KR20100028643A - 항-암 세포독성 단클론 항체 - Google Patents

항-암 세포독성 단클론 항체 Download PDF

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헬렌 피 핀들레이
수잔 이 한
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

암 세포의 항체 매개 치사는 암 치료를 위한 효과적인 접근법이다. 난소암 세포로의 면역화 시 마우스에서 생성된 항체는, 결과변수 (endpoint)로서 다양한 암 세포주에 대한 세포독성에 대해 스크리닝된다. IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된 하이브리도마 AR104A1289.2.2에 의해 생성된, 항-암 세포독성 단클론 항체가 단리되며, 이는 결장암 세포주에 대해 세포독성이고 인간 췌장, 유방 및 전립선암의 동물 모델에서의 종양 존재량을 감소시킨다. 상기 단클론 항체는 또한 여러 암 세포주에 결합한다. 상기 단클론 항체는, 비-암 세포주에 결합하지만 비-암 세포주에 대해 세포독성을 일으키지는 않는다. 상기 단클론 항체는 암의 단계화 및 진단을 조력하는데 사용될 수 있으며, 제 1 차 종양 및 종양 전이를 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 세포독성 단클론 항체는 또한 독소, 효소, 방사성 화합물 및 혈행 세포를 암 세포에 전달하고, 추가로 종양 존재량의 감소를 조력하는데 사용될 수 있다.

Description

항-암 세포독성 단클론 항체 {AN ANTI-CANCER CYTOTOXIC MONOCLONAL ANTIBODY}
협력 연구 협약 선언 ( Statement of Cooperative Research Agreement )
본원의 청구항에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명은, 협약의 범주 내에서 수행된 결과로서, Arius Research Inc.와 Takeda Pharmaceutical Company Limited 사이의 공동 연구 협약 (Joint Research Agreement) ("협약")에 대한 당사자들에 의해 생성되었다. 상기 협약은 본 발명의 일자 이전에 유효하였다.
기술 분야
본 발명은 암성 질환 변형 항체 (CDMAB)의 단리 및 생성, 및 임의로는 하나 이상의 화학요법제와 조합된, 치료 및 진단 과정에서의 이들 CDMAB의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 CDMAB를 이용하는 결합 검정법에 관한 것이다.
암 치료요법으로서 단클론 항체: 암을 나타내는 각각의 개인은 고유하며 사람의 고유성만큼 다른 암과 상이한 암을 갖는다. 이것에도 불구하고, 현재 치료요법은 동일한 단계에서의 동일한 유형의 암을 갖는 모든 환자를 동일한 방법으로 치료한다. 이들 환자 중 30% 이상이 제 1선 치료요법에 실패하여, 추가적인 치료 단계를 야기하며, 치료 실패, 전이 및 최후에는 사망의 가능성이 증가하게 된다. 치료에 대한 우위적인 접근은 특정 개인을 위한 치료요법의 개별화이다. 개별화를 위해 자체 적합화된 현재 유일한 치료요법은 수술이다. 화학요법 및 방사선 치료는 환자에게 맞추어질 수 없으며, 수술 자체는 대부분의 경우 치료에 불충분하다.
단클론 항체의 등장으로, 개별화된 치료요법을 위한 개발 방법의 가능성이 보다 현실적으로 되었는데, 이는 각각의 항체가 단일 에피토프로 유도될 수 있기 때문이다. 더욱이, 특정 개인의 종양을 고유하게 정의하는 에피토프의 집합체에 유도되는 항체의 조합을 생성할 수 있다.
암성 세포와 정상 세포 사이의 유의한 차이가, 암성 세포가 형질전환된 세포에 특이적인 항원을 포함한다는 것임을 인지하여, 과학계는 오랫동안 단클론 항체를 암 항원에 대해 특이적으로 결합하게 함으로써 형질전환된 세포를 특이적으로 표적하도록 설계할 수 있다고 여겨왔는데; 따라서 단클론 항체가 암 세포를 제거하기 위한 "마법의 탄환"으로서 역할할 수 있다는 믿음이 생겼다. 그러나, 단일 단클론 항체가 모든 경우의 암에서 역할할 수 없고, 단클론 항체가 표적된 암 치료로서의 부류로서 활용될 수 있다는 것이 현재 널리 인지된다. 개시된 본 발명의 교시에 따라 단리된 단클론 항체는 환자에게 유익한 방법으로 (예를 들어 종양 존재량을 감소시킴으로써) 암성 질환 과정을 변형시키는 것으로 나타났으며, 이는 암성 질환 변형 항체 (CDMAB) 또는 "항암" 항체로서 본원에서 다양하게 나타날 것이다.
현재, 암 환자는 통상 치료에 대한 적은 선택권을 갖는다. 암 치료요법에 대한 조직화된 접근은 세계적 생존율 및 이환율을 개선시켰다. 그러나, 특정 개인에 대해, 이러한 개선된 통계 자료가 이들의 개인적 상황에서의 개선과 반드시 상관 관계가 있는 것은 아니다.
따라서, 전문가가 동 세대에서의 다른 환자의 각각의 암을 독립적으로 치료할 수 있도록 방법론이 발휘된다면, 이는 단 한 사람에 대한 맞춤 치료요법의 고유한 접근을 허용한다. 치료요법의 이러한 과정은, 이상적으로는 치료율을 증가시키고, 보다 양호한 성과를 내어, 이로 인해 오랜 필요성을 만족시킨다.
역사적으로, 다클론 항체의 사용은 인간 암 치료에서의 제한된 성공으로 사용되어왔다. 림프종 및 백혈병은 인간 혈장으로 치료되었으나, 장기간 관해 또는 반응이 거의 없었다. 더욱이, 화학요법과 비교하여 추가적인 이득이 없고, 재현성이 부족하였다. 고체 종양 예컨대 유방암, 흑색종 및 콩팥 세포 암종은 또한, 인간 혈액, 침팬지 혈청, 인간 혈장 및 말 혈청으로 치료되었으나, 이에 상응하는 결과는 예측불가능하고 비효과적이었다.
고체 종양을 위한 단클론 항체의 많은 임상 실험이 있었다. 1980년대에, 특정 항원에 대한 항체를 사용하여 또는 조직 선택성을 기준으로 한, 인간 유방암에 대한 4번 이상의 임상 실험이 있었는데, 47명의 환자로부터 단 한 명의 반응자가 생겼다. 인간화 항-Her2/neu 항체 (Herceptin
Figure pct00001
)를 CISPLATIN과 병용하여 사용한 성공적인 임상 실험은 1998년까지는 없었다. 상기 실험에서 37명의 환자를 반응에 대해 평가하였는데, 약 1/4이 부분적인 반응률을 가졌고 추가적인 1/4이 경미한 또는 안정적인 질환 진전을 가졌다. 반응자 중에서 진전에 대한 시간 중간값은 8.4개월이었고, 반응 지속 중간값은 5.3개월이었다.
Herceptin
Figure pct00002
은 1998년에 Taxol
Figure pct00003
과 병용한 제 1선 용도에 대해 승인되었다. 임상 연구 결과는, Taxol
Figure pct00004
단독만을 받은 군 (3.0 개월)과 비교하여, Taxol
Figure pct00005
과 함께 항체 치료요법을 받은 환자에 대해, 질환 진전에 대한 시간 중간값 (6.9개월)이 증가된 것을 나타내었다. 또한, 생존 기간 중간값에서 약간의 증가가 있었다; Herceptin
Figure pct00006
과 Taxol
Figure pct00007
치료 부분 대 Taxol
Figure pct00008
단독 치료 부분에 대해, 22개월 대 18개월. 또한, 항체와 Taxol
Figure pct00009
병용군에서, Taxol
Figure pct00010
단독과 비교하여 완전 (8% 대 2%) 및 부분적 반응자 (34% 대 15%)의 수가 모두 증가하였다. 그러나, Herceptin
Figure pct00011
및 Taxol
Figure pct00012
로의 치료는 Taxol
Figure pct00013
단독 치료와 비교하여 더 높은 심독성 발생을 일으킨다 (각각 13% 대 1%). 또한, Herceptin
Figure pct00014
치료요법은, 현재 공지된 기능 또는 생물학적으로 중요한 리간드가 없는 수용체인 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (Her2/neu)를 과다발현 (면역조직화학 (IHC) 분석을 통해 측정된 바와 같음)하는 환자 (; 전이성 유방암을 갖는 환자의 약 25%)에 대해서만 효과적이었다. 그러므로, 유방암 환자에 대한 크게 미충족된 요구가 아직 존재한다. Herceptin
Figure pct00015
치료로부터 이익을 얻을 수 있는 환자라도 아직 화학요법을 필요로 하며, 그 결과로 적어도 일부 정도, 이러한 종류의 치료의 부작용을 아직 처리해야만 한다.
결장 직장암을 조사하는 임상 실험에는 당단백질 및 당지질 표적 모두에 대한 항체가 포함된다. 선암에 대한 일부 특이성을 갖는 항체 예컨대 17-1A는, 60명이 넘는 환자에서 임상 제 2상 실험을 거쳐 오직 1명의 환자만이 부분적인 반응을 가졌다. 다른 실험에서, 17-1A의 사용은 추가적인 시클로포스파미드를 사용하는 프로토콜에서, 52명의 환자 중 오직 1명이 완전한 반응, 및 2명이 경미한 반응을 일으켰다. 현재까지, 17-1A의 임상 제 3상 실험은 3기 결장암에 대한 항원보강제 치료요법으로서의 개선된 효능을 보여주지 못했다. 영상화에 대해 처음에 승인된 인간화 쥐과 단클론 항체의 사용도 또한 종양 퇴행을 일으키지 않았다.
최근에, 단클론 항체를 사용하는 결장 직장암 임상 연구로부터 어떤 긍정적인 결과가 존재하였다. 2004년에, ERBITUX
Figure pct00016
는 이리노테칸 기초 화학요법에 대해 불응인 EGFR-발현 전이 결장 직장암 환자의 제 2선 치료에 대해 승인되었다. 2-군 (two-arm) 임상 제 2상 연구 및 단일군 (single arm) 연구 모두로부터의 결과는, 이리노테칸과 병용된 ERBITUX
Figure pct00017
가 각각 23% 및 15%의 반응률과 함께 각각 4.1개월 및 6.5개월의 질환 진전에 대한 시간 중간값을 갖는다는 것을 나타내었다. 동일한 2-군 임상 제 2상 연구 및 다른 단일군 연구로부터의 결과는, ERBITUX
Figure pct00018
단독 치료가 각각 11% 및 9% 반응률과 함께 각각 1.5개월 및 4.2개월의 질환 진전에 대한 시간 중간값을 야기하였다는 것을 나타내었다.
결과적으로 스위스 및 미국에서 이리노테칸과 병용된 ERBITUX
Figure pct00019
치료, 및 미국에서 ERBITUX
Figure pct00020
단독 치료가 또한 제 1선 이리노테칸 치료요법에서 실패한 결장암 환자의 제 2선 치료로서 승인되었다. 그러므로, Herceptin
Figure pct00021
과 같은 스위스에서의 치료는 단클론 항체 및 화학요법의 조합으로서만 승인된다. 또한, 스위스 및 미국에서의 치료는 환자에 대한 제 2선 치료요법으로서만 승인된다. 또한, 2004년에, AVASTIN
Figure pct00022
이 전이성 결장 직장암의 제 1선 치료로서 정맥내 5-플루오로우라실계 화학요법과의 병행 사용에 대해 승인되었다. 임상 제 3상 연구 결과는, 5-플루오로우라실 단독으로 치료한 환자와 비교하여 AVASTIN
Figure pct00023
과 5-플루오로우라실로 치료된 환자의 생존 기간 중간값에서의 연장을 나타내었다 (각각 16개월 대 20개월). 그러나, Herceptin
Figure pct00024
및 ERBITUX
Figure pct00025
에서와 같이 치료는 단클론 항체 및 화학요법과의 조합으로서만 승인되었다.
또한 폐, 뇌, 난소, 췌장, 전립선 및 위암에 대한 취약한 결과가 지속된다. 비-소세포 폐암에 대한 가장 기대되는 최근의 결과는, 치료가 화학요법제 TAXOTERE
Figure pct00026
와 조합된 세포-치사 약물 독소루비신에 접합된 단클론 항체 (SGN-15; dox-BR96, 항-시알릴-LeX)를 포함하는, 임상 제 2상 실험으로부터 나왔다. TAXOTERE
Figure pct00027
는 폐암의 제 2선 치료에 대해 유일하게 FDA 승인된 화학요법이다. 초기 데이터는 TAXOTERE
Figure pct00028
단독과 비교하여 개선된 전체 생존을 나타낸다. 연구를 위해 모집된 62명의 환자 중에, 2/3는 TAXOTERE
Figure pct00029
와 조합된 SGN-15를 받은 반면, 나머지 1/3은 TAXOTERE
Figure pct00030
을 단독으로 받았다. TAXOTERE
Figure pct00031
와 조합된 SGN-15를 받은 환자에 대해, 전반적인 생존 기간 중간값은, TAXOTERE
Figure pct00032
을 단독으로 받은 환자에 대해서는 5.9개월인 것에 비교하여, 7.3개월이었다. 1년 및 18개월에서의 전반적인 생존은, SNG-15와 TAXOTERE
Figure pct00033
를 받은 환자에 대해 각각 29% 및 18% 였고, 이와 비교하여 TAXOTERE
Figure pct00034
을 단독으로 받은 환자에 대해서는 각각 24% 및 8% 였다. 추가적인 임상 실험이 계획되고 있다.
