.4.2의 치료적 효능은 인간 췌장암의 이종이식 종양 모델에서 이전에 증명되었다 (S.N. 11/709,676 및 상기 실시예 2에서 개시된 바와 같음). 이의 활성 메카니즘을 설명하기 위해, AR47A6.4.2는 두 췌장암 세포주, PL45 및 BxPC-3에서 CDC 활성에 대해 시험관내에서 평가되었다. PL45 및 BxPC-3 세포의 확립된 단층을, 플레이팅 후 2일에, 항체 (2, 0.2 및 0.02 마이크로그램/mL)로 처리하고, 1시간 동안 결합시켰다 (37℃; 4퍼센트 CO2). 이후 토끼 보체를 10퍼센트 (v/v)의 최종 농도가 수득되도록 첨가하고, 세포를 37℃, 4퍼센트 CO2에서 추가적인 3시간 동안 인큐베이션하였다. Cytotox 96TM 키트 (Promega Corporation, Madison, WI, USA)를 사용하여, 비타협 세포에서 존재하는 잔류 락테이트 데하이드로게나아제를 측정함으로써 CDC 활성을 평가하였다. 각각의 시험 항체를 삼중으로하여 평가하고, 하기의 등식을 사용하여, 토끼 보체만으로 처리된 웰과 비교하여, 퍼센트 세포독성으로서 결과를 표현하였다: 퍼센트 세포독성 = 100-[시험 항체(492 nm )-배경(492nm)]/보체 단독(492 nm ) - 배경(492 nm )]*100.
상기 실험으로부터의 결과 (도 12)는, 항-TROP-2 항체 AR47A6.4.2가 췌장암 표적 세포주 모두에서 (PL45 및 BxPC-3) 용량-의존성 방법으로 토끼 보체를 보충할 수 있었다는 것을 나타내었다. 최고 농도 (20 마이크로그램/mL)에서 동형-매치된 대조군으로 처리된 경우 CDC 활성은 이들 세포주에서 관찰되지 않았다. 상기 데이터는, AR47A6.4.2이 시험관내 보체 보충을 할 수 있으며, 상기 항체가 이의 효과를 생체내에서 발휘하는 메카니즘 중 하나일 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 7
에피토프 지도화
AR47A6.4.2에 의해 인지되는 TROP-2 분자의 부위(들)를 측정하기 위해 에피토프 지도화 실험을 실행하였다. 표준 Fmoc-화학을 사용하여 TROP-2의 아미노산 서열을 기준으로 중복되는 15-mer 펩티드를 합성하고, 트리플루오르산을 사용하여 스캐빈저로 탈보호하였다. 추가적으로, TROP-2 분자의 불연속 에피토프를 복원하기 위해, 골격 상 화학적으로 연결된 펩티드 (CLIPS) 기술을 사용하여 30-mer 이하로 이중 고리화된, 삼중-고리화되고 시트성인 펩티드를 화학 골격 상에서 합성하였다. 디시스테인을 포함하여 고리화된 펩티드를 합성하였는데, 이는 알파, 알파'-디브로목실렌으로 처리하여 환형화되었고, 다양한 간격에서 시스테인 잔기를 도입하여 루프의 크기가 다양하였다. 새로이 도입된 시스테인 옆의 다른 시스테인이 존재하는 경우, 이는 알라닌으로 대체되었다. 신용카드 형식의 폴리프로필렌 PEPSCAN 카드 (455개 펩티드 형식/카드)로 CLIPS 주형의 0.5 mM 용액 예컨대 암모늄 비카르보네이트 (20 mM, pH 7.9)/아세토니트릴 (1:1 (v/v)) 중 1,3-비스 (브로모메틸)벤젠과 반응시켜, 펩티드 중 다중 시스테인의 측쇄를 CLIPS 주형에 연결시켰다. 카드를 30분 내지 60분 동안 용액에서 부드럽게 진탕시키면서 용액 중에서 완전히 차폐하였다. 마지막으로, 카드를 과량의 H2O로 광범위하게 세척하고, PBS (pH 7.2) 중 1퍼센트 SDS/0.1퍼센트 베타-머캅토에탄올을 포함하는 분쇄-완충액에서 70℃에서 30분 동안 고주파 분해한 후, H2O에서 추가 45분 동안 고주파 분해하였다. 전체적으로, 3579개의 상이한 펩티드가 합성되었다. 각각의 펩티드에 대한 항체의 결합을 PEPSCAN-기재 ELISA에서 시험하였다. 공유 결합된 펩티드를 포함하는 455-웰 신용 카드 형식 폴리프로필렌 카드는 차단 용액 (PBS 중 5% 말-혈청 (v/v), 5% 오발부민 (w/v) 및 1% 트윈 80)에 희석된 10 마이크로그램/mL의 AR47A6.4.2로 이루어지는 제 1 항체 용액으로 하룻밤 동안 인큐베이션되었다. 1% 트윈 80을 포함하는 PBS로 세척한 후, 차단 용액 (PBS 중 5퍼센트 말-혈청 (v/v), 5퍼센트 오발부민 (w/v) 및 트윈 80) 중 토끼 항-마우스 항체 과산화효소의 1/1000 희석물로 1시간 동안 25℃에서 인큐베이션하였다. 1퍼센트 트윈 80을 포함하는 PBS로 세척한 후, 과산화효소 기질 2,2'-아지노-디-3-에틸벤즈티아졸린 설포네이트 (ABTS) 및 2 마이크로리터의 3퍼센트 H2O2를 첨가하였다. 1시간 후, 색 진전을 측정하였다. 전하 연결 장치 (CCD)-카메라 및 영상 처리장치 시스템을 갖는 0 내지 4000의 로그 눈금 상에서 색 진전을 졍량화하였다.
AR47A6.4.2가 가장 강하게 결합한 20개 펩티드 (3579개 중)를 도 13에 나타내었다. AR47A6.4.2가 결합한 펩티드의 조성을 분석하여 두 아미노산 호발부위를 확인하였다. 호발부위 아미노산 서열 LFRERYRLH (SEQ ID NO:11)는 펩티드 번호 1, 2, 7, 8, 12, 16, 17 및 18에 존재하였고, 호발부위 아미노산 서열 QVERTLIYY (SEQ ID NO:12)는 펩티드 번호 11 및 20에 존재하였다. 펩티드 3~6, 10, 14, 15 및 19는 TROP-2 분자의 세포내 부분 내에 있는 이들 펩티드의 서열로서 가장 에피토프와 유사한 것을 나타낼 수 있다. 전체 이들 결과는, AR47A6.4.2가 LFRERYRLH (SEQ ID NO:11) 및 QVERTLIYY (SEQ ID NO:12) 근처의 서열로 이루어지는 불연속 에피토프를 인지한다는 것을 나타낸다. 전체 TROP-2 분자 아미노 산 서열 내의 이들 아미노산 서열의 위치를 도 14에 나타낸다.
실시예 8
AR47A6.4.2의 인간화
당업계에 잘 공지되어 있는 방법, 및 적정한 것으로서 이들 방법에 사용되는 효소의 사용에 대한 공급자 지시사항을 이용하여 재조합 DNA 기술을 수행하였다. 상세한 실험 방법은 또한 하기에 기재된다.