전임상적으로, 흑색종에 대한 단클론 항체의 사용에서의 일부 제한적인 성공이 있었다. 이들 항체의 극소수가 임상 실험에 도달하였고, 현재까지 임상 제 3상 실험에서 유망한 결과를 나타내거나 승인된 것은 아무것도 없다.
질환을 치료하기 위한 신규 약물의 발견은, 질환 발병기전에 기여할 수 있는 30,000개의 공지된 유전자 생성물 중 관련된 표적을 확인하지 못하는 것에 의해 방해된다. 종양학 연구에서, 잠재적인 약물 표적은 종종 단순히 이들이 종양 세포에서 과다발현된다는 사실로 인해 선택된다. 따라서 확인된 표적은 이후 다수의 화합물과의 반응에 대해 스크리닝된다. 잠재적인 항체 치료요법의 경우에서, 이들 후보 화합물은 통상 Kohler 및 Milstein에 의해 규정된 기초 원리에 따른 전통적인 단클론 항체 생성 방법 (1975, Nature, 256, 495-497, Kohler 및 Milstein)으로부터 유래된다. 비장 세포는 항원 (예를 들어 전체 세포, 세포 분획, 정제된 항원)으로 면역화된 마우스로부터 수집되고, 무한증식 하이브리도마 파트너와 융합된다. 생성된 하이브리도마를 스크리닝하고 표적에 가장 열렬히 결합하는 항체를 분비하는 것을 선택한다. 암 세포에 대해 유도된 많은 치료적 및 진단 항체 (Herceptin
Figure pct00035
및 RITUXIMAB 포함)는, 이러한 방법을 사용하여 생성되고 이의 친화성을 기초로 선택된다. 이러한 전략의 결함은 2가지이다. 첫 번째로, 치료적 또는 진단 항체 결합에 대한 적정한 표적의 선택은 조직 특이적 발암 과정을 둘러싼 지식의 부족, 및 그 결과로서 생긴, 이들 표적을 확인하는, 과발현에 의한 선택과 같은 극단적으로 단순화된 방법에 의해 제한된다. 두 번째로, 최대 친화성으로 수용체에 결합하는 약물 분자가 통상 신호를 개시 또는 억제하기 위한 최고 확률을 갖는다는 가정은, 이 경우에 항상 그렇지 않을 수 있다.
유방 및 결장암의 치료로의 일부 진전에도 불구하고, 단일 제제 또는 공동 투여로서 유효한 항체 치료요법의 확인 및 개발은 모든 유형의 암에 대해 불충분하였다.
선행 특허:
미국 특허 제 5,750,102 호는 환자의 종양으로부터의 세포가 환자로부터의 세포 또는 조직으로부터 클로닝될 수 있는 MHC 유전자로 트랜스펙션되는 방법을 개시한다. 이들 트랜스펙션된 세포는 이후 환자에게 백신을 접종하는데 사용된다.
미국 특허 제 4,861,581 호는 포유류의 신생물 및 정상 세포의 내부 세포 성분에 특이적이나 외부 성분에는 특이적이지 않은 단클론 항체를 수득하고, 단클론 항체를 표지하고, 신생물 세포를 사멸시키기 위한 치료요법을 받는 포유류의 조직과 표지된 항체를 접촉시키고, 퇴행하는 신생물 세포의 내부 세포 성분에 대한 표지된 항체의 결합을 측정함으로써 치료요법의 유효성을 측정하는 단계를 포함하는 방법을 개시한다. 인간 세포내 항원에 대해 유도된 항체를 제조하는데 있어서, 당해 특허권자는 이러한 항원의 편리한 공급원을 나타내는 악성 세포를 인지한다.
미국 특허 제 5,171,665 호는 신규한 항체 및 이의 생성 방법을 제공한다. 상세하게는, 특허는 인간 종양 (예를 들어 결장 및 폐의 종양)이 결합된 단백질 항원에 강하게 결합하는 반면, 정상 세포에는 훨씬 덜한 정도로 결합하는 특성을 갖는 단클론 항체의 형성을 교시한다.
미국 특허 제 5,484,596 호는 인간 암 환자로부터 종양 조직을 수술적으로 제거하고, 종양 조직을 처리하여 종양 세포를 수득하고, 종양 세포를 조사 (irradiating)하여 생육가능하나 종양을 형성하지는 않게 하고, 이들 세포를 사용하여 제 1차 종양의 재발을 억제하면서 동시에 전이를 억제할 수 있는, 환자를 위한 백신을 제조하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 특허는 종양 세포의 표면 항원과 반응성인 단클론 항체의 개발을 교시한다. 4번째 컬럼, 45번째 줄 이하에서 설명된 바와 같이, 당해 특허권자는 인간 신생물에서 활성 특이적 면역요법을 나타내는 단클론 항체의 개발에서 자발생 종양 세포를 이용한다.
미국 특허 제 5,693,763 호는 인간 암종에 특유한 것으로서 기원의 상피 조직에 비의존적인 당단백질 항원을 교시한다.
미국 특허 제 5,783,186 호는 Her2 발현 세포에서의 세포자멸사를 유도하는 항-Her2 항체, 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주, 상기 항체를 이용하는 암 치료 방법 및 상기 항체를 포함하는 약학 조성물을 명시한다.
미국 특허 제 5,849,876 호는 종양 및 비종양 조직 공급원으로부터 정제된 점액소 항원에 대한 단클론 항체의 생성을 위한 신규한 하이브리도마 세포주를 기재한다.
미국 특허 제 5,869,268 호는 원하는 항원에 대해 특이적인 항체를 생성하는 인간 림프구를 생성하는 방법, 단클론 항체를 생성하는 방법 뿐 아니라 상기 방법에 의해 생성된 단클론 항체를 명시한다. 특허는 특히 암의 진단 및 치료에 유용한 항-HD 인간 단클론 항체의 생성을 명시한다.
미국 특허 제 5,869,045 호는 인간 암종 세포와 반응성인 항체, 항체 절편, 항체 접합체 및 단일 사슬 면역독소에 관한 것이다. 이들 항체가 기능하는 메카니즘은 이중적이어서, 분자가 인간 암종의 표면에 제시된 세포막 항원과 반응성이고, 또한 항체가 결합 후에 암종 세포 내에서 내재화되는 능력을 가져, 이들이 항체-약물 및 항체-독소 접합체를 형성하는데 특히 유용하게 된다. 이들의 비변형된 형태에서 항체는 또한 특정 농도에서 세포독성 특성을 명백히 보여준다.
미국 특허 제 5,780,033 호는 종양 치료요법 및 예방을 위한 자동항체의 사용을 개시한다. 그러나, 상기 항체는 노화된 포유류로부터의 항핵 자동항체이다. 이러한 경우에서, 자동항체는 면역계에서 발견된 자연 항체 중 한 유형으로 언급된다. 자동항체가 "노화된 포유류"로부터 나오기 때문에, 자동항체가 실제로 치료될 환자로부터 나온 것일 필요는 없다. 또한 특허는 노화된 포유류로부터의 자연 및 단클론 항핵 자동항체, 및 단클론 항핵 자동항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 개시한다.
발명의 개요
본 출원은 암성 질환 변형 단클론 항체를 인코딩하는 하이브리도마 세포주를 단리시키기 위한 특허 U.S. 6,180,357에서 교시된 환자 특이적 항암 항체 제조를 위한 방법론을 이용한다. 이들 항체는 한 종양에 대해 특이적으로 만들어질 수 있고, 따라서 암 치료요법의 개별화를 가능하게 한다. 본 출원의 문맥 내에서, 세포-치사 (세포독성) 또는 세포-성장 억제 (세포 증식 억제) 특성을 갖는 항암 항체를 이후 세포 독성으로서 나타낼 것이다. 이들 항체는 암의 단계화 및 진단을 조력하는데 사용될 수 있으며, 종양 전이를 치료하는데 사용될 수 있다. 이들 항체는 또한 예방적 치료로서 암의 방지에 사용될 수 있다. 전통적인 약물 개발 패러다임에 따라 생성된 항체와 달리, 이러한 방법으로 생성된 항체는 악성 조직의 성장 및/또는 생존에 필수인 것으로 이전에는 나타나지 않았던 통로 및 물질을 표적할 수 있다. 더욱이, 이들 항체의 결합 친화성은 더 강한 친화성 반응에 따르지 않을 수 있는 세포독성 사건의 개시를 위한 필요조건에 알맞다. 또한, 이는 표준 화학요법적 양식 (예를 들어 방사선핵종)을 본 발명의 CDMAB과 접합하여, 이로써 상기 화학요법의 용도에 초점을 맞추는 것도 본 발명의 범위 내에 있다. CDMAB은 또한 독소, 세포독성 부분, 효소 예를 들어 바이오틴 접합된 효소, 또는 혈행 세포와 접합되어, 이로써 항체 접합체를 형성할 수 있다.
개별화된 항암 치료의 전망은 환자가 관리되는 방식에서의 변화를 초래할 것이다. 있을 법한 임상 시나리오는 종양 검체가 제시되는 시기에 수득하고 보관하는 것이다. 이러한 검체로부터, 예비-존재하는 암성 질환 변형 항체의 패널로부터 종양을 유형화시킬 수 있다. 환자는 관례적으로 단계화되지만, 활용가능한 항체가 환자의 추가적인 단계화에 사용될 수 있다. 환자는 존재하는 항체로 즉시 치료될 수 있고, 이는 종양에 특이적인 항체의 패널이 본원에 개요로 나타낸 방법, 또는 본원에 개시된 스크리닝 방법과 함께 파지 디스플레이 라이브러리의 사용을 통해 생성될 수 있다. 생성된 모든 항체는 항암 항체의 라이브러리에 추가되는데, 이는 다른 종양이 치료되는 종양과 동일한 에피토프 중 일부를 가질 수 있기 때문이다. 본 방법에 따라 생성된 항체는 이들 항체에 결합하는 암을 갖는 많은 환자의 암성 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.
항암 항체에 추가로, 환자는 치료의 다중양식 요법의 부분으로서 현재 권장된 치료요법을 받을지를 택할 수 있다. 본 방법론을 통해 단리된 항체가 비-암성 세포에 대해 상대적으로 비독성이라는 사실은, 항체의 조합을 높은 용량에서, 단독 또는 통상적인 치료요법과 함께 사용될 수 있게 한다. 높은 치료 지수는 또한 단기간에 재치료를 가능하게 하는데, 치료 저항성 세포의 출현의 가능성이 감소되어야 한다.
환자가 치료요법의 처음 과정에 대해 불응이거나 전이가 발전된다면, 종양에 대해 특이적인 항체를 생성하는 방법은 재치료를 위해 반복될 수 있다. 더욱이, 항암 항체는 환자로부터 수득한 적혈구에 접합되고 전이 치료를 위해 재융합될 수 있다. 전이성 암에 대한 효과적인 치료는 거의 없는데, 전이는 통상 사망을 일으키는 불량한 결과를 예고한다. 그러나, 전이성 암은 통상 혈관화가 잘 되어 있어, 적혈구에 의한 항암 항체의 전달은 종양 위치에 항체를 집중시키는 효과를 가질 수 있다. 전이되기 전에도, 대부분의 암 세포는 이의 생존을 위해 숙주의 혈액 공급에 의존하며, 적혈구에 접합된 항암 항체가 원위치 (in situ) 종양에 대해 또한 효과적일 수 있다. 대안적으로는, 항체는 다른 혈행 세포, 예를 들어 림프구, 대식세포, 단핵구, 자연 치사 세포 등에 접합될 수 있다.
5개 부류의 항체가 존재하며, 각각은 이의 중쇄에 의해 주어지는 기능과 관련된다. 일반적으로, 네이키드 항체에 의한 암 세포 치사는 항체 의존성 세포독성 또는 보체 의존성 세포독성을 통해 매개된다. 예를 들어 쥐과 IgM 및 IgG2a 항체는 보체 시스템의 C-1 성분에 결합하여 인간 보체를 활성화시킬 수 있는데, 이로써 종양 분해를 일으킬 수 있는 보체 활성의 고전적 통로를 활성화시킬 수 있다. 인간 항체에 대해 가장 효과적인 보체 활성 항체는 일반적으로 IgM 및 IgG1이다. IgG2a 및 IgG3 동형의 쥐과 항체는 단핵구, 대식세포, 과립구 및 특정 림프구에 의한 세포사를 일으키는 Fc 수용체를 갖는 세포독성 세포를 보강하는데 효과적이다. IgG1 및 IgG3 동형 모두의 인간 항체는 ADCC를 매개한다.
항체 매개된 암 치사의 또 다른 가능한 메카니즘은 세포막 및 이에 결합된 당단백질 또는 당지질에서의 다양한 화학적 결합의 가수분해를 촉매하도록 기능하는 항체, 이른바 촉매적 항체의 사용을 통한 것일 수 있다.