mRNA는, 생산자의 지시사항에 따라 Poly A Tract System 1000 mRNA 추출 키트: (Promega Corp., Madison, WI)를 사용하여 하이브리도마 AR47A6.4.2 세포로부터 추출되었다. mRNA는 하기와 같이 역전사되었다: 카파 경쇄에 대해, 5.0 마이크로리터의 mRNA를 1.0 마이크로리터의 20 pmol/ 마이크로리터 MuIgGκVL-3' 프라이머 OL040 (도 15) 및 5.5 마이크로리터 무-뉴클레아제수 (Promega Corp., Madison, WI)와 혼합하였다. 람다 경쇄에 대해, 5.0 마이크로리터의 mRNA를 1.0 마이크로리터의 20 pmol/ 마이크로리터 MuIgGλVL-3' 프라이머 OL042 (도 15) 및 5.5 마이크로리터 무-뉴클레아제수 (Promega Corp., Madison, WI)와 혼합하였다. 감마 중쇄에 대해, 5 마이크로리터의 mRNA를 1.0 마이크로리터의 20 pmol/ 마이크로리터 MuIgGVH-3' 프라이머 OL023 (도 16) 및 5.5 마이크로리터 무-뉴클레아제수 (Promega Corp., Madison, WI)와 혼합하였다. 모든 세 반응 혼합물을 70℃에서 5분 동안으로 설정된 열 순환기의 예비-가열된 블럭에 두었다. 각각의 4.0 마이크로리터 ImPromII 5x 반응 완충액 (Promega Corp., Madison, WI), 0.5 마 이크로리터 RNasin 리보핵산 억제제 (Promega Corp., Madison, WI), 2.0 마이크로리터 25mM MgCl2 (Promega Corp., Madison, WI), 1.0 마이크로리터 10mM dNTP 혼합물 (Invitrogen, Paisley, UK) 및 1.0 마이크로리터 Improm II 역전사효소 (Promega Corp., Madison, WI)를 첨가하기 전, 이를 얼음에서 5분 동안 냉각시켰다. 42℃에서 1시간 동안으로 설정된 예비-가열된 PCR 블럭로 옮기기 전에, 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 이후, PCR 블럭에서 70℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 역전사효소를 열 불활성화시켰다.
중쇄 및 경쇄 서열을 cDNA로부터 하기와 같이 증폭시켰다: 37.5 마이크로리터 10x Hi-Fi 연장 PCR 완충액: (Roche, Mannheim, Germany), 7.5 마이크로리터 10mM dNTP 혼합물 (Invitrogen, Paisley, UK) 및 3.75 마이크로리터 Hi-Fi 연장 DNA 중합효소 (Roche, Mannheim, Germany)를 273.75 마이크로리터 무-뉴클레아제수에 첨가하여 PCR 마스터 혼합물을 제조하였다. 상기 마스터 혼합물을, 얼음 상 15개의 박막 PCR 반응 튜브에, 21.5 마이크로리터 일정부분으로 분주하였다. 이들 튜브 중 6개에, 2.5 마이크로리터의 MuIgVH-3' 역전사 반응 혼합물 및 1.0 마이크로리터의 중쇄 5' 프라이머 집단 HA 내지 HF (프라이머 서열 및 프라이머 집단 구성성분에 대해서는 도 16을 참조)를 첨가하였다. 또 다른 7개 튜브에, 2.5 마이크로리터의 MuIgKVL-3' 역전사 반응물 및 1.0 마이크로리터의 경쇄 5' 프라이머 집단 LA 내지 LG (도 15)를 첨가하였다. 마지막 튜브에, 2.5 마이크로리터의 MuIgKVL-3' 역전사 반응물 및 1.0 마이크로리터의 람다 경쇄 프라이머 MuIgλ VL5'-LI를 첨가하였다. 반응물을 열 순환기 블럭에 두고 95℃에서 2분 동안 가열하였다. 94℃에서 30초 동안의 40 사이클, 55℃에서 1분 동안, 및 72℃에서 30초 동안으로 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하였다. 마지막으로 PCR 생성물을 72℃에서 5분 동안 가열한 후, 4℃에 두었다.
pGEM-T 이지 벡터 시스템 I (Promega Corp., Madison, WI) 키트를 사용하여 증폭 생성물을 pGEM-T 이지 벡터에 클로닝하고 서열화하였다. 생성된 VH 및 VL 서열을 각각 도 17 및 18에 나타내었다.
키메라 항체의 생성을 위해, 프라이머 OL334 및 OL335 (도 19)를 사용하여 PCR로 VH 부위 유전자를 증폭하고; cDNA 클론 중 하나로부터의 플라스미드 DNA를 주형으로서 사용하여 5' MluI 및 3' HindIII 제한 효소 위치에서 제조되도록 이를 설계하였다. 0.5 mL PCR 튜브에 5 마이크로리터 10x Hi-Fi 연장 PCR 완충액: (Roche, Mannheim, Germany), 1.0 마이크로리터 10mM dNTP 혼합물 (Invitrogen, Paisley, UK), 0.5 마이크로리터의 프라이머 OL330, 0.5 마이크로리터의 프라이머 OL331, 1.0 마이크로리터 주형 DNA 및 0.5 마이크로리터 Hi-Fi 연장 DNA 중합효소 (Roche, Mannheim, Germany)를 41.5 마이크로리터 무-뉴클레아제수와 함께 첨가하였다.
올리고뉴클레오티드 OL336 및 OL337 (도 20)을 사용하여 BssHII 및 BamHI 제한 효소 위치에서 제조되도록 유사한 방법으로 VL 부위를 증폭하였다. 반응물을 열 순환기의 블럭에 두고 95℃에서 2분 동안 가열하였다. 94℃에서 30초 동안의 30 사이클, 55℃에서 1분 동안 및 72℃에서 30초 동안으로 중합효소 연쇄 반 응 (PCR)을 수행하였다. 마지막으로 PCR 생성물을 72℃에서 5분 동안 가열한 후, 4℃에서 두었다. 이후 VH 및 VL 부위 PCR 생성물을 각각 벡터 pANT15 및 pANT13에 (도 21) 각각 MluI/HindIII 및 BssHII/BamHI 위치에서 클로닝하였다. pANT15 및 pANT13 모두는 인간 Ig 발현 카세트를 포함하는 pAT153-기재 플라스미드이다. pANT15에서의 중쇄 카세트는 hCMVie 프로모터에 의해 조절되는 인간 게놈 IgG1 불변 부위와 함께, 하류 인간 IgG 폴리A 부위로 이루어진다. pANT15는 또한 SV40 프로모터에 의해 조절되는 햄스터 dhfr 유전자와 함께 하류 SV40 폴리A 부위를 포함한다. pANT13의 경쇄 카세트는 hCMVie 프로모터에 의해 조절되는 게놈 인간 카파 불변 부위와 함께 하류 경쇄 폴리A 부위로 이루어진다. 인간 Ig 리더 서열과 불변 부위 사이의 클로닝 위치는 가변 부위 유전자가 삽입되도록 한다.
NS0 세포 (ECACC 85110503, Porton, UK)를 전기천공을 통해 이들 두 플라스미드로 공동-트랜스펙션하고, DMEM (Invitrogen, Paisley, UK) + 5퍼센트 FBS (Ultra low IgG Cat No. 16250-078 Invitrogen, Paisley, UK) + 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen, Paisley, UK) + 100 nM 메토트랙세이트 (Sigma, Poole, UK)에서 선별하였다. 메토트랙세이트 저항성 콜로니를 단리하고, 생산자의 권장된 조건에 따라 1 mL HiTrap MabSelect SuRe 컬럼 (GE Healthcare, Amersham, UK)을 사용하여 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 항체를 정제하였다.
AR47A6.4.2 마우스 항체를 사용하여 ELISA-기재 경쟁 검정에서 키메라 항체를 시험하고, Biotintag 마이크로 바이오티닐화 키트 (Sigma, Poole, UK)를 사용하 여 바이오티닐화시켰다. 다양한 농도의 경쟁 항체의 존재 하에 OVCAR-3 세포를 결합시키도록 바이오티닐화된 마우스 AR47A6.4.2를 사용하였다. OVCAR-3 세포를 조직 배양물 처리된, 평평한 바닥의, 96 웰 플레이트에서 근합류로 배양한 후, 고정시켰다. 바이오티닐화된 마우스 AR47A6.4.2 항체를 1 마이크로그램/mL로 희석하고, 0~5 마이크로그램/mL 범위의 농도에서 동일 부피의 경쟁 항체와 혼합하였다. 100 마이크로리터의 항체 혼합물을 OVCAR-3 코팅된 플레이트의 웰에 옮기고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 스트렙파비딘-HRP 접합체 (Sigma, Poole, UK) (1:500으로 희석) 및 OPD 기질 (Sigma, Poole, UK)을 첨가하여 결합된 바이오티닐화된 마우스 AR47A6.4.2를 검출하였다. 3M HCl 첨가로 중단시키기 전, 5분 동안 암 환경에서 검정을 현상하였다. 이후 MRX TCII 플레이트 판독기 (Dynex Technologies, Worthing, UK)에서 흡광도 490nm에서 검정 플레이트를 판독하였다. 키메라 항체 ((ch)AR47A6.4.2)는, OVCAR-3 세포에 결합하기 위해 바이오티닐화된 AR47A6.4.2 항체와 경쟁하는데 있어서 마우스 AR47A6.4.2 항체와 동등한 것으로 나타났다.