항체-매개 암 세포 치사의 세 가지 추가적인 메카니즘이 존재한다. 첫 번째는 암 세포 상 잔류물인 추정의 항원에 대한 면역 반응이 일어나도록 신체를 유도하기 위한 백신으로서 항체를 사용하는 것이다. 두 번째는 성장 수용체를 표적하고, 이의 기능으로 방해하거나 수용체를 강하 조절하여 이의 기능이 효과적으로 손실되도록 항체를 사용하는 것이다. 세 번째는 직접적인 세포사를 일으킬 수 있는 세포 표면 부분의 직접 연결 (예컨대 TRAIL R1 또는 TRAIL R2와 같은 사멸 수용체, 또는 인테그린 분자 예컨대 알파 V 베타 3 등의 연결)에 대한 이러한 항체의 효과이다.
암 약물의 임상적 이용은 환자에 대한 허용가능한 위험 특성 하 약물의 이득을 기준으로 한다. 암 치료요법에서 생존은 일반적으로 가장 많이 추구하는 이득 (benefit)이지만, 삶을 연장시키는 것에 더하여 다른 잘 인지된 이득이 많이 존재한다. 치료가 생존에 불리한 영향을 갖지 않는, 이들 다른 이득에는, 증상 완화, 유해 사례에 대한 보호, 재발까지의 시간 또는 무질환 생존 기간의 연장, 및 질병 진행까지의 시간 연장이 포함된다. 이들 기준은 일반적으로 허용되며, 미국 식품 의약품국 (FDA)과 같은 규제 기관은 이러한 이득을 생성하는 약물을 승인한다 (Hirschfeld 등 Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42:137-143 2002). 이들 기준에 추가로, 이러한 유형의 이득을 예지할 수 있는 다른 결과변수 (endpoint)가 있다는 것이 잘 인지된다. 미국 F.D.A.에 의해 수여된 가속화된 승인 절차는, 환자 이득을 예측할 법한 대리지표가 있다는 것을 일부분 인정한다. 2003년 말 현재, 이러한 절차 하에 16개의 승인된 약물이 있었으며, 이들 중, 네 개는 최종 승인으로 넘어갔는데, 즉 잇따른 연구가 대리 결과변수 (surrogate endpoint)에 의해 예측되는 바와 같은 직접적인 환자 이득을 나타내었다. 고체 종양에서의 약물 효과를 측정하기 위한 한 가지 중요한 결과변수는 치료에 대한 반응을 측정함으로써 종양 존재량을 평가하는 것이다 (Therasse 등 Journal of the National Cancer Institute 92(3):205-216 2000). 이러한 평가를 위한 임상적 기준 (RECIST 기준)은 국제 암 전문가 집단인 Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group 에 의해 공표되었다. RECIST 기준에 따른 객관적인 반응에 의해 나타내는 바와 같이, 종양 존재량에 대한 효과가 설명된 약물은, 적정한 대조군과 비교하여 궁극적으로 직접적인 환자 이득을 생성하는 경향이 있다. 전임상 환경에서 종양 존재량은 일반적으로 평가 및 기록하기에 보다 간단하다. 전임상 연구가 임상 환경으로 변형될 수 있는 것에서, 전임상 모델에서 연장된 생존을 만들어내는 약물은 최대 예견된 임상 효용을 갖는다. 임상 치료에 대한 긍정적인 반응을 만들어내는 것과 유사하게, 전임상 환경에서 종양 존재량을 감소시키는 약물은 또한 질환에 대해 유의한 직접적 영향을 갖는다. 생존의 연장이, 가장 많이 구하는 암 약물 치료로부터의 임상 결과이지만, 임상 효용을 갖는 다른 이득이 있으며, 질환 진전에서의 지연과 상관관계가 있을 수 있는 종양 존재량 감소, 연장된 생존 또는 둘 다가 또한 직접적인 이득을 야기하고 임상 영향을 가질 수 있다는 것이 명백하다 (Eckhardt 등 Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds; ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003, 페이지 209-219).
본 발명은 세포독성 검정, 및 인간 암의 동물 모델에서의 이의 효과로써 AR104A1289.2.2의 개발 및 용도를 기재한다. 본 발명은 표적 분자에 존재하는 에피토프(들)에 특이적으로 결합하며, 또한 네이키드 항체로서, 악성 종양 세포에 대해 시험관내 세포독성 특성을 갖지만 정상 세포에 대해서는 상기 특성을 갖지 않으며, 또한 네이키드 항체로서, 종양 성장의 억제를 직접적으로 매개하는 시약을 기재한다. 추가적인 진전은 항-암 항체의 용도 예컨대 종양 성장 억제, 및 암 치료의 기타 결과변수를 달성하기 위한, 동족 항원 마커를 발현하는 표적 종양에 대한 상기 용도의 것이다.
모두에서, 본 발명은 치료제용 표적으로서 AR104A1289.2.2 항원의 용도를 교시하는데, 이는 투여되는 경우 포유류에서 항원을 발현하는 암의 종양 존재량을 감소시킬 수 있다. 본 발명은 또한, 포유류에서 항원을 발현하는 암의 종양 존재량이 감소되도록 이의 항원을 표적하기 위한 CDMAB (AR104A1289.2.2) 및 이의 유도체, 및 이의 항원 결합 절편, 및 이의 리간드를 유도하는 세포 독성의 용도를 교시한다. 더욱이, 본 발명은 또한 진단, 치료요법의 예측, 및 상기 항원을 발현하는 종양을 갖는 포유류의 예후를 위해 유용할 수 있는, 암성 세포에서 AR104A1289.2.2 항원을 검출하는 용도를 교시한다.
따라서, 본 발명의 목적은 하이브리도마 세포주 및 상기 하이브리도마 세포주를 인코딩하는 상응하는 단리된 단클론 항체 및 이의 항원 결합 절편을 단리하기 위해, 특정한 개인, 또는 하나 이상의 특정한 암 세포주로부터 유래한 암성 세포에 대해 야기된 암성 질환 변형 항체 (CDMAB)를 생성하는 방법을 이용하는 것이며, 여기서 CDMAB는 암 세포에 대해 세포독성이면서 동시에 비-암성 세포에 대해서는 상대적으로 비독성이다.
본 발명의 추가적인 목적은 암성 질환 변형 항체, 이의 리간드 및 항체 결합 절편을 교시하는 것이다.
본 발명의 또 다른 추가적인 목적은 세포독성이 항체 의존성 세포독성을 통해 매개되는 암성 질환 변형 항체를 생성하는 것이다.
본 발명의 또 다른 추가적인 목적은 세포독성이 보체 의존성 세포독성을 통해 매개되는 암성 질환 변형 항체를 생성하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포독성이 세포 화학 결합의 가수분해를 촉진하기 위한 이들의 능력의 기능인 암성 질환 변형 항체를 생성하는 것이다.
본 발명의 더 추가적인 목적은 암의 진단, 예후 및 모니터링을 위한 결합 검정에 유용한 암성 질환 변형 항체를 생성하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 본 발명의 예시 및 실시예, 특정 구현예로서 설명되는 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
발명의 상세한 설명
일반적으로, 하기의 단어 또는 구절들은 본 개요, 상세한 설명, 실시예 및 청구항에 사용될 때 하기 나타낸 정의를 갖는다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는, 예를 들어 단독 단클론 항체 (작용제, 길항제, 및 중화 항체, 탈-면역화, 쥐과, 키메라 또는 인간화 항체 포함), 다에피토프 특이성 (polyepitopic specificity)을 갖는 항체 조성물, 단쇄 항체, 면역접합체 및 항체 절편을 포함한다 (하기 참조).
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동질인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내는데, 즉 상기 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체들은 매우 특이적이어서, 단일 항원 위치에 대해 유도된다. 더욱이, 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제조물과 반대로, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 유도된다. 이의 특이성에 추가로, 상기 단클론 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론"은, 실질적으로 동질인 항체의 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특징을 나타내는 것이며, 임의의 특정 방법에 의해 상기 항체를 제조하여야 한다는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 문헌 [Kohler 등, Nature, 256:495 (1975)]에 최초 기재된 하이브리도마 (쥐과 또는 인간) 방법에 의해 생성될 수 있고, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 생성될 수도 있다 (예를 들어 미국 특허 제 4,816,567 호 참조). "단클론 항체"는 또한, 예를 들어 문헌 [Clackson 등, Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks 등, J. Mol . Biol ., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
"항체 절편"은 완전한 (intact) 항체의 일부분, 바람직하게는 이의 항원-결합 또는 가변 부위를 포함하는 부분을 포함한다. 항체 절편의 예에는 전장 (full length) 보다 짧은 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 절편들; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 단쇄 항체, 단일 영역 항체 분자, 융합 단백질, 재조합 단백질 및 항체 절편(들)으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
"완전한" 항체는 항원-결합 가변 부위 뿐 아니라 경쇄 불변 영역 (CL) 및 중쇄 불변 영역인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 상기 불변 영역은 본래적 서열 불변 영역 (예를 들어 인간 본래적 서열 불변 영역) 또는 이의 아미노산 서열 변이일 수 있다. 바람직하게는, 완전한 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 갖는다.
중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 완전한 항체는 상이한 "부류"로 할당될 수 있다. 완전한 항체에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 부류가 있으며, 이들 중 몇몇은 "하위부류"(동형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가적으로 나뉠 수 있다. 상이한 항체 부류들에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 면역글로불린 부류의 아단위 (subunit) 구조 및 3차원 형상은 잘 공지되어 있다.
항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 부위 (본래적 서열의 Fc 부위 또는 아미노산 서열 변이의 Fc 부위)에 기인한 것일 수 있는 생물학적 활성을 나타낸다. 항체 효과기 기능의 예에는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이 포함된다.
"항체-의존성 세포-매개성 세포독성" 및 "ADCC"는, Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예컨대 자연 치사 (NK) 세포, 중성구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인지하고 이후 상기 표적 세포의 용해를 일으키는, 세포-매개성 반응을 나타낸다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch 및 Kinet, Annu . Rev . Immunol 9:457-92 (1991)]의 464페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 미국 특허 제 5,500,362 호 또는 제 5,821,337 호에 기재된 것과 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수도 있다. 이러한 검정에 유용한 효과기 세포에는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 치사 (NK) 세포가 포함된다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes 등 PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하여 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 상기 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예에는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 치사 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 중성구가 포함되며; PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 효과기 세포는 그의 본래적 공급원으로부터, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 혈액 또는 PBMC로부터 단리될 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 부위에 결합하는 수용체를 기술하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 본래적 서열의 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이며, 이에는 대립유전자 변이 및 이들 수용체의 선택적 스플라이싱 (alternatively spliced) 형태를 포함하여, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체가 포함된다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")가 포함되며, 이는 이의 세포질 영역이 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체인 FcγRIIA는 그의 세포질 영역에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 저해 수용체인 FcγRIIB는 그의 세포질 영역에 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다 (하기 총설 참조: M. in Daeron, Annu . Rev . Immunol . 15:203-234 (1997)). FcR은 하기에 개관되어 있다: 문헌 [Ravetch 및 Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel 등, Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas 등, J. Lab . Clin . Med . 126:330-41 (1995)]. 미래에 확인될 것들을 포함하여, 다른 FcR도 본원에서 "FcR"이라는 용어에 포함된다. 상기 용어에는 또한, 모체 IgG의 태아로의 전달을 담당하는 신생아 수용체인 FcRn이 포함된다 (Guyer 등, J. Immunol . 117:587 (1976) 및 Kim 등, Eur . J. Immunol . 24:2429 (1994)).
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적을 용해할 수 있는 분자의 능력을 나타낸다. 보체 활성화 통로는 보체계의 제 1 성분 (C1q)이 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예를 들어 항체)에 결합함에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro 등, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 것과 같은, CDC 검정을 수행할 수 있다.
용어 "가변"은, 가변 영역의 특정 부분의 서열이 항체들 간에 광범위하게 상이하여 이들이 각 특정 항체의 대응 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에 사용되는 사실을 나타낸다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 영역 전체에 걸쳐 고르게 분포하지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 영역 모두에 존재하는 과가변 (hypervariable) 영역으로 불리는 3개의 단편에 집중되어 있다. 가변 영역에서 더욱 고도로 보존된 부분은 구조형성 부위 (framework region, FR)로 불린다. 본래적 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 4개의 FR을 포함하는데, 이들은 주로 3개의 과가변 부위로 연결된 β-시트 배열을 취하며, 상기 과가변 영역들은 상기 β-시트 구조를 연결하는, 일부 경우에는 상기 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 사슬 내의 과가변 부위는 상기 FR에 의해 서로 아주 근접하게 결합되어 있고, 다른 쇄로부터의 과가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (하기 참조: Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. pp 15-17; 48-53 (1991)). 상기 불변 영역은 항체가 항원에 결합하는데 있어서 직접적으로 관여하는 것은 아니나, 항체 의존성 세포독성 (ADCC)에서 항체의 관여와 같은 다양한 효과기 기능을 나타낸다.
본원에서 사용되는 경우 용어 "과가변 부위"는 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 과가변 부위는 일반적으로 하기를 포함한다: "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어 경쇄 가변 영역에서 잔기 24~34 (L1), 50~56 (L2) 및 89~97 (L3) 및 중쇄 가변 영역에서 31~35 (H1), 50~65 (H2) 및 95~102 (H3); Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. pp 15-17; 48-53 (1991)) 및/또는 "과가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어 경쇄 가변 영역에서 잔기 26~32 (L1), 50~52 (L2) 및 91~96 (L3) 및 중쇄 가변 영역에서 26~32 (H1), 53~55 (H2) 및 96~101 (H3); Chothia 및 Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)). "구조형성 부위" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의되는 바와 같은 과가변 부위 잔기가 아닌 가변 영역 잔기이다. 항체를 파파인으로 절단하면, "Fab" 절편으로 불리는 각각 단일 항원-결합 위치를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 절편과, 쉽게 결정화하는 그의 능력이 명칭에 반영된 나머지의 "Fc" 절편이 생성된다. 펩신 처리에 의해서는, 2개의 항원-결합 위치를 가지며 여전히 항원과 가교결합할 수 있는 F(ab')2 절편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원-인지 및 항원-결합 위치를 포함하는 최소 항체 절편이다. 상기 부위는 강한 비공유 결합 상태로 있는 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 영역의 이량체로 이루어진다. 이러한 배열로, 각 가변 영역의 3개의 과가변 부위는 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원-결합 위치를 정의한다. 집합적으로, 6개의 과가변 부위는 해당 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일의 가변 영역 (또는 항원에 특이적인 3개의 과가변 부위만 포함하는 Fv의 절반)이라도, 전체 결합 위치보다 친화력이 덜하긴 하지만, 항원을 인지하여 그에 결합하는 능력을 갖는다. Fab 절편은 또한 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 제 1 불변 영역 (CH1)을 포함한다. Fab' 절편은 중쇄 CH1 영역의 카르복시 말단에서 항체 힌지 (hinge) 부위로부터의 하나 이상의 시스테인을 비롯한 수 개의 잔기가 추가된 점이 Fab 절편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 영역의 시스테인 잔기(들)가 하나 이상의 유리 티올기를 갖는 Fab'를 나타낸다. F(ab')2 항체 절편은 원래는 그들 사이에 힌지 시스테인이 존재하는 Fab' 절편의 쌍으로 생성되었다. 항체 절편의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물종의 항체의 "경쇄"는 그의 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는, 2개의 분명히 구별되는 유형 중 하나로 할당될 수 있다.
"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 절편은 항체의 VH 및 VL 영역을 포함하는데, 여기서 이들 영역은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 VH 및 VL 영역 사이에, scFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성할 수 있게 하는 폴리펩티드 연결자를 추가로 포함한다. scFv에 대한 개관을 위해서는, 하기를 참조한다: 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)].
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 가진 소형 항체 절편으로서, 동일 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내에서 가변 중쇄 영역 (VH)이 가변 경쇄 영역 (VL)에 연결되어 있는 것을 포함하는 절편을 나타낸다. 상기 동일 사슬 상의 상기 두 영역 간의 쌍 형성 (pairing)을 허용하기에는 너무 짧은 연결자를 사용함으로써, 상기 영역은 또 다른 사슬의 상보성 영역과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 위치를 생성하도록 촉진된다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger 등, Proc . Natl . Acad . ScL USA, 90:6444-6448 (1993)]에 더욱 상세히 기술되어 있다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염물 성분은 상기 항체의 진단적 또는 치료적 사용을 방해하는 물질로서, 이에는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질이 포함될 수 있다. 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 원 위치에 존재하는 항체가 포함되는데, 그 이유는 상기 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로는, 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
관심 항원에 "결합하는" 항체는, 항체가 상기 항원을 발현하는 세포를 표적하는 것에 있어서 치료제 또는 진단제로서 유용하도록 충분한 친화성을 갖고 상기 항원에 결합할 수 있는 것이다. 상기 항체가 항원성 부분에 결합하는 것인 경우, 이는 통상 다른 수용체들에 반대되는 것으로서 항원성 부분에 우선적으로 결합할 것인데, 이에는 비-특이적 Fc 접촉과 같은 우연적인 결합, 또는 다른 항원에 공통인 번역후 변형 부분에의 결합이 포함되지 않으며, 이는 다른 단백질과 유의하게 교차반응하지 않는 것일 수도 있다. 관심 항원에 결합하는 항체의 검출 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 이는 FACS, 세포 ELISA 및 웨스턴 블럿과 같은 검정법을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 바와 같은 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양"은 상호교환가능하게 사용되며, 이러한 모든 표기에는 자손이 포함된다. 또한, 인위적인 또는 인위적인 것이 아닌 돌연변이로 인해서, 모든 자손의 DNA 내용이 정확히 동일하지는 않을 수 있음이 또한 이해된다. 최초 형질변환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가진 돌연변이 자손이 포함된다. 다른 의미가 의도된 경우는 문맥으로부터 명백할 것이다.
"치료 또는 치료하는"이란 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치를 모두 나타내는 것으로서, 이 때 목적은 표적 병리학적 상태 또는 장애를 방지하거나 또는 진행을 늦추는 (약화시키는) 것이다. 치료를 요하는 자들에는, 이미 상기 장애를 가진 자들 뿐 아니라, 상기 장애를 가지기 쉬운 자들 또는 상기 장애가 예방되어야 할 자들이 포함된다. 따라서, 본원에서 치료 대상인 포유류은 상기 장애를 가진 것으로 진단된 것일 수도 있고 또는 상기 장애에 걸리기 쉬운 또는 그에 취약한 것일 수도 있다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장 또는 사멸을 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 상태를 나타내거나 또는 기재한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프계 종양 (lymphoid malignancies)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 암의 더 구체적인 예에는 편평 세포 암 (예를 들어 편평 상피 세포 암), 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암 및 폐의 편평 암종을 포함하는 폐암, 복막의 암, 간세포 암, 위장관 암을 포함하는 위(gastric 또는 stomach)암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포 선종 (hepatoma), 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장 또는 콩팥암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종 뿐 아니라 두경부암이 포함된다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예에는 하기가 포함된다: 알킬화제, 예컨대 티오테파 (thiotepa) 및 시클로포스파미드 (CYTOXANTM); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판 (busulfan), 임프로설판 (improsulfan) 및 피포설판 (piposulfan); 아지리딘, 예컨대 벤조도파 (benzodopa), 카르보쿠온 (carboquone), 메투레도파 (meturedopa), 및 우레도파 (uredopa); 알트레타민 (altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올멜라민 (trimethylolmelamine) 을 포함하는 메틸올멜라민 (methylolmelamine) 및 에틸렌이민; 질소 머스터드, 예컨대 클로람부실 (chlorambucil), 클로르나파진 (chlornaphazine), 콜로포스파미드 (cholophosphamide), 에스트라무스틴 (estramustine), 이포스파미드 (ifosfamide), 메클로레타민 (mechlorethamine), 메클로레타민 옥시드 하이드로클로라이드, 멜팔란 (melphalan), 노벰비킨 (novembichin), 페네스테린 (phenesterine), 프레드니무스틴 (prednimustine), 트로포스파미드 (trofosfamide), 우라실 머스타드 (uracil mustard); 니트로스우레아 (nitrosurea), 예컨대 카르무스틴 (carmustine), 클로로조토신 (chlorozotocin), 포테무스틴 (fotemustine), 로무스틴 (lomustine), 니무스틴 (nimustine), 라니무스틴 (ranimustine); 항생제, 예컨대 아클라시노마이신 (aclacinomycin), 악티노마이신 (actinomycin), 안트라마이신 (anthramycin), 아자세린 (azaserine), 블레오마이신 (bleomycin), 칵티노마이신 (cactinomycin), 칼리케아미신 (calicheamicin), 카라비신 (carabicin), 카르노마이신 (carnomycin), 카르지노필린 (carzinophilin), 크로모마이신 (chromomycin), 닥티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 데토루비신 (detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신 (epirubicin), 에소루비신 (esorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 마르셀로마이신 (marcellomycin), 미토마이신 (mitomycin), 마이코페놀산 (mycophenolic acid), 노갈라마이신 (nogalamycin), 올리보마이신 (olivomycin), 페플로마이신 (peplomycin), 포트피로마이신 (potfiromycin), 푸로마이신 (puromycin), 쿠엘라마이신 (quelamycin), 로도루비신 (rodorubicin), 스트렙토니그린 (streptonigrin), 스트렙토조신 (streptozocin), 투베르시딘 (tubercidin), 우베니멕스 (ubenimex), 지노스타틴 (zinostatin), 조루비신 (zorubicin); 항-대사물, 예컨대 메토트랙세이트 (methotrexate) 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린 (denopterin), 메토트랙세이트, 프테로프테린 (pteropterin), 트리메트렉세이트 (trimetrexate); 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈 (fludarabine), 6-메르캅토퓨린, 티아미프린 (thiamiprine), 티오구아닌 (thioguanine); 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈 (ancitabine), 아자시티딘 (azacitidine), 6-아자우리딘 (6-azauridine), 카르모푸르 (carmofur), 시타라빈 (cytarabine), 디데옥시우리딘 (dideoxyuridine), 독시플루리딘 (doxifluridine), 에노시타빈 (enocitabine), 플록서리딘 (floxuridine), 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론 (calusterone), 드로모스타놀론 프로피오네이트 (dromostanolone propionate), 에피티오스타놀 (epitiostanol), 메피티오스탄 (mepitiostane), 테스토락톤 (testolactone); 항-부신제 (anti-adrenal), 예컨대 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide), 미토탄 (mitotane), 트리로스탄 (trilostane); 엽산 보충물, 예컨대 폴린산 (folinic acid); 아세글라톤 (aceglatone); 알도포스파미드 글리코시드 (aldophosphamide glycoside); 아미노레불린산 (aminolevulinic acid); 암사크린 (amsacrine); 베스트라부실 (bestrabucil); 비산트렌 (bisantrene); 에다트락세이트 (edatraxate); 데포파민 (defofamine); 데메콜신 (demecolcine); 디아지쿠온 (diaziquone); 엘포르미틴 (elformithine); 엘리프티늄 아세테이트 (elliptinium acetate); 에토글루시드 (etoglucid); 갈륨 니트레이트 (gallium nitrate); 하이드록시우레아; 렌티난 (lentinan); 로니다민 (lonidamine); 미토구아존 (mitoguazone); 미토잔트론 (mitoxantrone); 모피다몰 (mopidamol); 니트라크린 (nitracrine); 펜토스타틴 (pentostatin); 페나메트 (phenamet); 피라루비신 (pirarubicin); 포도필린산 (podophyllinic acid); 2-에틸히드라지드 (2-ethylhydrazide); 프로카르바진 (procarbazine); PSK®; 라족산 (razoxane); 시조피란 (sizofiran); 스피로게르마늄 (spirogermanium); 테누아존산 (tenuazonic acid); 트리아지쿠온 (triaziquone); 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄 (urethan); 빈데신 (vindesine); 다카르바진 (dacarbazine); 만노무스틴 (mannomustine); 미토브로니톨 (mitobronitol); 미토락톨 (mitolactol); 피포브로만 (pipobroman); 가시토신 (gacytosine); 아라비노시드 (arabinoside) ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁산 (taxane), 예를 들어 파클리탁셀 (paclitaxel) (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀 (docetaxel) (TAXOTERE®, Aventis, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈 (gemcitabine); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트랙세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 (cisplatin) 및 카르보플라틴 (carboplatin); 빈블라스틴 (vinblastine); 백금; 에토포시드 (etoposide) (VP-16); 이포스파미드 (ifosfamide); 미토마이신 C (mitomycin C); 미토잔트론; 빈크리스틴 (vincristine); 비노렐빈 (vinorelbine); 나벨빈 (navelbine); 노반트론 (novantrone); 테니포시드 (teniposide); 다우노마이신 (daunomycin); 아미노프테린 (aminopterin); 젤로다 (xeloda); 이반드로네이트 (ibandronate); CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신 (esperamicin); 카페시타빈 (capecitabine); 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체. 상기 정의에는 또한 하기가 포함된다: 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예컨대 항-에스트로겐, 예를 들어 타목시펜 (tamoxifen), 랄록시펜 (raloxifene), 아로마타제 (aromatase) 저해 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜 (trioxifene), 케옥시펜 (keoxifene), LY117018, 오나프리스톤 (onapristone), 및 토레미펜 (toremifene) (Fareston); 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드 (flutamide), 닐루타미드 (nilutamide), 비카루타미드 (bicalutamide), 류프롤리드 (leuprolide), 및 고세렐린 (goserelin); 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체.
치료를 목적으로 하는 "포유류"는, 인간, 마우스, SCID 또는 누드 마우스 또는 마우스 종, 가축 및 사육 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 양, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는, 포유류로 분류되는 임의의 동물을 나타낸다. 바람직하게는, 본원에서 포유류는 인간이다.