인간화 VH 및 VL 서열은 마우스 AR47A6.4.2 서열 및 동종 인간 VH 및 VL 서열과 비교하여 설계되었다. VH 변이의 서열을 도 22에 나타내었고, VL 변이의 서열을 도 23에 나타내었다. 인간화 V 부위 유전자는, 동종 인간 VH 및 VL 서열로부터의 아미노산이 도입되도록 긴 중복 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR용 마우스 AR47A6.4.2 VH 및 VL 주형을 사용하여 구성되었다. 변이 인간화 VH 및 VL 서열의 생성에 사용된 올리고뉴클레오티드를 각각 도 19 및 20에 나타내었다. US2004260069 (Hellendoorn, Carr 및 Baker)에 상세히 나와있는 바와 같이, 변이 유전자를 발현 벡터 pSVgpt 및 pSVhyg에 직접적으로 클로닝하였다.
변이 인간화 중쇄 및 경쇄의 모든 조합물 (키메라 구성물을 포함)을 CHO-K1 세포 (ECACC 85051005, Porton, UK)에 일시적으로 트랜스펙션하고, 48시간 후 상청액을 채취하였다. 표준으로서 정제된 인간 IgG1/카파 (Sigma, Poole, UK)를 사용하여 IgG Fc/카파 ELISA에서 항체 발현에 대해 정량하였다. Immunosorb 96 웰 플레이트 (Nalge nunc, Hereford, UK)를 1X PBS (pH 7.4) 중 1:1500으로 희석된 마우스 항-인간 IgG Fc-특이적 항체 (I6260 Sigma, Poole, UK)로 37℃에서 1시간 동안 코팅하였다. 검체 및 표준 (2퍼센트 BSA/PBS에 희석된)을 첨가하기 전에 플레이트를 PBS + 0.05퍼센트 트윈 20에서 3회 세척하였다. 플레이트를 PBS/트윈에서 3회 세척하기 전에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 2퍼센트 BSA/PBS에서 1:1000 희석된 검출 항체 염소 항-인간 카파 경쇄 과산화효소 접합체 (A7164 Sigma, Poole, UK)를 100 마이크로리터/웰로 첨가하였다. 플레이트를 PBS/트윈으로 5회 세척하기 전에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. OPD 기질 (Sigma, Poole, UK)을 사용하여 결합한 항체를 검출하였다. 3M HCl의 첨가로 중단시키기 전에 5분 동안 암 환경에서 검정을 현상하였다. 이후 MRX TCII 플레이트 판독기 (Dynex Technologies, Worthing, UK)에서 490 nm에서 플레이트를 판독하였다.
인간화 변이의 결합을 상기 기재한 경쟁 결합 ELISA에서 검정하였다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트 상에 고정된 OVCAR-3에 대해 마우스 AR47A6.4.2와 결합 경쟁하는 정제된 키메라 항체 ((ch)AR47A6.4.2)의 다양한 농도 (156.25 ng/mL 내지 5 마이크로그램/mL)로 표준 곡선을 생성하였다. OVCAR-3 세포에 대한 마우스 AR47A6.4.2의 결합을 염소 항-마우스 IgG:HRP 접합체 (A2179 Sigma, Poole, UK)로 검출하고, TMB 기질 (Sigma, Poole, UK)을 사용하여 현상하였다. 키메라 표준 곡선을 사용하여, 시험한 농도에서 예측되는 억제율을 각각의 변이에 대해 계산하고, 실제로 관찰된 것과 비교하였다. 이후 각각의 다양한 중쇄/경쇄 조합물에 대한 예측된 억제로 시험 검체의 관찰된 억제를 나누어 결과를 정상화시켰다. 따라서 관찰/예측 비율 = 1.0인 검체는 키메라 항체와 동일한 결합 친화성을 갖는 반면, >1.0의 값을 갖는 검체는 TROP-2에 대해 감소된 결합을 가지며, <1.0의 비율을 갖는 검체는 TROP-2에 대한 개선된 결합을 갖는다. 결과를 도 24에 나타내었다.
VH 및 VL 유전자의 조합을 이중 벡터 pANT18 (pANT 18 벡터는 이전에 기재한 플라스미드 pANT15를 기준으로 하며, pANT13로부터의 경쇄 카세트가 SpeI/PciI 제한 효소 위치에 클로닝됨)에 클로닝하고, 전기천공으로 CHO/dhfr- 세포 (ECACC, 94060607)에 트랜스펙션하고, 배지 {L-글루타민 및 Na 피루베이트를 갖는 높은 글루코오스 DMEM (Invitrogen, Paisley UK) + 5퍼센트 투석된 FBS (Cat No. 26400-044 Invitrogen, Paisley, UK), 프롤린 (Sigma, Poole, UK) 및 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen, Paisley, UK) (하이포잔틴 및 티미딘이 고갈됨)}에서 선별하였다. 상기와 같은 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 항체를 정제하였다. 정제된 항체를 +4℃에서 보관 (pH 7.4 PBS에서)하기 전에 필터 멸균하였다. 항 체의 농도를 상기와 같이 인간 IgG1/카파 캡쳐 ELISA로 계산하였다.
정제된 항체 검체 중 네 개를, 상기와 같은 경쟁 ELISA를 통해 OVCAR-3 세포 발현 인간 TROP-2에 대한 결합을 시험하였다. 각각의 항체의 다양한 농도 (156 ng/mL 내지 5 마이크로그램/mL)를 정제된 마우스 AR47A6.4.2와 혼합하고, 고정된 OVCAR-3 세포로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 첨가하였다. 상기와 같이 염소 항-마우스 IgG (Fc):HRP 접합체로 마우스 AR47A6.4.2의 결합을 검출하였다. 450 nm에서의 흡광도를 플레이트 판독기에서 측정하고, 이를 시험 항체 농도에 대해 표시하여 곡선화하였다. OVCAR-3 세포에 대한 마우스 AR47A6.4.2 결합을 50퍼센트 (IC50)로 억제하는데 필요한 선택된 변이의 농도를 계산하고 키메라 항체와 비교하였다.
네 개의 변이 인간화 항체 및 키메라 항체에 대한 IC50은 하기와 같다:
(ch)AR47A6.4.2 = 1.71 마이크로그램/mL
(hu)AR47A6.4.2 변이 HV2/KV3 = 2.24 마이크로그램/mL
(hu)AR47A6.4.2 변이 HV2/KV4 = 3.04 마이크로그램/mL
(hu)AR47A6.4.2 변이 HV3/KV3 = 2.04 마이크로그램/mL
(hu)AR47A6.4.2 변이 HV3/KV4 = 1.02 마이크로그램/mL
실시예 9
rhTROP-2에 대한 AR47A6.4.2 및 (hu)AR47A.6.4.2의 결합 친화성의 측정
재조합 인간 TROP-2 (rhTrop-2)과의 결합 후 각각의 해리 상수 (KD)를 측정 하여 AR47A6.4.2, (hu)AR47A6.4.2 변이 HV2/KV3, (hu)AR47A6.4.2 변이 HV2/KV4, (hu)AR47A6.4.2 변이 HV3/KV3 및 (hu)AR47A6.4.2 변이 HV3/KV4의 결합 친화성을 비교하였다.