"올리고뉴클레오티드"는 공지된 방법으로 화학적으로 합성된 짧은 길이의, 단일- 또는 이중-가닥 폴리데옥시뉴클레오티드이다(예컨대, 1988년 5월 4일 공개된 EP 266,032 에 기재된 것과 같은 고체상 기법들을 사용하거나 또는 문헌 [Froehler 등, Nucl . Acids Res ., 14:5399-5407, 1986]에 기재된 바와 같은 데옥시뉴클레오시드 H-포스포네이트 중간체를 통한, 포스포트리에스테르, 포스파이트, 또는 포스포라미다이트 화학). 이들은 그 후 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정제된다.
본 발명에 따르면, 비-인간 (예를 들어 쥐과) 면역글로불린의 "인간화" 및/또는 "키메라" 형태는 원래의 항체와 비교하여, 인간 항-마우스 항체 (HAMA), 인간 항-키메라 항체 (HACA) 또는 인간 항-인간 항체 (HAHA) 반응의 감소를 야기하는 특정 키메라 면역글로불린, 이들의 면역글로불린 사슬 또는 절편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체들의 기타 항원-결합 하위서열)을 포함하고, 목적하는 효과를 재현하는데 필요한, 상기 비-인간 면역글로불린에서 유래한 필수 부분 (예를 들어 CDR(들), 항원 결합 부위(들), 가변 영역(들) 등)을 포함하는 한편, 동시에 상기 비-인간 면역글로불린에 필적하는 결합 특징을 보유하는 항체를 나타낸다. 대부분, 인간화 항체는, 수용자 항체의 상보성 결정 부위 (CDR)의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 가진 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 랫트 또는 토끼의 CDR의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 Fv 구조형성 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 FR 잔기로 대체된다. 더욱이, 상기 인간화 항체는 수용자 항체나 이입되는 CDR 또는 FR 서열에는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하고 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상의, 전형적으로는 2개의, 가변 영역을 실질적으로 모두 포함할 것인데, 이 때 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 부위는 비-인간 면역글로불린의 것에 해당하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기는 인간 면역글로불린 공통 서열의 잔기이다. 상기 인간화 항체는 최적으로는 또한 면역글로불린 불변 부위 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 것이다.
"탈-면역화" 항체는 주어진 종에 대해 비-면역원성이거나, 또는 면역원성이 보다 덜한 면역글로불린이다. 탈-면역화는 상기 항체에 구조적 변경을 가하여 달성할 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 탈-면역화 기술이 사용될 수 있다. 항체를 탈-면역화하는 한 가지 적절한 기술은, 예를 들어 2000년 6월 15일 공개된 WO 00/34317에 기재되어 있다.
"세포자멸사"를 유도하는 항체는 임의 수단에 의해, 이에 제한되는 것은 아니나 아넥신 V (annexin V)의 결합, 카스파제 (caspase) 활성, DNA 파편화, 세포 수축, 소포체 팽창, 세포 파편화, 및/또는 막 소포 (아포토시스 소체로 불림) 형성으로 예증되는, 예정된 세포사를 유도하는 항체이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "항체 유도성 세포독성"은 IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 하이브리도마 상청액 또는 항체로부터 유래된 세포독성 효과를 의미하는 것으로 이해되며, 상기 효과는 반드시 결합 정도에 관련되지는 않는다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 하이브리도마 세포주 뿐 아니라 이로부터 생성된 단리된 단클론 항체는 대안적으로는 이들의 내부적 호칭인, AR104A1289.2.2 또는 기탁 명칭인, IDAC 190607-04로 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같은 "항체-리간드"에는 표적 항원이 하나 이상의 에피토프에 대해 결합 특이성을 나타내는 부분이 포함되고, 이는 IDAC 190607-04 (IDAC 190607-04 항원)로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 단리된 단클론 항체에 의해 결합된 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인지 및 결합하는, 완전한 항체 분자, 항체 절편 및 적어도 항원-결합 부위 또는 그의 일부분 (즉, 항체 분자의 가변 부분)을 갖는 임의의 분자, 예를 들어 Fv 분자, Fab 분자, Fab' 분자, F(ab')2 분자, 이특이성 항체, 융합 단백질 또는 임의의 유전적으로 조작된 분자일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "암성 질환 변형 항체" (CDMAB)는 환자에 유익한 방식으로, 예를 들어 종양 존재량을 감소시키거나 또는 종양을 가진 개인의 생존을 연장시키는 것으로 암성 질환 과정을 변형하는 단클론 항체 및 이의 항체-리간드를 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같은 "항원-결합 부위"는 표적 항원을 인지하는 분자의 일부분을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "경쟁적으로 억제하다"는 통상의 상호 (reciprocal) 항체 경쟁 검정을 사용하여 IDAC 190607-04 (IDAC 190607-04 항체)로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 단클론 항체가 유도되는 결정인자 위치를 인지하여 결합할 수 있는 것을 의미한다 (Belanger L., Sylvestre C. and Dufour D. (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta 48, 15).
본원에서 사용된 바와 같은 "표적 항원"은 IDAC 190607-04 항원 또는 이의 일부분이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "면역접합체"는 세포독소, 방사능제 (radioactive agent), 효소, 독소, 항-종양 약물 또는 치료제에 화학적으로 또는 생물학적으로 연결된 항체와 같은 임의의 분자 또는 CDMAB를 의미한다. 상기 항체 또는 CDMAB는, 해당 표적에 결합할 수 있는 한, 상기 분자 상의 임의의 위치에서 세포독소, 방사능제, 항-종양 약물 또는 치료제에 연결될 수 있다. 면역접합체의 예에는, 항체 독소 화학 접합체 및 항체-독소 융합 단백질이 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "융합 단백질"은 항원 결합 부위가 생물학적으로 활성인 분자, 예를 들어 독소, 효소에 연결된 임의의 키메라 단백질 또는 단백질 약물을 의미한다.
본원에 기재된 발명을 더욱 완전히 이해할 수 있도록, 하기에 상세히 설명한다.
본 발명은 IDAC 190607-04 항원을 특이적으로 인지 및 이와 결합하는 CDMAB (즉, IDAC 190607-04 CDMAB)를 제공한다.
IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 CDMAB는, 이것이 이의 표적 항원에 대한 하이브리도마 IDAC 190607-04에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 면역특이적 결합을 경쟁적으로 억제하는 항원-결합 부위를 갖는 한, 임의의 형태일 수 있다. 따라서, IDAC 190607-04 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는 임의의 재조합 단백질 (예를 들어, 항체가 제 2 단백질, 예컨대 림포카인 또는 종양 억제 성장 인자와 조합된 융합 단백질)이 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명의 한 구현예에서, CDMAB는 IDAC 190607-04 항체이다.
다른 구현예에서, CDMAB는 IDAC 190607-04 항체의 항원-결합 부위를 갖는 Fv 분자 (예컨대 단쇄 Fv 분자), Fab 분자, Fab' 분자, F(ab')2 분자, 융합 단백질, 이특이성 항체, 이종항체 또는 임의의 재조합 분자일 수 있는 항원 결합 절편이다. 본 발명의 CDMAB는 IDAC 190607-04 단클론 항체가 유도되는 에피토프로 유도된다.
본 발명의 CDMAB를 분자 내의 아미노산 변형으로 변형시켜, 유도체 분자를 생성할 수 있다. 화학적 변형이 또한 가능할 수 있다.
유도체 분자는 상기 폴리펩티드의 기능적 특성을 보유할 것인데, 즉, 상기와 같은 치환을 가진 분자는 여전히 IDAC 190607-04 항원 또는 이의 일부분에 대한 상기 폴리펩티드의 결합을 가능하게 할 것이다.
이러한 아미노산 치환에는, 반드시 이에 제한되는 것은 아니나 당업계에 "보존적인 것"으로 공지된 아미노산 치환이 포함된다.
예를 들어, 해당 단백질의 형태나 기능을 변경시키지 않는, "보존적 아미노산 치환"으로 일컬어지는 특정 아미노산 치환이 종종 단백질 내에서 이루어질 수 있다는 것은 단백질 화학에 있어서 잘 확립된 원리이다.
이러한 변경에는, 이소류신 (I), 발린 (V), 및 류신 (L) 중 임의의 것을 이들 소수성 아미노산 중 임의의 다른 것으로; 아스파르트산 (D)을 글루탐산 (E)으로 및 그 반대로; 글루타민 (Q)을 아스파라긴 (N)으로 및 그 반대로; 및 세린 (S)을 트레오닌 (T)으로 및 그 반대로 치환하는 것이 포함된다. 다른 치환들도 또한, 특정 아미노산의 환경 및 해당 단백질의 3차원 구조 내에서의 그의 역할에 따라 보존적인 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 글리신 (G) 및 알라닌 (A)은 빈번히 상호교환가능하며, 알라닌 및 발린 (V)도 마찬가지이다. 메티오닌 (M)은 비교적 소수성인 것으로서, 류신 및 이소류신과 빈번히, 및 발린과 간혹 상호교환될 수 있다. 리신 (K) 및 아르기닌 (R)은, 해당 아미노산 잔기의 유의한 특징이 그의 전하이며 이들 두 아미노산 잔기의 상이한 pK가 유의하지 않은 위치에서 빈번히 상호교환가능하다. 또 다른 변경들도 특정 환경에서 "보존적"인 것으로 간주될 수 있다.
도 1은 세포주 Lovo, MDA-MB-231, OVCAR-3 및 CCD-27sk에 대한 세포독성% 및 하이브리도마 상청액의 결합 수준을 비교한다.
도 2는 암 및 정상 세포주에 대한 AR104A1289.2.2의 결합을 나타낸다. 데이터는 동형 (isotype) 대조군을 초과하는 배수 증가로서 평균 형광 세기를 나타내도록 표로 나타낸다.
도 3은 여러 암 및 비-암 세포주에 대해 유도된 AR104A1289.2.2 및 항-EGFR 항체의 대표적 FACS 분포도를 포함한다.
도 4는 예방적 BxPC-3 췌장암 모델에서의 종양 성장에 대한 AR104A1289.2.2의 효과를 입증한다. 수직의 점선은 항체가 투여되는 동안의 기간을 나타낸다. 데이터점은 평균 +/- SEM을 나타낸다.
도 5는 예방적 BxPC-3 췌장암 모델에서의 체중에 대한 AR104A1289.2.2의 효과를 입증한다. 데이터점은 평균 +/- SEM을 나타낸다.
도 6은 예방적 MDA-MB-231 유방암 모델에서의 종양 성장에 대한 AR104A1289.2.2의 효과를 입증한다. 수직의 점선은 항체가 투여되는 동안의 기간을 나타낸다. 데이터점은 평균 +/- SEM을 나타낸다.
도 7은 예방적 MDA-MB-231 유방암 모델에서의 체중에 대한 AR104A1289.2.2의 효과를 입증한다. 데이터점은 평균 +/- SEM을 나타낸다.
도 8은 예방적 PC-3 전립선암 모델에서의 종양 성장에 대한 AR104A1289.2.2의 효과를 입증한다. 수직의 점선은 항체가 투여되는 동안의 기간을 나타낸다. 데이터점은 평균 +/- SEM을 나타낸다.
도 9는 예방적 PC-3 전립선암 모델에서의 체중에 대한 AR104A1289.2.2의 효과를 입증한다. 데이터점은 평균 +/- SEM을 나타낸다.
실시예 1
하이브리도마 생성 - 하이브리도마 세포주 AR104A1289.2.2
하이브리도마 세포주 AR104A1289.2.2는, 부다페스트 조약에 따라, 캐나다 국제 기탁 기관 (IDAC), 캐나다, R3E 3R2, 마니토바, 위니펙, 알링턴 스트리트 1015, 캐나다 보건청 국립 미생물학 연구소에 2007년 6월 19일에, 등록 번호 190607-04로 기탁되었다. 37 CFR 1.808에 따라, 기탁자는 기탁 물질의 공공에 대한 활용성에 대해 강요된 모든 제한이 특허의 인가 시 최종적으로 제거될 것임을 확인하였다. 기탁에서 생존 검체가 분배될 수 없다면 기탁물은 대체될 것이다.
항-암 항체 AR104A1289.2.2를 생성하는 하이브리도마를 생성시키기 위해, 동결된 인간 복막액 (사전 동의로 수득된 환자 기증물)으로부터 단리된 전이성 난소 암종과 일치하는 악성 세포를 PBS에서 제조하였다. IMMUNEASYTM (Qiagen, Venlo, Netherlands) 보강제를 사용하기 위해 부드러운 혼합으로 제조하였다. 5 내지 7주령 BALB/c 마우스를, 항원-보강제의 50 μl 중 천만개 세포를 피하 주사하여 면역화시켰다. 최근에 제조된 항원-보강제를 사용하여, 면역화된 마우스를 복강내로, 초기 면역화 2 내지 5주 후, 50 μl 중 천만개 세포를 사용하여 부스팅시켰다. 마지막 면역화 3일 후 융합에 비장을 사용하였다. 단리된 비장세포를 NSO-1 골수종 파트너와 융합시켜 하이브리도마를 제조하였다. 융합물로부터의 상청액을 하이브리도마의 서브클론으로부터 시험하였다.
하이브리도마 세포에 의해 분비된 항체가 IgG 또는 IgM 동형인지 측정하기 위해, ELISA 검정을 사용하였다. 4℃에서 코팅 완충액 (0.1 M 카르보네이트/바이카르보네이트 완충액, pH 9.2~9.6) 중 2.4 μg/mL의 농도에서의 염소 항-마우스 IgG + IgM (H+L)을 100 μl/웰로 ELISA 플레이트에 하룻밤 동안 첨가하였다. 상기 플레이트를 세척 완충액 (PBS + 0.05% 트윈)에서 3회 세척하였다. 100 μl/웰 블로킹 완충액 (세척 완충액 중 5% 밀크)을 1시간 동안 실온에서 상기 플레이트에 첨가한 후, 세척 완충액에서 3회 세척하였다. 100 μl/웰의 하이브리도마 상청액을 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, 염소 항-마우스 IgG 또는 IgM 서양고추냉이 과산화효소 접합체의 1/100,000 희석물 (5% 밀크 함유 PBS에서 희석된)을, 100 μl/웰로 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 상기 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 100 μl/웰의 TMB 용액을 1~3분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 50 μl/웰 2M H2S04를 첨가하여 착색 반응을 종결하고, Perkin-Elmer HTS7000 플레이트 판독기로 450 nm에서 플레이트를 판독하였다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, AR104A1289.2.2 하이브리도마는 IgG 동형의 항체를 주로 분비하였다.
하이브리도마 세포에 의해 분비된 항체의 하위부류를 측정하기 위해, 마우스 단클론 항체 동형화 키트 (HyCult Biotechnology, Frontstraat, Netherlands)를 사용하여 동형화 실험을 수행하였다. 500 μl의 완충 용액을, 랫트 항-마우스 하위부류 특이적 항체를 함유하는 시험 조각에 첨가하였다. 500 μl의 하이브리도마 상청액을 시험관에 첨가하고, 부드럽게 휘저어 침수시켰다. 콜로이드성 입자와 연결되는 제 2 랫트 단클론 항체로써, 포획된 마우스 면역글로불린을 직접적으로 검출하였다. 이들 두 단백질의 조합은 동형 분석에 사용되는 시각적 신호를 생성시켰다. 항-암 항체 AR104A1289.2.2는 IgG2a, 카파 동형의 항체였다.
한정 희석의 단계 후, 세포 ELISA 검정에서, 표적 세포에 결합하는 항체에 대해 하이브리도마 상청액을 시험하였다. 1개 인간 결장암 세포주, 1개 인간 유방암 세포주, 1개 인간 난소 세포주 및 1개 인간 비-암 피부 세포주를 시험하였다: 각각 Lovo, MDA-MB-231, OVCAR-3 및 CCD-27sk. 모든 세포주는 미국 미생물 보존 센터 (ATCC, Manassas, VA)로부터 수득하였다. 플레이팅된 세포를 사용 전에 고정시켰다. MgCl2 및 CaCl2를 함유하는 PBS로 플레이트를 실온에서 3회 세척하였다. 100 μl의, PBS에서 희석된 2% 파라포름알데히드를 각각의 웰에 10분 동엔 실온에서 첨가한 후 폐기하였다. MgCl2 및 CaCl2를 함유하는 PBS로 플레이트를 실온에서 다시 3회 세척하였다. 세척 완충액 (PBS + 0.05% 트윈) 중 5% 밀크 100 μl/웰로 1시간 동안 실온에서 블로킹을 수행하였다. 상기 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, 75 μl/웰로 하이브리도마 상청액을 1시간 동안 실온에서 첨가하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, 서양고추냉이 과산화효소와 접합된 염소 항-마우스 IgG 또는 IgM 항체의 1/25,000 희석물 (5% 밀크 함유 PBS에서 희석된)을 100 μl/웰로 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, 100 μl/웰의 TMB 기질을 1~3시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 50 μl/웰 2M H2S04로 반응을 종결하고, Perkin-Elmer HTS7000 플레이트 판독기로 450 nm에서 플레이트를 판독하였다. 도 1에 표로 나타낸 바와 같은 결과는 시험한 세포주에 결합하지 않는 것으로 이미 나타났던 사내 (in-house) IgG 동형 대조군과 비교하여 배경을 초과하는 배수로서 표현되었다. 하이브리도마 AR104A1289.2.2로부터의 항체는, Lovo 결장암, MDA-MB-231 유방암 및 CCD-27sk 비-암 피부 세포주에 대한 검출가능한 결합을 나타내었다.
항체 결합에 대한 시험과 함께, 하이브리도마 상청액의 세포독성 효과 (항체 유도성 세포독성)를 하기의 세포주에서 시험하였다: Lovo, MDA-MB-231, OVCAR-3 및 CCD-27sk. Molecular Probes (Eugene, OR)로부터 칼세인 AM을 수득하고, 하기에 개략적으로 나타낸 바와 같이 검정을 수행하였다. 검정 전에 세포를 사전측정된 적정한 밀도에서 플레이팅하였다. 2일 후, 하이브리도마 마이크로타이터 플레이트로부터의 75 μl의 상청액을 세포 플레이트로 옮기고, 5% CO2 인큐베이터에서 5일 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로서 역할하는 웰을 빌 때까지 뽑아내고, 배양 배지에 용해된 100 μl의 나트륨 아지드 (NaN3, 0.1%, Sigma, Oakville, ON) 또는 시클로헥스이미드 (CHX, 0.5 μM, Sigma, Oakville, ON)를 첨가하였다. 처리 5일 후, 인버팅 및 블럿팅 건조로 플레이트를 비웠다. MgCl2 및 CaCl2를 함유하는 실온 DPBS (둘베코 포스페이트 완충 식염수)를 다중채널 압착 병 (squeeze bottle)으로부터 각각의 웰에 분배하고, 3회 두드리고, 인버팅 후 블럿팅 건조로 웰을 비웠다. MgCl2 및 CaCl2를 함유하는 DPBS에서 희석된 50 μl의 형광 칼세인 염료를 각각의 웰에 첨가하고, 5% CO2 인큐베이터에서 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. Perkin-Elmer HTS7000 형광 플레이트 판독기에서 상기 플레이트를 판독하고, 데이터를 마이크로소프트 엑셀에서 분석하였다. 결과를 도 1에 표로 나타내었다. AR104A1289.2.2 하이브리도마로부터의 상청액은 Lovo 세포 상에서 15%의 특이적 세포독성을 일으켰다. Lovo에 대한 양성 대조군 나트륨 아지드 및 시클로헥스이미드로 수득된 세포독성은 각각 500% 및 31%였다. 비-암 피부 세포주 CCD-27sk에 대한 관찰가능한 세포독성은 없었다. 공지된 비-특이적 세포독성제 시클로헥스이미드 및 NaN3은 일반적으로, 기대한 바와 같은 세포독성을 일으켰다.
도 1로부터의 결과는 상이한 세포주 상에서의 AR104A1289.2.2의 세포독성 효과가 결합 수준과 관련되지 않았다는 것을 입증한다. MDA-MB-231 세포주에 대한 가장 높은 수준의 결합이 있었으나, 가장 높은 수준의 세포독성은 Lovo 세포주에 대해서 유도되었다. AR104A1289.2.2는, CCD-27sk 비-암 피부 세포주에 대해 결합하였음에도 불구하고, 여기서 세포독성을 일으키지 않았다. 그러므로 상기 항체는 기능적 특이성을 나타내어, 이는 결합 정도와 반드시 관련되지는 않았다.
실시예 2
시험관내 결합
수집 및 재접종 (주당 2회 발생)으로 CL-1000 플라스크 (BD Biosciences, Oakville, ON)에서 하이브리도마를 배양하여, AR104A1289.2.2 단클론 항체를 생성시켰다. 단백질 G 세파로오스 4 패스트 플로우 (Amersham Biosciences, Baie d'Urfe, QC)를 사용하는 표준 항체 정제 방법을 따랐다. 인간화된, 탈-면역화된, 키메라 또는 쥐과인 단클론 항체를 이용하는 것은 본 발명의 범주 내에 있다.
AR104A1289.2.2의 난소 (ES-2, OV2008, OVCAR-3 및 SK-OV-3), 유방 (MDA-MB-231 및 SK-BR-3), 폐 (A549), 췌장 (BxPC-3), 결장 (Lovo) 및 전립선 (PC-3) 암세포주, 및 피부 (CCD-27sk)로부터의 비-암 세포주로의 결합을 흐름 세포측정 (FACS)으로 평가하였다. 난소암 세포주 중 두 개를 제외한 모든 세포주는 미국 미생물 보존 센터 (ATCC, Manassas, VA)로부터 수득하였다. OV2008 및 ES-2 난소암 세포주는 오타와 지역 암 센터 (Ottawa, ON)로부터 수득하였다.
DPBS (Ca++ 및 Mg++이 없는)로 세포 단일층을 초기 세척하여, FACS를 위해 세포를 제조하였다. 이후 세포 해리 완충액 (Invitrogen, Burlington, ON)을 사용하여 37℃에서 세포 배양 플레이트로부터 이들 세포를 제거시켰다. 원심분리 및 수집 후, MgCl2, CaCl2 및 2% 소 태아 혈청을 함유하는 DPBS에서 4℃에서 세포를 재현탁 (염색 배지)하고 계수하고, 적정한 세포 밀도로 분주하고, 세포를 펠릿화시키기 위해 회전 강하시키고 시험 항체 (AR104A1289.2.2) 또는 대조군 항체 (동형 대조군, 항-EGFR (c225, IgG1, 카파, Cedarlane, Hornby ON))의 존재 하에 4℃에서 염색 배지에 재현탁하였다. 동형 대조군 및 시험 항체를 20 μg/mL에서 평가한 반면, 항-EGFR은 5 μg/mL에서, 얼음에서 30분 동안 평가하였다. Alexa Fluor 546-접합된 제 2 항체의 첨가 전, 세포를 염색 배지로 1회 세척하였다. 염색 배지 중 Alexa Fluor 546-접합된 항체를 이후 30분 동안 4℃에서 첨가하였다. 이후 세포를 마지막으로 세척하고 고정 배지 (1.5% 파라포름알데히드를 함유하는 염색 배지)에서 재현탁시켰다. FACSarrayTM 시스템 소프트웨어 (BD Biosciences, Oakville, ON)를 사용하여 FACSarrayTM 상에서 검체를 실행시켜 세포의 흐름 세포측정 획득을 평가하였다. 세포의 전방 산란 (FSC) 및 측방 산란 (SSC)을, FSC 및 SSC 검출기에서의 전압 및 진폭 획득값을 조정함으로써 설정하였다. 비염색된 세포를 실행시켜 세포가 약 1~5 단위의 형광 세기 중간값으로 균일한 피크를 갖게 함으로써, 형광에 대한 검출기 (Alexa-546) 채널을 조정하였다. 각각의 검체에 대해, 약 10,000 게이트 사건 (염색된 고정 세포)을 분석을 위해 획득하였고, 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 동형 대조군을 초과하는 평균 형광 세기 배수 증가를 나타낸다. AR104A1289.2.2 항체의 대표적 분포도를 도 3에 대해 종합하였다. AR104A1289.2.2는, 난소암 세포주 OVCAR-3 및 결장암 세포주 Lovo를 제외하고, 시험 세포주에 대한 결합이 입증되었다. 난소 ES-2 (2.9-배), OV2008 (2.6-배) 및 SK-OV-3 (1.9-배); 유방 MDA-MB-231 (4.4-배) 및 SK-BR-3 (1.8-배); 폐 A549 (5.2-배); 췌장 BxPC-3 (7.3-배) 및 전립선 PC-3 (9.5-배) 암세포주, 및 비-암 피부 세포주 CCD-27sk (2.0-배)에 대한 결합이 존재하였다. 이들 데이터는 AR104A1289.2.2가 다양한 수준의 항원 발현으로 여러 상이한 암 세포주에 대해 결합한다는 것을 입증하였다.
실시예 3
BxPC-3 세포를 이용한 생체내 종양 실험
실시예 1은 AR104A1289.2.2가 인간 암 세포주에 대해 항-암 특성을 갖는다는 것을 입증하였다. 인간 암 세포주에 대한 생체내 효능을 입증하기 위해, AR104A1289.2.2를 BxPC-3 췌장암 이종이식 모델에서 시험하였다. 도 4 및 도 5와 관련하여, 6 내지 8주령 암컷 SCID 마우스에 100 μl PBS 용액 중 5백만개 인간 췌장암 세포 (BxPC-3)를 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하여 이식하였다. 상기 마우스를 8마리씩 2개의 처리군으로 무작위하게 나누었다. 이식 후 1일에, 저장 농축액을 2.7 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 20 mM Na2HPO4를 함유하는 희석제로 희석한 후, 20 mg/kg의 AR104A1289.2.2 시험 항체 또는 완충액 대조군을 300 μl의 부피로 각각의 세대에 대해 복강내 투여하였다. 이후 상기 항체 및 대조군 검체를, 연구 기간 동안 주 1회 투여하였다. 종양 성장을 약 매 7일 모두 캘리퍼스 (calipers)로 측정하였다. 상기 연구를 항체 8회 용량 후 완료하였다. 연구 기간 동안 주 1회 동물의 체중을 기록하였다. 연구의 말미에서 모든 동물을 CCAC 지침에 따라 안락사시켰다.