표준 아민 결합 절차를 사용하여 항-폴리히스티딘 단클론 항체 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 고정시켰다. 0.4M EDC 및 0.1M NHS (유속 10 마이크로리터/분)의 1:1 혼합물 104 마이크로리터를 주입하여 CM5 센서 칩 (GE Healthcare, Piscataway, NJ USA, 과거 Biacore)의 표면을 활성화시켰다. 항-폴리히스티딘 항체를 약 2000 RU에 도달하도록 20 마이크로그램/mL (pH 5.5 10 mM 나트륨 아세테이트에 희석)의 농도로 주입하였다. 마지막으로, 센서 칩 표면 상 임의 빈 활성화된 위치를 차단하기 위해 119 마이크로리터의 1.0M 에탄올아민-HCL (pH 8.5)을 표면에 걸쳐 주입하였다. HIS-표지된 rhTROP-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 1 마이크로그램/mL로 주입하고, 칩 표면 상의 HIS 표지로써 수집한 후, AR47A6.4.2, (hu)AR47A6.4.2 변이 HV2/KV3, (hu)AR47A6.4.2 변이 HV2/KV4, (hu)AR47A6.4.2 변이 HV3/KV3 또는 (hu)AR47A6.4.2 변이 HV3/KV4를 주입하였다. 10mM 글리신-HCl (pH 2.0)을 60초 동안 50 마이크로리터/분의 유속으로 주입하여, 후속 주입을 위해 센서 칩 표면을 재생시켰다. 영동 완충액 (HBS-EP+, GE Healthcare, Piscataway, NJ USA, 과거 Biacore)에서 항체를 희석하고, 0.67 내지 333 nM 범위의 농도에서 순차적으로 주입하고, 각각의 사이클 사이에 표면을 재생하였다. 대조군으로서, 각각의 항체 농도를 또한, 고정화된 항-폴리히스티딘 항체를 가지지만 표면상 rhTROP-2를 수집하지 못한 참고물 표면에 걸 쳐 주입하였다. Biacore T100 평가 소프트웨어 버전 1.1을 사용하여, 단순 1:1 반응 모델을 사용하여 수득한 센소그램에서 운동학 분석을 수행하였다. 측정된 결합 및 해리 속도 상수를 사용하여 항체의 KD를 계산하였다. Biacore T100 시스템 (GE Healthcare, Piscataway, NJ USA, 과거 Biacore)을 사용하여 실험을 수행하였다. 이들 실험의 결과로 쥐과 AR47A6.4.2에 대해 3.03 nM의 값이 수득된 반면 모든 네 (hu)AR47A6.4.2는 0.613 내지 0.697 nM 사이였는데 (도 25), 이는 모든 항체가 나노몰 내지 서브나노몰 범위에 있으며, 인간화 항체의 친화성이 모체 쥐과 AR47A6.4.2의 것보다 더 높다는 것을 나타낸다. 결합 속도 상수 (Ka) 및 해리 속도 상수 (Kd)를 또한 표로 만들었다 (도 25).
실시예 10
경쟁적 결합제의 단리
항체가 주어지면, 당업자들은 경쟁적으로 억제하는 CDMAB, 예를 들어 경쟁하는 항체를 생성할 수 있고, 이는 동일한 에피토프를 인지하는 것이다 (Belanger L 등, Clinica Chimica Acta 48:15-18 (1973)). 한 가지 방법은 항체에 의해 인지되는 항원을 발현하는 면역원으로 면역화를 일으키는 것이다. 상기 검체에는 조직, 단리된 단백질(들) 또는 세포주(들)가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 생성된 하이브리도마는 경쟁적 검정을 사용하여 스크리닝될 수 있는데, 이는 시험 항체의 결합을 억제하는 항체를 확인하는 것으로, 예컨대, ELISA, FACS 또는 웨스턴 블럿팅이 있다. 또 다른 방법은 파지 디스플레이 항체 라이브러리 및 상기 항원의 하나 이상의 에피토프를 인지하는 항체에 대한 패닝 (panning)을 이용할 수 있다 (Rubinstein JL 등, Anal Biochem 314:294-300 (2003)). 모든 경우에서, 항체는 본래 표지된 항체의 결합을 그의 표적 항원의 하나 이상의 에피토프로 치환하는 그의 능력을 기준으로 선택된다. 그러므로, 상기 항체는 본래 항체처럼 항원의 하나 이상의 에피토프를 인지하는 특징을 갖는다.
실시예 11
AR47A6.4.2 단클론 항체의 가변 부위의 클로닝
AR47A6.4.2 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 단클론 항체의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)로부터 가변 부위의 서열을 이미 측정하였다 (S.N. 11/709,676에 개시된 바와 같음). 키메라 및 인간화 IgG를 생성하기 위해, 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역을 적정한 발현용 벡터에 서브클로닝할 수 있다 (상기 실시예 8에 개시된 바와 같음).
다른 구현예에서, AR47A6.4.2 또는 그의 탈면역화된, 키메라 또는 인간화 버전을, 항체가 발현되고 회수될 수 있도록, 유전자도입 동물에서 항체를 인코딩하는 핵산을 발현시켜 생성하였다. 예를 들어, 상기 항체는 회수 및 정제를 촉진하는 조직 특이적 방법으로 발현될 수 있다. 상기 한 구현예에서, 본 발명의 항체는 수유하는 동안 분비를 위한 유선에서 발현되었다. 유전자도입 동물에는 마우스, 염소 및 토끼가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
(i) 단클론 항체
단클론 항체를 인코딩하는 DNA (S.N. 11/709,676에 개시된 바와 같음)는 통상의 과정을 사용하여 (예를 들어, 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 쉽게 단리 및 서열화된다. 상기 하이브리도마 세포는 상기 DNA에 대한 바람직한 공급원으로서 역할한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터에 위치시킬 수 있고, 그 다음 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예컨대 대장균 (E.coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포에 트랜스펙션시켜 재조합 숙주 세포에서 단클론 항체를 합성하였다. 예를 들어, 동종 쥐과 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 대한 코딩 서열로 대체하여, 상기 DNA를 또한 변형시킬 수 있다. 키메라 또는 하이브리드 항체는 또한 가교결합제를 수반하는 것을 포함하는, 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 디설피드 교환 반응을 사용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 구성될 수 있다. 상기 목적에 적절한 시약의 예에는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트가 포함된다.
(ii) 인간화 항체
인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그것으로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "이입 (import)" 잔기로 언급되며, 이는 통상적으로 "이입" 가변 영역으로부터 얻어진다. 인간화는 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 대체하여, Winter 및 그의 동료들의 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (Jones 등, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 등, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen 등, Science 239:1534-1536 (1988); Clark, Immunol. Today 21:397-402 (2000)에서 재고됨).
인간화 항체는 모체 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 모체 서열 및 다양한 개념의 인간화 생성물에 대한 분석 방법에 의해 생성될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델이 통상적으로 활용가능하고, 이는 당업자에게 익숙하다. 컴퓨터 프로그램이 활용가능하고, 이는 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형상학적 구조를 도시하고 표시한다. 이렇게 나타난 것을 검토하는 것은 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 상기 잔기의 유사한 역할에 대한 분석, 즉, 그의 항원에 결합하도록 상기 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기에 대한 분석을 허용한다. 상기 방법으로, 원하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성을 얻도록, 컨센서스 및 이입 서열로부터 FR 잔기를 선택 및 조합할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적이고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미치는 것에 연루되어 있다.
(iii) 항체 절편
항체 절편의 생성을 위해 다양한 기술이 개발되고 있다. 이러한 절편은 재조합 숙주 세포에 의해 생성될 수 있다 (Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11:548-557 (1999); Little 등, Immunol. Today 21:364-370 (2000)에서 재고됨). 예를 들어, Fab'-SH 절편을 대장균에서 직접 회수하여 화학적으로 커플링하여 F(ab')2 절편을 형성할 수 있다 (Carter 등, Biotechnology 10:163-167 (1992)). 다른 구 현예에서, F(ab')2 분자의 조립을 촉진하는 류신 지퍼 GCN4를 사용하여 F(ab')2 를 형성하였다. 다른 접근법에 따르면, Fv, Fab 또는 F(ab')2 절편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다.
실시예 12
본 발명의 항체를 포함하는 조성물
본 발명의 항체를 암의 예방/치료를 위한 조성물로 사용할 수 있다. 본 발명의 항체를 포함하는, 암의 예방/치료를 위한 조성물은 액체 제제의 형태로, 또는 적절한 제제의 약학 조성물로서 인간 또는 포유류 (예를 들어 랫트, 토끼, 양, 돼지, 소과, 고양이과, 개과, 원숭이 등)에 경구적으로 또는 비경구적 (예를 들어 혈관 내, 복강 내, 피하 등)으로 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 그 자체로 투여될 수 있거나 적정한 조성물로서 투여될 수 있다. 상기 투여에 사용되는 조성물은 본 발명의 항체 또는 이의 염을 갖는 약리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 경구 또는 비경구 투여에 적절한 약학 제제의 형태로 제공된다.
비경구 투여를 위한 조성물의 예는 주사제, 좌제 등이다. 주사제는 정맥 내, 피하, 피부 내 및 근육 내 주사, 점적 주입, 관절 내 주사 등과 같은 투여 형태를 포함할 수 있다. 이들 주사제는 공지된 방법들에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어 주사제는, 본 발명의 항체 또는 이의 염을 주사액으로 통상적으로 사용되는 멸균 수성 매질 또는 유성 매질 중에 용해, 현탁 또는 유화시켜 제조될 수 있다. 주사용 수성 매질로서 예를 들어, 생리 식염수, 포도당 및 기타 보조제를 포함하는 등장액 등이 있는데, 이는 알코올 (예를 들어 에탄올), 다가알코올 (예를 들어 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온 계면활성제 (예를 들어 폴리소르베이트 80, HCO-50 (수소화된 피마자유의 폴리옥시에틸렌 (50 몰) 부가물)) 등과 같은 적정한 가용화제와 조합으로 사용될 수 있다. 유성 매질로서, 예를 들어 참깨유, 대두유 등을 이용하며, 이는 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 같은 가용화제와 조합으로 사용될 수 있다. 이렇게 제조된 주사액은 통상적으로 적정한 앰플에 채워진다. 직장 투여에 사용되는 좌제는 본 발명의 항체 또는 이의 염을 통상의 좌제용 기재와 배합하여 제조될 수 있다. 경구 투여용 조성물은 고체 또는 액체 제제를 포함하며, 상세하게는 정제 (당의정 (dragee) 및 필름 코팅된 정제를 포함), 알약, 과립, 분말 제제, 캡슐 (연질 캡슐 포함), 시럽, 유화제, 현탁액 등을 포함한다. 이러한 조성물은 공지된 방법에 의해 제조되며, 약학 제제 분야에서 통상적으로 사용되는 비히클 (vehicle), 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 정제용 비히클 또는 부형제의 예는 락토오스, 전분, 수크로오스, 마그네슘 스테아레이트 등이다.
유리하게는, 상기 기재된 경구 또는 비경구적 사용을 위한 조성물은 상기 활성 성분의 용량에 맞춰진 적절한 단위 용량을 갖는 약학 제제로 제조된다. 상기 단위 용량 제제에는 예를 들어, 정제, 알약, 캡슐, 주사액 (앰플), 좌제 등이 포함된다. 상기 화합물의 포함량은 일반적으로 투약 단위 형태 당 5 내지 500 mg이며; 상기 기재된 항체가 특별히 주사 형태로는 약 5 내지 약 100 mg, 및 기타 형태로는 10 내지 250 mg으로 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 항체를 포함하는 상기 예방/치료제 또는 조절자의 용량은 투여받는 대상, 표적 질환, 상태, 투여 경로 등에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 성인에서의 유방암을 치료/예방하기 위한 목적으로 사용되는 경우, 본 발명의 항체를 체중 1 kg 당 약 0.01 내지 약 20 mg, 바람직하게는 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 약 10 mg 및 보다 바람직하게는 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 약 5 mg의 용량으로, 1일 약 1 내지 5회, 바람직하게는 1일 약 1 내지 3회 정맥 내 투여하는 것이 유리하다. 기타 비경구 및 경구 투여에서는, 상기 제제를 상기 제시된 용량에 상응하는 용량으로 투여할 수 있다. 상태가 특별히 중증인 경우, 상태에 따라 상기 용량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 항체는 그대로 또는 적정한 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 상기 투여에 사용되는 조성물은 상기 항체 또는 이의 염을 갖는 약리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여 (예를 들어 혈관 내 주사, 피하 주사 등)에 적절한 약학 제제의 형태로 제공된다. 상기 기재된 각 조성물은 다른 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 다른 약물, 예를 들어 알킬화제 (예를 들어 시클로포스파미드, 이포스파미드 등), 대사 길항제 (예를 들어 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 등), 항-종양 항생제 (예를 들어 미토마이신, 아드리아마이신 등), 식물 유래 항-종양제 (예를 들어 빈크리스틴, 빈데신, 택솔 (Taxol) 등), 시스플라틴, 카르보플라틴, 에토포시드, 이리노테칸 등과 조합으로 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 및 상기 기재된 약물은 환자에 동시에 또는 시차를 두고 투여될 수 있다.
본원에 기재된, 특히 암에 대한 치료 방법은 또한 다른 항체 또는 화학요법제의 투여로 실행될 수 있다. 예를 들어, EGFR에 대한 항체, 예컨대 ERBITUX
Figure 112009073290341-PCT00036
(cetuximab)는 또한 특히 결장암을 치료하는 경우 투여될 수 있다. ERBITUX
Figure 112009073290341-PCT00037
는 또한 건선의 치료에 효과적인 것으로 나타났다. 조합으로 사용되는 다른 항체는 특히 유방암을 치료하는 경우 Herceptin
Figure 112009073290341-PCT00038
(trastuzumab), 특히 결장암을 치료하는 경우 AVASTIN
Figure 112009073290341-PCT00039
, 및 특히 비-소세포 폐암을 치료하는 경우 SGN-15를 포함한다. 다른 항체/화학요법제와 함께 본 발명의 항체를 투여하는 것은 동일하거나 상이한 경로를 통해, 동시에 또는 순차적으로 일어날 수 있다.
사용되는 화학요법제/다른 항체 치료법은 환자의 상태를 치료하기 위해 최적화된 것으로 여겨지는 임의의 치료법을 포함한다. 상이한 악성종양은 특이적 항-종양 항체 및 특이적 화학요법제의 사용을 필요로 할 수 있으며, 이는 환자 기준으로 환자에 대해 결정될 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 화학요법은 동시에 또는 보다 바람직하게는 항체 치료 후에 투여된다. 그러나, 본 발명이 임의의 특정 방법 또는 투여 경로에만 제한되는 것은 아니라는 것을 강조해야만 한다.
우세한 증거는 AR47A6.4.2가 TROP-2 상에 존재하는 에피토프의 결찰을 통해 항-암 효과를 매개하고 생존을 연장시킨다는 것을 나타낸다. AR47A6.4.2 항체 를 세포, 예컨대 MDA-MB-231 세포를 발현하여 동족 항원을 면역침전하는데 사용할 수 있다는 것이 S.N. 11/709,676 에 개시된 바와 같이 이미 나타났다. 또한, FACS, 세포 ELISA 또는 IHC에 의해 예시되나 이에 제한되지는 않는 기술을 사용하여, AR47A6.4.2, 키메라 AR47A6.4.2 ((ch)AR47A6.4.2) 또는 인간화 변이, (hu)AR47A6.4.2를, 특이적으로 그에 결합하는 TROP-2 항원성 부분을 발현하는 세포 및/또는 조직의 검출에 사용할 수 있다는 것을 나타낼 수 있다.
AR47A6.4.2 항체와 함께, 다른 항-TROP-2 항체를 사용하여 다른 형태의 TROP-2 항원을 면역침전 및 단리시킬 수 있고, 항원을 또한 사용하여 동일 유형의 검정법을 사용하여 항원을 발현하는 세포 또는 조직에 대한 상기 항체의 결합을 억제할 수 있다.