AR104A1289.2.2는 인간 췌장암의 BxPC-3 생체내 예방 모델에서 종양 성장을 감소시켰다. Arius 항체 AR104A1289.2.2로의 처리는, 항체의 마지막 용량 후 6일인 56일에 측정된 바와 같이 완충액 처리군과 비교하여, 53.3% (p=0.0010, t-시험)로 BxPC-3 종양의 성장을 감소시켰다 (도 4).
연구 전체에 걸쳐 독성의 임상적 징후는 없었다. 주 간격으로 측정된 체중은 웰-빙 및 번식 실패에 대한 대리지표였다 (도 5). 치료 기간의 말미에서 군들 사이의 평균 체중의 유의한 차이는 없었다. 또한, 연구의 시작에서 끝까지 각각의 군 내에서 평균 체중의 유의한 차이는 없었다.
요약하여, AR104A1289.2.2는 인간 췌장암 이종이식 모델에서 잘 용인되었고, 종양 존재량을 감소시켰다.
실시예 4
MDA-MB-231 세포를 이용한 생체내 종양 실험
실시예 1 및 3은 AR104A1289.2.2가 인간 결장암 및 췌장암 증상에 대해 항-암 특성을 갖는다는 것을 입증하였다. 인간 유방암 모델에서의 효능을 입증하기 위해, AR104A1289.2.2를 MDA-MB-231 유방암 이종이식 모델에서 시험하였다. 도 6 및 도 7과 관련하여, 6 내지 8주 암컷 SCID 마우스에 100 μl PBS 용액 중 5백만개 인간 유방암 세포 (MDA-MB-231)를 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하여 이식하였다. 상기 마우스를 8마리씩 2개의 처리군으로 무작위하게 나누었다. 이식 후 1일에, 저장 농축액을 2.7 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 20 mM Na2HPO4를 함유하는 희석제로 희석한 후, 20 mg/kg의 AR104A1289.2.2 시험 항체 또는 완충액 대조군을 300 μl의 부피로 각각의 세대에 대해 복강내 투여하였다. 이후 상기 항체 및 대조군 검체를, 연구 기간 동안 주 1회 투여하였다. 종양 성장을 약 매 7일 모두 캘리퍼스로 측정하였다. 상기 연구를 항체 8회 용량 후 완료하였다. 연구 기간 동안 주 1회 동물의 체중을 기록하였다. 연구의 말미에서 모든 동물을 CCAC 지침에 따라 안락사시켰다.
AR104A1289.2.2는 인간 유방암의 MDA-MB-231 생체내 예방 모델에서 종양 성장을 감소시켰다. Arius 항체 AR104A1289.2.2로의 처리는, 항체의 마지막 용량 후 26일인 76일에 측정된 바와 같이 완충액 처리군과 비교하여, 94.2% (p=0.0003, t-시험)로 MDA-MB-231 종양의 성장을 감소시켰다 (도 6).
연구 전체에 걸쳐 독성의 임상적 징후는 없었다. 주 간격으로 측정된 체중은 웰-빙 및 번식 실패에 대한 대리지표였다 (도 7). 치료 기간의 말미에서 군들 사이의 평균 체중의 유의한 차이는 없었다. 또한, 연구의 시작에서 끝까지 각각의 군 내에서 평균 체중의 유의한 차이는 없었다.
요약하여, AR104A1289.2.2는 인간 유방암 이종이식 모델에서 잘 용인되었고, 종양 존재량을 유의하게 감소시켰다.
실시예 5
PC-3 세포를 이용한 생체내 종양 실험
실시예 1, 3 및 4는 AR104A1289.2.2가 인간 결장암, 췌장암 및 유방암 증상에 대해 항-암 특성을 갖는다는 것을 입증하였다. 전립선암 모델에서의 효능을 입증하기 위해, AR104A1289.2.2를 PC-3 전립선암 이종이식 모델에서 시험하였다. 도 8 및 도 9와 관련하여, 6 내지 8주 암컷 SCID 마우스에 100 μl PBS 용액 중 1백만개 인간 전립선암 세포 (PC-3)를 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하여 이식하였다. 상기 마우스를 8마리씩 2개의 처리군으로 무작위하게 나누었다. 이식 후 1일에, 저장 농축액을 2.7 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 20 mM Na2HPO4를 함유하는 희석제로 희석한 후, 20 mg/kg의 AR104A1289.2.2 시험 항체 또는 완충액 대조군을 300 μl의 부피로 각각의 세대에 대해 복강내 투여하였다. 이후 상기 항체 및 대조군 검체를, 연구 기간 동안 주 1회 투여하였다. 종양 성장을 약 매 7일 모두 캘리퍼스로 측정하였다. 상기 연구를 항체 8회 용량 후 완료하였다. 연구 기간 동안 주 1회 동물의 체중을 기록하였다. 연구의 말미에서 모든 동물을 CCAC 지침에 따라 안락사시켰다.
AR104A1289.2.2는 인간 전립선암의 PC-3 생체내 예방 모델에서 종양 성장을 감소시켰다. Arius 항체 AR104A1289.2.2로의 처리는, 항체의 5번째 용량 후 4일인 33일에 측정된 바와 같이 완충액 처리군과 비교하여, 76.5% (p=0.0003, t-시험)로 PC-3 종양의 성장을 감소시켰다 (도 8). 모든 마우스는 33일에 아직 살아있었다. 연구는 마지막 용량 후 3일인 53일까지 지속되었다. 연구 결과변수였던 큰 종양 부피 및 종양 병변으로 인해, 대조군에서의 세 마리 마우스, 및 항체-처리군에서의 한 마리 마우스를 53일에 제거하였다. 그러나, 53일에, AR104A1289.2.2는 61.3% (p=0.0483, t-시험)로 PC-3 종양의 성장을 여전히 유의하게 감소시켰다.
연구 전체에 걸쳐 독성의 임상적 징후는 없었다. 주 간격으로 측정된 체중은 웰-빙 및 번식 실패에 대한 대리지표였다 (도 9). 연구의 시작에서 끝까지 완충액 처리군에서 평균 체중이 유의하게 감소하였다 (p=0.0001, t-시험). 그러나, 연구의 시작에서 끝까지 AR104A1289.2.2 처리된 마우스의 평균 체중에서는 유의한 차이가 없었다.
요약하여, AR104A1289.2.2는 인간 전립선암 이종이식 모델에서 잘 용인되었고, 종양 존재량을 유의하게 감소시켰다. AR104A1289.2.2는 4가지 상이한 인간 암 증상 (: 결장, 췌장, 유방 및 전립선암)에 대해 효능이 입증되었다. 처리 이득은, 인간을 포함하는 다른 포유류에서의 치료요법에 대한 상기 항체의 약리학적 및 약학적 이득을 제안하는 인간 암 질환의 몇몇 잘 인지된 모델에서 관찰되었다. 전체적으로, 상기 데이터는 AR104A1289.2.2 항원이 암 연관된 항원이며 인간 암 세포 상에서 발현되고, 병리학적으로 관련된 암 표적이라는 것을 입증하였다.
실시예 6
경쟁적 결합제의 단리
항체가 주어지면, 당업자들은 경쟁적으로 억제하는 CDMAB, 예를 들어 경쟁하는 항체를 생성할 수 있으며, 이는 동일한 에피토프를 인지하는 것이다 (Belanger L 등, Clinica Chimica Acta 48:15-18 (1973)). 한 가지 방법은 항체에 의해 인지되는 항원을 발현하는 면역원으로 면역화를 일으키는 것이다. 상기 검체에는 조직, 단리된 단백질(들) 또는 세포주(들)가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 생성된 하이브리도마는 경쟁적 검정을 사용하여 스크리닝될 수 있는데, 이는 시험 항체의 결합을 억제하는 항체를 확인하는 것으로, 예컨대, ELISA, FACS 또는 웨스턴 블럿팅이 있다. 또 다른 방법은 파지 디스플레이 항체 라이브러리 및 상기 항원의 하나 이상의 에피토프를 인지하는 항체에 대한 패닝 (panning)을 이용할 수 있다 (Rubinstein JL 등, Anal Biochem 314:294-300 (2003)). 모든 경우에서, 항체는 본래 표지된 항체의 결합을 그의 표적 항원의 하나 이상의 에피토프로 치환하는 그의 능력을 기준으로 선택된다. 그러므로, 상기 항체는 본래 항체처럼 항원의 하나 이상의 에피토프를 인지하는 특징을 갖는다.
실시예 7
AR104A1289.2.2 단클론 항체의 가변 부위의 클로닝
AR104A1289.2.2 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 단클론 항체의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)로부터 가변 부위의 서열을 측정할 수 있다. 구아니디늄 이소티오시아네이트로의 세포 가용화를 포함하는 표준 방법 (Chirgwin 등 Biochem. 18:5294-5299 (1979))을 사용하여, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 RNA를 대상 하이브리도마로부터 추출할 수 있다. mRNA를 사용하여, 당업계에 공지된 PCR 방법론에 의해 VH 및 VL 유전자의 후속 단리를 위한 cDNA를 제조할 수 있다 (Sambrook 등, eds., Molecular Cloning, 14장, Cold Spring Harbor laboratories Press, N.Y. (1989)). 중쇄 및 경쇄의 N-말단 아미노산 서열은 자동화 에드만 (Edman) 서열화로 독립적으로 측정될 수 있다. CDR 및 측면위치 FR의 추가적인 길이를 또한 VH 및 VL 절편의 아미노산 서열화로 측정할 수 있다. 합성 프라이머를 이후 AR104A1289.2.2 단클론 항체로부터의 VH 및 VL 유전자의 단리를 위해 설계할 수 있고, 상기 단리된 유전자를 서열화를 위한 적정한 벡터 내에 연결시킬 수 있다. 키메라 및 인간화 IgG를 생성하기 위해, 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역을 적정한 발현용 벡터에 서브클로닝할 수 있다.
(i) 단클론 항체
단클론 항체를 인코딩하는 DNA (실시예 1에 개략적으로 나타낸 바와 같음)는 통상의 과정을 사용하여 (예를 들어, 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 쉽게 단리 및 서열화된다. 상기 하이브리도마 세포는 상기 DNA에 대한 바람직한 공급원으로서 역할한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터에 위치시킬 수 있고, 그 다음 숙주 세포, 예컨대 대장균 (E.coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 (다르게는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는)에 트랜스펙션시켜 재조합 숙주 세포에서 단클론 항체를 합성하였다. 예를 들어, 동종 쥐과 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 대한 코딩 서열로 대체하여, 상기 DNA를 또한 변형시킬 수 있다. 키메라 또는 하이브리드 항체는 또한 가교결합제를 수반하는 것을 포함하는, 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 디설피드 교환 반응을 사용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 구성될 수 있다. 상기 목적에 적절한 시약의 예에는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트가 포함된다.
(ii) 인간화 항체
인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그것으로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "이입 (import)" 잔기로 언급되며, 이는 통상적으로 "이입" 가변 영역으로부터 얻어진다. 인간화는 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 대체하여, Winter 및 그의 동료들의 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (Jones 등, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 등, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen 등, Science 239:1534-1536 (1988); Clark, Immunol. Today 21:397-402 (2000)에서 재고됨).
인간화 항체는 모체 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 모체 서열 및 다양한 개념의 인간화 생성물에 대한 분석 방법에 의해 생성될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델이 통상적으로 활용가능하고, 이는 당업자에게 익숙하다. 컴퓨터 프로그램이 활용가능하고, 이는 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형상학적 구조를 도시하고 표시한다. 이렇게 나타난 것을 검토하는 것은 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 상기 잔기의 유사한 역할에 대한 분석, 즉, 그의 항원에 결합하도록 상기 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기에 대한 분석을 허용한다. 상기 방법으로, 원하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성을 얻도록, 컨센서스 및 이입 서열로부터 FR 잔기를 선택 및 조합할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적이고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미치는 것에 연관되어 있다.
(iii) 항체 절편
항체 절편의 생성을 위한 다양한 기술이 개발되고 있다. 이러한 절편은 재조합 숙주 세포에 의해 생성될 수 있다 (Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11:548-557 (1999); Little 등, Immunol. Today 21:364-370 (2000)에서 재고됨). 예를 들어, Fab'-SH 절편을 대장균에서 직접 회수하여 화학적으로 커플링하여 F(ab')2 절편을 형성시킬 수 있다 (Carter 등, Biotechnology 10:163-167 (1992)). 다른 구현예에서, F(ab')2 분자의 조립을 촉진하는 류신 지퍼 GCN4를 사용하여 F(ab')2 를 형성시켰다. 다른 접근법에 따르면, Fv, Fab 또는 F(ab')2 절편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다.
실시예 8
본 발명의 항체를 포함하는 조성물
본 발명의 항체를 암의 예방/치료를 위한 조성물로 사용할 수 있다. 본 발명의 항체를 포함하는, 암의 예방/치료를 위한 조성물은 저-독성이며, 액체 제제의 형태로, 또는 적절한 제제의 약학 조성물로서 인간 또는 포유류 (예를 들어 랫트, 토끼, 양, 돼지, 소과, 고양이과, 개과, 원숭이 등)에 경구적으로 또는 비경구적 (예를 들어 혈관 내, 복강 내, 피하 등)으로 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 그 자체로 투여될 수 있거나 적정한 조성물로서 투여될 수 있다. 상기 투여에 사용되는 조성물은 본 발명의 항체 또는 이의 염을 갖는 약리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 경구 또는 비경구 투여에 적절한 약학 제제의 형태로 제공된다.