SEQ ID NO
Figure 112009073290341-PCT00040
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공개물은 본 발명이 속한 업계의 숙련된 자들의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공개물은, 각 개별 공개물이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지적되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 특정 형태가 설명되지만, 본 발명을 본원에 기술된 및 나타낸 부 분들의 특정 형태 또는 배열로 제한시키고자 하는 것은 아님이 이해되어야 한다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경이 가해질 수 있으며, 본 발명이 본 명세서에 나타내고 기술된 것에 제한되는 것으로 간주되어서는 안된다는 것은 당업자들에 자명할 것이다. 당업자는 본 발명이 상기 목표를 수행하고 언급된 목적 및 이점, 뿐만 아니라 그에 내재된 목적 및 이점을 달성하기에 충분히 적합하게 되어있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 본원에 기재된 임의의 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 생물학적으로 관련된 화합물, 방법, 절차 및 기술은 현재 바람직한 구현예를 대표하며, 예시적인 것으로 의도된 것이고, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도한 것이 아니다. 본 발명의 취지에 포함되며 첨부된 청구항의 범위로 정의되는 상기에서의 변경 및 기타 용도가 당업자들에게 발생할 것이다. 본 발명을 특정 바람직한 구현예와 관련하여 기술하였지만, 청구된 본 발명을 이러한 특정 구현예로 과도하게 제한해서는 안 된다는 것을 이해하여야 한다. 사실상, 본 발명을 실행하기 위해 기술된 양식에 대한, 당업자들에 자명한 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
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Figure 112009073290341-PCT00042
<110> YOUNG, DAVID S. F. FINDLAY, HELEN P. HAHN, SUSAN E. DACRUZ, LUIS A. G. FERRY, ALISON L. <120> CYTOTOXICITY MEDIATION OF CELLS EVIDENCING SURFACE EXPRESSION OF TROP-2 <130> 2056.092 <140> 11/807,837 <141> 2007-05-30 <150> 11/709,676 <151> 2007-02-22 <150> 60/776,466 <151> 2006-02-24 <160> 117 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala Val Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> 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Sequence: Synthetic primer <400> 41 atggaagccc cagctcagct tctcttcc 28 <210> 42 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (6) <223> Inosine <220> <221> modified_base <222> (12) <223> Inosine <220> <221> modified_base <222> (18) <223> Inosine <400> 42 atgagnmmkt cnmttcantt cytggg 26 <210> 43 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (12) <223> Inosine <220> <221> modified_base <222> (24) <223> Inosine <400> 43 atgakgthcy cngctcagyt yctnrg 26 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 44 atggtrtccw casctcagtt ccttg 25 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 45 atgtatatat gtttgttgtc tatttct 27 <210> 46 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 46 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgct 29 <210> 47 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 47 atggatttwc argtgcagat twtcagctt 29 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 48 atggtyctya tvtccttgct gttctgg 27 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 49 atggtyctya tvttrctgct gctatgg 27 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 50 actggatggt gggaagatgg a 21 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 51 atggcctgga ytycwctywt mytct 25 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (15) <223> Inosine <400> 52 agctcytcwg wgganggygg raa 23 <210> 53 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 53 atgrasttsk ggytmarctk grttt 25 <210> 54 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 54 atgraatgsa sctgggtywt yctctt 26 <210> 55 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 55 atggactcca ggctcaattt agttttcct 29 <210> 56 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 56 atggctgtcy trgbgctgyt cytctg 26 <210> 57 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 57 atggvttggs tgtggamctt gcyattcct 29 <210> 58 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 58 atgaaatgca gctggrtyat sttctt 26 <210> 59 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 59 atggrcagrc ttacwtyytc attcct 26 <210> 60 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 60 atgatggtgt taagtcttct gtacct 26 <210> 61 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 61 atgggatgga gctrtatcat sytctt 26 <210> 62 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 62 atgaagwtgt ggbtraactg grt 23 <210> 63 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (15) <223> Inosine <400> 63 atggratgga sckknrtctt tmtct 25 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 64 atgaacttyg ggytsagmtt grttt 25 <210> 65 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 65 atgtacttgg gactgagctg tgtat 25 <210> 66 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 66 atgagagtgc tgattctttt gtg 23 <210> 67 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 67 atggattttg ggctgatttt ttttattg 28 <210> 68 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (21) <223> Inosine <400> 68 ccagggrcca rkggatarac ngrtgg 26 <210> 69 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 69 cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag 48 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc aca aac tat 96 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 gga atg aac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg 144 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 ggc tgg ata aac acc aaa act gga gag cca aca tat gct gaa gag ttc 192 Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc tat 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ttg cag atc aac aac ctc aaa aaa gag gac acg gct aca tat ttc tgt 288 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Lys Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 gga aga ggg ggc tac ggt agt agc tac tgg tac ttc gat gtc tgg ggc 336 Gly Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 363 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 70 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 70 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Lys Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 71 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 71 gac atc cag atg act cag tct cca gcc tcc cta tct gca tct gtg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gaa act gtc acc atc aca tgt cga gca agt gag aat att tac agt tat 96 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 tta gca tgg tat cag cag aaa cag gga aaa tct cct cag ctc ctg gtc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 tat aat gca aaa acc tta gca gaa ggt gtg cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tca ggc aca cag ttt tct ctg aag atc aac agc ctg cgg cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Arg Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt ggg agt tat tac tgt caa cat cat tat ggt tct ccg ctc 288 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Leu 85 90 95 acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aga 321 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg 100 105 <210> 72 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 72 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Arg Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg 100 105 <210> 73 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 73 gatcacgcgt gtccactccc agatccagtt ggtgcagtc 39 <210> 74 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 74 gtacaagctt acctgaggag acggtgaccg tgg 33 <210> 75 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 75 gatcacgcgt gtccactccc agatccagtt ggtgcagtct ggacctgagc tgaa 54 <210> 76 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 76 cagtctggac ctgagctgaa gaagcctgga gcgtcagtca aggtctcctg caa 53 <210> 77 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Synthetic oligonucleotide <400> 82 gatcacgcgt gtccactccc agatccagtt ggtgcagtct ggacatgagg tgaagaagcc 60 60 <210> 83 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 aatacatagc catgtcctct gc 22 <210> 84 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 gcagaggaca tggctatgta tt 22 <210> 85 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 agaggacatg gctatgtatt actgtggaag a 31 <210> 86 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 ctggcagagg tgtccaaaga ga 22 <210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 87 tctctttgga cacctctgcc ag 22 <210> 88 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 88 gatcacgcgt gtccactccc aggtccagtt ggtg 34 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 89 gaggtgtcca tagagaagac a 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 90 tgtcttctct atggacacct c 21 <210> 91 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 91 agccccctct tgcacagtaa ta 22 <210> 92 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 92 tattactgtg caagaggggg ct 22 <210> 93 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 93 catggcgcgc gatgtgacat tgtgatgacc cagtc 35 <210> 94 <211> 63 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 99 gtcttcagcc tgcagagaac tgatggtg 28 <210> 100 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 100 gttctctgca ggctgaagac atcgcagttt att 33 <210> 101 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 gatcggatcc aactgaggaa gcaaagttta aattctactc acgtttaatc tccaccttgg 60 tcccaccacc gaacg 75 <210> 102 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 gatcgcgcgc gatgtgacat tgtgatgacc cagtctccct catccctgtc cgca 54 <210> 103 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 cgatgtcttc aggctgcaga gaac 24 <210> 104 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 gttctctgca gcctgaagac atcg 24 <210> 105 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 gatcgcgcgc gatgtgacat tcagatgacc cagt 34 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 tccactgcca ctgaagcgat c 21 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 107 gatcgcttca gtggcagtgg a 21 <210> 108 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 cactgaagcg actagggact cca 23 <210> 109 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 tggagtccct agtcgcttca gtg 23 <210> 110 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 tctgcagcct gaagacatcg caacttatta ctgtc 35 <210> 111 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 111 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly His Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Met Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 112 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 112 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly His Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Met Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 113 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 113 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly His Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Met Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 114 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 114 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Met Ala Met Tyr Phe Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 115 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 115 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 116 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 116 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 117 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 117 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (60)

  1. 포유류에서 인간 췌장, 유방, 전립선, 난소 또는 결장 종양을 감소시키는 방법으로서, 이 때 상기 인간 췌장, 유방, 전립선, 난소 또는 결장 종양은 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는 것이고, 상기 CDMAB는 단리된 단클론 항체의 이의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력에 의해 특징지어지고, 상기 단클론 항체 또는 이의 CDMAB를 상기 포유류의 췌장, 유방, 전립선, 난소 또는 결장 종양 존재량을 감소시키기에 효과적인 양으로 상기 포유류에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 세포독성 부분에 접합되는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 보체를 활성화시키는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 인간화 항체, 또는 상기 인간화 항체로부터 생성된 항원 결합 절편인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 키메라 항체, 또는 상기 키메라 항체로부터 생성된 항원 결합 절편인 방법.