비경구 투여를 위한 조성물의 예는 주사제, 좌제 등이다. 주사제는 정맥 내, 피하, 피부 내 및 근육 내 주사, 점적 주입, 관절 내 주사 등과 같은 투약 형태를 포함할 수 있다. 이들 주사제는 공지된 방법들에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어 주사제는, 본 발명의 항체 또는 이의 염을 주사액으로 통상적으로 사용되는 멸균 수성 매질 또는 유성 매질 중에 용해, 현탁 또는 유화시켜 제조될 수 있다. 주사용 수성 매질로서 예를 들어, 생리 식염수, 포도당 및 기타 보조제를 포함하는 등장액 등이 있는데, 이는 알코올 (예를 들어 에탄올), 다가알코올 (예를 들어 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온 계면활성제 (예를 들어 폴리소르베이트 80, HCO-50 (수소화된 피마자유의 폴리옥시에틸렌 (50 몰) 부가물)) 등과 같은 적정한 가용화제와 조합으로 사용될 수 있다. 유성 매질로서, 예를 들어 참깨유, 대두유 등을 이용하며, 이는 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 같은 가용화제와 조합으로 사용될 수 있다. 이렇게 제조된 주사액은 통상적으로 적정한 앰플에 채워진다. 직장 투여에 사용되는 좌제는 본 발명의 항체 또는 이의 염을 통상의 좌제용 기재와 배합하여 제조될 수 있다. 경구 투여용 조성물은 고체 또는 액체 제제를 포함하며, 상세하게는 정제 (당의정 (dragee) 및 필름 코팅된 정제를 포함), 알약, 과립, 분말 제제, 캡슐 (연질 캡슐 포함), 시럽, 유화제, 현탁액 등을 포함한다. 이러한 조성물은 공지된 방법에 의해 제조되며, 약학 제제 분야에서 통상적으로 사용되는 비히클 (vehicle), 희석제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 정제용 비히클 또는 부형제의 예는 락토오스, 전분, 수크로오스, 마그네슘 스테아레이트 등이다.
유리하게는, 상기 기재된 경구 또는 비경구적 사용을 위한 조성물은 상기 활성 성분의 용량에 맞춰진 적절한 단위 용량을 갖는 약학 제제로 제조된다. 상기 단위 용량 제제에는 예를 들어, 정제, 알약, 캡슐, 주사액 (앰플), 좌제 등이 포함된다. 상기 화합물의 함유량은 일반적으로 투약 단위 형태 당 5 내지 500 mg이며; 상기 기재된 항체가 특별히 주사 형태로는 약 5 내지 약 100 mg, 및 기타 형태로는 10 내지 250 mg으로 함유되는 것이 바람직하다.
본 발명의 항체를 포함하는 상기 예방/치료제 또는 조절자의 용량은 투여받는 대상, 표적 질환, 상태, 투여 경로 등에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 성인에서의 유방암을 치료/예방하기 위한 목적으로 사용되는 경우, 본 발명의 항체를 체중 1 kg 당 약 0.01 내지 약 20 mg, 바람직하게는 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 약 10 mg 및 보다 바람직하게는 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 약 5 mg의 용량으로, 1일 약 1 내지 5회, 바람직하게는 1일 약 1 내지 3회 정맥 내 투여하는 것이 유리하다. 기타 비경구 및 경구 투여에서는, 상기 제제를 상기 제시된 용량에 상응하는 용량으로 투여할 수 있다. 상태가 특별히 중증인 경우, 상태에 따라 상기 용량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 항체는 그대로 또는 적정한 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 상기 투여에 사용되는 조성물은 상기 항체 또는 이의 염을 갖는 약리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여 (예를 들어 혈관 내 주사, 피하 주사 등)에 적절한 약학 제제의 형태로 제공된다. 상기 기재된 각 조성물은 다른 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 다른 약물, 예를 들어 알킬화제 (예를 들어 시클로포스파미드, 이포스파미드 등), 대사 길항제 (예를 들어 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 등), 항-종양 항생제 (예를 들어 미토마이신, 아드리아마이신 등), 식물 유래 항-종양제 (예를 들어 빈크리스틴, 빈데신, 택솔 (Taxol) 등), 시스플라틴, 카르보플라틴, 에토포시드, 이리노테칸 등과 조합으로 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 및 상기 기재된 약물은 환자에 동시에 또는 시차를 두고 투여될 수 있다.
우세한 증거는 AR104A1289.2.2가 암 세포주 상에 존재하는 에피토프의 연결을 통해 항-암 효과를 매개한다는 것을 나타낸다. 또한, FACS, 세포 ELISA 또는 IHC에 의해 예시되나 이에 제한되지는 않는 기술을 사용하여, AR104A1289.2.2 항체를, 특이적으로 그에 결합하는 에피토프를 발현하는 세포의 검출에 사용할 수 있다는 것을 나타낼 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공개물은 본 발명이 속한 업계의 숙련된 자들의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공개물은, 각 개별 공개물이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타내어지는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 특정 형태가 설명되지만, 본 발명을 본원에 기술되고 나타내어진 부분들의 특정 형태 또는 배열로 제한시키고자 하는 것은 아님이 이해될 것이다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경이 가해질 수 있으며, 본 발명이 본 명세서에 나타내고 기재된 것에 제한되는 것으로 간주되어서는 안된다는 것은 당업자들에 자명할 것이다.
당업자는 본 발명이 상기 목표를 수행하고 언급된 목적 및 이점, 뿐만 아니라 그에 내재된 목적 및 이점을 달성하기에 충분히 적합하게 되어있다는 것을 용이하게 인지할 것이다. 본원에 기재된 임의의 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 생물학적으로 관련된 화합물, 방법, 절차 및 기술은 현재 바람직한 구현예를 대표하며, 예시적인 것으로 의도된 것이고, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도된 것이 아니다. 본 발명의 취지에 포함되며 첨부된 청구항의 범위로 정의되는 상기에서의 변경 및 기타 용도가 당업자들에게 발생할 것이다. 본 발명을 특정 바람직한 구현예와 관련하여 기재하였지만, 청구된 본 발명을 이러한 특정 구현예로 과도하게 제한해서는 안 된다는 것을 이해하여야 한다. 사실상, 본 발명을 실행하기 위해 기재된 양식에 대한, 당업자들에 자명한 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
Figure pct00036
Figure pct00037
캐나다국제기탁기관(IDAC) 190607-04 20070619

Claims (47)

  1. IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된, 단리된 단클론 항체.
  2. IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 인간화 항체, 또는 상기 인간화 항체로부터 생성된 항원 결합 절편.
  3. IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 키메라 항체, 또는 상기 키메라 항체로부터 생성된 항원 결합 절편.
  4. IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된, 단리된 하이브리도마 세포주.
  5. 하기 단계를 포함하는, 인간 종양에서 선택된 조직 검체에서 암성 세포의 항체 유도성 세포독성을 개시하는 방법:
    상기 인간 종양에서 조직 검체를 제공하는 단계;
    IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체, IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 인간화 항체, IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 키메라 항체 또는 이의 암성 질환 변형 항체 (CDMAB)를 제공하는 단계, 여기서 상기 CDMAB는 상기 단리된 단클론 항체의 이의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력에 의해 특징지어짐;
    상기 단리된 단클론 항체, 상기 인간화 항체, 상기 키메라 항체 또는 이의 CDMAB를 상기 조직 검체와 접촉시키는 단계;
    여기서, 상기 단리된 단클론 항체, 상기 인간화 항체, 상기 키메라 항체 또는 이의 CDMAB와 상기 조직 검체와의 결합이 세포독성을 유도함.
  6. 제 1 항에 따른 단리된 단클론 항체의 CDMAB.
  7. 제 2 항에 따른 인간화 항체의 CDMAB.
  8. 제 3 항에 따른 키메라 항체의 CDMAB.
  9. 세포독성 부분, 효소, 방사성 화합물 및 혈행 세포로 이루어지는 군에서 선택된 구성원과 접합된, 제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항, 제 7 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 CDMAB.
  10. 단클론 항체 또는 이의 CDMAB를 포유류의 종양 존재량을 감소시키기에 효과적인 양으로 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 항체 유도성 세포독성에 취약한 인간 종양을 치료하는 방법으로서, 이 때 상기 인간 종양은 IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는 것이고, 상기 CDMAB는 상기 단리된 단클론 항체의 이의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력에 의해 특징지어지는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 세포독성 부분과 접합되는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 보체를 활성화시키는 방법.
  14. 제 10 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 인간화되는 방법.
  16. 제 10 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 키메라인 방법.
  17. IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체에서와 동일한 에피토프(들)에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체.
  18. 단클론 항체 또는 이의 CDMAB를 포유류의 종양 존재량을 감소시키기에 효과적인 양으로 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 인간 종양을 치료하는 방법으로서, 이 때 상기 인간 종양은 IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는 것이고, 상기 CDMAB는 상기 단리된 단클론 항체의 이의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력에 의해 특징지어지는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 세포독성 부분과 접합되는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 보체를 활성화시키는 방법.
  22. 제 18 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 방법.
  23. 제 18 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 인간화되는 방법.
  24. 제 18 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 키메라인 방법.
  25. 단클론 항체 또는 이의 CDMAB를 포유류의 종양 존재량을 감소시키기에 효과적인 양으로 하나 이상의 화학요법제와 함께 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 인간 종양을 치료하는 방법으로서, 이 때 상기 인간 종양은 IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는 것이고, 상기 CDMAB는 상기 단리된 단클론 항체의 이의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력에 의해 특징지어지는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 세포독성 부분과 접합되는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 보체를 활성화시키는 방법.
  29. 제 25 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 방법.
  30. 제 25 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 인간화되는 방법.
  31. 제 25 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 키메라인 방법.
  32. 하기 단계를 포함하는, 인간 종양에서 선택된 조직 검체에서 암성 세포의 존재를 측정하기 위한 결합 검정으로서, 상기 세포가 IDAC 등록 번호 190607-04를 갖는 하이브리도마 세포주 AR104A1289.2.2에 의해 생성된 단리된 단클론 항체, IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 인간화 항체, 또는 IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체의 키메라 항체에 의해 특이적으로 결합되는 검정:
    상기 인간 종양에서 조직 검체를 제공하는 단계;
    IDAC 등록 번호 190607-04를 갖는 하이브리도마 세포주 AR104A1289.2.2에 의해 생성된 단리된 단클론 항체에 의해 인지되는 것과 동일한 에피토프(들)를 인지하는, 상기 단리된 단클론 항체, 상기 인간화 항체, 상기 키메라 항체 또는 이의 CDMAB 중 하나 이상을 제공하는 단계;
    하나 이상의 상기 제공된 항체 또는 이의 CDMAB를 상기 조직 검체와 접촉시키는 단계;
    상기 하나 이상의 제공된 항체 또는 이의 CDMAB와 상기 조직 검체와의 결합을 측정하는 단계;
    이로써 상기 조직 검체에서 상기 암성 세포의 존재를 나타냄.
  33. 단클론 항체 또는 이의 CDMAB를 포유류의 인간 종양 존재량을 감소시키기에 효과적인 양으로 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 종양 존재량을 감소시키기 위한 단클론 항체의 용도로서, 이 때 상기 인간 종양은 IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는 것이고, 상기 CDMAB는 상기 단리된 단클론 항체의 이의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력에 의해 특징지어지는 용도.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 세포독성 부분과 접합되는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  36. 제 33 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 보체를 활성화시키는 방법.
  37. 제 33 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 방법.
  38. 제 33 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 인간화되는 방법.
  39. 제 33 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 키메라인 방법.
  40. 단클론 항체 또는 이의 CDMAB를 하나 이상의 화학요법제와 함께 포유류의 인간 종양 존재량을 감소시키기에 효과적인 양으로 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 종양 존재량을 감소시키기 위한 단클론 항체의 용도로서, 이 때 상기 인간 종양은 IDAC에 등록 번호 190607-04로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB에 특이적으로 결합하는 항원의 하나 이상의 에피토프를 발현하는 것이고, 상기 CDMAB는 상기 단리된 단클론 항체의 이의 표적 항원에의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력에 의해 특징지어지는 용도.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 세포독성 부분과 접합되는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 세포독성 부분이 방사성 동위원소인 방법.
  43. 제 40 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 보체를 활성화시키는 방법.
  44. 제 40 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 항체 의존성 세포독성을 매개하는 방법.
  45. 제 40 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 인간화되는 방법.
  46. 제 40 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체가 키메라인 방법.
  47. 하기를 조합하여 포함하는, 인간 암성 종양의 치료에 효과적인 조성물:
    제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 6 항, 제 7 항, 제 8 항 또는 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 CDMAB;
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 절편과, 세포독성 부분, 효소, 방사성 화합물 및 혈행 세포로 이루어지는 군에서 선택된 구성원과의 접합체; 및
    필요량의 약학적으로 허용가능한 담체;
    여기서, 상기 조성물은 상기 인간 암성 종양을 치료하는데 효과적임.
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