  8. 포유류에서 항체 유도된 세포독성에 취약한 인간 췌장, 유방, 전립선, 난소 또는 결장 종양을 감소시키는 방법으로서, 이 때 상기 인간 췌장, 유방, 전립선, 난소 또는 결장 종양은 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는 것이고, 상기 CDMAB는 단리된 단클론 항체의 이의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력에 의해 특징지어지고, 상기 단클론 항체 또는 이의 CDMAB를 상기 포유류의 췌장, 유방, 전립선, 난소 또는 결장 종양 존재량을 감소시키기에 효과적인 양으로 상기 포유류에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 세포독성 부분에 접합되는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 보체를 활성화시키는 방법.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 방법.
  13. 제 8 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 인간화 항체, 또는 상기 인간화 항체로부터 생성된 항원 결합 절편인 방법.
  14. 제 8 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 키메라 항체, 또는 상기 키메라 항체로부터 생성된 항원 결합 절편인 방법.
  15. 포유류에서 인간 췌장, 유방, 전립선, 난소 또는 결장 종양을 감소시키는 방 법으로서, 이 때 상기 인간 췌장, 유방, 전립선, 난소 또는 결장 종양은 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는 것이고, 상기 CDMAB는 단리된 단클론 항체의 이의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력에 의해 특징지어지고, 상기 단클론 항체 또는 이의 CDMAB를 하나 이상의 화학요법제와 함께 상기 포유류의 췌장, 유방, 전립선, 난소 또는 결장 종양 존재량을 감소시키기에 효과적인 양으로 상기 포유류에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 세포독성 부분에 접합되는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  18. 제 15 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 보체를 활성화시키는 방법.
  19. 제 15 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 방법.
  20. 제 15 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 인간화 항체, 또는 상기 인간화 항체로부터 생성된 항원 결합 절편인 방법.
  21. 제 15 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 키메라 항체, 또는 상기 키메라 항체로부터 생성된 항원 결합 절편인 방법.
  22. 인간 유방, 췌장, 난소, 전립선 또는 결장 종양 존재량을 감소시키기 위한 단클론 항체의 용도로서, 이 때 상기 인간 유방, 췌장, 난소, 전립선 또는 결장 종양은 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는 것이고, 상기 CDMAB는 단리된 단클론 항체의 이의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력에 의해 특징지어지고, 상기 단클론 항체 또는 이의 CDMAB를 상기 포유류의 인간 유방, 췌장, 난소, 전립선 또는 결장 종양 존재량을 감소시키기에 효과적인 양으로 상기 포유류에게 투여하는 것을 포함하는 용도.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 세포독성 부분에 접합되는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  25. 제 22 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 보체를 활성화시키는 방법.
  26. 제 22 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 방법.
  27. 제 22 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 인간화 항체인 방법.
  28. 제 22 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 키메라 항체인 방법.
  29. 인간 유방, 췌장, 난소, 전립선 또는 결장 종양 존재량을 감소시키기 위한 단클론 항체의 용도로서, 이 때 상기 인간 유방, 췌장, 난소, 전립선 또는 결장 종양은 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는 것이고, 상기 CDMAB는 단리된 단클론 항체의 이의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력에 의해 특징지어지고, 상기 단클론 항체 또는 이의 CDMAB를 하나 이상의 화학요법제와 함께 상기 포유류의 인간 유방, 췌장, 난소, 전립선 또는 결장 종양 존재량을 감소시키기에 효과적인 양으로 상기 포유류에 투여하는 것을 포함하는 용도.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 세포독성 부분에 접합되는 방법.
  31. 제 3O 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  32. 제 29 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 보체를 활성화시키는 방법.
  33. 제 29 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 방법.
  34. 제 29 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 인간화 항체인 방법.
  35. 제 29 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 키메라 항체인 방법.
  36. IDAC 등록번호가 141205-05인 하이브리도마 세포주 AR47A6.4.2에 의해 생성된 단리된 단클론 항체에 의해 특이적으로 결합되는 인간 TROP-2 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는 인간 유방, 췌장, 난소, 전립선 또는 결장 종양을 감소시키는 방법으로서, IDAC 등록번호가 141205-05인 하이브리도마 세포주 AR47A6.4.2에 의해 생성된 단리된 단클론 항체에 의해 결합된 것들과 동일한 에피토프(들)에 결합하는 하나 이상의 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB를 상기 인간 종양을 겪는 개인에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 에피토프(들)의 결합에 의해 유방, 췌장, 난소, 전립선 또는 결장 종양 존재량이 감소되는 방법.
  37. IDAC 등록번호가 141205-05인 하이브리도마 세포주 AR47A6.4.2에 의해 생성된 단리된 단클론 항체에 의해 특이적으로 결합된 인간 TROP-2 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는 인간 유방, 췌장, 난소, 전립선 또는 결장 종양을 감소시키는 방법으로서, IDAC 등록번호가 141205-05인 하이브리도마 세포주 AR47A6.4.2에 의해 생성된 단리된 단클론 항체에 의해 결합된 것과 동일한 에피토프(들)에 결합하는 하나 이상의 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB를 하나 이상의 화학요법제와 함께 상기 인간 종양을 겪는 개인에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 투여에 의해 종양 존재량이 감소되는 방법.
  38. IDAC 등록번호가 141205-05인 하이브리도마 세포주 AR47A6.4.2에 의해 생성 된 단리된 단클론 항체, IDAC에 등록번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 인간화 항체 또는 IDAC에 등록번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 키메라 항체에 의해 특이적으로 결합되는 인간 종양으로부터 선택된 조직 검체에서 암성 세포의 존재를 측정하는 결합 검정법으로서, 하기 단계를 포함하는 검정법:
    상기 인간 종양으로부터 조직 검체를 제공하는 단계;
    상기 단리된 단클론 항체, 상기 인간화 항체, 상기 키메라 항체 또는 IDAC 등록번호가 141205-05인 하이브리도마 세포주 AR47A6.4.2에 의해 생성된 단리된 단클론 항체에 의해 인지되는 것과 동일한 에피토프(들)를 인지하는 이의 CDMAB 중 하나 이상을 제공하는 단계;
    하나 이상의 상기 제공된 항체 또는 이의 CDMAB를 상기 조직 검체와 접촉시키는 단계; 및
    하나 이상의 상기 제공된 항체 또는 이의 CDMAB와 상기 조직 검체와의 결합을 측정하는 단계;
    이로써 상기 조직 검체에서의 상기 암성 세포의 존재를 표시함.
  39. IDAC 등록번호가 141205-05인 하이브리도마 세포주 AR47A6.4.2에 의해 생성된 단리된 단클론 항체, IDAC에 등록번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 인간화 항체 또는 IDAC에 등록번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 키메라 항체에 의해 특이적 으로 인지되는 TROP-2를 발현하는 세포의 존재를 측정하는 결합 검정법으로서, 하기 단계를 포함하는 검정법:
    세포 검체를 제공하는 단계;
    IDAC 등록번호가 141205-05인 하이브리도마 세포주 AR47A6.4.2에 의해 생성된 단리된 단클론 항체, 상기 인간화 항체, 상기 키메라 항체 또는 이의 CDMAB를 제공하는 단계;
    상기 단리된 단클론 항체 또는 상기 항원 결합 절편을 상기 세포 검체와 접촉시키는 단계; 및
    상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB와 상기 세포 검체와의 결합을 측정하는 단계;
    이로써 상기 단리된 단클론 항체 또는 상기 이의 CDMAB에 의해 특이적으로 결합되는 TROP-2의 항원을 발현하는 세포의 존재가 측정됨.
  40. 세포 표면 상에 TROP-2의 하나 이상의 에피토프를 발현하며, 하나 이상의 에피토프가, IDAC에 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체 또는 상기 단리된 단클론 항체로부터 생성된 항원 결합 절편에 의해 결합되는 경우 세포독성을 야기하는, 암성 세포의 보체 의존성 세포독성을 유도하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    IDAC에 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체 또는 상기 단리된 단클론 항체로부터 생성된 항원 결합 절편을 제공하는 단계, 및
    상기 암성 세포와 상기 단리된 단클론 항체 또는 상기 항원 결합 절편을 접촉시키는 단계;
    이로써 상기 단리된 단클론 항체 또는 상기 항원 결합 절편과 상기 TROP-2의 하나 이상의 에피토프와의 결합의 결과로서 세포독성이 생김.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 세포독성 부분에 접합되는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  43. 제 40 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 보체를 활성화시키는 방법.
  44. 제 40 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 세포독성을 매개하는 방법.
  45. 제 40 항에 있어서, 상기 단클론 항체가 IDAC에 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 인간화 항체 또는 상기 인간화 항체로부터 생성된 항원 결합 절편인 방법.
  46. 제 40 항에 있어서, 상기 단클론 항체가 IDAC에 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 키메라 항체 또는 상기 키메라 항체로 부터 생성된 항원 결합 절편인 방법.
  47. 세포 표면 상 TROP-2의 하나 이상의 에피토프를 발현하며, 하나 이상의 에피토프가, IDAC에 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체 또는 상기 단리된 단클론 항체로부터 생성된 항원 결합 절편에 의해 결합되는 경우 세포 독성을 야기하는, 암성 세포의 보체 의존성 세포독성을 유도하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    IDAC에 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의, 또는 상기 단리된 단클론 항체로부터 생성된 항원 결합 절편의 결합을 경쟁적으로 억제하고, 상기 TROP-2의 하나 이상의 에피토프에 의해 결합되는 경우 세포독성을 야기하는 단리된 단클론 항체를 제공하는 단계; 및
    상기 암성 세포를 상기 단리된 단클론 항체 또는 상기 항원 결합 절편과 접촉시키는 단계;
    이로써 상기 단리된 단클론 항체 또는 상기 항원 결합 절편과 상기 TROP-2의 하나 이상의 에피토프와의 결합의 결과로서 세포독성이 생김.
  48. IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체와 동일한 에피토프(들)에 특이적으로 결합하는 단클론 항체.
  49. 인간 TROP-2에 특이적으로 결합하는 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB로 서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가, IDAC 등록번호가 141205-05인 하이브리도마 세포주 AR47A6.4.2에 의해 생성된 단리된 단클론 항체와 동일한 인간 TROP-2의 에피토프(들)와 반응하며; 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB는 상기 단리된 단클론 항체의 이의 표적 인간 TROP-2 항원에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력에 의해 특징지어지는, 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB.
  50. IDAC 등록번호가 141205-05인 하이브리도마 세포주 AR47A6.4.2에 의해 생성된 단리된 단클론 항체에 의해 인지되는 것과 동일한 에피토프(들)를 인지하는 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB로서, 상기 단클론 항체 또는 이의 CDMAB는 상기 단리된 단클론 항체의 이의 표적 에피토프(들)에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력에 의해 특징지어지는, 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB.
  51. IDAC 등록번호가 141205-05인 하이브리도마 세포주 AR47A6.4.2에 의해 생성된 단리된 단클론 항체와 동일한 인간 TROP-2의 에피토프(들)에 특이적으로 결합하는, 하기를 포함하는 인간화 항체 또는 이의 인간 TROP-2 결합 절편:
    SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3의 상보성 결정 부위 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위; 및
    SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:6의 상보성 결정 부위 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위.
  52. IDAC 등록번호가 141205-05인 하이브리도마 세포주 AR47A6.4.2에 의해 생성된 단리된 단클론 항체와 동일한 인간 TROP-2의 에피토프(들)에 특이적으로 결합하는, 하기를 포함하는 인간화 항체 또는 이의 인간 TROP-2 결합 절편:
    SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3의 상보성 결정 부위 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위; 및
    SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:6의 상보성 결정 부위 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위; 및
    인간 항체 또는 인간 항체 컨센서스 골격의 중쇄 및 경쇄로부터의 가변 영역 골격 부위.
  53. 상기 단클론 항체가 SEQ ID NO:7의 중쇄 가변 부위 아미노산 서열; 및 SEQ ID NO:8에서 선택된 경쇄 가변 부위 아미노산 서열을 포함하는, 인간 TROP-2에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 인간 TROP-2 결합 절편.
  54. 상기 단클론 항체가 SEQ ID NO:7의 중쇄 가변 부위 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:9에서 선택된 경쇄 가변 부위 아미노산 서열을 포함하는, 인간 TROP-2에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 인간 TROP-2 결합 절편.
  55. 상기 단클론 항체가 SEQ ID NO:10의 중쇄 가변 부위 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:8에서 선택된 경쇄 가변 부위 아미노산 서열을 포함하는, 인간 TROP-2에 특 이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 인간 TROP-2 결합 절편.
  56. 상기 단클론 항체가 SEQ ID NO:10의 중쇄 가변 부위 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:9에서 선택된 경쇄 가변 부위 아미노산 서열을 포함하는, 인간 TROP-2에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 인간 TROP-2 결합 절편.
  57. 하기를 조합하여 포함하는, 인간 췌장, 전립선, 난소, 유방 또는 결장 종양을 치료하는데 효과적인 조성물:
    제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항, 제 7 항, 제 8 항, 제 17 항, 제 49 항, 제 50 항, 제 54 항, 제 55 항 및 제 56 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 CDMAB;
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 절편과, 세포독성 부분, 효소, 방사성 화합물, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분 및 혈행 세포로 이루어진 군에서 선택되는 구성원과의 접합체; 및
    필요량의 약리학적으로 허용가능한 담체;
    이 때 상기 조성물은 상기 인간 췌장, 유방, 전립선, 난소 또는 결장 종양을 치료하는데 효과적임.
  58. 하기를 조합하여 포함하는, 인간 췌장, 유방, 전립선, 난소 또는 결장 종양을 치료하는데 효과적인 조성물:
    제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항, 제 7 항, 제 8 항, 제 17 항, 제 49 항, 제 50 항, 제 54 항, 제 55 항 및 제 56 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 CDMAB; 및
    필요량의 약리학적으로 허용가능한 담체;
    이 때 상기 조성물은 상기 인간 췌장, 유방, 전립선, 난소 또는 결장 종양을 치료하는데 효과적임.
  59. 하기를 조합하여 포함하는, 인간 췌장, 유방, 전립선, 난소 또는 결장 종양을 치료하는데 효과적인 조성물:
    제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항, 제 7 항, 제 8 항, 제 17 항, 제 49 항, 제 50 항, 제 54 항, 제 55 항 및 제 56 항 중 어느 한 항에 따른 항체, 항원 결합 절편 또는 CDMAB와; 세포독성 부분, 효소, 방사성 화합물, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 부분 및 혈행 세포로 이루어진 군에서 선택되는 구성원과의 접합체; 및
    필요량의 약리학으로 허용가능한 담체;
    이 때 상기 조성물은 상기 인간 췌장, 유방, 전립선, 난소 또는 결장 종양을 치료하는데 효과적임.
  60. 인간 암성 종양의 존재를 검출하기 위한 검정 키트로서, 상기 인간 암성 종양은 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단 클론 항체 또는 이의 CDMAB에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는 것이고, 상기 CDMAB는 단리된 단클론 항체의 이의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력에 의해 특징지어지고, 상기 키트가 IDAC에 등록 번호 141205-05로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB, 및 상기 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 폴리펩티드 (폴리펩티드의 존재는 특정 절삭 수준에서 상기 인간 암성 종양의 존재의 진단임)에 결합되는지의 여부를 검출하기 위한 수단을 포함하는 검정 키트.
KR1020097024842A 2007-05-30 2008-05-23 암 세포의 세포독성을 매개하는 인간화 및 키메라 항-ｔｒｏｐ-２ 항체 KR20100003366A (ko)

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